CN113265461B - 一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组及试剂盒 - Google Patents
一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组及试剂盒 Download PDFInfo
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明属于生物检测技术领域，公开了一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组及试剂盒。该试剂盒可以方便快捷辅助医生对患者进行诊断时提供科学数据或对携带者筛查提供数据支撑，有助于医生对患者进行尽快的确诊，或者在备孕阶段提前预知生育风险。其是针对遗传物质DNA/RNA进行检测的手段，准确度高，假阳性率低，成本低，结果判读简单，有效降低克拉伯病患儿的出生率。该反应体系等位基因之间的扩增效率差异最大化，适用于Ct值判读，也适用终点法判读；耗时较短，准确性高。可用于快速、准确地检测人全血样本中GALC基因NM_000153转录本上c.1901T>C致病变异，用于克拉伯病的辅助诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组及试剂盒。
背景技术
Krabbe病(Krabbe disease，又称球形细胞白质营养不良)是一种严重的神经系统疾病。该病也被归为白质营养不良疾病的一种。这种疾病通常是由于神经系统的脱髓鞘引起的。髓鞘是神经细胞周围的保护层，确保神经信号的有效传递。Krabbe病的特征还包括大脑中出现球状细胞，这种细胞体型较大，通常有不止一个细胞核。
Krabbe病最常见的形式为婴儿型，通常在1岁之前开始。最初的体征和症状通常包括易怒、肌肉无力、进食困难、没有任何感染迹象的发烧、姿势僵硬以及智力和身体的发育迟缓。随着疾病的发展，肌肉持续减弱，影响婴儿的活动、咀嚼、吞咽和呼吸能力。患儿还会出现视力丧失和癫痫发作。婴儿型的Krabbe病患者很少能活到2岁以上。迟发型的Krabbe病较为少见，起病于儿童、青春期或成年期。最常见的初始病症包括视力问题和行走困难。然而，患者间的体征和症状有很大的不同。迟发型Krabbe病患者可以会在起病后存活较长时间。Krabbe病通常由GALC基因突变引起。该基因编码半乳糖神经酰胺酶，这种酶负责分解半乳糖脂，其中就包括半乳糖基神经酰胺，是髓鞘的重要组成部分。它的代谢在人体内终生持续发生，属于髓鞘正常周转的一部分。另一种半乳糖脂称为心磷脂，是生产髓鞘过程中的副产物。如果不被半乳糖基神经酰胺酶分解，可以引起神经毒性。
GALC基因的致病变异严重降低了(甚至消除了)半乳糖神经酰胺酶的活性。在患者体内，半乳糖基神经酰胺和精神肽不能被及时分解。过量的半乳糖神经酰胺聚集在某些细胞中，形成了球状细胞。这些半乳糖脂的积聚会对髓鞘形成细胞造成损害，从而损害髓鞘的形成，并导致神经系统的脱髓鞘。如果没有髓鞘，大脑和身体其他部位的神经就不能正常传递信号，从而导致Krabbe病的症状和体征。
Krabbe病为常染色体隐性遗传疾病，这意味着患者每个细胞中的一对等位基因都存在致病变异。患有常染色体隐性遗传病的患者父母每人携带一个带有致病变异的等位基因。但他们(即携带者)通常不会表现出这种疾病的迹象和症状。在美国，Krabbe病的发病率大约为十万分之一。以色列地区少数与世隔绝的社区报告的发病率较高，可以达到千分之六。在中国，该病目前缺乏流行病学调查。本实验室在郑州采集了388例健康备孕人群的DNA，发现致病变异位点c.1901T>C的携带率为(3.09％，12/388)，以此推算Krabbe病的理论发病率约为23.9/10万，显著高于目前文献报道的发病率。综合其他致病位点，克拉伯病在中国的真实发病率必然远高于目前的文献报道。由于Krabbe病患者90％以上在两岁前夭折，因此临床实际观察到的发病率必然明显偏低。
目前国内外对于克拉伯病的筛查方法有全基因组Sanger测序、NGS、MLPA、酶活性检测和临床检查。其中临床检查包括：婴儿期鞘氨醇半乳糖苷水平检测、神经影像学诊断(MRI)、脑髓液蛋白浓度检测。但是，全基因的测序费用过高，酶活性检测以及其他临床检查需要时间较久，采样或操作困难、无法用于携带者筛查，很难满足目前临床实际需求。
建立快速、准确的检测克拉伯病的方法具有重要意义。克拉伯病属于溶酶体储蓄症的一种，结合国内情况，该类疾病的患者需要极其高昂的治疗费用，且预后较差，需要终身使用各类药物。
目前为止，国内关于Krabbe病的报道大多数为病例个案报道，且文献可查的病例数少于50例，其中多个病例携带c.1901T>C变异位点。目前，还没有专门针对该变异位点的荧光定量PCR引物、探针和试剂盒。针对该变异位点进行筛查，可在产前有效提示携带者风险，极大的降低Krabbe病患儿的出生率。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组及试剂盒。
本发明所采用的技术方案为：一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组，包括针对高频GALC基因致病变异位点的第一正链引物组、第一反链引物组、第二引物组和第一正链探针组、第一反链探针组；
其中，第一正链引物组包括三组正链引物对，每一组正链引物对包括一条上游引物和一条下游引物，分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示；
第一反链引物组包括五组反链引物对，每一组反链引物对包括一条上游引物和一条下游引物，分别如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.16所示；
第二引物组包括五组引物对，每一组引物对包括一条上游引物和一条下游引物，分别如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.26所示；
第一正链探针组包括两条正链探针，分别如SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.28所示；
第一反链探针组包括七条正链探针，分别如SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.35所示。
作为优选地，所述高频GALC基因致病变异位点为NM_000153:exon16:c.1901T>C(T变异为C)变异位点。
作为优选地，所述第一正链探针组和第一反链探针组5′端均标记有荧光基团，3′端均标记有淬灭基团。
作为优选地，所述荧光基团包括但不限于FAM、Cy5、ROX、VIC和NED中的任意一种；
所述淬灭基团包括但不限于QSY、MGB和BHQ1中的任意一种。
一种用于检测高频基因致病变异的试剂盒，所述试剂盒包括检测液、DNA聚合酶、dNTPs、qPCR缓冲液、ROX参比荧光染料、空白对照品和阳性对照品。
作为优选地，所述检测液包括权利要求1中的第一正链引物组、第一反链引物组、第二引物组和第一正链探针组、第一反链探针组。
作为优选地，所述空白对照品为RNase-freeddH2O。
作为优选地，所述阳性对照品为人基因组DNA样本。
作为优选地，所述检测液装量为2.2uL；所述qPCR缓冲液装量为10uL。
作为优选地，所述试剂盒在辅助检测高频GALC基因位点变异致克拉伯病中的非诊断目的的应用。
本发明的有益效果为：
(一)本发明提供了一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组及试剂盒。该试剂盒包含适用于高频位点(GALC:NM_000153:exon16:c.1901T>C:p.L634S)的特异性引物组/探针组，适用于高GC序列的高效DNA聚合酶、特定比例的dNTPs、适用于高GC序列的缓冲液体系、ROX参比荧光染料。该试剂盒可以方便快捷的应用于辅助医生对患者进行诊断时提供科学数据或对携带者筛查提供数据支撑，有助于医生对患者进行尽快的确诊，或者在备孕阶段提前预知生育风险。该试剂盒基于Taqman探针的荧光定量PCR法，其优点是针对遗传物质DNA/RNA进行检测的手段，准确度较高，假阳性率较低，成本低廉，不需要高端仪器，结果判读简单，有助于进行普遍筛查，降低克拉伯病患儿的出生率。
(二)该发明设计反应体系可以使用人基因组DNA溶液作为模板，也可以使用未溶血的全血作为模板直接检测，省去了DNA提取的过程，提高了检测工作人员的工作效率。
(三)该反应体系的特异性引物组/探针组经过优化，等位基因之间的扩增效率差异达到最大化，使检测工作人员可以方便准确的解读结果，不需要进行内参基因的比对或使用delta-delta-Ct法进行计算分析；该反应体系即适用于Ct值的判读，也可以使用终点法进行判读；相较于NGS和其他检测手段，荧光定量PCR的成本低廉，耗时较短，准确性得到公认，适合在临床推广。
(四)可用于快速、准确地体外检测人全血样本中GALC基因NM_000153转录本上的c.1901T>C致病变异。检测结果用于克拉伯病(Krabbe disease)的辅助诊断。该变异的致病性明确，且在正常人群中携带率较高(3.09％，12/388)。
附图说明
图1是当使用野生型DNA作模板，log对数曲线实验结果示意图；
图2是当使用野生型DNA作模板，Linear线性扩增曲线实验结果示意图；
图3是当使用杂合型DNA作模板，log对数曲线实验结果示意图；
图4是当使用杂合型DNA作模板，Linear线性扩增曲线实验结果示意图；
图5是当使用合成的纯合突变DNA作模板，log对数曲线实验结果示意图；
图6是当使用合成的纯合突变DNA作模板，Linear线性扩增曲线实验结果示意图；
图7是当使用终点法进行SNP分型实验结果示意图。
图中：F-FAM探针通道；V-VIC探针通道。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例：
该试剂盒是用于检测高频基因位点(GALC:NM_000153:exon16:c.1901T>C:p.L634S)致病变异的特异性引物/探针群，适用于高GC序列的高效DNA聚合酶、特定比例的dNTPs、适用于高GC序列的缓冲液体系、ROX参比荧光染料、空白对照和阳性对照品。
检测位点及其引物组核苷酸序列陈列表1：
上述引物和探针均为自主设计，通过调整具体的设计参数，均可以对检测位点进行有效的区分。上述各引物序列均为针对高频GALC基因位点的具有检测意义的核苷酸序列。
引物序列温度的设置，决定了PCR反应时的延伸温度。过高或过低都会对PCR反应产生不利影响。
上述第一正链引物组的引物对是基于DNA正链设计的引物；第一反链引物组的引物对是基于DNA反链设计的引物。
第一反链引物组第四上游引物和第一反链引物组第五上游引物核苷酸序列均对应第一反链引物组第四下游引物核苷酸序列，设计了两条上游引物的目的是为了提高检出率，所设计的多条引物均具有其设计意义及效果。
第二引物组第三上游引物分别对应第三下游引物、第四下游引物和第五下游引物，设计多条下游引物，均是为了提高检出率，所设计的多条引物均具有其设计意义及效果。
检测位点及其探针组核苷酸序列陈列表2：
试剂配置：
| 组分 | 体积uL | 终浓度(μM) |
| primer F(10μM) | 1.8 | 0.9 |
| primer R(10μM) | 1.8 | 0.9 |
| TaqMan Probe 1(10μM) | 0.4 | 0.2 |
| TaqMan Probe 2(10μM) | 0.4 | 0.2 |
| qPCR反应缓冲液 | 10 | - |
| 模板(DNA溶液) | 2 | - |
| RNase-free ddH2O | 3.6 | - |
| total volume | 20 | - |
扩增程序：
试剂盒结果：
当使用GALC基因NM_000153:exon16:c.1901T>C变异位点携带者DNA作为模板时，可以观察到FAM和VIC双通道都出现了明显的S型扩增曲线，且FAM通道和VIC通道的Ct值差距不大于1.0；当使用野生型DNA作为模板时，可以观察到VIC通道出现明显的S型扩增曲线，且FAM通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于3.0；纯合突变的患者DNA作为模板时，可以观察到FAM通道出现明显的S型扩增曲线，且VIC通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于3.0。
实验例：
1、当使用野生型DNA作为模板时：
以上表格中样本(111001139725、111001139717、111001139700、111001152842、111001139720、111001155336)为野生型人基因组DNA，FAM和VIC信号的阈值线设置为0.1，阈值线0.1以下为背景信号，不具备参考意义。
由上表和如图1所示的log对数曲线实验结果示意图可知，VIC信号的平均Ct值为23.42，标准差为0.08；而FAM信号的平均Ct值为41.60，标准差为0.86；且三个样本的FAM信号Ct值为undetermined。
Linear线性扩增曲线实验结果如图2所示。图2结果体现出，linear曲线中几乎观测不到FAM通道的扩增曲线。且FAM和VIC信号之间的Ct值差距均在17以上。
2、当使用杂合型DNA作为模板时：
样本111001148086，111001155278，111001155333，111001148162，111001155335和111001154688均来自于GALC基因变异位点c.1901T>C的携带者。FAM和VIC信号的阈值线设置为0.1，阈值线0.1以下为背景信号，不具备参考意义。由上表和如图3所示的log对数曲线实验结果示意图可知，VIC信号的平均Ct值为26.90，标准差为0.12；而FAM信号的平均Ct值为26.10，标准差为0.18；六名携带者的两等位基因之间的Ct值差异均小于1.0。
Linear线性扩增曲线实验结果如图4所示。图4结果体现出：当检测携带者DNA时，FAM和VIC通道均有明显的S型扩增曲线。
3、当使用合成的纯合突变DNA片段作为模板时：
样本GALC-HOMO-01至GALC-HOMO-05为人工合成的GALC基因片段，并且带有纯合突变的c.1901T>C变异位点，FAM信号和VIC信号的阈值线设置为0.1，阈值线0.1以下为背景信号，不具备参考意义。
由上表和如图5所示的log对数曲线实验结果示意图可知，VIC信号的平均Ct值为26.25，标准差为0.27；而FAM信号的平均Ct值为22.18，标准差为0.34。由于本实验中的样本为人工合成的短片段DNA，GALC等位基因的拷贝数远高于等浓度基因组DNA中的拷贝数。因此如图6所示的Linear线性扩增曲线实验结果示意图显示，VIC基因仍然会有微弱的扩增曲线，但两个等位基因之间的Ct差仍然大于3.7。在使用患者基因组DNA时，VIC信号会被进一步的抑制。在扩增终点，FAM信号明显高于VIC信号十倍以上，不会影响结果的判读。
4、当使用终点法进行SNP分型时：
由上表和终点法实验结果如图7所示的可知，根据终点法判定的SNP和样本基因型完全一致，符合率为100％。图7中的圈不具有任何意义，是用于表示圈内数据为同一组数据。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京华诺奥美医学检验实验室有限公司
<120> 一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组及试剂盒
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> PP-F3 第二引物组第三上游引物核苷酸序列
<400> 21
atatgcttta ggacgtgttg aagttac 27
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> PP-R3 第二引物组第三下游引物核苷酸序列
<400> 22
tccagactcc aatcagcaat actt 24
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> PP-F3 第二引物组第三上游引物核苷酸序列
<400> 23
atatgcttta ggacgtgttg aagttac 27
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> PP-R4 第二引物组第四下游引物核苷酸序列
<400> 24
tttacctcca gactccaatc agc 23
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> PP-F3 第二引物组第三上游引物核苷酸序列
<400> 25
atatgcttta ggacgtgttg aagttac 27
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> PP-R5 第二引物组第五下游引物核苷酸序列
<400> 26
ggttctcaca taggttaccc tcaca 25
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> GALC-AG-1位点 第一正链探针组核苷酸序列 5'端标记荧光基团FAM，3'端标记淬灭基团MGB
<400> 27
taatagttga cgtgagtgta ta 22
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> GALC-AG-2位点 第一正链探针组核苷酸序列 5'端标记荧光基团VIC，3'端标记淬灭基团MGB
<400> 28
cttaatagtt aacgtgagtg tat 23
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> GALC-TC-1位点 第一反链探针组核苷酸序列 5'端标记荧光基团FAM，3'端标记淬灭基团MGB
<400> 29
cactcacgtc aactat 16
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> GALC-TC-2位点 第一反链探针组核苷酸序列 5'端标记荧光基团VIC，3'端标记淬灭基团MGB
<400> 30
atacactcac gtcaact 17
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> GALC-TC-3位点 第一反链探针组核苷酸序列 5'端标记荧光基团FAM，3'端标记淬灭基团MGB
<400> 31
actcacgtca actat 15
<210> 32
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> GALC-TC-4位点 第一反链探针组核苷酸序列 5'端标记荧光基团FAM，3'端标记淬灭基团MGB
<400> 32
actcacgtca actat 15
<210> 33
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(33)
<223> GALC-TC-5位点 第一反链探针组核苷酸序列 5'端标记荧光基团FAM，3'端标记淬灭基团MGB
<400> 33
ctcacgtcaa ctatt 15
<210> 34
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> GALC-TC-3v位点 第一反链探针组核苷酸序列 5'端标记荧光基团VIC，3'端标记淬灭基团MGB
<400> 34
actcacgtta actat 15
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> GALC-TC-4v位点 第一反链探针组核苷酸序列 5'端标记荧光基团VIC，3'端标记淬灭基团MGB
<400> 35
ctcacgttaa ctatt 15
Claims (6)
1.一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组，其特征在于，包括针对高频GALC基因致病变异位点的第一正链引物组、第一反链引物组、第二引物组和第一正链探针组、第一反链探针组；
其中，第一正链引物组包括三组正链引物对，每一组正链引物对包括一条上游引物和一条下游引物，分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示；
第一反链引物组包括五组反链引物对，每一组反链引物对包括一条上游引物和一条下游引物，分别如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.16所示；
第二引物组包括五组引物对，每一组引物对包括一条上游引物和一条下游引物，分别如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.26所示；
第一正链探针组包括两条正链探针，分别如SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.28所示；第一反链探针组包括七条正链探针，分别如SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.35所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组，其特征在于，所述高频GALC基因致病变异位点为NM_000153:exon16:c.1901T>C变异位点。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组，其特征在于，所述第一正链探针组和第一反链探针组5′端均标记有荧光基团，3′端均标记有淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、Cy5、ROX、VIC和NED中的任意一种；所述淬灭基团包括QSY、MGB和BHQ1中的任意一种。
5.一种用于检测高频基因致病变异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测液、DNA聚合酶、dNTPs、qPCR缓冲液、ROX参比荧光染料、空白对照品和阳性对照品；
所述检测液包括权利要求1中的第一正链引物组、第一反链引物组、第二引物组和第一正链探针组、第一反链探针组；
所述空白对照品为RNase-freeddH2O；
所述阳性对照品为人基因组DNA样本；
所述检测液装量为2.2uL；所述qPCR缓冲液装量为10uL。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测高频基因致病变异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在辅助检测高频GALC基因位点变异致克拉伯病中的非诊断目的的应用。
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110750370.7A CN113265461B (zh) | 2021-07-02 | 2021-07-02 | 一种用于检测高频基因致病变异的引物组和探针组及试剂盒 |
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