CN113718025B - 一种基于kasp的用于糖尿病视网膜病变基因检测的snp试剂盒 - Google Patents
一种基于kasp的用于糖尿病视网膜病变基因检测的snp试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，属于医药技术领域。该SNP试剂盒包括一组或多组用于扩增7个基因的7个SNP位点的KASP引物组，所述7个基因的7个SNP位点分别为EDN1基因的RS5370位点、CFH基因的RS800292位点、AGER基因的RS1800625位点、OPG基因的RS3134069位点、IL10基因的RS1800896位点、VEGFA基因的RS2010963位点和RAGE基因的RS2070600位点。本发明可以快速、准确地检测出糖尿病患者的糖尿病视网膜病变，具有特异性强、灵敏度高、准确性强和通量高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，属于医药技术领域。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus，简称DM)是一种慢性内分泌代谢性疾病，以高血糖为主要特征，伴有脂肪、蛋白质代谢紊乱等症状。根据发病机制的不同，糖尿病分为1型、2型、特异型和妊娠糖尿病4类。糖尿病患者长期存在的高血糖会导致全身各组织器官的微血管，包括眼底视网膜上的微血管，变得脆弱。糖尿病引发的视网膜并发症，被称为糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,简称DR)，简称“糖网”，是一类可引起严重视力损害甚至失明的慢性、进展性眼部疾病。我国每年有很多糖尿病患者并发糖尿病视网膜病变而引起视力下降，导致生活质量下降，很多糖尿病患者仅仅因为不能及时随诊观察，导致视力出现不可逆的损害。
SNP(Single Nucleotide Polymorphisms,即单核苷酸多态性)，作为第三代分子标记物，是在基因组上单个核苷酸的变异形成的遗传标记，具有密度高、多态性丰富和二等位基因性等特点。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP位点，在疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试中作为强有力的检测工具。
对糖尿病视网膜病变患者的血清进行SNP检测，筛查致病基因，可以对临床糖尿病病人的早期随访和用药指导提供预测性依据，也能为将来的基因调控表达治疗提供数据支持。传统SNP检测方法，如DNA测序、RFLP、SSCP和ASO等，操作复杂，易出错；Taqman方法、质谱分析、DNA芯片、SNaPshot法等，有高效快速的优点，但需要投入昂贵设备或者高成本的试剂，也难以普及应用
KASP(Kompetitive AlleleSpecific PCR，即竞争性等位基因特异性PCR)技术，是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(Insertions and Deletions，即插入和缺失)，可在广泛的基因组DNA样品中，甚至是一些复杂基因组的DNA样品中，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断，具有高度稳定性与准确性的特点。但KASP分子标记的开发需要综合考虑目的区段DNA变异、多态性等因素，标记开发的成功率较低。
现有技术中，虽然也有糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，但存在如下缺陷：一是涉及检测的基因位点不够全面，检测结果存在偏差；二是没有基于KASP技术，检测周期长，不能进行批量检测。
鉴于此，有必要提供一种基于KASP技术的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，以解决现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，包括一组或多组用于扩增7个基因的7个SNP位点的KASP引物组，所述7个基因的7个SNP位点分别为EDN1基因的RS5370位点、CFH基因的RS800292位点、AGER基因的RS1800625位点、OPG基因的RS3134069位点、IL10基因的RS1800896位点、VEGFA基因的RS2010963位点和RAGE基因的RS2070600位点。
本发明的基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒的原理是：
本发明利用KASP基因研究平台技术，对大量2型糖尿病患者的血清进行基因SNP位点分析，筛查出与糖尿病视网膜病变密切相关的7个基因的7个SNP位点，发现带有上述7个SNP位点之一的2型糖尿病患者，其视网膜病变的发病率明显增加。因此，通过提取糖尿病患者的基因组DNA，进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，检测上述7个SNP位点的突变状况，可以早期诊断和临床预后评价糖尿病视网膜病变。
本发明共采集实验总样本数700例，分为两组，一组为NDR组，一组为PDR组，基因检测使用本发明的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，相较于现有技术，具有基因位点全面、检测结果准确、检测周期短，能批量检测等优点。
本发明的基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒的有益效果是：
1、本发明的基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，可以快速、准确地检测出糖尿病患者的糖尿病视网膜病变，具有特异性强、灵敏度高、准确性强和通量高等优点。
2、本发明的基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，最快可在2小时内得出实验结果，并可进行批量检测，为患者患糖尿病视网膜病变的风险进行评估，并可用于糖尿病视网膜病变的早期诊断和临床预后。
3、本发明的基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，成本低廉，操作容易，检测结果准确可靠，适合规模化推广应用。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述KASP引物组为两条等位基因特异性上游引物和一条通用下游引物，具体序列为：
用于检测RS5370位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
用于检测RS800292位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4-5所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
用于检测RS1800625位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7-8所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
用于检测RS3134069位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10-11所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
用于检测RS1800896位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13-14所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
用于检测RS2010963位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16-17所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
用于检测RS2070600位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19-20所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示。
采用上述进一步的有益效果是：上述KASP引物组，是针对本发明的7个基因的7个SNP位点的侧翼序列设计的，采用Primer 3在线引物软件。
更进一步，所述反向共用引物均有荧光标记。
更进一步，所述荧光标记包括FAM色标记和/或HEX色标记。
进一步，还包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶和dNTPs中的至少一种。
本发明的基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
步骤1：提取患者的组织样本的基因组DNA，-20℃冻存备用；
步骤2：384板每孔KASP反应体系总体积为1.622μL：2×KASP Master Mix，0.8μL；72×KASP assaymix，0.022μL；10ng/μL的步骤1提取得到的基因组DNA，0.8μl；
步骤3：进行KASP反应
阶段1：94℃，预变性15min；
阶段2：94℃，20s，65-57℃，每个循环降0.8℃，1min，共循环10次；
阶段3：94℃，20s，59℃，1min，共循环27次；
步骤4：对PCR扩增产物进行荧光扫描，读取荧光信号。
上述步骤1中，组织样本包括血液、毛发、唾液和脱落细胞中的至少一种。基因组DNA的提取方法包括磁珠法或者Chelex-100法。
上述步骤2中，，KASP assaymix由上游引物1、上游引物2、下游引物和PCR反应缓冲液按体积比为12:12:30:46混合而成。
上述步骤3中，KASP反应在LGC的IntelliQube仪器中进行。
上述步骤4中，聚合在接近X轴的显示红色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示蓝色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示紫色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，显示黑色drop out的样本可能由于DNA质量不好或浓度过低或者为阴性对照，扩增产物没有被明确分型。灰色的样本Indeterminate分群不明显，不便判断。
附图说明
图1为本发明的实施例中，RS5370(G>T)位点的KASP检测分型图。
图2为本发明的实施例中，RS800292(G>A)位点的KASP检测分型图。
图3为本发明的实施例中，RS1800625(A>G)位点的KASP检测分型图。
图4为本发明的实施例中，RS3134069(A>C)位点的KASP检测分型图。
图5为本发明的实施例中，RS1800896(T>C)位点的KASP检测分型图。
图6为本发明的实施例中，RS2010963(C>G)位点的KASP检测分型图。
图7为本发明的实施例中，RS2070600(C>T)位点的KASP检测分型图。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本实施例的基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，包括一组或多组用于扩增7个基因的7个SNP位点的KASP引物组，所述7个基因的7个SNP位点分别为EDN1基因的RS5370位点、CFH基因的RS800292位点、AGER基因的RS1800625位点、OPG基因的RS3134069位点、IL10基因的RS1800896位点、VEGFA基因的RS2010963位点和RAGE基因的RS2070600位点。
所述KASP引物组为两条等位基因特异性上游引物和一条通用下游引物，具体序列为：
用于检测RS5370位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
用于检测RS800292位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4-5所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
用于检测RS1800625位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7-8所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
用于检测RS3134069位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10-11所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
用于检测RS1800896位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13-14所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
用于检测RS2010963位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16-17所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
用于检测RS2070600位点的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19-20所示，反向共用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示。
KASP引物组具体信息如表1所示。
表1KASP引物组
所述反向共用引物均有荧光标记。
所述荧光标记包括FAM色标记和/或HEX色标记。
还包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶和dNTPs中的至少一种。
上述基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
步骤1：DNA提取
采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司。
(1)吸取1ml抗凝血液，加入2ml细胞裂解液CL颠倒混匀，10000rpm离心1min，吸去上清，留取细胞核沉淀，加入200μl缓冲液GS，振荡至彻底悬浮。
(2)加入20μl Proteinase K溶液，混匀。
(3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(5)将步骤(4)所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱CB3放入收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm(13,400×g)离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)重复操作步骤(7)。
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
步骤2：KASP检测
(1)384板每孔PCR反应体系：2×KASP Master Mix，0.8μl；72×KASP assaymix，0.022μl；10ng/μL的基因组DNA模板，0.8μl。
根据要检测的样本数和检测的SNP位点，配置相应的KASP Master Mix和KASPassaymix混匀，转到96孔的2ml深孔板中。KASP assaymix由上游引物1、上游引物2、下游引物和PCR反应缓冲液按体积比为12:12:30:46混合而成。
(2)设置好相应条件，运用LGC的IntelliQube仪器，将PCR板进行密封。
(3)进行KASP反应
阶段1：94℃，预变性15min；
阶段2：94℃，20s，65-57℃，每个循环降0.8℃，1min，共循环10次；
阶段3：94℃，20s，59℃，1min，共循环27次；
(4)对PCR扩增产物进行荧光扫描，读取荧光信号
采用LGC的IntelliQube仪器对PCR扩增产物进行荧光扫描，读取荧光信号，并进行统计学分析，见图1-图7，表1-表7。
表1
表2
表3
表4
表5
表6
表7
上述结果表明：
NDR组与PDR组相比，RS5370位点的TT基因型是DR的易感基因型。NDR组与PDR组相比，RS1800292位点的AA基因型是DR的易感基因型。NDR组与PDR组相比，RS1800625位点的TT基因型是DR的易感基因型。NDR组与PDR组相比，RS3134069位点的TT基因型是DR的易感基因型。
NDR组与PDR组相比，RS1800896位点的TT基因型是DR的保护基因型。
NDR组与PDR组相比，RS2010963位点的GG基因型是DR的易感基因型。
NDR组与PDR组相比，RS2070600位点的TT、CT基因型是DR的保护基因型。
综上，本发明的基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，可以快速、准确地检测出糖尿病患者的糖尿病视网膜病变，具有特异性强、灵敏度高、准确性强和通量高等优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 桂林医学院附属医院
<120> 一种基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tacataacgc tctctggagg gc 42
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tcacataacg ctctctggag gga 43
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttatcttgc tttattaggt cggagac 27
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tctcccttcc tgcataccat tattac 46
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tctcccttcc tgcataccat tattat 46
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctatctata aatgccgccc tg 22
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tacaggagag aaacctgttt ggaa 44
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tacaggagag aaacctgttt ggag 44
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttttttccc tgggtttagt tgag 24
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc ttacgcgctg aacttctgga gta 43
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tcgcgctgaa cttctggagt c 41
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
accctagagc aaagtgccaa ac 22
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc tctcttacct atccctactt cccct 45
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat tctcttacct atccctactt ccccc 45
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cacacaaatc caagacaaca ctactaag 28
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaggtgacc aagttcatgc tcactcactt tgcccctgtc g 41
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaggtcgga gtcaacggat tcactcactt tgcccctgtc c 41
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aagaggtagc aagagctcca gag 23
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaaggtgacc aagttcatgc tcggaaggaa gagggagcc 39
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaaggtcgga gtcaacggat tccggaagga agagggagct 40
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggaaggtcct gtctccccag 20
Claims (4)
1.一种基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，其特征在于，包括用于扩增7个基因的7个SNP位点的KASP引物组，所述7个基因的7个SNP位点分别为EDN1基因的RS5370位点、CFH基因的RS800292位点、AGER基因的RS1800625位点、OPG基因的RS3134069位点、IL10基因的RS1800896位点、VEGFA基因的RS2010963位点和RAGE基因的RS2070600位点；
所述KASP引物组为两条等位基因特异性上游引物和一条通用下游引物，具体序列为：
用于检测RS5370位点的引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示，通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
用于检测RS800292位点的引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4-5所示，通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
用于检测RS1800625位点的引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7-8所示，通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
用于检测RS3134069位点的引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10-11所示，通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
用于检测RS1800896位点的引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13-14所示，通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
用于检测RS2010963位点的引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16-17所示，通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
用于检测RS2070600位点的引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19-20所示，通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示。
2.根据权利要求1所述的基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，其特征在于，所述通用下游引物均有荧光标记。
3.根据权利要求2所述的基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，其特征在于，所述荧光标记包括FAM色标记或HEX色标记。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于KASP的用于糖尿病视网膜病变基因检测的SNP试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶和dNTPs中的至少一种。
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