CN103789440A - 脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用 - Google Patents

脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法，包括步骤：提取检测对象的基因组DNA；采用两套PCR引物对和Taqman MGB荧光探针组合分别对基因组DNA进行荧光定量PCR，其中PCR引物对分别是SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列分别是SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；根据荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，分析基因组DNA中的脊髓性肌萎缩症相关基因的两个位点是否存在突变。还涉及相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用，本发明设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断、治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。

Description

脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用
技术领域
本发明涉及疾病相关基因突变检测技术领域，更具体地，涉及脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测技术领域，特别是指一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用。
背景技术
脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy,SMA）是一种常见的神经系统常染色体隐性遗传病，SMA的主要相关基因SMN1基因定位于5q13.1，本病患者主要是因为SMN1基因纯合性缺失所致。SMA可分为3型：SMA I型，又称婴儿重型、Werdnig-Hoffmann病，患儿出生后6个月内发病，全身性严重肌无力及肌张力减低，无倚托不能坐，常在2岁前死于呼吸肌麻痹；SMA II型，又称中间型，婴儿于出生后6～18个月发病，能坐，但不能无扶助站立，其生存时间依赖于呼吸肌受累麻痹的程度；SMA III型，亦即慢性型，又称Kugebug-Welander病，多于出生18个月后发病，婴儿可独立行走，病情进展缓慢，可存活至成年。本病群体发病率为1：6000－1：10000，居致死性常染色体隐性遗传病的第二位，该疾病的基因携带者频率为1：40－1：60。脊肌萎缩症目前尚无有效的治疗办法，预防患者出生是阻断该病遗传的最有效的手段，因此产前基因检测是避免再次生育患者的最佳选择。
约95%的患者可以检测出SMN1基因有大片段缺失的情形发生（exon7和/或exon8缺失）。其中大部分SMA患者的SMN1基因发生了纯合子缺失突变(homozygous deletion)。至于少数未发现SMN1基因大片段缺失或转换的SMA患者，则可能在SMN1基因上发生一些小突变而致病。由DNA分子检测技术来检测SMN1基因的拷贝数，可以作为诊断是否为SMA患者或携带者的一项重要依据。
在该背景条件下，现行的SMA诊断依据临床特点、肌电图和PCR-RFLP、PCR-DHPLC、毛细管电泳和测序分析等，需要特殊的生化分析仪与试剂，检测需要1周左右时间，且开管检测操作容易造成污染。
因此，需要提供一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法，其采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用，该检测方法设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断、治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法，其特点是，包括步骤：
a.提取检测对象的基因组DNA；
b.采用第一PCR引物对和第一Taqman MGB荧光探针对所述步骤a得到的基因组DNA进行荧光定量PCR，其中所述第一PCR引物对是SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列，所述第一Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；采用第二PCR引物对和第二Taqman MGB荧光探针对所述步骤a得到的基因组DNA进行荧光定量PCR，其中所述第二PCR引物对是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
c.根据所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，分析所述基因组DNA中的脊髓性肌萎缩症相关基因的两个位点是否存在突变。
较佳地，在进行荧光定量PCR时，还采用内参PCR引物对和内参Taqman MGB荧光探针进行扩增，其中所述内参PCR引物对是SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测探针组合物，其特点是，包括第一PCR引物对、第一Taqman MGB荧光探针、第二PCR引物对和第二Taqman MGB荧光探针，其中所述第一PCR引物对是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第一Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述第二PCR引物对是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
较佳地，所述脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测探针组合物还包括内参PCR引物对和内参Taqman MGB荧光探针，所述内参PCR引物对是SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了上述的脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测探针组合物在检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变中的应用。
在本发明的第四方面，提供了一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒，其特点是，包括第一引物容器、第一荧光探针容器、第二引物容器和第二荧光探针容器，所述第一引物容器内具有第一PCR引物对干燥粉末或溶液，所述第一荧光探针容器内具有第一Taqman MGB荧光探针干燥粉末或溶液，所述第二引物容器内具有第二PCR引物对干燥粉末或溶液，所述第二荧光探针容器内具有第二Taqman MGB荧光探针干燥粉末或溶液，其中所述第一PCR引物对是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第一Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述第二PCR引物对是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
较佳地，所述脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒还包括内参引物容器和内参荧光探针容器，所述内参引物容器内具有内参PCR引物对干燥粉末或溶液，所述内参荧光探针容器内具有内参Taqman MGB荧光探针干燥粉末或溶液，其中所述内参PCR引物对是SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
在本发明的第五方面，提供了上述的脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒在检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变中的应用。
本发明的创新点在于通过荧光定量PCR技术检测检测对象（主要是正常人或患者）的基因组DNA中的脊髓性肌萎缩症相关基因的2个位点是否存在突变，设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断、治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。
附图说明
图1是SMN1基因的exon7位点正常检测结果图。其中，1为β-actin基因扩增曲线，2为SMN1基因的exon7位点扩增曲线，横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号，单位为lux。
图2是SMN1基因的exon7位点缺失检测结果图。其中，3为β-actin基因扩增曲线，4为SMN1基因的exon7位点扩增曲线，横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号，单位为lux。
图3是SMN1基因的exon8位点正常检测结果图。其中，5为β-actin基因扩增曲线，6为SMN1基因的exon8位点扩增曲线，横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号，单位为lux。
图4是SMN1基因的exon8位点缺失检测结果图。其中，7为β-actin基因扩增曲线，8为SMN1基因的exon8位点扩增曲线，横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号，单位为lux。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，下列具体实施例仅仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
实施例1：DNA制备
1）测试用正常人基因组DNA制备
采取正常人血滤纸，Chlex100抽提制备，正常人基因组DNA浓度调节到10ng/μl。
2）SMN1正常基因型标准品制备
依据SMN1和内参基因β-actin序列，人工合成SMN1EXON7（SEQ ID NO:1）、SMN1EXON8（SEQ ID NO:2）和β-actin（SEQ ID NO:3）。分别含上述片段的T载体浓度调节为1ng/ul作为10倍正常基因型模板。
3）SMN1突变缺失基因型标准品制备
人工合成内参基因β-actin（SEQ ID NO:3）。含上述片段的T载体浓度调节为1ng/ul作为10倍突变缺失基因型模板。
实施例2：SMN1突变基因扩增引物和MGB探针设计合成
根据SMN1EXON7和SMN1EXON8设计合成引物，SMN1基因探针标记Fam，内参基因探针标记Vic。验证荧光定量PCR引物特异性扩增目标基因片段，Taqman MGB位点特异性探针报告对应荧光信号。人工合成基因片段特异性扩增引物和位点特异性TaqmanMGB报告探针。基因片段特异性引物和位点特异性Taqman MGB探针序列见表1和表2（SEQ ID NO:4到SEQ ID NO:12）。
表1
Figure BDA0000467222820000041
Figure BDA0000467222820000051
表2
实施例3：SMN1Taqman定量PCR基因正常或缺失检测
1）exon7基因验证
反应体系：引物探针混合物2.5μl，2倍Multiplex PCR Mix（QIAGEN N.V.，德国）12.5μl，标准模板2.5μl，5倍Easy Buffer5μl，ddH2O2.5μl。
定量PCR仪：ABI7500（Life Technologies公司，美国）。
反应条件：95℃5分钟；94℃30秒——60℃30秒——72℃45秒，40循环。
2）exon8基因验证
反应体系：引物探针混合物2.5μl，2倍Multiplex PCR Mix（QIAGEN N.V.，德国）12.5μl，标准模板2.5μl，5倍Easy Buffer5μl，ddH2O2.5μl。
定量PCR仪：ABI7500（Life Technologies公司，美国）。
反应条件：95℃5分钟；94℃30秒——60℃30秒——72℃45秒，40循环。
实施例4：结果读取
1）exon7基因验证结果读取：
请参见图1和图2，检测到Vic信号确定为扩增成功，Fam无扩增确定为exon7缺失，吻合度要求100%。正常人基因组检测到Fam和Vic信号，SMA exon7缺失患者Fam信号检测不到。
2）exon8基因验证结果读取：
请参见图3和图4，检测到Vic信号确定为扩增成功，Fam无扩增确定为exon8缺失，吻合度要求100%。正常人基因组检测到Fam和Vic信号，SMA exon8缺失患者Fam信号检测不到。
本发明通过使用上述引物对和Taqman MGB探针可以确定上述2个基因位点的基因型，一共可以分为四种基因型，分别是EXON7及EXON8正常、EXON7缺失、EXON8缺失、EXON7及EXON8缺失，由此，结合临床和家系数据可以确定对应个体是否为SMA患者或携带者。
本发明提出的检测覆盖约95%SMA的2个基因位点检测引物，标的基因和内参基因Taqman MGB探针分别用Fam和Vic标记，显然可以选用其它合适荧光标记。
本发明提出的SMA的2个基因位点检测引物探针，分位点包装为2管，单引物探针浓度为0.1到0.5μM，设计为10倍浓度，使用时终浓度为1倍浓度。
本发明的SMA的2个基因位点检测引物探针分别与模板及PCR扩增试剂混合，在定量PCR仪上扩增并收集Ct值，依据Ct值确定位点基因型。
本发明使用Taqman MGB探针定量PCR确定约95%SMA的2个基因位点的基因型。综合2个位点的基因型确定个体SMN1基因型。结合临床和家系数据可以确定个体为携带者或患者。本发明提供的试剂可以在具有定量PCR的实验室完成，检测时间仅仅需要3到5个小时；检测仪器（如AB7500定量PCR仪）和方法（Taqman MGB探针定量PCR）获得SFDA认证；可以在单个实验室全闭管完成，可避免高浓度模板污染；该发明可以稳定实施，具备在大规模推广的技术条件。
因此，本发明的脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法可以使用定量PCR仪和配套PCR试剂，通过扩增检测2个SMA常见突变基因位点，可在3到5个小时内得出检测结果。该发明提供的试剂检测SMA在具有定量PCR仪的单个实验室闭管完成，可有效避免高浓度样本污染。该发明提供的试剂可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于检测，具备产业化推广的条件。
综上所述，本发明的脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断、治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
Figure IDA0000467222910000031

Claims (8)

1.一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法，其特征在于，包括步骤：
a.提取检测对象的基因组DNA；
b.采用第一PCR引物对和第一Taqman MGB荧光探针对所述步骤a得到的基因组DNA进行荧光定量PCR，其中所述第一PCR引物对是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第一Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列；采用第二PCR引物对和第二Taqman MGB荧光探针对所述步骤a得到的基因组DNA进行荧光定量PCR，其中所述第二PCR引物对是SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
c.根据所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，分析所述基因组DNA中的脊髓性肌萎缩症相关基因的两个位点是否存在突变。
2.根据权利要求1所述的脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法，其特征在于，在进行荧光定量PCR时，还采用内参PCR引物对和内参Taqman MGB荧光探针进行扩增，其中所述内参PCR引物对是SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
3.一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测探针组合物，其特征在于，包括第一PCR引物对、第一Taqman MGB荧光探针、第二PCR引物对和第二Taqman MGB荧光探针，其中所述第一PCR引物对是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第一Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述第二PCR引物对是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二TaqmanMGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测探针组合物，其特征在于，所述脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测探针组合物还包括内参PCR引物对和内参Taqman MGB荧光探针，所述内参PCR引物对是SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测探针组合物在检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变中的应用。
6.一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括第一引物容器、第一荧光探针容器、第二引物容器和第二荧光探针容器，所述第一引物容器内具有第一PCR引物对干燥粉末或溶液，所述第一荧光探针容器内具有第一Taqman MGB荧光探针干燥粉末或溶液，所述第二引物容器内具有第二PCR引物对干燥粉末或溶液，所述第二荧光探针容器内具有第二Taqman MGB荧光探针干燥粉末或溶液，其中所述第一PCR引物对是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第一Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述第二PCR引物对是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒还包括内参引物容器和内参荧光探针容器，所述内参引物容器内具有内参PCR引物对干燥粉末或溶液，所述内参荧光探针容器内具有内参Taqman MGB荧光探针干燥粉末或溶液，其中所述内参PCR引物对是SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒在检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变中的应用。
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