CN113322317A - 一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组及试剂盒 - Google Patents

一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组及试剂盒。该试剂盒是以人DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增得到扩增曲线，能够快速、准确、灵敏地检测出线粒体tRNA Leu(UUR)3243A>G突变位点。该试剂盒还设置了野生型位点探针，通过突变型和野生型探针Ct值，获得突变型与野生型的相对比例。本发明填补了临床检测tRNA Leu(UUR)3243A>G突变位点的空白，为相关疾病后续的治疗提供及时的辅助性数据。试剂盒重复性好，精密度高。试剂盒检测周期短，最快能45分钟内完成检测，节约检测时间，加快效率，是一种高效的辅助检测手段。在以非诊断目的的应用中，仅将试剂盒和采集样品进行混合用荧光定量PCR仪器即可完成检测，操作要求简单，临床推广性高。

Description

一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组及试 剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组及试剂盒。
背景技术
线粒体病是指由于线粒体的DNA和核DNA的突变或缺失导致的线粒体氧化呼吸链相关蛋白的异常，继而导致的阻碍ATP合成的多脏器功能障碍综合征。线粒体基因突变的类型包括碱基突变、插入、缺失突变、mt DNA拷贝数突变，tRNA Leu(UUR)3243A>G是最常见的线粒体基因突变，通常为母系遗传，但偶有散发突变，可导致一系列从轻到致死性的临床症状，其中之一就是糖尿病。
糖尿病患者tRNA Leu(UUR)3243A>G突变发生率可达50％以上，且1-30％患者的突变是属于遗传获得。tRNA Leu(UUR)3243A>G突变相关糖尿病平均发病年龄为40岁，且I型、II型糖尿病均可出现。除此之外，大量研究还表明，此种突变还可导致其他疾病：①心肌病；②耳聋；③发育迟缓；④认知下降；⑤糖耐量异常；⑥癫痫；⑦胃肠道功能障碍便秘/肠易激综合征；⑧偏头疼；⑨慢性进行性眼外肌麻痹；⑩视网膜病变。
该基因突变在不同地方的人中发病率存在差异，英国东北部的人中该基因突变发生率为7.59/100000，芬兰北部的人中为16.3/100000，澳大利亚的人中发病率为236/100000，且在携带者人群中发生率为1/400。目前国内外相关研究均为对各自队列病人进行临床表型分布特点，范围局限、人种差异、且各研究涵盖范围不完全相同。tRNA Leu(UUR)3243A>G突变的检测方法有传统的PCR酶切法，该方法操作复杂，步骤繁琐。也可采用高通量测序的方法，但价格昂贵；而荧光定量PCR的方法具有操作简单，方便快捷的特点。
相关技术公开了采用荧光定量PCR方法对tRNA Leu(UUR)3243A>G进行了突变位点定量检测，但该方法采用检测体系检测周期较长，不利于临床及时提供检测结果；另一方面，该发明虽然能对突变位点进行相对定量，但并未对将野生型与突变型进行相对定量，只有明确野生型与突变型的相对比例才能更好的为后续干预方案的制定提供更好的指导。
目前我国还没有CFDA批准用于tRNA Leu(UUR)3243A>G突变临床检测的试剂盒。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组及试剂盒。
本发明所采用的技术方案为：一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组，包括针对线粒体肥胖基因tRNA Leu(UUR)3243突变位点的第一引物对和第一探针组，所述第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第一探针组包括第一突变型位点探针和第一野生型位点探针，第一突变型位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；第一野生型位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述第一突变型位点探针的5′端和第一野生型位点探针的5′端均标记有荧光基团；所述第一突变型位点探针的3′端和第一野生型位点探针的3′端均标记有淬灭基团。
作为优选地，所述线粒体肥胖基因tRNA Leu(UUR)3243突变位点为tRNA Leu(UUR)3243A>G(A突变为G)位点；
所述荧光基团包括但不限于FAM、Cy5、ROX、VIC和NED中的任意一种；
所述淬灭基团包括但不限于NFQ、QSY、MGB和BHQ1中的任意一种。
作为优选地，所述第一引物对的引物浓度为50-400nM；可优选为200nM；
所述第一探针组的浓度为50-200nM；可优选为100nM。
一种用于线粒体肥胖基因突变检测的试剂盒，所述试剂盒包括检测液、PCR扩增反应液和对照品。
作为优选地，所述检测液包括权利要求1中所述的第一引物对和第一探针组。
作为优选地，所述PCR扩增反应液包括taq DNA聚合酶、4种dNTP及PCR缓冲液。
作为优选地，所述对照品包括阳性对照品和阴性对照品。
作为优选地，所述阳性对照品为含有线粒体tRNA Leu(UUR)3243G的质粒。
作为优选地，所述阴性对照品为含有线粒体tRNA Leu(UUR)3243A的质粒。
作为优选地，所述试剂盒以人线粒体tRNA Leu(UUR)3243A>G位点在糖尿病中的非诊断目的的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组，是以tRNALeu(UUR)3243A>G位点，以人基因组DNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光定量PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，进而能够快速、准确、灵敏地检测出tRNA Leu(UUR)3243A>G突变位点。
同时，该检测试剂盒还设置了野生型位点探针(A位点)，可以通过比较突变型和野生型探针Ct值，从而计算突变型与野生型的相对比例起到了提示作用。
该检测试剂盒填补了临床检测tRNA Leu(UUR)3243A>G突变位点的空白，为相关疾病后续的治疗提供及时的辅助性数据。实验结果重复性好，精密度高。另外，该试剂盒的检测时间周期短，最快能在45分钟内完成检测，极大的节约了检测时间，加快临床诊断效率，是一种高效的辅助检测手段。
该检测试剂盒在非诊断目的的应用过程中，仅需操作者将扩增反应液、检测液和采集的样品模板进行混合即可上机检测，检测仪器仅依赖于荧光定量PCR仪器，对操作人员的要求极其简单，临床可推广性高。
附图说明
图1是实施例中阴阳性结果分析中阳性检测结果示意图；
图2是实施例中阴阳性结果分析中阴性检测结果示意图。
图中：G-突变型探针信号；A-野生型探针信号。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例：
1、线粒体肥胖基因tRNA Leu(UUR)3243A>G突变位点核酸检测试剂盒(荧光定量PCR)。
本发明建立了一种利用荧光定量PCR技术简便、快速、准确、高通量检测人线粒体tRNA Leu(UUR)3243A>G突变位点引物对、探针组及试剂盒，从而为tRNA Leu(UUR)3243A>G突变的检测提供参考依据，试剂盒保存于-20℃。
试剂盒规格：50人份/盒，具体组分见表1。
表1.试剂盒组分
Figure BDA0003148868780000051
检测液：包括针对tRNA Leu(UUR)3243位点第一引物对、第一探针组和RNase FreeddH2O。
PCR扩增反应液：购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：Q113-02/03。
阳性对照品：含有线粒体tRNA Leu(UUR)3243G位点的质粒。
阴性对照品：含有线粒体tRNA Leu(UUR)3243A位点的质粒。
检测位点及序列陈列表：
Figure BDA0003148868780000052
Figure BDA0003148868780000061
2、试剂盒性能验证
2.1 样本处理
选用企业参考品进行试剂盒性能验证。所有获得样本，利用美基生物核酸提取试剂盒(产品编号：IVD4173)提取来获得DNA，所得DNA样本保存于2-8℃；若样本长时间不适用可保存于-20℃。
2.2 PCR扩增
按下表配置PCR扩增反应液(每个反应20μL)
组分 1个反应体积
检测液 7.5μL
扩增反应液 12.5μL
总体积 20μL
将配置好的PCR扩增反应液按20μL每个反应孔进行分装。将获得的样品DNA、阳性对照品DNA、阴性对照品DNA各5μL加入相应反应孔，上机进行PCR扩增。
2.3 扩增程序：
50℃2min(1个循环)；95℃5min(1个循环)；95℃5sec，60℃15sec，(40个循环)。
选择FAM(Reporter：FAM；Quencher：NFQ-MGB)荧光检测通道检测G位点；选择VIC(Reporter：VIC；Quencher：NFQ-MGB)荧光检测通道检测A位点，Passive reference设置为ROX。荧光数据采集在60℃。
2.4 结果分析：
2.4.1 阴阳性分析
Figure BDA0003148868780000071
Figure BDA0003148868780000081
如图1所示，为阳性检测结果示意图，其FAM荧光通道中扩增曲线呈S型，且Ct≤35时。其中G代表突变型探针信号；A代表野生型探针信号。
如图2所示，为阴性检测结果示意图，F其AM荧光通道中Ct>35或无扩增；VIC荧光通道中扩增曲线呈S型，且Ct≤35时。其中G代表突变型探针信号；A代表野生型探针信号。
2.4.2 相对拷贝数分析
阳性对照品突变型基因与野生型基因间的△Ct值，△Ct＝CtFAM–CtVIC。记为△Cta。
分别计算待测样本突变型基因与野生型△Ct值，△Ct＝CtFAM–CtVIC，记为△Cts。
待测样本靶基因△△Ct＝待测样本靶基因△Cts-△Cta。
待测样本相对表达量(RQ值)＝待测样本目标基因相对拷贝数＝2-△△Ct。
2.5 试剂盒性能：
2.5.1 阳性符合率100％：对企业参考品的阳性样本进行检测，结果均为阳性，阳性符合率为100％。
表2 tRNA Leu(UUR)3243G企业阳性参考品
Figure BDA0003148868780000082
Figure BDA0003148868780000091
2.5.2 阴性符合率100％：对企业参考品中的含有tRNA Leu(UUR)3243A序列的临床血液DNA样本进行检测，检测结果为阴性，符合率100％。
表3 tRNA Leu(UUR)3243突变企业阴性参考品
Figure BDA0003148868780000092
2.5.3 重复性实验：检测20ng/μL的P1和P2，各重复检测10次，CV≤5％。
2.5.4 最低检出限：本试剂盒最低检测限为5ng/μL。
本试剂盒对稀释至不低于5ng/μL的P1和P2，检测结果均为阳性。
实验例：对50份临床样本检测。
1、样本处理
获得10名糖尿病及40名健康人受检者血液样本，样本来源于某医院采集所得。
样本获得要点：采用紫色头盖管(含有乙二胺四乙酸以及盐的采血管)采集静脉血，采集后4℃保存备用。
每份样本取200μL，按照美基生物核酸提取试剂盒(产品编号：IVD4173)进行核酸提取DNA待用。
2、PCR扩增
按下表配置PCR扩增反应液(每个反应20μL)
组分 1个反应体积 60
检测液 7.5μL 450μL
扩增反应液 12.5μL 750μL
总体积 20μL 1200μL
将配置好的PCR扩增反应液液按20μL每个反应孔进行分装。将已处理样本DNA、阳性对照品DNA、阴性对照品DNA各5μL加入相应反应孔，上机进行PCR扩增。
3、扩增程序：
50℃ 2min(1个循环)；95℃ 5min(1个循环)；95℃ 5sec，60℃ 15sec，(40个循环)。
选择FAM(Reporter：FAM；Quencher：NFQ-MGB)荧光检测通道检测G位点；选择VIC(Reporter：VIC；Quencher：NFQ-MGB)荧光检测通道检测A位点，Passive reference设置为ROX。荧光数据采集在60℃。
3.4 结果分析：
50例临床样本tRNA Leu(UUR)3243位点荧光定量PCR检测结果
Figure BDA0003148868780000101
Figure BDA0003148868780000111
Figure BDA0003148868780000121
Figure BDA0003148868780000131
备注：上述UD代表无信号，未检出。
由上表可以得出检测结果：最终试剂盒检测结果显示其中5例阳性，45例阴性。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京华诺奥美基因生物科技有限公司
<120> 一种用于线粒体核酸检测的引物对和探针组及其试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 3243位点第一上游引物核苷酸序列
<400> 1
ccacccaaga acagggtttg 20
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> 3243位点第一下游引物核苷酸序列
<400> 2
tatgttgtta agaagaggaa ttgaacct 28
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> 3243 G突变位点，5'端标记荧光基团FAM，3'端标记淬灭基团NFQ
<400> 3
taagatggca gggcc 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> 3243 A突变位点，5'端标记荧光基团VIC，3'端标记淬灭基团NFQ
<400> 4
tggcagagcc cggta 15
<210> 5
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(501)
<223> tRNA Leu(UUR)3243位点 核苷酸序列
<400> 5
gttggatcag gacatcccga tggtgcagcc gctattaaag gttcgtttgt tcaacgatta 60
aagtcctacg tgatctgagt tcagaccgga gtaatccagg tcggtttcta tctacttcaa 120
attcctccct gtacgaaagg acaagagaaa taaggcctac ttcacaaagc gccttccccc 180
gtaaatgata tcatctcaac ttagtattat acccacaccc acccaagaac agggtttgtt 240
aagatggcag agcccggtaa tcgcataaaa cttaaaactt tacagtcaga ggttcaattc 300
ctcttcttaa caacataccc atggccaacc tcctactcct cattgtaccc attctaatcg 360
caatggcatt cctaatgctt accgaacgaa aaattctagg ctatatacaa ctacgcaaag 420
gccccaacgt tgtaggcccc tacgggctac tacaaccctt cgctgacgcc ataaaactct 480
tcaccaaaga gcccctaaaa c 501

Claims (10)

1.一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组，其特征在于，包括针对线粒体肥胖基因tRNA Leu(UUR)3243突变位点的第一引物对和第一探针组，所述第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第一探针组包括第一突变型位点探针和第一野生型位点探针，第一突变型位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；第一野生型位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述第一突变型位点探针的5′端和第一野生型位点探针的5′端均标记有荧光基团；所述第一突变型位点探针的3′端和第一野生型位点探针的3′端均标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组，其特征在于，所述线粒体肥胖基因tRNA Leu(UUR)3243突变位点为tRNA Leu(UUR)3243A>G位点；
所述荧光基团包括FAM、Cy5、ROX、VIC和NED中的任意一种；
所述淬灭基团包括NFQ、QSY、MGB和BHQ1中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种用于线粒体肥胖基因突变检测的引物对和探针组，其特征在于，所述第一引物对的引物浓度为50-400nM；
所述第一探针组的浓度为50-200nM。
4.一种用于线粒体肥胖基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测液、PCR扩增反应液和对照品。
5.根据权利要求4所述的一种用于线粒体肥胖基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述检测液包括权利要求1中的第一引物对和第一探针组。
6.根据权利要求4所述的一种用于线粒体肥胖基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应液包括taq DNA聚合酶、4种dNTP及PCR缓冲液。
7.根据权利要求4所述的一种用于线粒体肥胖基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述对照品包括阳性对照品和阴性对照品。
8.根据权利要求7所述的一种用于线粒体肥胖基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有线粒体tRNA Leu(UUR)3243 G的质粒。
9.根据权利要求7所述的一种用于线粒体肥胖基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述所述阴性对照品为含有线粒体tRNA Leu(UUR)3243 A的质粒。
10.根据权利要求4所述的一种用于线粒体肥胖基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以人线粒体tRNA Leu(UUR)3243 A>G位点在糖尿病中的非诊断目的的应用。
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李 颖等: "广西地区妊娠期糖尿病患者所生新生儿线粒体tRNALeu（UUR）基因3243位点突变的研究", 《中国临床新医学》 *

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CN114085903A (zh) * 2022-01-19 2022-02-25 广州嘉检医学检测有限公司 检测线粒体3243a＞g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法
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