CN113913512A - 一种用于检测脊髓肌萎缩症相关基因的引物探针组合物及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测脊髓肌萎缩症相关基因的引物探针组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测SMN1和SMN2基因拷贝数的引物探针组合物以及相关试剂盒，所述引物探针组合物包含SEQ ID NO:1～2所示的探针和SEQ ID NO:4～7所示的引物。本发明的引物探针组合物是针对中国人特有序列设计，具有更高的特异性，结果准确，操作简便。

Description

一种用于检测脊髓肌萎缩症相关基因的引物探针组合物及试 剂盒
技术领域
本发明属于生物技术及临床分子诊断领域，具体涉及脊髓性肌萎缩症的检测。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是儿童最常见的神经肌肉病，以脊髓前角α运动神经元退化变性导致的肌无力和肌萎缩为主要临床特征，主要表现为进行性、对称性四肢和躯干的肌无力，近端重于远端，下肢重于上肢，有时可见舌肌纤颤、手震颤；临床检测包括血肌酶谱、肌酸激酶(CK)值正常或轻度升高，绝大多数患者不超过正常值的10倍，肌电图提示神经源性损害。SMA发病率约为1/10000，人群携带率为1/50。
SMA为常染色体隐性遗传病，致病基因为SMN1，修饰基因为SMN2，SMN1决定疾病的发生，SMN2影响疾病的严重程度和进展。SMA突变基因型95％由SMN1双等位基因纯合缺失所致，由于SMN1基因外显子8位于非编码区，SMN1缺失通常指外显子7缺失。SMN2拷贝数是目前公认的SMA修饰因子，患者携带SMN2拷贝数越多表型越轻；尽管其与表型的相关性不完全一致，在国内外管理共识中仍将SMN2拷贝数作为SMA诊断的标准步骤之一。SMA基因诊断的主要目标基因为SMN1和SMN2，其中SMN1拷贝数和致病性变异的检测结果用于疾病诊断或排除诊断，SMN2拷贝数的检测结果作为患者诊断后的治疗、临床管理和预后评估的参考指标。
目前SMA相关基因SMN1和SMN2拷贝数变异检测主要通过多重连接探针扩增法(MLPA)和荧光定量PCR法进行检测。
MLPA方法针对SMN1与SMN2基因第7和第8外显子碱基差异位点(c.840位点C/T和c.*239位点G/A)设计杂交位点(c.840位点C/T和c.*239位点G/A)设计杂交探针，采用其他染色体位点的多个管家基因作为内参基因，以SMN1∶SMN2不同拷贝数的样本作为平行对照，在完成杂交连接等系列反应后，根据荧光峰面积的比值比来判断目标基因序列的拷贝数。MLPA技术通过直接检测SMN1拷贝数，明确区分患者、携带者及正常人；还可同时检测患者的SMN2拷贝数，是目前国内外SMA管理共识推荐使用诊患者、携带者及正常拷贝数，是目前国内诊断SMA的金标准。虽然MLPA技术特异性好，临床应用较为成熟，但其对设备要求高(需要高成本的基因分析仪)、成本高(仅MLPA试剂盒中的试剂每孔的成本高于100元)、操作步骤多(一般需要四步操作，变性-杂交-连接-扩增)、检测周期长(48小时以上)，限制了该技术的进一步推广应用。
荧光定量PCR：主要原理是通过多重实时荧光定量PCR反应，以管家基因序列为内参，采用Taqman探针法分别对SMN1基因进行拷贝数相对定量，来判断是否发生缺失变异。该方法优势是操作简便(仅需要一步扩增)、成本低廉(每个标本的成本低于40元)检测周期短(4小时之内出结果)，适用于人群筛查。目前在国内仅有一家相关基因的检测，但是仅有SMN1基因拷贝数的检测，尚无SMN2基因拷贝数检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种针对SMN1基因(NCBI Gene ID:6606)7号外显子和SMN2基因(NCBI Gene ID:6607)7号外显子缺失(拷贝数变化)检测的特异性引物和探针，采用该核酸组合与相应的Taqman探针混合进行多重荧光PCR检测的方法；通过检测荧光信号的有无或强弱，通过相对定量的计算方法判断相应的基因拷贝数是否存在缺失(拷贝数变化)，具有较高的灵敏度和较强的特异性。
为实现本发明的目标，在第一个方面，本发明提供一种检测SMN1和SMN2基因拷贝数的引物探针组合物，其包含SEQ ID NO:1～2所示的探针和SEQ ID NO:4～7所示的引物。
Figure BDA0003386255850000021
注：RPP30,Gene ID:10556。
优选地，所述引物探针组合物还包括针对内参基因的探针和引物，其中，所述探针的序列如SEQ ID NO:3所示，所述引物的序列如SEQ ID NO:8和9所示。
优选地，所述探针具有5’修饰和3’修饰，其中，SEQ ID NO:1的探针具有5’-FAM修饰和3’-BQ1修饰，SEQ ID NO:2的探针具有5’-FAM修饰和3’-BQ1修饰，SEQ ID NO:3的探针具有5’-HEX修饰和3’-BQ1修饰。
在第二个方面，本发明提供一种检测SMN1和SMN2基因拷贝数的试剂盒，包括本发明的引物探针组合物。
优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增用Taq酶、镁离子和dNTP混合液。
在第三个方面，提供本发明的引物探针组合物或试剂盒在检测SMN1和SMN2基因拷贝数中的应用。
在第四个方面，提供一种检测SMN1和SMN2基因拷贝数的方法，包括使用本发明的引物探针组合物或试剂盒。
优选地，所述方法的扩增过程为：95℃2min，变性；95℃15S、60℃30S，40个循环；40℃冷退。
本发明的引物探针组合物是针对中国人特有序列设计，具有更高的特异性，避免了假阳性假阴性的出现，能简便、有效地检测SMN1和SMN2基因拷贝数是否存在缺失突变，为临床医生能明确患者的基因型及变异的致病性等提供依据，以解释患者的临床表现，确认遗传学诊断的有效性，使得对患者及时进行临床分型及病情评估，解释疾病的发生发展，开展药物治疗、多学科管理和定期随访。
具体实施方式
以下将通过具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明的内容不限于此。
以下实施例中，如无特别说明，使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购的方式获得；使用的实验方法也为本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例的内容可以毫无疑问地实施所述方案并获得相应的结果。
实施例
材料与样本：
1、样本的来源；
本实施例中使用的样本为申请人进行SMA携带者筛查的血样样本，样本捐赠人已经签过知情同意书。
2、实验方法；
2.1 PCR扩增体系的配置(20μl体系)：
10μl Mix(2×)：包含Taq酶、Mg2+、dNTP混合液等扩增液；
2μl(每种基因的引物和探针共1μl，具体浓度为正反引物各5μM+1.25μM探针)
1μl DNA模板(20ng-40ng，提取自血样样本)
7μl H2O
2.2 PCR扩增
变性：95℃2min；
退火及延伸：95℃15S，60℃30S(荧光收集)，40个循环；
冷退：40℃。
2.3设置内参
正常未见缺失的标本为内参标本，RPP30基因为内参基因，阈值ABI7500，40000。根据CT值进行ΔΔCt法计算相对拷贝数，其中：①每次试验均含有正常对照标本、杂合缺失标本和纯合缺失标本作为参照；②拷贝数小于0.1为纯合缺失，拷贝数在0.3-0.7为杂合缺失，拷贝数大约0.8为未见缺失。如果拷贝数在0.1-0.3和0.7-0.8之间认为是灰度区间，需要重新检测。
3.现有技术对照
利用上海五色石医学科技有限公司生产的运动神经元存活基因1(SMN1)外显子缺失检测试剂盒(荧光定量PCR法)和MRC Holland公司的MLPA(P060)作为对照实验。
4.实验内容
利用本发明技术进行了100例标本检测，其结果与上海五色石医学科技有限公司生产的运动神经元存活基因1(SMN1)外显子缺失检测试剂盒(荧光定量PCR法)结果完全一致。但五色石试剂盒不包括SMN2基因外显子7，无法对该基因外显子7进行检测。
进一步做了29例MLPA样本检测，与本专利检测结果完全一致(包含SMN1基因外显子7和SMN2基因外显子7)，具体结果见表1。MLPA试剂盒成本高、操作复杂、检测时间长；而本发明方法基于荧光定量PCR技术，成本低、检测时间更短。
5.结果复核
如果本发明检测结果与目前成品试剂盒检测结果不一致时，需要重新进行检测(同一标本3个不同浓度模板)，以确定是否为检测失效。同时应用第三种或第四种不同方法进行检测，综合分析其结果。目前已经做的检测尚未存在与当前成品试剂盒检测结果不一致情况。
表1：本方法部分实验结果与其他方法比对的结果汇总：
Figure BDA0003386255850000051

Claims (8)

1.一种检测SMN1和SMN2基因拷贝数的引物探针组合物，其包含SEQ ID NO:1～2所示的探针和SEQ ID NO:4～7所示的引物。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其中，还包括针对内参基因的探针和引物，其中，所述内参基因的探针的序列如SEQ ID NO:3所示，所述内参基因的引物的序列如SEQID NO:8和9所示。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其中，所述探针具有5’修饰和3’修饰，其中，SEQ ID NO:1的探针具有5’-FAM修饰和3’-BQ1修饰，SEQ ID NO:2的探针具有5’-FAM修饰和3’-BQ1修饰，SEQ ID NO:3的探针具有5’-HEX修饰和3’-BQ1修饰。
4.一种检测SMN1和SMN2基因拷贝数的试剂盒，包括权利要求1～3任一项所述的引物探针组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括PCR扩增用Taq酶、镁离子和dNTP混合液。
6.权利要求1～3任一项所述的引物探针组合物或权利要求4或5所述的试剂盒在检测SMN1和SMN2基因拷贝数中的应用。
7.一种检测SMN1和SMN2基因拷贝数的方法，包括使用权利要求1～3任一项所述的引物探针组合物或权利要求4或5所述的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述方法的扩增过程为：95℃2min，变性；95℃15S、60℃30S，40个循环；40℃冷退。
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