CN103555835A - 用于sma基因筛查的引物、探针及其使用方法 - Google Patents

用于sma基因筛查的引物、探针及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103555835A
CN103555835A CN201310509147.9A CN201310509147A CN103555835A CN 103555835 A CN103555835 A CN 103555835A CN 201310509147 A CN201310509147 A CN 201310509147A CN 103555835 A CN103555835 A CN 103555835A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
primer
probe
combination
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310509147.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103555835B (zh
Inventor
曾骥孟
庄建立
刘斌
赖金娇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zeng Jimeng
Original Assignee
Rui Bao Biological Medicine Technology (xiamen) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rui Bao Biological Medicine Technology (xiamen) Co Ltd filed Critical Rui Bao Biological Medicine Technology (xiamen) Co Ltd
Priority to CN201310509147.9A priority Critical patent/CN103555835B/zh
Publication of CN103555835A publication Critical patent/CN103555835A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103555835B publication Critical patent/CN103555835B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于SMA基因筛查的引物、探针及其使用方法，属于生物技术领域。本发明公开的用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针有八种组合，可有效的应用于运动神经元存活基因1的筛查。同时，本发明也公开了十六组用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针组合；以及利用上述用于运动神经元存活基因1筛查的引物和探针和用于运动神经元存活基因2筛查的引物和探针在胎儿SMA基因筛查中的应用。利用本发明提供的引物和探针组合可高效地检测成人和胎儿的SMA基因型。

Description

用于SMA基因筛查的引物、探针及其使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及用于人类脊髓性肌萎缩症（SMA）基因筛查的引物、探针及其使用方法。
背景技术
脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是一组以脊髓前角运动神经元退行性病变为病理特征的常染色体隐性遗传病，临床表现为进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力、萎缩和瘫痪，新生儿发病率为1/6000～1/10000，在正常人群中基因携带者的发生率为1/40～1/60，居致死性常染色体隐性遗传病第二位，仅次于囊性纤维变。
根据发病年龄和临床表现，可将SMA分为四型：（1）Ⅰ型SMA（急性型）：出生后6个月内发病，全身肌肉无力，肌张力减退，患儿不能坐和站立，通常在2岁内死于呼吸衰竭；（2）Ⅱ型SMA（中间型）：出生后6～18个月间发病，患儿能坐但不能独自行走，预期寿命显著降低；（3）Ⅲ型SMA（少年型）：患儿能坐和行走，多数表现有肌力弱，预期寿命不减少，成年后仍经常需要依靠拐杖或轮椅代步；（4）Ⅳ型SMA（成人型）：30岁后发病，症状极轻，寿命正常。其中Ⅰ～Ⅲ型称为儿童型SMA，是婴幼儿期最常见的致死性常染色体隐性遗传病之一，目前尚无特效治疗手段。
研究发现，定位于染色体5q11.2～13.3区域的运动神经元存活基因（survival motorneuron gene，SMN）是SMA发病的决定性基因。SMN基因全长20kb，含8个外显子，其转录产物约1700bp，编码294个氨基酸。该基因在5号染色体上有2种拷贝，在端粒侧的称为SMN1（即SMNt），在着丝粒侧的称SMN2（即SMNc），两者间具有高度的同源性，仅有5个碱基对的差异。SMA发病主要是由于SMN基因发生缺失、点突变等基因异常所致。研究表明，SMN1基因是SMA的致病基因，大多数（90.0～98.6%）患者有SMN1基因第7、8外显子或单纯第7外显子的纯合缺失或突变；而SMN2基因是SMA症状轻重的调节基因，其拷贝数与SMA病情的严重程度有关，轻型SMA患者比重型SMA具有更多的SMN2拷贝数，即SMN2能在一定程度上弥补SMN1缺失所造成的功能缺陷。由于SMA属于染色体隐性遗传病，若夫妻皆为SMA致病基因携带者，则胎儿无论男女皆有1/4的概率为SMA患者，1/2的概率为SMA致病基因携带者，另1/4的概率为正常。因此，筛查具有SMA家族病史者的SMA致病基因存在状态，对夫妻双方均为SMA致病基因携带者的胎儿进行产前诊断，对于防治SMA、推进优生优育、提高人口素质具有重要意义。
过去，SMA的临床确诊主要依靠临床病史、体征及肌电图和肌活检综合诊断，误诊率和漏诊率很高。
近年来，分子生物学技术的飞速发展为SMA遗传学研究提供了新的途径和方法，使对该疾病的基因诊断和产前诊断成为可能。目前对SMA致病基因进行检测的方法包括聚合酶链式反应-单链构象多态性技术（PCR-SSCP）、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析技术（PCR-RFLP）、变性高效液相色谱法（DHPLC）、多重连接依赖式探针扩增技术（MLPA）、实时荧光定量聚合酶链式反应技术（Real-Time PCR）等。但是，PCR-SSCP技术实验要求高，电泳时温度的变化等可通过影响单链DNA的折叠而易造成假阳性或假阴性结果，使其在临床实验室的应用受到限制；PCR-RFLP技术用于临床基因检测操作步骤繁琐，需要对PCR产物进行后处理，在操作过程中易发生污染，且存在酶切不完全和扩增时产生异源双链而不能酶切所造成的假阴性结果，也无法检测SMN1基因的杂合性缺失，因而无法区分SMA致病基因携带者和正常人；DHPLC法用于SMA致病基因检测，只能检测杂合突变，由于检测体系敏感，易导致检测失败或结果重复性不好，且因SMN基因的拷贝数波动较大，数据分析存在一定问题；MLPA技术应用于SMA致病基因检测，不仅可检测出SMN基因的拷贝数，还能判断杂合子和纯合子缺失，此外由于具有半定量作用，能检测出致病基因携带者，且具有准确性高、重复性好及简便快速等优点，该方法结合DNA测序技术，可使基因诊断结果更为准确可靠，但MLPA也有其局限性：1、需要精确测量DNA的浓度，样本容易被污染；2、不能用于单个细胞的检测；3、不能检测染色体的平衡易位。
Real-Time PCR法可有效应用于SMA致病基因拷贝数检测，其最大优点是可对基因拷贝数进行定量分析，且实验过程操作简便快捷，可有效避免PCR产物遗留污染。由于基因分析的定量化是未来基因诊断的发展趋势，Real-Time PCR技术在基因定量分析方面的先天优势使其具有极大的临床应用价值，将越来越广泛的应用于临床实践。
发明内容
为解决上述问题，本发明提出了用于人类脊髓性肌萎缩症（SMA）基因筛查的引物、探针及其使用方法。
本发明涉及一种用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针，所述的引物和探针选自如下任一组合：
第一种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：1、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第二种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：2、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第三种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：1、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16；
第四种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：2、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16。
第五种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：1、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第六种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：2、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第七种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：1、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16；
第八种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：2、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16。
本发明还涉及一种利用上述用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针在人SMA基因筛查中的应用，包括如下步骤：
（1）样品的DNA提取；
（2）荧光PCR扩增：
PCR体系如下：
Figure BDA0000401804450000041
PCR反应条件如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，40个循环；
（3）检测：
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到SMN1和β-actin的标准曲线，进而通过标准曲线得到待测样品的SMN1基因和β-actin基因的拷贝数；
（4）结果判定：
要求SMN1和β-actin的标准曲线的相关系数r值大于0.99；
根据步骤（3）得到的SMN1和β-actin的拷贝数，计算SMN1与β-actin的拷贝数比；如果比值为0.9-1.6，则表明待测样品的提供者为正常人，比值为0.4-0.6，则表明待测样品的提供者为携带者。
本发明还涉及一种用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针，所述的引物和探针选自如下任一组合：
第一种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：3、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第二种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：3、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第三种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：3、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16；
第四种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：3、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16。
第五种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：4、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第六种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：4、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第七种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：4、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16；
第八种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：4、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16。
第九种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：5、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第十种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：5、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第十一种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：5、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16；
第十二种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：5、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16。
第十三种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：6、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第十四种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：6、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第十五种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：6、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16；
第十六种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：6、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16。
本发明还涉及一种利用上述用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针和上述用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针在胎儿SMA基因筛查中的应用，包括如下步骤：
（1）样品的DNA提取；
（2）荧光PCR扩增：
PCR体系如下：
Figure BDA0000401804450000061
PCR反应条件如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，40个循环；
所述的引物1、引物2、引物3、引物4、探针1、探针2的组合具体如下：
第一种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第二种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第三种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第四种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第五种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第六种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第七种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
第八种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
（3）检测：
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到SMN1和β-actin的标准曲线，进而通过标准曲线得到待测样品的SMN1基因和β-actin基因的拷贝数；
（4）第一次结果判定：
要求SMN1和β-actin的标准曲线的相关系数r值大于0.99；
根据步骤（3）得到的SMN1和β-actin的拷贝数，计算SMN1与β-actin的拷贝数比，如果比值为0.9～1.6，则表明待测样品的提供者为正常人，比值为0.4～0.6，则表明待测样品的提供者为携带者，如果比值为0，则表明待测样品的提供者为患者；
（5）第二次结果判定：
将步骤（4）中经过第一次结果判定为患者的DNA样品再次按照步骤（2）所示的方法进行PCR扩增；除了使用的引物1、引物2、引物3、引物4、探针1、探针2不同外，其余均和步骤（2）的条件相同；
PCR体系中使用的引物1、引物2、引物3、引物4、探针1、探针2的组合具体如下：
第一种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第二种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第三种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第四种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
第五种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第六种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第七种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第八种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
第九种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第十种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第十一种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第十二种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
第十三种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第十四种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第十五种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第十六种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到SMN2和β-actin的标准曲线，进而通过标准曲线得到待测样品的SMN2基因和β-actin基因的拷贝数；
第二次结果判定的方法如下：
首先，SMN2和β-actin的标准曲线的相关系数r值大于0.99；
根据上述方法得到的SMN2和β-actin的拷贝数，计算SMN2与β-actin的拷贝数比，如果比值为0～1.1，则表明待测样品的提供者为SMA-Ⅰ型，如果比值为1.4～2.1，则表明待测样品的提供者为SMA-Ⅱ或SMA-Ⅲ型。
其中，
步骤（1）所述的样品的DNA提取方法如下：抽取孕妇的羊水样品，然后将羊水样品先经过细胞培养后，取培养后的细胞提取DNA。
上述的引物和探针的序列组成如下表：
表1：引物和性探针的序列组成
引物名称 序列 序列编号
SMN1-F1 5’-CTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3’ SEQ ID No：1
SMN1-F2 5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTCA-3’ SEQ ID No：2
SMN2-F1 5’-CTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTT-3’ SEQ ID No：3
SMN2-F2 5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTTA-3’ SEQ ID No：4
SMN2-F3 5’-TTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTT-3’ SEQ ID No：5
SMN2-F4 5’-TTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTTA-3’ SEQ ID No：6
SMN-R1 5’-AGTAAGATTCACTTTCATAATGCTGG-3’ SEQ ID No：7
SMN-R2 5’-AACCTTTCAACTTTCTAACATCTGAACT-3’ SEQ ID No：8
SMN-P1 FAM-5’-TCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACAT-3’-TAMRA SEQ ID No：9
SMN-P2 FAM-5’-TAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCAT-3’-TAMRA SEQ ID No：10
Actin-F1 5’-AGGGCTTCTTGTCCTTTCC-3’ SEQ ID No：11
Actin-R1 5’-CACCTGGGTCATCTTCTCG-3’ SEQ ID No：12
Actin-P1 HEX-5’-CAACTGGGACGACATGGAGAAAATC-3’-TAMRA SEQ ID No：13
Actin-F2 5’-CTCGCTGTCCACCTTCCA-3’ SEQ ID No：14
Actin-R2 5’-CGACTGCTGTCACCTTCAC-3’ SEQ ID No：15
Actin-P2 HEX-5’-CTATGACTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3’-TAMRA SEQ ID No：16
本发明的有益效果是：
在本发明提供的引物和探针的基础上建立的多重实时荧光PCR，可以同时区分待检者为正常人或者是携带者，如果待检样品为羊水，也能准确区分待检者（胎儿）为正常人、携带者或者是患者，如果是患者，还能够区分疾病的严重程度。
附图说明
图1是正常人SMN1基因和β-actin基因扩增曲线图；
图2是SMA患者SMN1基因和β-actin基因扩增曲线图；
图1和图2是使用实施案例1中的方法，使用用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针的第一种组合获得的图谱。
图3是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针的第一种组合获得的SMN1和β-actin基因的标准曲线图；
图4是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针的第二种组合获得的SMN1和β-actin基因的标准曲线图；
图5是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针的第三种组合获得的SMN1和β-actin基因的标准曲线图；
图6是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针的第四种组合获得的SMN1和β-actin基因的标准曲线图；
图7是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针的第五种组合获得的SMN1和β-actin基因的标准曲线图；
图8是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针的第六种组合获得的SMN1和β-actin基因的标准曲线图；
图9是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针的第七种组合获得的SMN1和β-actin基因的标准曲线图；
图10是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针的第八种组合获得的SMN1和β-actin基因的标准曲线图；
图11是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第一种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图；
图12是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第二种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图；
图13是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第三种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图；
图14是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第四种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图；
图15是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第五种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
图16是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第六种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
图17是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第七种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
图18是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第八种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
图19是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第九种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
图20是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第十种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
图21是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第十一种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
图22是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第十二种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
图23是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第十三种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
图24是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第十四种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
图25是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第十五种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
图26是本发明实施例中使用用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针的第十六种组合获得的SMN2和β-actin基因的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步说明：
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的全血样品均为非肝素抗凝全血；使用的10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶均购自中国大连宝生物公司。
实施例1：
本实施例以SMN1基因检测为例来说明单管荧光PCR检测待检样品的方法。
实验用样品为家族无SMA遗传病史的50对夫妻的全血样品和家族有SMA遗传病史的30对夫妻的全血样品。
利用上述用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针区分160人中正常人和携带者的方法包括以下步骤：
（1）样品的DNA提取：
每人抽取400μL全血样品，采用RBC公司MagCore Genomic DNA Whole Blood Kit试剂盒（Cat.No：MGB400-04），按试剂盒的操作说明提取DNA；经紫外分光光度计检测提取的DNA质量后，将提取的DNA用Tris-HCl溶液（10mmol/L，pH8.0）调整到10ng/μL作为PCR扩增的模板；
（2）荧光PCR扩增：
PCR体系如下：
PCR反应条件如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，40个循环；
所述的引物1、引物2、引物3、引物4、探针1、探针2的组合为第一种组合，具体如下：
第一种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
（3）检测：
采用Mx3000P实时PCR扩增仪（StrataGene公司）于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到SMN1和β-actin的标准曲线（如图3所示），进而通过标准曲线得到待测样品的SMN1基因和β-actin基因的拷贝数。一次可检测48份样品（包括阴、阳对照；每个样品做两个重复）。
（4）结果判定：
要求SMN1和β-actin的标准曲线的相关系数r值大于0.99。
根据步骤（3）得到的SMN1和β-actin的拷贝数，计算SMN1与β-actin的拷贝数比；如果比值为0.9～1.6，则表明待测样品的提供者为正常人，比值为0.4～0.6，则表明待测样品的提供者为携带者。
结果显示：
前述家族无SMA遗传病史的50对夫妻的全血样品中，有99份样品的SMN1与β-actin的基因拷贝数比落在0.9～1.6的范围内，判断该99人为正常人；1份样品的SMN1与β-actin的基因拷贝数比落在0.4～0.6之间，判断其为携带者。
前述家族有SMA遗传病史的30对夫妻的全血样品中，有43份样品的SMN1与β-actin的基因拷贝数比落在0.9～1.6的范围内，判断该43人为正常人；17份样品的SMN1与β-actin的基因拷贝数比落在0.4～0.6的范围内，判断该17人为携带者。
将第一种引物和探针组合换成如下第二至第八种组合也可以得到和第一种引物和探针组合相同的结果，具体的组合如下：
第二种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；（获得的SMN1和β-actin的标准曲线图如图4所示）
第三种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；（获得的SMN1和β-actin的标准曲线图如图5所示）
第四种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；（获得的SMN1和β-actin的标准曲线图如图6所示）
第五种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；（获得的SMN1和β-actin的标准曲线图如图7所示）
第六种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；（获得的SMN1和β-actin的标准曲线图如图8所示）
第七种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；（获得的SMN1和β-actin的标准曲线图如图9所示）
第八种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16。（获得的SMN1和β-actin的标准曲线图如图10所示）
同时又采用多重连接探针扩增（MLPA）技术对上述所有的样品进行验证。使用荷兰MRC公司的SALSA MLPA P060SMA probemix–100rxn检测试剂盒（Cat.No：P060-100R），按照试剂盒说明书步骤进行实验验证。
结果如表2所示：
表2
Figure BDA0000401804450000151
由表2可知，本实施例提供的方法与MLPA方法的结果完全一致，说明本实施例提供的方法准确率很高；但是，与MLPA方法相比，本方法单个PCR反应即可判断检体为正常人、携带者或者是患者，检测时间仅需100分钟左右，因此本发明省时省力，准确性高，可满足产前诊断的快速筛查。
实施例2：
本实施例以SMN1和SMN2基因检测为例来说明单管荧光PCR检测胎儿为正常人或是患者的方法。
实验用样品为50对夫妻双方均为携带者的孕妇的羊水样品。
利用上述用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针和用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针来判断50名胎儿为正常人或是患者的方法包括以下步骤：
（1）样品的DNA提取：
每个孕妇均抽取400μL羊水样品，然后将羊水样品先经过Biological Industries公司的BIOAMF-2Complete Medium For Human Amniotic Fluid and Chorionic Villi Samples培养基（Cat.No：01-194-1），按培养基的操作说明进行细胞培养后，取不超过1×106个培养后的细胞，采用RBC公司MagCore Cultured Cells DNA Kit试剂盒（Cat.No：MCC-02），按试剂盒的操作说明提取DNA；经紫外分光光度计检测提取的DNA质量后，将提取的DNA用Tris-HCl溶液（10mmol/L，pH8.0）调整到10ng/μL作为PCR扩增的模板；
（2）荧光PCR扩增：
PCR体系如下：
Figure BDA0000401804450000161
PCR反应条件如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，40个循环；
所述的引物1、引物2、引物3、引物4、探针1、探针2的组合为第一种组合，具体如下：
第一种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
（3）检测：采用Mx3000P实时PCR扩增仪（StrataGene公司）于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到SMN1和β-actin的标准曲线（如图3所示），进而通过标准曲线得到待测样品的SMN1基因和β-actin基因的拷贝数。一次可检测48份样品（包括阴、阳对照；每个样品做两个重复）。
（4）第一次结果判定：
要求SMN1和β-actin的标准曲线的相关系数r值大于0.99。
根据步骤（3）得到的SMN1和β-actin的拷贝数，计算SMN1与β-actin的拷贝数比，如果比值为0.9～1.6，则表明待测样品的提供者为正常人，比值为0.4～0.6，则表明待测样品的提供者为携带者，如果比值为0，则表明待测样品的提供者为患者。
将第一种引物和探针组合换成如下第二至第八种组合也可以得到和第一种引物和探针组合相同的结果，具体的组合如下：
第二种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第三种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第四种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第五种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第六种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第七种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
第八种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
当检测结果表明待测样品的提供者为患者时，需再进行SMN2基因检测，根据SMN2与β-actin的拷贝数比值判断待测样品的提供者的临床分型。
（5）第二次结果判定：
将步骤（4）中经过第一次结果判定为患者的DNA样品再次按照步骤（2）所示的方法进行PCR扩增；除了使用的引物1、引物2、引物3、引物4、探针1、探针2不同外，其余均和步骤（2）的条件相同；
PCR体系中使用的引物1、引物2、引物3、引物4、探针1、探针2的组合为第一种组合，具体如下：
第一种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
同时采用Mx3000P实时PCR扩增仪（StrataGene公司）于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到SMN2和β-actin的标准曲线（如图11所示），进而通过标准曲线得到待测样品的SMN2基因和β-actin基因的拷贝数。一次可检测48份样品（包括阴、阳对照；每个样品做两个重复）。
第二次结果判定的方法如下：
首先，SMN2和β-actin的标准曲线的相关系数r值大于0.99。
根据上述方法得到的SMN2和β-actin的拷贝数，计算SMN2与β-actin的拷贝数比，如果比值为0～1.1，则表明待测样品的提供者为SMA-Ⅰ型，如果比值为1.4～2.1，则表明待测样品的提供者为SMA-Ⅱ或SMA-Ⅲ型。
结果显示：
前述50份待检样品，其中有11份样品的SMN1与β-actin的基因拷贝数比落在0.9～1.6的范围内，判断该11个胎儿为正常人；32份样品的SMN1与β-actin的基因拷贝数比落在0.4～0.6的范围内，判断该32个胎儿为携带者；7份样品的SMN1与β-actin的基因拷贝数比为0，判断该7个胎儿为患者。
对7份初步判断为患者的样品又进行了SMN2基因检测；其中3份样品的SMN2与β-actin的基因拷贝数的比值为0～1.1，判定该3个胎儿为SMA-Ⅰ型患者；4份SMN2与β-actin的基因拷贝数的比值为1.4～2.1，判定该4个胎儿为SMA-Ⅱ或SMA-Ⅲ型患者。
将第一种引物和探针组合换成如下第二至第十六种组合也可以得到和第一种引物和探针组合相同的结果，具体的组合如下：
第二种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图12所示）
第三种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图13所示）
第四种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图14所示）
第五种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图15所示）
第六种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图16所示）
第七种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图17所示）
第八种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图18所示）
第九种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图19所示）
第十种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图20所示）
第十一种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图21所示）
第十二种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图22所示）
第十三种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图23所示）
第十四种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图24所示）
第十五种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图25所示）
第十六种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16。（获得的SMN2和β-actin的标准曲线图如图26所示）
同时又采用多重连接探针扩增（MLPA）技术对上述所有的样品进行验证。使用荷兰MRC公司的SALSA MLPA P060SMA probemix–100rxn检测试剂盒（Cat.No：P060-100R），按照试剂盒说明书步骤进行实验验证。
结果如表3和表4所示：
表3
Figure BDA0000401804450000201
表4
Figure BDA0000401804450000202
由表3和表4可知，本实施例提供的方法与MLPA方法的结果完全一致，说明本实施例提供的方法准确率很高；但是，与MLPA方法相比，本方法步骤少，耗时少，可满足产前诊断的快速筛查。
Figure IDA0000401804530000011
Figure IDA0000401804530000021
Figure IDA0000401804530000031
Figure IDA0000401804530000041

Claims (7)

1.用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针，选自如下任一组合：
第一种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：1、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第二种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：2、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第三种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：1、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16；
第四种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：2、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16。
第五种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：1、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第六种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：2、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第七种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：1、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16；
第八种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：2、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16。
2.权利要求1所述的用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针在人SMA基因筛查中的应用。
3.根据权利要求2所述的用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针在人SMA基因筛查中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）样品的DNA提取；
（2）荧光PCR扩增：
PCR体系如下：
Figure FDA0000401804440000021
PCR反应条件如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，40个循环；
（3）检测：
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到SMN1和β-actin的标准曲线，进而通过标准曲线得到待测样品的SMN1基因和β-actin基因的拷贝数；
（4）结果判定：
要求SMN1和β-actin的标准曲线的相关系数r值大于0.99；
根据步骤（3）得到的SMN1和β-actin的拷贝数，计算SMN1与β-actin的拷贝数比；如果比值为0.9～1.6，则表明待测样品的提供者为正常人，比值为0.4～0.6，则表明待测样品的提供者为携带者。
4.用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针，选自如下任一组合：
第一种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：3、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第二种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：3、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第三种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：3、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16；
第四种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：3、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16。
第五种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：4、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第六种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：4、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第七种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：4、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16；
第八种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：4、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16。
第九种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：5、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第十种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQ IDNo：5、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第十一种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：5、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16；
第十二种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：5、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16。
第十三种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：6、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：13；
第十四种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：6、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：11、引物4：SEQ ID No：12、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：13；
第十五种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：6、引物2：SEQ ID No：7、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：9和探针2：SEQ ID No：16；
第十六种组合：含有以下六个序列表中序列编号所示的DNA序列：引物1：SEQID No：6、引物2：SEQ ID No：8、引物3：SEQ ID No：14、引物4：SEQ ID No：15、探针1：SEQ ID No：10和探针2：SEQ ID No：16。
5.权利要求1所述的用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针和权利要求4所述的用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针在胎儿SMA基因筛查中的应用。
6.根据权利要求5所述的用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针和用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针在胎儿SMA基因筛查中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）样品的DNA提取；
（2）荧光PCR扩增：
PCR体系如下：
Figure FDA0000401804440000041
Figure FDA0000401804440000051
PCR反应条件如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火60秒，40个循环；
所述的引物1、引物2、引物3、引物4、探针1、探针2的组合具体如下：
第一种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第二种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第三种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第四种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第五种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第六种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第七种组合：引物1为：SEQ ID No：1，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
第八种组合：引物1为：SEQ ID No：2，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
（3）检测：
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到SMN1和β-actin的标准曲线，进而通过标准曲线得到待测样品的SMN1基因和β-actin基因的拷贝数；
（4）第一次结果判定：
要求SMN1和β-actin的标准曲线的相关系数r值大于0.99；
根据步骤（3）得到的SMN1和β-actin的拷贝数，计算SMN1与β-actin的拷贝数比，如果比值为0.9～1.6，则表明待测样品的提供者为正常人，比值为0.4～0.6，则表明待测样品的提供者为携带者，如果比值为0，则表明待测样品的提供者为患者；
（5）第二次结果判定：
将步骤（4）中经过第一次结果判定为患者的DNA样品再次按照步骤（2）所示的方法进行PCR扩增；除了使用的引物1、引物2、引物3、引物4、探针1、探针2不同外，其余均和步骤（2）的条件相同；
PCR体系中使用的引物1、引物2、引物3、引物4、探针1、探针2的组合具体如下：
第一种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第二种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第三种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第四种组合：引物1为：SEQ ID No：3，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
第五种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第六种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第七种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第八种组合：引物1为：SEQ ID No：4，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
第九种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第十种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第十一种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第十二种组合：引物1为：SEQ ID No：5，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
第十三种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：13；
第十四种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：11，引物4为：SEQ ID No：12；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：13；
第十五种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：7；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：9，探针2为SEQID No：16；
第十六种组合：引物1为：SEQ ID No：6，引物2为：SEQ ID No：8；引物3为：SEQ ID No：14，引物4为：SEQ ID No：15；探针1为SEQ ID No：10，探针2为SEQID No：16；
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到SMN2和β-actin的标准曲线，进而通过标准曲线得到待测样品的SMN2基因和β-actin基因的拷贝数；
第二次结果判定的方法如下：
首先，SMN2和β-actin的标准曲线的相关系数r值大于0.99；
根据上述方法得到的SMN2和β-actin的拷贝数，计算SMN2与β-actin的拷贝数比，如果比值为0～1.1，则表明待测样品的提供者为SMA-Ⅰ型，如果比值为1.4～2.1，则表明待测样品的提供者为SMA-Ⅱ或SMA-Ⅲ型。
7.根据权利要求6所述的用于运动神经元存活基因1（SMN1）筛查的引物和探针和用于运动神经元存活基因2（SMN2）筛查的引物和探针在胎儿SMA基因筛查中的应用，其特征在于，步骤（1）所述的样品的DNA提取方法如下：
抽取孕妇的羊水样品，然后将羊水样品先经过细胞培养后，取培养后的细胞提取DNA。
CN201310509147.9A 2013-10-25 2013-10-25 用于sma基因筛查的引物、探针及其使用方法 Expired - Fee Related CN103555835B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310509147.9A CN103555835B (zh) 2013-10-25 2013-10-25 用于sma基因筛查的引物、探针及其使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310509147.9A CN103555835B (zh) 2013-10-25 2013-10-25 用于sma基因筛查的引物、探针及其使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103555835A true CN103555835A (zh) 2014-02-05
CN103555835B CN103555835B (zh) 2015-04-15

Family

ID=50010178

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310509147.9A Expired - Fee Related CN103555835B (zh) 2013-10-25 2013-10-25 用于sma基因筛查的引物、探针及其使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103555835B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103789440A (zh) * 2014-02-19 2014-05-14 上海五色石医学研究有限公司 脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用
CN106520942A (zh) * 2016-10-28 2017-03-22 苏州天隆生物科技有限公司 人运动神经元存活基因smn1和smn2检测试剂盒及检测方法
CN108456726A (zh) * 2018-04-19 2018-08-28 深圳会众生物技术有限公司 脊髓性肌萎缩症基因检测探针、引物和试剂盒
CN110527718A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 丰技生物科技股份有限公司 Sma基因的snp位点的检测方法
CN111172273A (zh) * 2020-01-19 2020-05-19 陕西师范大学 一种smn1基因检测的引物组、试剂盒及检测方法
WO2021020261A1 (ja) * 2019-07-26 2021-02-04 積水メディカル株式会社 Ｓｍｎ１遺伝子の検出又は定量方法
CN114317727A (zh) * 2022-03-03 2022-04-12 上海恩元生物科技有限公司 用于smn基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂及应用
CN116179679A (zh) * 2022-11-07 2023-05-30 嘉检(广州)生物工程技术有限公司 Smn1基因的检测引物对、检测探针以及用于检测脊髓性肌萎缩症的试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1769486A (zh) * 2004-11-01 2006-05-10 苏怡宁 脊髓型肌肉萎缩症的鉴别方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1769486A (zh) * 2004-11-01 2006-05-10 苏怡宁 脊髓型肌肉萎缩症的鉴别方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRUNO MARANDA ET AL: "Spinal muscular atrophy: Clinical validation of a single-tube multiplex real time PCR assay for determination of SMN1 and SMN2 copy numbers", 《CLINICAL BIOCHEMISTRY》 *
YU HUANG LIANG ET AL: "deletion analysis of SMN1 and NAIP genes in southern Chinese children with spinal muscular atrophy", 《浙江大学学报科学技术版（英文版）》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103789440A (zh) * 2014-02-19 2014-05-14 上海五色石医学研究有限公司 脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用
CN106520942A (zh) * 2016-10-28 2017-03-22 苏州天隆生物科技有限公司 人运动神经元存活基因smn1和smn2检测试剂盒及检测方法
CN108456726A (zh) * 2018-04-19 2018-08-28 深圳会众生物技术有限公司 脊髓性肌萎缩症基因检测探针、引物和试剂盒
CN110527718A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 丰技生物科技股份有限公司 Sma基因的snp位点的检测方法
WO2021020261A1 (ja) * 2019-07-26 2021-02-04 積水メディカル株式会社 Ｓｍｎ１遺伝子の検出又は定量方法
EP4006155A4 (en) * 2019-07-26 2023-08-16 Sekisui Medical Co., Ltd. METHODS FOR DETECTING OR QUANTIFICATION OF SMN1 GENE
CN111172273A (zh) * 2020-01-19 2020-05-19 陕西师范大学 一种smn1基因检测的引物组、试剂盒及检测方法
CN111172273B (zh) * 2020-01-19 2023-05-30 陕西师范大学 一种smn1基因检测的引物组、试剂盒及检测方法
CN114317727A (zh) * 2022-03-03 2022-04-12 上海恩元生物科技有限公司 用于smn基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂及应用
CN116179679A (zh) * 2022-11-07 2023-05-30 嘉检(广州)生物工程技术有限公司 Smn1基因的检测引物对、检测探针以及用于检测脊髓性肌萎缩症的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN103555835B (zh) 2015-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103555835B (zh) 用于sma基因筛查的引物、探针及其使用方法
CN108048548A (zh) 人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量pcr试剂盒
CN105695567B (zh) 一种用于检测胎儿染色体非整倍体的试剂盒、引物和探针序列及检测方法
CN104630368B (zh) 一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒
CN103614477B (zh) 一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量pcr试剂盒
CN101323877B (zh) 检测21号染色体和性染色体数目异常的试剂盒
CN106755399B (zh) 一种i型神经纤维瘤病致病突变基因及基于此突变基因的病因学诊断试剂
CN103451302A (zh) 聋病易感基因线粒体12SrDNA 1555A＞G、1494C＞T突变比例检测试剂盒
CN105950766B (zh) 一种用于检测hla-b*5801等位基因的引物组及试剂盒
CN104087672A (zh) 一种多重实时荧光定量pcr技术快速检测人21号染色体数目的试剂盒
CN106834501A (zh) 与中国儿童肥胖相关的单核苷酸多态性位点及其应用
CN108300788A (zh) 一种用于检测轻型脑外伤的微小核糖核酸组合及其应用
CN111944893B (zh) 与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物及其应用
CN111944894B (zh) 用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断的分子标志物及其应用
CN110592204A (zh) 血清miRNA组合作为分子标记物评估非阻塞性无精症
CN104087671A (zh) 一种用于检测人21号染色体数目的试剂盒
CN103820555A (zh) 一种利用连锁不平衡在家系中筛查Wilson disease基因突变的方法
CN108998528B (zh) 肺癌诊断分子标记物lncRNA LINC00516和试剂盒及其应用
CN113215243A (zh) 一种用于检测slc22a5基因高频致病变异的荧光定量pcr探针引物组和试剂盒
CN103074416B (zh) 一种检测五条染色体数目异常的方法
CN108018351A (zh) 一种与摄入高脂食物所致代谢疾病相关的生物标志物及其应用
CN111041086B (zh) Rpl13基因先天性心脏病易感snp位点及其应用
CN114606311B (zh) SLC39A13基因rs755555位点的应用及其检测引物和探针组合、试剂盒
CN114032297B (zh) 一种与ICP辅助诊断相关的血清/血浆外泌体miRNA标志物及其应用
CN113718025B (zh) 一种基于kasp的用于糖尿病视网膜病变基因检测的snp试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: CENG JIMENG

Free format text: FORMER OWNER: RUIBAO BIO-MEDICINE TECHNOLOGY (XIAMEN) CO., LTD.

Effective date: 20150303

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zeng Jimeng

Inventor after: Zhuang Jianli

Inventor after: Liu Bin

Inventor after: Lai Jinjiao

Inventor after: Guan Zhenqun

Inventor before: Zeng Jimeng

Inventor before: Zhuang Jianli

Inventor before: Liu Bin

Inventor before: Lai Jinjiao

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 361115 XIAMEN, FUJIAN PROVINCE TO: 361102 XIAMEN, FUJIAN PROVINCE

Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: CENG JIMENG ZHUANG JIANLI LIU BIN LAI JINJIAO TO: CENG JIMENG ZHUANG JIANLI LIU BIN LAI JINJIAO GUAN ZHENQUN

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20150303

Address after: 361102 School of pharmacy, Xiangan campus, Xiamen University, Fujian 259, Xiamen, China

Applicant after: Zeng Jimeng

Address before: 301 block D, Jianye Building, industrial zone, torch hi tech Zone (Xiangan), Fujian, Xiamen 361115, China

Applicant before: Rui Bao biological medicine technology (Xiamen) Co., Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150415

Termination date: 20151025

EXPY Termination of patent right or utility model