JP2006508632A - 遺伝子疾患の検出法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年3月11日に出願された米国特許出願第10/093,618号明細書、および2002年3月1日および2002年3月8日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第60/360,232号明細書および米国仮特許出願第60/378,354号明細書に対する優先権を主張する。これらの出願内容は参照として本願明細書にその全体が組み込まれている。
発明の分野
本発明は、染色体異常および突然変異を含む遺伝子疾患の検出法に関する。本発明は、胎児のDNA配列決定のための迅速で非侵襲的な方法を提供する。本法は、転座、トランスバージョン、モノソミー、トリソミーおよび他のアニュオプロディズ、欠失、付加、増幅、転座、および再配列を含む胎児における染色体異常の検出に特に有用である。
染色体異常は、ヒトにおける出生時遺伝子欠損の原因としてかなりの割合を占めている。ヒトの細胞核は、46個の染色体を含有しているが、これらが遺伝的指令を含み、また細胞の働きを決定している。46個の染色体のうちの半分は一方の親に由来する。正常な男性では互いに全く異なっている性染色体を除いて、母親からの染色体と父親からの染色体とが対応した組を形成する。これらの対は卵子が精子によって受精した時に組合わされたものである。時には、染色体の形成、または組合わせのいずれかにエラーが生じ、が多すぎるか、または少なすぎる染色体を有するか、あるいは何らかの仕方で混合された染色体を有する受精卵子が形成される。各染色体は、多くの遺伝子を含有しているため、染色体異常は、身体系の多くに影響を与え、しばしば発達障害(例えば、精神遅滞)を含む重大な出生時欠損を生じ易い。
これは、無害な非侵襲的方法である。高周波音波は、羊膜腔内の胎児を含む種々の組織および器官によって生じたエコーのパターンから可視画像を生成させるために用いられる。発達しつつある胎芽は懐胎約6週目に視覚化できる。懐胎約16週目から20週目に主な内部器官および四肢を評価して異常がないかどうかを判断できる。
これは、針を母体の下腹部から子宮内部の羊膜腔内へ通す侵襲性の高い方法である。この方法は、懐胎約14週目に実施できる。出生前診断のためには、たいていの羊水穿刺は懐胎14週から20週の間に実施される。しかし、羊水穿刺前には超音波検査を実施し、懐胎令、胎児および胎盤の位置、および十分な羊水が存在しているかどうかの判断する。羊水中に存在する胎児細胞(大部分は胎児の皮膚に由来)を染色体の生化学的分析および分子生物学的分析用に培養液中で増殖させることができる。
この方法では、超音波誘導装置を有するカテーテルを、膣を経てその頚部を通り、子宮内へと発達中の胎盤まで通す。カテーテルの導入によって胎盤の絨毛膜絨毛の細胞を得ることができ、染色体分析などの種々の方法で分析して胎児の核型を決定できる。また、これらの細胞は培養して、生化学的分析または分子生物学的分析をすることができる。CVSは、典型的に懐胎9.5週から12.5週の間に実施される。
発達中の胎児は、主要な2つの血液蛋白質−アルブミンおよびアルファ−フェトプロテイン(AFP)を有する。母体は、通常その血液にアルブミンのみを有するので、胎児のAFP濃度を測定するためにMSAFP試験が利用できる。通常は、羊水に出て胎盤を通り母体の血液に到達できるAFPはほんの少量である。しかし、胎児が神経管欠陥を有すると、羊水中に漏れ出るAFPが増す。神経管欠陥としては、無脳症(神経管の頭端における閉鎖不全)および二分脊椎(神経管の尾端における閉鎖不全)が挙げられる。このような欠陥の発生率は、米国では出生1,000件につき約1件から2件である。また、胎児の腹壁に欠陥があると、母体の血液内の胎児AFPはより多量となる。
受胎および発達中の胎芽の子宮への着床後、約1週目から栄養膜は、妊娠診断に利用できる検出可能なベータ−HCG(ヒト絨性ゴナドトロピン)を産生し始める。ベータ−HCGは、母体血清においても定量でき、流産の恐れがある場合、または異所性妊娠が疑われる場合、ベータ−HCG量が正常よりも低くなるため、この定量は妊娠初期に有用であり得る。
母体血清中のエストリオール量は、胎児が生存可能かどうか、胎盤が正しく機能しているか、また母体が健康状態にあるかどうかによって変わってくる。デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)は、胎児の副腎によって作られ、胎盤内でエストリオールへと代謝される。エストリオールは母体の循環に入り、母体の腎臓によって尿中へ、または母体の肝臓によって胆汁中へ排泄される。第3トリメスターに測定された正常濃度のエストリオールは、胎児の一般的健康状態の目安となる。エストリオールの濃度が低下する場合は、胎児は危険な状態にあり、即時分娩が必要であると考えられる。ダウン症候群が存在する場合、また、無脳症を伴う副腎形成不全が存在する場合、エストリオールは低下する傾向がある。
三重スクリーン試験は、母体血清アルファ−フェトプロテイン(MSAFP)、ヒト絨性ゴナドトロピン(hCG)および未抱合型エストリオール(uE3)の分析を含んでなる。血液試験は通常、最後の月経期の16〜18週後に実施される。この三重スクリーン試験は、非侵襲的ではあるが、試験の異常結果が出生時欠陥を示しているわけではなく、この試験は、危険性が高いことを示し、さらなる試験が必要であることを示唆するだけである。例えば、1,000人の女性のうち100人がこの三重スクリーン試験から異常結果を得る。しかし、出生時欠陥を持つ胎児を有するのは100人の女性のうちわずか2〜3人である。誤陽性の発生率がこのように高いため、妊婦に非常に大きなストレスと不必要な心配を与える。
母体血液内には胎児有核細胞が存在するため、これらの細胞を非侵襲的な出生前診断に利用することができる(ウォークノースカら(Walknowska,et al.)、ランセット(Lancet)1:p.1119−1122、1969年;ローら(Lo et al.)、ランセット(Lancet)2:p.1363−65、1989年;ローら(Lo et al.)、ブラッド(Blood)88:p.4390−95、1996年)。特定のDNA配列を探すために、胎児細胞を種々の方法によって分類し、分析することができる(ビアンチら(Bianchi et al.)、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス(Am.J.Hum.Genet.)61:p.822−29、(1997);ビアンチら(Bianchi et al.)、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(PNAS)93:p.705−08、(1996))。蛍光インシトウハイブリダイゼーション(FISH)は、母体血液から回収された胎児細胞の特定の染色体を同定し、トリソミーXおよびモノソミーXなどの異数体の病態を診断するために適用できる。
母体の血漿および血清において、胎児DNAが検出され、定量されてきた(ローら(Lo et al.)、ランセット(Lancet)350:p.485−487(1997);ローら(Lo et al.)、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス(Am.J.hum.Genet.)62:p.768−775(1998))。胎児顆粒球、リンパ球、有核赤血球および栄養芽層細胞などの複数の胎児細胞型が母体循環内に存在する(パートルおよびビアンチ(Pertl,and Bianchi)、産科学および婦人科学(Obstetrics and Gynecology)98:p.483−490(2001))。胎児DNAは、懐胎7週目に血清中で検出でき、妊娠期間の増加とともに上昇する。母体の血清と血漿中に存在する胎児DNAは、胎児細胞単離プロトコルから得られたDNA濃度に相当する。
本発明は、突然変異および染色体異常などの遺伝子疾患の検出方法に関する。好ましい実施形態において、本発明は、限定はしないが、転座、トランスバージョン、モノソミー、トリソミーおよび他のアニュオプロディズ、欠失、付加、増幅、断片、転座、および再配列などの変異および染色体異常を検出するために用いられる。多くの異常を同時に検出することができる。また、本発明は妊娠女性のサンプルから退治のDNA配列を決定するための非侵襲的方法を提供する。本発明は、限定はしないが、点突然変異、読み枠シフト、トランジョン、トランスバージョン、付加、挿入、欠失、付加−欠失、フレームシフト、ミスセンス、復帰突然変異、および微小付随体変化など、野生型配列に較べた場合の遺伝子配列における何らかの変化を検出するために利用できる。
本発明は、限定はしないが、挿入、欠失、および染色体異常などの遺伝子疾患の検出方法を提供し、特に、胎児の遺伝子疾患の検出に有用である。本法は、転座、付加、増幅、トランスバージョン、逆位、異数性、倍数性、モノソミー、トリソミー、トリソミー21、トリソミー13、トリソミー14、トリソミー15、トリソミー16、トリソミー18、トリソミー22、三倍体、四倍体ならびXO、XXY、XYYおよびXXXなどの性染色体異常の検出に特に有用である。また本法は、胎児DNAの配列を決定するための非侵襲的方法を提供する。
鋳型DNA
「関心対象座」とは、核酸の広い領域内に存在する、ある選択された領域を意味する。関心対象座が、限定はしないが、1〜100、1〜50、1〜20個または1〜10個のヌクレオチドであり、好ましくは、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2個または1個のヌクレオチドである。
関心対象座の配列決定法
限定はしないが、対立遺伝子特異的PCR、PCR、質量分析、MALDI−TOF質量分析ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー移動(FREST)、蛍光局在化、DNA塩基配列決定、サンガージデオキシ塩基配列決定、DNA塩基配列決定ゲル、DNA自動塩基配列決定装置上での毛管電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、マイクロアレー、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロットおよび米国特許第6,251,639号明細書に記載されている単一プライマー線形、DNA増幅などの核酸配列についての情報を提供する任意の方法を用いることができる。
I.プライマーデザイン
鋳型DNAの増幅に用いられるプライマーをデザインまたは選択するために、コンセンサス配列などの公表された配列を用いることができる。関心対象座にフランクするプライマー構築用に用いられる配列の選択は、関心対象座の配列の検査により、または直接それに対してなされる。最近公表されたヒトゲノムの配列は、関心対象の所望のヒト遺伝子座にフランクするプラーマーをデザインするための有用なコンセンサス配列情報源を提供している。
プライマーをデザインできる。認識部位が関心対象座から13塩基である場合、BsmFIによる消化で5’オーバーハング(RXXX)が生成され、関心対象座(R)はこのオーバーハングにおける1番目のヌクレオチド(3’から5’へ読んで)、Xは任意のヌクレオチドである。認識部位が関心対象座から12塩基である場合、BsmFIによる消化で5’オーバーハング(XRXX)が生成され、関心対象座(R)はこのオーバーハングにおける2番目のヌクレオチド(3’から5’へ読んで)である。認識部位が関心対象座から11塩基である場合、BsmFIによる消化で5’オーバーハング(XXRX)が生成され、関心対象座(R)はこのオーバーハングにおける3番目のヌクレオチド(3’から5’へ読んで)である。制限酵素による消化が関心対象座を含有する5’オーバーハングを生成するように制限酵素認識部位から関心対象座の間の距離をデザインする。認識部位から関心対象座の間の効果的距離は、制限酵素の選択によって変わる。
5’C 3’
3’GGN1N2CC5’
関心対象座にヌクレオチドのグアニンが報告されていない場合、3’窪み端は、オーバーハング内の1番目のヌクレオチドに相補的である未標識シトシンによってはめ込むことができる。過剰のシトシンを除去した後、関心対象座を表す次のヌクレオチド、N1をはめ込むために標識ddNTP類を用いることができる。限定はしないが、BssKI(5’↓CCNGG3’)、DdeI(5’C↓TNAG3’)、EcoNI(5’CCTNN↓NNNAGG3’)、Fnu4HI(5’GC↓NGC3’)、HinfI(5’G↓ANTC3’)、PflFI(5’GACN↓NNGTC3’)、Sau96I(5’G↓GNCC3’)、ScrFI(5’CC↓NGG3’)、およびTthl11I(5’GACN↓NNGTC3’)などの他の制限酵素を用いることができる。
5’C 3’
3’GGN1N2CC5’
関心対象座にヌクレオチドのグアニンが報告されていない場合、5’オーバーハングは、未標識シトシンによってはめ込むことができる。過剰のシトシンを濯いで除去し、標識ddNTP類によってはめ込むことができる。取り込まれた1番目のヌクレオチドが関心対象座に相当する。関心対象座にグアニンが報告されている場合、関心対象座を未標識シトシンによってはめ込むことができ、関心対象座の下流のヌクレオチド1個を検出することができる。例えば、N2はアデニンと推定される。関心対象座がグアニンである場合、未標識シトシンをはめ込み反応に用いることができる。シトシンを除去した後、標識チミジンによるはめ込み反応を用いることができる。関心対象座がグアニンである場合だけ、標識チミジンが取り込まれることになる。このように、関心対象座の配列は、関心対象座の下流のヌクレオチドを検出することによって決定することができる。
II.関心対象座の増幅
限定はしないが、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、3SR(自立配列反応)、LCR(リガーゼ連鎖反応)、PACE−PCR(cDNA端の急速増幅)、PLCR(ポリメラーゼ連鎖反応とリガーゼ連鎖反応との組合わせ)、Q−ベータファージ増幅(シャーら(Shah et al.)、ジャーナル・オブ・メディカル・マイクロジー(J.Medical Micro.)33:p.1435−41(1995))、SDA(鎖置換増幅)、SOE−PCR(スプライス重複伸長PCR)などの当業界に知られた任意の好適な方法を用いて、鋳型DNAを増幅できる。これらの方法は、本出願に明白に記載されている遊離可能なプライマーに媒介されたサイクル増幅反応の変法をデザインするために使用できる。最も好ましい実施形態において、鋳型DNAは、PCR(PCR:実用的アプローチ(A Practical Approach)、インニスら(Innis,et al.)、IRLプレス(IRL Press)(1991);およびPCRテクノロジー:DNA増幅の原理と応用(PCR Technology:Principals and Applications of DNA Amplification)、エイチ・エイ・エーリッヒ(H.A.Erlich)、ストックトン・プレス(Stockton Press)、(1989))を用いて増幅される。PCRはまた、米国特許第4,683,195号明細書;米国特許第4,683,202号明細書;米国特許第4,800,159号明細書;米国特許第4,965,188号明細書;米国特許第4,889,818号明細書;米国特許第5,075,216号明細書;米国特許第5,079,352号明細書;米国特許第5,104,792号明細書;米国特許第5,023,171号明細書;米国特許第5,091,310号明細書;および米国特許第5,066,584号明細書、を含む多数の米国特許に記載されている。
III.増幅DNAの精製
本発明の実施にとって、増幅DNAの精製は、必ずしも必要ではない。しかしながら、一実施形態において、精製が好ましい場合は、プライマー(第1または第2のプライマー)の5’端を、PCR産物の精製を容易にするタグによって修飾できる。好ましい実施形態においてPCR産物の精製を容易にするタグによって第1のプライマーを修飾する。修飾は、全プライマーに対して同じであることが好ましいが、PCR産物を異なった群に分けることが望まれる場合は、異なった修飾を用いることができる。
IV.増幅DNAの消化
当業界に公知の標準的プロトコルを用いて第1のプライマーまたは第2のプライマー上に供給された配列を認識する制限酵素によって、増幅DNAを消化することができる(図6A〜6D)。制限酵素消化は、当業界に周知の標準的プロトコルを用いて実施される。使用される酵素は、第1のプライマーまたは第2のプライマーによって生成される制限認識部位に依って決まる。プライマー上に生成した制限認識部位についての詳細に関しては、上記の「プライマーデザイン」の節を参照されたい。
ではめ込みができる。残りのデオキシヌクレオチドを洗い流し、関心対象座部位は、標識デオキシヌクレオチド、未標識デオキシヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド、または未標識ジデオキシヌクレオチドによってはめ込みができる。はめ込み反応後、任意の好適な方法によってヌクレオチドを検出できる。したがって、dNTPによる第1のはめ込み反応後、10/14および11/15で切断された分子の3’窪み端は、関心対象座によるものである。ここで、3’窪み端は関心対象座に相当する1個の塩基、2個の塩基、3個の塩基または4個の塩基ではめ込みできる。
V.標識ヌクレオチド類の取り込み
第2のプライマー上の配列を認識する制限酵素による消化によって、3’窪み端および関心対象座を含有する5’オーバーハングが生成する(図1G)。3’窪み端は、5’オーバーハングを鋳型として用い、未標識または標識ヌクレオチド類もしくは未標識および標識ヌクレオチド双方の組合わせの存在下ではめ込みができる。ヌクレオチドは、限定はしないが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、染色質部分、および検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分などの検出を可能にする任意のタイプの化学基または化学部分によって標識できる。ヌクレオチドは、1種または1種以上のタイプの化学基または化学部分によって標識できる。各ヌクレオチドを同一の化学基または化学部分によって標識できる。あるいは、各々異なったヌクレオチドを異なった化学基または化学部分によって標識できる。標識ヌクレオチドは、dNTP類、ddNTP類またはdNTP類、ddNTP類双方の混合物で標識できる。
ホモ接合グアニン:
鋳型DNAがグアニンに関してホモ接合であるならば、オーバーハングに相補的な1位にddATPが取り込まれることはないが、1番目に利用できる位置、この場合、オーバーリングに相補的な2位に、ddATPが取り込まれることになる。例えば、オーバーハングにおける2番目の位置がチミジンに相当するならば:
オーバーハングのX0が標識ヌクレオチドに対して相補的であるならば、標識ヌクレオチドはX0位に取り込まれ、品質保証のレベルを増加させる。これによりさらなる配列情報が提供される。
限定はしないが、蛍光検出、DNA塩基配列決定ゲル、自動DNA塩基配列決定装置上の毛管電気泳動、(例えば、ABIプリズム3100ジェネティック・アナライザー(ABI Prism 3100 Genetic Analyzer)または、ABIプリズム3700ジェネティック・アナライザー)、マイクロチャネル電気泳動、および他の塩基配列決定法、サンガー(Sanger)ジデオキシ塩基配列決定法、質量分析、飛行時間型質量分析、四重極質量分析、磁気偏向型質量分析、電気偏向型質量分析、赤外分光、紫外分光、パレンチオスタティック(palentiostatic)アンペロメトリー、またはサザンブロット、スロットブロット、ドットブロットなどのDNAハイブリダイゼーション法、およびDNA断片を「プローブ」と「標的」の双方として使用できるDNAマイクロアレイ、ELISA、蛍光分析、および蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)などの種々の方法によって関心対象座を分析することができる。
一実施形態において、関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を算出することができる。関心対象座におけるヌクレオチドの強度を、限定はしないが、ジーンスキャン(GeenScan)およびイメージクオント(ImageQuant)などの任意の数のコンピュータプログラムを用いて定量化できる。例えば、ヘテロ接合SNPに関しては、2種のヌクレオチドが存在し、各々が1:1の比率で存在し得る。好ましい実施形態において、複数のヘテロ接合SNPの比率を算出することができる。
胎児染色体異常の検出
上記の標題「鋳型DNA」の節で検討したように、鋳型DNAが母体の鋳型DNAと胎児鋳型DNAとを含んでなる妊娠女性のサンプルから鋳型DNAを得ることができる。一実施形態において、鋳型DNAは妊娠女性の血液から得られる。好ましい実施形態において、鋳型DNAは妊娠女性の血液の血漿または血清から得られる。
関心対象座とヘテロ接合の関心対象座との任意の組合わせを分析することができる。
短縦列反復を用いた胎児染色体異常の検出
短縦列反復(STR)は、前後様式で多数回反復されている長さが、通常2〜5塩基対の短いDNA配列である。縦列反復DNA配列は、ヒトゲノム全体で広く存在しており、集団内の個体間で十分な変異性を示している。微小付随体は9〜80塩基対のコア反復を有する。
キット
本発明の方法は、本法に用いられる試薬をキットの形態で提供することにより最も利便性よく実施される。キットは1種以上の以下の成分を含有することが好ましい:キットの使用説明書、別々の容器またはパッケージに封鎖した適切な緩衝剤、塩類、DNA抽出清浄剤、プライマー、ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、5’修飾物質および所望の場合、適切な純度の水、キットの使用者が本発明の方法によって適切な核酸サンプルを抽出し、それを分析することを可能にするような成分。キットで提供されるプライマーは、キットの目的およびそのキットを用いて試験することが望まれているDNAに依って変わる。
利用法
本発明の方法は、個体の遺伝子型を知ることが望まれる場合にはいつでも使用できる。本発明の方法は、遺伝子疾患の検出に特に有用である。本発明の方法は、胎児における遺伝子疾患の検出目的の非侵襲的方法として特に有用である。好ましい実施形態において、本発明の方法は、単一のヌクレオチド多型の同定法を提供する。
以下の実施例は、例示のみであり、請求項で規定された本発明の範囲を限定する意図はない。
DNA配列をPCRによって増幅したが、非特異的増幅を減少させるために指定温度において、サイクル1を実施してから、サイクル2で温度を上げ、さらにサイクル3で温度を上げた。第2のプライマーの、鋳型DNAにアニールする3’領域の融解温度を算出することによって、PCRのサイクル1のTM1を決定した。例えば、図1Bにおいて、TM1は領域「c」の略融解温度であり得る。アニーリング温度は、サイクル2において、第1のプライマーの、鋳型DNAにアニールする3’領域の略融解温度であるTM2へと上昇させた。例えば図1Cにおいて、アニーリング温度(TM2)は、領域「b」の融解温度に相当する。サイクル3において、アニーリング温度は、第2のプライマーの全配列の略融解温度であるTM3へと上昇させた。例えば図1Dにおいて、アニーリング温度(TM3)は、領域「c」+領域「d」の融解温度に相当する。増幅の残りのサイクルはTM3で実施した。
鋳型DNAは、インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血した5mlの血液サンプルから調製した。血液は36人の志願者から採血した。QIAGENより供給されたQIAamp DNAブラッド・ミディ・キット(Blood Midi Kit)(カタログ番号51183)を用いて、各血液サンプルから鋳型DNAを単離した。36人の志願者各人の鋳型DNAを、さらなる分析のために単離後プールした。
プライマーデザイン
以下の4つの単一ヌクレオチド多型を分析した。すなわち、染色体21上に位置する、ヒト染色体21cSNPデータベースに帰属する同定番号SNP HC21S00340(図3、レーン1);染色体1上に位置するSNP TSC0095512(図3、レーン2)、染色体1上に位置するSNP TSC0214366(図3、レーン3)、および染色体1上に位置するSNP TSC0087315(図3、レーン4)である。SNP合弁会社(SNP Consortium Ltd.)のデータベースは、2002年2月14日時点で有効が確認されたウェブサイトアドレス、http://snp.cshl.org./でアクセスできる。
PCR反応
4つの関心対象座全てを、PCRを用いて鋳型ゲノムDNAから増幅した(米国特許第4,683,195号明細書および米国特許第4,683,202号明細書)。PCR反応の構成要素は以下のとおりである:40ngの鋳型DNA、5μMの第1のプライマー、5μMの第2のプライマー、キアゲン(Qiagen)から入手された1×ホットスター・タク・マスター・ミックス(HotStar Taq Master Mix)(カタログ番号203443)。ホットスター・タク・マスター・ミックスは、DNAポリメラーゼ、PCR緩衝剤、200μMの各dNTP、および1.5mM MgCl2を含有した。
染色体1上のSNP(TSC0095512)、染色体13上のSNP(TSC0264580)および染色体21上のSNP(HC21S00027)を分析した。TSC0095512は2つの異なるプライマーセットを用いて分析し、HC21S00027はヌクレオチドの取り込みに関して、2種の反応を用いて分析した。
鋳型DNAの調製
鋳型DNAは、インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血した5mlの血液サンプルから調製した。QLAGENより供されたQIAamp DNAブラッド・ミディ・キット(Blood Midi Kit)(カタログ番号51183)を用いて、鋳型DNAを単離した。鋳型DNAは、前記キットに含まれる使用説明書に従って単離した。単離後、36人のヒト志願者の鋳型DNAを一緒にプールし、制限酵素EcoRIによって切断した。製造元の使用説明書に従って制限酵素消化を実施した。
プライマーデザイン
関心対象座は全てポリメラーゼ連鎖反応(PCR、参照のため本願明細書に組み込まれている米国特許第4,683,196号明細書および米国特許第4,683,202号明細書)を用いて、鋳型ゲノムDNAから増幅した。本実施例では、関心対象座を別々の反応管で増幅したが、それらを1つのPCR反応において一緒に増幅することもできる。特異性を増大させるため、「ホットスタート」PCRを用いた。PCR反応は、QIAGENから供されたホットスター・タク・マスター・ミックスキット(カタログ番号203443)を用いて実施した。一反応当たりの鋳型DNAおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化できるが、本実施例では、40ngの鋳型ヒトゲノムDNAおよび5μMの各プライマーを用いた。40サイクルのPCRを実施した。以下のPCR条件を用いた:
(1)95℃で15分15秒;
(2)37℃で30秒;
(3)95℃で30秒;
(4)57℃で30秒;
(5)95℃で30秒;
(6)64℃で30秒;
(7)95℃で30秒;
(8)ステップ6と7とを39回反復;
(9)72℃で5分。
PCR産物をゲノム鋳型DNAから分離した。各PCR産物を、ロッシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)GmbH(ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)の2001年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号1 645 692)からのストレプタウェル(Streptawell)の透明ハイ・バインド(High−Bind)プレートの4つの別々の反応ウェルに分割した。第1のプライマーは5’ビオチンタグを含有したので、PCR産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型DNAは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー(Thermomixer)(エッペンドルフ)を37℃、1000rpmにて20分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら1×PBSで3回洗浄した(カンドパルら(Kandpal et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.1789〜1795(1990);カネオカら(Kaneoka et al.)、バイオテクニクス(Biotechniques)、10:p.30〜34(1001);グリーンら(Green et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.6163〜6164(1990))。
第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素により、精製PCR産物を消化した。SNP HC21S00027(図6Aと6B)およびSNP TSC0095512(図6Cと6D)を、2種の異なる第2プライマーを用いて別々の反応において増幅した。図6A(SNP HC21S00027)および図6C(SNP TSC0095512)は、制限酵素BsmFIによる消化後のPCR産物を表している(ニューイングランド・バイオラブス、カタログ番号R0572S)。図6B(SNP HC21S00027)および図6D(SNP TSC0095512)は、制限酵素BceAIによる消化後のPCR産物を表している。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。SNP TSC0264580は、BsmFIにより消化された。適切な制限酵素による消化後、開裂した断片を除去するためPBSでウェルを3回洗浄した。
標識ヌクレオチドの取り込み
上記の制限酵素による消化によって、SNP部位または関心対象座および3’窪み端を含有した5’オーバーハングを有するDNA断片が得られた。5’オーバーハングは鋳型として働き、DNAポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
ストレプトアビジンマトリックスからの遊離後、10μlのサンプルから2〜3μlを48ウェル膜トレイ(ザ・ゲル・カンパニー(The Gel Company)、カタログ番号TAM48−01)内に入れた。トレイ内のサンプルを48フロー・メンブレン・コーム(Flow Membrane Comb)(ザ・ゲル・カンパニー(The Gel Company)、カタログ番号TAM48)に吸収させ、36cm 5%アクリルアミド(尿素)ゲル内へ挿入した(バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ(Bio Whittaker Molecular Applications)、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス(Long Ranger Run Gel Packs)、カタログ番号50691)。
染色体1の4つの関心対象座および染色体21の2つの関心対象座を別々のPCR反応にて増幅し、一緒にプールしてから分析した。増幅された関心対象座の各々の大きさが異なるようにプライマーをデザインすることにより、関心対象座を検出することができた。
鋳型DNAの調製
鋳型DNAは、インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血した5mlの血液サンプルから調製した。キアゲン(QIAGEN)より供給されたキアアンプDNAブラッド・ミディ・キット(カタログ番号51183)を用いて、各血液サンプルから鋳型DNAを単離した。鋳型DNAをキットに含まれる使用説明書のとおり単離した。36人のヒト志願者から鋳型DNAを単離し、さらなる分析のために1つのサンプルにプールした。
プライマーデザイン
PCR反応は、以下のアニーリング温度を用いた以外は実施例2に記載されたとおりに実施した:PCRの1番目のサイクルのアニーリング温度は37℃で30秒、PCRの2番目のサイクルのアニーリング温度は57℃で30秒、およびPCRの3番目のサイクルのアニーリング温度は64℃で30秒であった。引き続く全てのサイクルのアニーリング温度は64℃で30秒であった。PCRは37サイクル実施した。PCR後、反応液から1/4容量を取り、1本の管に合わせた。
サンプルをストレプタウェルマイクロ滴定プレートの単一ウェルに結合させたこと以外、PCR産物(合わせて1つのサンプルとなっており、「サンプル」と称す)は、実施例2に記載されたとおりゲノム鋳型DNAから分離した。
単離断片の制限酵素消化
第2のプライマーの認識部位に結合した制限酵素BceAIによってサンプルを消化した。制限酵素消化は、酵素と共に供給された使用説明書に従って実施した。制限酵素消化後、ウェルを1×PBSによって3回洗浄した。
ヌクレオチドの取り込み
上記の制限酵素による消化によって、SNP部位または関心対象座および3’窪み端を含有した5’オーバーハングを有するDNA断片が得られた。5’オーバーハングは鋳型として働き、DNAポリメラーゼの存在下、ヌクレオチドの取り込みを可能にした。
ストレプトアビジンマトリックスからの遊離後、10μlのサンプルから2〜3μlを48ウェル膜トレイ(ザ・ゲル・カンパニー(The Gel Company)、カタログ番号TAM48−01)内に入れた。トレイ内のサンプルを48フロー・メンブレン・コーム(Flow Membrane Comb)(ザ・ゲル・カンパニー(The Gel Company)、カタログ番号TAM48)に吸収させ、36cm 5%アクリルアミド(尿素)ゲル内へ挿入した(バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ(Bio Whittaker Molecular Applications)、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス(Long Ranger Run Gel Packs)、カタログ番号50691)。
ヌクレオチドが検出できる。例えば、サンプルが50人の鋳型DNAを含有し、そのうち49人が、関心対象座にチミジンを有し、1人がグアニンを有するとすれば、図9A〜9Cにあるように各「はめ込み」反応をゲルの別々のレーンで操作する4つの別々の「はめ込み」反応の実施によってグアニンを検出できる。複数の鋳型DNAからなるサンプルを分析する場合、質量の違いにより1個の関心対象座部位における複数のヌクレオチドを識別する必要性が複数の「はめ込み」反応によって緩和される。
妊娠女性のサンプルにおける遊離の胎児DNAを用いて胎児の染色体異常の配列を決定または検出する能力は、胎児DNAのパーセンテージの低さが障害となっていた。遊離胎児DNAのパーセンテージを上昇させることによって、突然変異、挿入、欠失、転座、トランスバージョン、モノソミー、トリソミー、トリソミー21、トリソミー18、トリソミー13、XXY、XXX、他の異数性、欠失、付加、増幅、転座および再配列の検出が増強すると考えられる。妊娠女性から得られた血漿中の胎児パーセントを、細胞溶解阻害剤の存在下、非存在下双方において決定した。Y染色体上の遺伝子マーカーを用いて、胎児DNAのパーセントを算出した。
インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血された血液サンプル5mlから鋳型DNAを調製した。血液は2本の管に分割した(フィッサシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific)、9mlEDTAバキューム管、カタログ番号NC9897284)1本の管にホルムアルデヒド(25μl/ml血液)を加えた。他方の管は、EDTAの存在以外は未処理のままであった。2本の管を1000rpmにて10分間回転させた。各サンプルの上澄み液(血漿)の2ミリリットルを新たな管に移し、3000rpmにて10分間回転させた。各サンプルの800μlをDNA精製に用いた。血球のDNA精製用キアゲン・ミディキット(キアンプDNAブラッド・ミディキット(QIAmp DNA Blood Midi Kit)(カタログ番号51183)を用いてDNAを単離した。DNAを100μlの希釈水に溶出させた。2種の鋳型DNAが得られた。すなわち、EDTAで処理した血液サンプル由来のもの、ならびにEDTAおよびホルムアルデヒドで処理した血液サンプル由来のものである。
プライマーデザイン
2つの異なったプライマーセットを用いた。すなわち、一方のプラーマーセットは、Y染色体に特異的であり、したがって、胎児DNAに特異的であり、他方のプライマーセットは、母体の鋳型DNAと胎児の鋳型DNAの双方に存在する嚢胞性線維症遺伝子を増幅するようにデザインされた。
SRY遺伝子および嚢胞性線維症遺伝子を、PCRを用いて鋳型ゲノムDNAから増幅した(米国特許第4,683,195号明細書および米国特許第4,683,202号明細書)。特異性を増大させるため、「ホットスタート」PCRを用いた。PCR反応はキアゲン(Quiagen)より供されたホットスター・タク・マスター・ミックスキット(カタログ番号203443)を用いて実施した。SRY遺伝子増幅のために、キアゲン精製カラムから溶出したDNAを連続的に1:2の希釈した。嚢胞性線維症遺伝子の増幅のために、キアゲン精製カラムからのDNAを1:4に希釈し、次に連続的に1:2に希釈した。以下の成分を各PCR反応に用いた:8μlの鋳型DNA(希釈または未希釈)、1μlの各プライマー(5μM)、10μlのホットスター・タク混合物。以下のPCR条件を用いた:
(1)95℃で15分
(2)94℃で1分
(3)54℃で15秒
(4)72℃で30秒
(5)ステップ2〜4を45サイクル反復
(6)72℃で10分。
胎児DNAの定量化
キアゲンカラムから溶出した鋳型DNAを、以下の濃度に連続的に希釈した:1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096。SRY遺伝子の増幅は、未希釈の鋳型を用いて実施した、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512。嚢胞性線維症遺伝子の増幅は、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096に希釈した鋳型DNAを用いて実施した。EDTA単独で処理した血漿サンプルならびにEDTAおよびホルムアルデヒドで処理した血漿サンプルから精製した鋳型DNAを用いて同じ連続希釈を実施した。
%胎児DNA=(SRY遺伝子量/嚢胞性線維症遺伝子量)*2*100。
SRY遺伝子量は、遺伝子が増幅された最高希釈値によって示された。同様に、嚢胞性線維症遺伝子量は、それが増幅された最高希釈値によって示された。前記式は、2つの乗法因子を含有しているが、これは、SRY遺伝子(Y染色体上に位置)にはただ1つのコピーが存在し、一方、嚢胞性線維症遺伝子には2つのコピーが存在する事実に関して標準化するために用いられる。
トリソミー21の遺伝子座を有する個人の鋳型DNAを分析した。染色体13上の3つの関心対象座および染色体21上の2つの関心対象座を分析した。
インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血された血液サンプル5mlから鋳型DNAを調製した。前記ヒト志願者は、追加の染色体21(トリソミー21)を有することが前もって遺伝子型決定されていた。キアゲン(QIAGEN)より提供されたキアンプDNAブラッド・ミディキット(QIAmp DNA Blood Midi Kit)(カタログ番号51183)を用いて鋳型DNAを単離した。
プライマーデザイン
以下の5種の単一ヌクレオチド多形を分析した:染色体21上に位置するSNP TSC0115603;染色体21上に位置するSNP TSC03209610;染色体13上に位置するSNP TSC0198557;および染色体13上に位置するSNP TSC0200347。他の個人の鋳型DNAを内部対照として用いた。グアニンに関してホモ接合であることが前もって同定されたSNP TSC0200347を内部対照として用いた。SNP合弁会社のデータベースは、2002年4月1日現在実効があるhttp://snp.eshl.org/ウェブサイト宛先にてアクセスできる。
PCRを用いて、鋳型ゲノムDNAから増幅された5つ全ての関心対象座を増幅した(米国特許第4,683,195号明細書および米国特許第4,683,202号明細書)。特異性を増大させるため、「ホットスタート」PCRを用いた。PCR反応はキアゲン(Quiagen)より供されたホットスター・タク・マスター・ミックスキット(カタログ番号203443)を用いて実施した。各関心対象座に関して、一反応当たりの鋳型DNA量およびプライマー量を最適化できる。本実施例では、40ngのヒトゲノム鋳型DNAおよび5μMの各プライマーを用いた。38サイクルのPCRを実施した。SNP TSC0115603、SNP TSC0309610およびSNP TSC02003437に関して以下のPCR条件を用いた:
(1)95℃で15分15秒;
(2)42℃で30秒;
(3)95℃で30秒;
(4)60℃で30秒;
(5)95℃で30秒;
(6)69℃で30秒;
(7)95℃で30秒;
(8)ステップ6と7とを37回反復;
(9)72℃で5分。
(1)95℃で15分15秒;
(2)37℃で30秒;
(3)95℃で30秒;
(4)57℃で30秒;
(5)95℃で30秒;
(6)64℃で30秒;
(7)95℃で30秒;
(8)ステップ6と7とを37回反復;
(9)72℃で5分。
キアゲン・ミン・エリュート(Qiagen MinElute)PCR精製キットを製造元の使用説明書(カタログ番号28006)に従って用い、PCR反応の成分からPCR産物を分離した。前記PCR産物を20μlの希釈水に溶出させた。各増幅SNPに1ミクロリットルのPCR産物、1μlの増幅内部対照DNA(SNP TSC0200347)および8μlの希釈水を混合した。各サンプルの5ミクロリットルをピアース・ストレプタウェル・マイクロ滴定プレート(カタログ番号15501)の2つの別々の反応ウェル内に入れた。第1のプライマーは5’ピオチンタグを含有したので、PCR産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型DNAは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー(Thermomixer)(エッペンドルフ)を45℃、150rpmにて1時間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら1×PBSで3回洗浄した(カンドパルら(Kandpal et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチNucl.Acids Res.)18:p.1789〜1795(1990);カネオカら(Kaneoka et al.)、バイオテクニクス(Biotechniques)、10:p.30〜34(1001);グリーンら(Green et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.6163〜6164(1990))。
第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合した制限酵素により精製PCR産物を消化した。精製PCR産物を制限酵素BceAI(ニューイングランド・バイオラブス、カタログ番号R0623S)。この消化は、制限酵素と共に供された使用説明書に従ってマイクロ滴定プレートのウェル内で実施した。適切な制限酵素による消化後、前記ウェルをPBSで3回洗浄し、開裂した断片を除去した。
上記制限酵素消化によって、SNPおよび3’窪み端を含有した、5’オーバーハングを有するDNAが得られた。5’オーバーハングは鋳型として働き、DNAポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
ストレプトアビジンマトリックスから遊離後、10μlのサンプルのうち3μlを48ウェル膜トレイ(ザ・ゲル・カンパニー(The Gel Company)、カタログ番号TAM48−01)に入れた。トレイ中のサンプルを48フロー膜コーム(ザ・ゲル・カンパニー、カタログ番号TAM48)で吸収させ、36cm5%アクリルアミド(尿素)ゲル(バイオホィッテーカー・モレキュラー・アプリケーションズ(BioWhittaker Molecular Applications)、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス(Long Ranger Run Gel Packs)、カタログ番号50691)内に挿入した。
インフォームドコンセントを得た後、4人からゲノムDNAを採取した。鋳型DNAを用いて染色体13上の6種のSNP(TSC0837969、TSC0034767、TSC1130902、TSC0597888、TSC0195492、TSC0607185)を分析した。これらのSNP類に関する情報は、以下のウェブサイトに見ることができる:www.snp.chsl.org/snpsearch.shtml;ウェブサイトは2003年2月11日現在有効である。
インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血された血液サンプル9mlから鋳型DNAを調製した。キアゲン(QIAGEN)より提供されたキアンプDNAブラッド・ミディキット(QIAmp DNA Blood Midi Kit)(カタログ番号51183)を用いて鋳型DNAを単離した。鋳型DNAは、キットに含まれる使用説明書に従って単離した。
プライマーのデザイン
SNP TSC0837969は、以下のプライマーセットを用いて増幅した:
(1)95℃で15分15秒;
(2)37℃で30秒;
(3)95℃で30秒;
(4)57℃で30秒;
(5)95℃で30秒;
(6)64℃で30秒;
(7)95℃で30秒;
(8)ステップ6と7とを39回反復;
(9)72℃で5分。
関心対象断片の精製
PCR産物をゲノム鋳型DNAから分離した。PCR反応後、1個体の各PCR反応液の1//4容量をロッシュ・ダイアグノシティックス(Roche Diagnostics)GmbHによるストレプタウェル、透明ハイ・バンドプレート(カタログ番号一645692、ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、2001年バイオケミカルズ・カタログに掲載)の1つのウェル内に共に混合した。第1のプライマーは5’ピオチンタグを含有したので、PCR産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型DNAは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー(Thermomixer)(エッペンドルフ)を37℃、1000rpmにて20分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら1×PBSで3回洗浄した(カンドパルら(Kandpal et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.1789〜1795(1990);カネオカら(Kaneoka et al.)、バイオテクニクス(Biotechniques)、10:p.30〜34(1001);グリーンら(Green et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.6163〜6164(1990))。
単離断片の制限酵素消化
第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素BsmFIにより、精製PCR産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するためPBSでウェルを3回洗浄した。
標識ヌクレオチドの取り込み
BsmFIによる制限酵素消化により、SNP部位または関心対象座および3’窪み端を含有した5’オーバーハングを有するDNA断片が得られた。5’オーバーハングは鋳型として働き、DNAポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
関心対象座の検出
ストレプトアビジンマトリックスからの遊離後、サンプルを36cm 5%アクリルアミド(尿素)ゲル(バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ(Bio Whittaker Molecular Applications)、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス(Long Ranger Run Gel Packs)、カタログ番号50691)の一レーンに乗せた。前記サンプルを3000ボルトで3分ゲル内に電気泳動させた。自動塩基配列決定装置ヘーファー(Hoefer)SQ3シーケンサー上で3時間、ゲルを操作した。ゲルを装置から取り出し、タイフーン9400バリアブルモード・イメジャー上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。
シトシンに関してホモ接合:
種々のタイプの癌に対する非侵襲的方法は、疾病率およびその疾病による死亡率を減少させる可能性を有する。結腸直腸腫瘍の早期検出のために結腸鏡検査、バリウム注腸およびS状結腸鏡検査などの幾つかの方法が開発されているが、これらの方法は侵襲的であり、患者の低コンプライアンス率を生じるために利用法が限られている。非侵襲的な遺伝子試験は、早期段階の結腸直腸腫瘍の同定に有用であり得る。
鋳型DNAは、限定はしないが、大便サンプルなどの結腸細胞を含有するサンプルから精製する。鋳型DNAは、アールキストら(Ahlquist et al.)(ガストロエンテロロジー(Gastroenterology)、119:p.1219−1227、2000年)に記載された方法を用いて精製する。大便サンプルが凍結している場合は、そのサンプルを室温で解凍し、イグザクター・スツール・シェーカー(Exactor stool shaker)(イグザクト・ラボラトリーズ(Exact Laboratories)、マサチューセッツ州メイナード所在)で均一化する。均一化後、各サンプルの4グラム当量を2536xgで5分間遠心分離する。前記サンプルを2回目は、16,500xgで10分間遠心分離する。上澄み液を20μlのRナーゼ(1ミリリットル当たり0.5mg)と共に37℃で1時間温置する。1リットル当たり3モルの酢酸ナトリウム1/10容量および等容量のイソプロパノールによってDNAを沈殿させる。前記DNAを5mlのトリス−EDTA(1リットル当たり0.01モルのトリス(pH7.4)および1リットル当たり0.001モルのEDTA)に溶解する。
突然変異がコドン1370に存在するかどうかを決定するために、以下のプライマーを用いる:
関心対象座は全てポリメラーゼ連鎖反応(PCR、参照のため本願明細書に組み込まれている米国特許第4,683,196号明細書および米国特許第4,683,202号明細書)を用いて、鋳型ゲノムDNAから増幅した。この実施例では、関心対象座を別々の反応管で増幅したが、それらを1つのPCR反応において一緒に増幅することもできる。特異性を増大させるため、例えば、キアゲンから供給されたホットスター・タク・マスター・ミックスキット(カタログ番号203443)を使用した「ホットスタート」PCRを用いた。一反応当たり鋳型DNAおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化されるが、本実施例では、40ngの鋳型ヒトゲノムDNAおよび5μMの各プライマーを用いた。40サイクルのPCRを実施した。以下のPCR条件を用いた:
(1)95℃で15分15秒;
(2)37℃で30秒;
(3)95℃で30秒;
(4)57℃で30秒;
(5)95℃で30秒;
(6)64℃で30秒;
(7)95℃で30秒;
(8)ステップ6と7とを39回反復;
(9)72℃で5分。
第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素BsmFI(ニューイングランド・バイオラブス、カタログ番号R0572S)により、精製PCR産物を消化する。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施する。適切な制限酵素による消化後、開裂した断片を除去するためPBSでウェルを3回洗浄する。
上記の制限酵素による消化によって、関心対象座および3’窪み端を含有した5’オーバーハングを有するDNA断片が得られる。5’オーバーハングは鋳型として働き、DNAポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にする。
太字は、コドンを示す。アンダーケース文字は欠失を表す。欠失がコード領域を超えて広がる場合は、他の位置情報が与えられる。例えば、略号5’UTRは、5’未翻訳領域を表し、略号E616は、エキソン6/イントロン6境界を示す。
単一ヌクレオチド多形(SNP)は、配列変化のうちで最もよく見られる形態であり、ヒトゲノムには、5%以上の集団頻度で300万の共有SNPが存在すると予想されてきた。これらの多形を指標として遺伝子マップが開発されている。
特定のSNPの対立遺伝子頻度を決定するために、250人からインフォームドコンセントを得てDNAを採取した。各個人から9mlの血液サンプルを滅菌管(フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific)、9ml EDTA減圧管、カタログ番号NC9897284)に採取した。管を1000rpmで10分間回転させた。各サンプルの上澄み液(血漿)を取り、一般に「バフィーコート(buffy−coat)」と称されている残りの血液サンプルの1ミリリットルを新たな管に移した。各サンプルに1ミリリットルの1×PBSを加えた。
以下のプライマーセットを用いてSNP TSC0903430を増幅した:
(1)95℃で15分15秒;
(2)37℃で30秒;
(3)95℃で30秒;
(4)57℃で30秒;
(5)95℃で30秒;
(6)64℃で30秒;
(7)95℃で30秒;
(8)ステップ6と7とを39回反復;
(9)72℃で5分。
関心対象断片の精製
PCR産物を、未使用PCR剤から単離した。PCR反応後、SNP TSC0903430、SNP TSC0337961およびSNP TSC0786441に関する反応液の1/2容量を1本の反応管に一緒に混合した。SNP TSC1168303、SNP TSC0056188、SNP TSC0466177、およびSNP TSC0197424に関する反応液の1/2容量を1本の反応管に一緒にプールした。未使用のプライマーおよびヌクレオチドを、キアゲン・ミンエリュートPCR精製キット(キアゲン、カタログ番号28004)を用いて反応液から除去した。反応は、カラムと共に供された製造元の使用説明書に従って行った。
単離断片の制限酵素消化
第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素により、精製PCR産物を消化した。消化は制限酵素と共に供された使用説明書に従ってエッペンドルフ管内で実施した。
標識ヌクレオチドの取り込み
BsmFIによる制限酵素消化によって、SNP部位または関心対象座および3’窪み端を含有した5’オーバーハングを有するDNA断片が得られた。5’オーバーハングは鋳型として働き、DNAポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
関心対象座の検出
サンプルを、36cm 5%アクリルアミド(尿素)ゲル(バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ(Bio Whittaker Molecular Applications)、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス(Long Ranger Run Gel Packs)、カタログ番号50691)の1レーンに載せた。前記サンプルを3000ボルトで3分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置(ホーファーSQ3シーケンサー)上で3時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン9400バリアブルモード・イメージャー(Typhoon9400Variable Mode Imager)上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。
ヘテロ接合SNPは、定義によりヌクレオチド1個だけ異なっている。ヘテロ接合SNPにおいては、対立遺伝子1と対立遺伝子2とは、1:1の比で存在し得る。しかし、DNAポリメラーゼが他のヌクレオチドよりも速く1個のヌクレオチドを取り込んで、そのため、ヘテロ接合SNPの観察された比が理論上予想された1:1の比と異なり得るという可能性がある。
24人からインフォームドコンセントを得てDNAを採取した。各個人から9mlの血液サンプルを滅菌管(フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific)、9ml EDTA減圧管、カタログ番号NC9897284)に採取した。管を1000rpmで10分間回転させた。各サンプルの上澄み液(血漿)を取り、一般に「バフィーコート(buffy−coat)」と称されている残りの血液サンプルの1ミリリットルを新たな管に移した。各サンプルに1ミリリットルの1×PBSを加えた。
プライマーデザイン
以下のプライマーセットを用いてSNP TSC0607185を増幅した:
(1)95℃で15分15秒;
(2)37℃で30秒;
(3)95℃で30秒;
(4)57℃で30秒;
(5)95℃で30秒;
(6)64℃で30秒;
(7)95℃で30秒;
(8)ステップ6と7とを39回反復;
(9)72℃で5分。
関心対象断片の精製
PCR産物をゲノム鋳型DNAから分離した。PCR反応液の1/2を、ロッシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)GmbH(ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)の2001年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号1 645 692)からのストレプタウェル(Streptawell)の透明ハイ・バインド(High−Bind)プレートの1つのウェルに移した。第1のプライマーは5’ビオチンタグを含有したので、PCR産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型DNAは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー(Thermomixer)(エッペンドルフ)を37℃、1000rpmにて20分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら1×PBSで3回洗浄した(カンドパルら(Kandpal et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.1789〜1795(1990);カネオカら(Kaneoka et al.)、バイオテクニクス(Biotechniques)、10:p.30〜34(1001);グリーンら(Green et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.6163〜6164(1990))。
単離断片の制限酵素消化
第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素BsmFIにより、精製PCR産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するためPBSでウェルを3回洗浄した。
標識ヌクレオチドの取り込み
BsmFIによる制限酵素消化により、SNP部位または関心対象座および3’窪み端を含有した5’オーバーハングを有するDNA断片が得られた。5’オーバーハングは鋳型として働き、DNAポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
関心対象座の検出
サンプルを、36cm 5%アクリルアミド(尿素)ゲル(バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ(Bio Whittaker Molecular Applications)、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス(Long Ranger Run Gel Packs)、カタログ番号50691)の1レーンに載せた。前記サンプルを3000ボルトで3分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置(ホーファーSQ3シーケンサー)上で3時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン9400バリアブルモード・イメージャー(Typhoon9400Variable Mode Imager)上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。各バンドを枠で囲み、タイフーン9400バリアブルモード・イメージャー・ソフトウェアを用いて、バンドの強度を算出した。
実施例10
実施例9で検討したように、特定のSNPにおけるある対立遺伝子対他の対立遺伝子の比は、理論上予想された50:50の比から変化し得る。ある対立遺伝子対他の対立遺伝子の比が、染色体疾患を有する個人において線形を維持するという条件で、追加染色体の存在を検出するためにこれらのSNPを用いることができる。例えば、SNPXにおいて、対立遺伝子1対対立遺伝子2のパーセンテージが75:25であるとすれば、ダウン症候群を有する個人に関して、対立遺伝子1対対立遺伝子2の予想パーセンテージは、このSNPにおける予想パーセンテージからの変化を反映するように適切に調整されなければならない。
鋳型DNAの調製
正常な遺伝子核型を有する4人および染色体21の1つ余分なコピーを有すること(ダウン症候群)が確認されている1人からDNAを採取した。ダウン症候群を有する個人の親からもインフォームドコンセントを得た。
プライマーデザイン
以下のプライマーセットを用いてTSC0108992を増幅した:
(1)95℃で15分15秒;
(2)37℃で30秒;
(3)95℃で30秒;
(4)57℃で30秒;
(5)95℃で30秒;
(6)64℃で30秒;
(7)95℃で30秒;
(8)ステップ6と7とを37回反復;
(9)72℃で5分。
関心対象断片の精製
PCR産物をゲノム鋳型DNAから分離した。各PCR産物を2つのサンプルに分け、ロッシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)GmbH(ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)の2001年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号1 645 692)からのストレプタウェル(Streptawell)の透明ハイ・バインド(High−Bind)プレートの2つの別々の反応ウェルに移した。各PCR反応に関し各々、マイクロ滴定プレートの別々のウェルに2つの複製物が存在した。第1のプライマーは5’ビオチンタグを含有したので、PCR産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型DNAは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー(Thermomixer)(エッペンドルフ)を37℃、1000rpmにて20分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら1×PBSで3回洗浄した(カンドパルら(Kandpal et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.1789〜1795(1990);カネオカら(Kaneoka et al.)、バイオテクニクス(Biotechniques)、10:p.30〜34(1001);グリーンら(Green et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.6163〜6164(1990))。
単離断片の制限酵素消化
第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素BsmFIにより、精製PCR産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するため1×PBSでウェルを3回洗浄した。
標識ヌクレオチドの取り込み
BsmFIによる制限酵素消化により、SNP部位または関心対象座および3’窪み端を含有した5’オーバーハングを有するDNA断片が得られた。5’オーバーハングは鋳型として働き、DNAポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
関心対象座の検出
サンプルを、36cm 5%アクリルアミド(尿素)ゲル(バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ(Bio Whittaker Molecular Applications)、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス(Long Ranger Run Gel Packs)、カタログ番号50691)の1レーンに載せた。前記サンプルを3000ボルトで3分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置(ホーファーSQ3シーケンサー)上で3時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン9400バリアブルモード・イメージャー(Typhoon9400Variable Mode Imager)上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。各バンドを枠で囲み、タイフーン9400バリアブルモード・イメージャー・ソフトウェアを用いて、バンドの強度を算出した。
ある特定のSNPに関する対立遺伝子2対対立遺伝子1のパーセンテージは、一貫性が高い。実験的に決定された比からの統計上有意な偏差は染色体異常の存在を示す。正常な個人の鋳型DNAおよびダウン症候群を有する個人の鋳型DNAを用いて、染色体21上のSNP TSC0108992における対立遺伝子2対対立遺伝子1のパーセンテージを下記に計算した。
鋳型DNAの調製
正常な遺伝子核型を有する個人および染色体21の1つ余分なコピーを有することが確認されている個人(ダウン症候群)からDNAを採取した。ダウン症候群を有する個人の親からもインフォームドコンセントを得た。
鋳型DNAの混合
正常な遺伝子核型を有する個人の鋳型DNAおよび染色体21の1つ余分なコピーを有する個人の鋳型DNAを10ng/μlの濃度に希釈した。正常な鋳型DNAおよびダウン症候群の鋳型DNAの4種の混合物を以下の様式で作成した:
混合物1: 32μlの正常DNA+8μlのダウン症候群DNA
混合物2: 28μlの正常DNA+12μlのダウン症候群DNA
混合物3: 20μlの正常DNA+20μlのダウン症候群DNA
混合物4: 10μlの正常DNA+30μlのダウン症候群DNA
正常な鋳型DNAおよびダウン症候群を有する個人の鋳型DNAに関して、3つの別々のPCR反応を設定した。同様に、各混合物に関して3つの別々のPCR反応を設定した。
プライマーデザイン
SNP TSC0108992は、以下のプライマーセットを用いて増幅した:
(1)95℃で15分15秒;
(2)37℃で30秒;
(3)95℃で30秒;
(4)57℃で30秒;
(5)95℃で30秒;
(6)64℃で30秒;
(7)95℃で30秒;
(8)ステップ6と7とを37回反復;
(9)72℃で5分。
関心対象断片の精製
PCR産物をゲノム鋳型DNAから分離した。各PCR産物を2つのサンプルに分け、ロッシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)GmbH(ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)の2001年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号1 645 692)からのストレプタウェル(Streptawell)の透明ハイ・バインド(High−Bind)プレートの2つの別々のウェルに移した。各PCR反応に関し各々、マイクロ滴定プレートの別々のウェルに2つの複製物が存在した。第1のプライマーは5’ビオチンタグを含有したので、PCR産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型DNAは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー(Thermomixer)(エッペンドルフ)を37℃、1000rpmにて20分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら1×PBSで3回洗浄した(カンドパルら(Kandpal et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.1789〜1795(1990);カネオカら(Kaneoka et al.)、バイオテクニクス(Biotechniques)、10:p.30〜34(1001);グリーンら(Green et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.6163〜6164(1990))。
単離断片の制限酵素消化
第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素BsmFIにより、精製PCR産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するため1×PBSでウェルを3回洗浄した。
標識ヌクレオチドの取り込み
BsmFIによる制限酵素消化により、SNP部位または関心対象座および3’窪み端を含有した5’オーバーハングを有するDNA断片が得られた。5’オーバーハングは鋳型として働き、DNAポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
関心対象座の検出
サンプルを、36cm 5%アクリルアミド(尿素)ゲル(バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ(Bio Whittaker Molecular Applications)、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス(Long Ranger Run Gel Packs)、カタログ番号50691)の1レーンに載せた。前記サンプルを3000ボルトで3分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置(ホーファーSQ3シーケンサー)上で3時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン9400バリアブルモード・イメージャー(Typhoon9400Variable Mode Imager)上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。各バンドを枠で囲み、タイフーン9400バリアブルモード・イメージャー・ソフトウェアを用いて、バンドの強度を算出した。
上記実施例9で検討したように、ヘテロ接合SNPにおける対立遺伝子1対対立遺伝子2の比は一定である。しかし、ヘテロ接合SNPにおける対立遺伝子1対対立遺伝子2の比に影響を与え得る1つの要因は、ゲノム数の少なさである。例えば、40個のゲノムがあるとすると、これは、対立遺伝子1の合計40個の染色体と対立遺伝子2の40個の染色体があることを意味するが、プライマーが対立遺伝子1を有する40個の染色体にアニールするが、対立遺伝子2を有する染色体には30個しかアニールしないということが統計上あり得る。これは、対立遺伝子1対対立遺伝子2の比に影響を与えることになり、ある一定のSNPに関する「p」値に大きな影響を与え得る。
鋳型DNAの調製
ヒト志願者からインフォームドコンセントを得た後、9mlの血液サンプルを滅菌管に採取した(フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific)、9ml EDTA減圧管、カタログ番号NC9897284)。管を1000rpmで10分間回転させた。各サンプルの上澄み液(血漿)を取り、一般に「バフィーコート(buffy−coat)」と称されている残りの血液サンプルの1ミリリットルを新たな管に移した。各サンプルに1ミリリットルの1×PBSを加えた。キアゲンより提供されたキアンプDNAブラッド・ミディキット(カタログ番号51183)を用いて鋳型DNAを単離した。
複合プライマーのデザイン
プライマーは、染色体21上に位置する関心対象座のコピー数を増やすために、染色体21上の様々な領域にアニールするようにデザインした。プライマーの長さは12塩基であった。しかし、限定はしないが、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36〜45、46〜55、56〜65、66〜75、76〜85、86〜95、96〜105、106〜115、116〜125塩基、および125塩基以上などの任意の長さのプライマーが使用できる。プライマーは、センス鎖とアンチセンス鎖の双方にアニールするようにデザインした。
セット1:
SNP TSC0397235、SNP TSC0470003、SNP TSC1649726、SNP TSC1261039、SNP TSC0310507、SNP TSC1650432、SNP TSC1335008、SNP TSC0128307、およびSNP TSC0259757を包囲する染色体21上の領域を、ポリメラーゼ連鎖(PCR、本願明細書に参照として組み込んでいる米国特許第4,683,195号明細書および米国特許第4,683,202号明細書)を用いて、鋳型ゲノムDNAから増幅した。このPCR反応には、関心対象座の上流および下流の凡そ130塩基にアニールするプライマーを使用した。PCR反応を用いたのは、関心対象座のコピー数を増加させて、ゲノム数の少なさから生じ得る誤差を排除するためである。
(1)95℃で15分;
(2)95℃で30秒;
(3)4℃で30秒;
(4)37℃で30秒;
(5)ステップ2〜4を24回反復;
(6)72℃で10分。
関心対象断片の精製
キアゲン・ミンエリュート(Quiagen MinElute)PCR精製キット(キアゲン、カタログ番号28004)を用いて、反応液から余分のプライマーおよびヌクレオチドを除去した。反応は、カラムと共に供された製造元の使用説明書に従って実施した。DNAを100μlの滅菌水中へ溶出した。
SNP TSC0397235を以下のプライマーセットを用いて増幅した:
(1)95℃で15分15秒;
(2)37℃で30秒;
(3)95℃で30秒;
(4)57℃で30秒;
(5)95℃で30秒;
(6)64℃で30秒;
(7)95℃で30秒;
(8)ステップ6と7とを39回反復;
(9)72℃で5分。
各SNPに関し、元の鋳型DNAからのPCR反応液20マイクロリットルのうち4マイクロリットルを、アガロースゲル電気泳動によって分析した(図18Aを参照)。各SNPに関し、複合鋳型から増幅したPCR反応液20マイクロリットルのうち4マイクロリットルを、アガロースゲル電気泳動によって分析した(図18Bを参照)。
PCR産物をゲノム鋳型DNAから分離した。PCR反応液の1/2を、ロッシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)GmbH(ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)の2001年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号1 645 692)からのストレプタウェル(Streptawell)の透明ハイ・バインド(High−Bind)プレートの1つのウェルに移した。第1のプライマーは5’ビオチンタグを含有したので、PCR産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型DNAは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー(Thermomixer)(エッペンドルフ)を37℃、1000rpmにて20分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら1×PBSで3回洗浄した(カンドパルら(Kandpal et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.1789〜1795(1990);カネオカら(Kaneoka et al.)、バイオテクニクス(Biotechniques)、10:p.30〜34(1001);グリーンら(Green et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.6163〜6164(1990))
単離断片の制限酵素消化
第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素BsmFIにより、精製PCR産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するためPBSでウェルを3回洗浄した。
BsmFIによる制限酵素消化により、SNP部位または関心対象座および3’窪み端を含有した5’オーバーハングを有するDNA断片が得られた。5’オーバーハングは鋳型として働き、DNAポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
サンプルを、36cm 5%アクリルアミド(尿素)ゲル(バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ(Bio Whittaker Molecular Applications)、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス(Long Ranger Run Gel Packs)、カタログ番号50691)の1レーンに載せた。前記サンプルを3000ボルトで3分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置(ホーファーSQ3シーケンサー)上で3時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン9400バリアブルモード・イメージャー(Typhoon9400Variable Mode Imager)上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。各バンドを枠で囲み、タイフーン9400バリアブルモード・イメージャー・ソフトウェアを用いて、バンドの強度を算出した。
妊娠女性の血液から分離した血漿は、母体鋳型DNAと胎児鋳型DNAの双方を含んでいる。先に検討したように、母体血漿中、胎児DNAのパーセンテージは、個々の妊娠女性によって変化する。しかし、母体鋳型DNAがホモ接合であり、血漿から得られた鋳型DNAがヘテロ接合パターンを示す場合のSNPを分析することによって胎児DNAのパーセンテージを決定できる。
全血からの血漿調製
各々9mlの血液を含有する4本の管から血漿を分離した(フィッシャー・サイエンティフィック)。血液は、インフォームドコンセントを得た妊娠女性から静脈穿刺により採取した。採血後、ホルムアルデヒド(25μl/ml血液)を各管に加えた。前記管は発送まで4℃で保存した。前記管は、フェデラルエクスプレス(Federal Express)により、アイスパックを含有したフォームコンテナー中で発送した。
上記サンプルから血漿を取り出した後、一般に「バフィコート」と称される残りの血液サンプルの1ミリリットルを新たな管に移した。1×PBSの1ミリリットルを前記サンプルに加えた。キアゲンより提供されたキアンプDNAブラッド・ミディキット(カタログ番号51183)を用いて鋳型DNAを単離した。
実施例8は、集団内で可能性の高いSNPの同定、または所与の個人のヘテロ接合SNPを同定するための方法を説明している。実施例8に記述された方法を、母体DNAがホモ接合である染色体13上のSNPを同定するために母体鋳型DNAに適用した。任意の数のSNPをスクリーンできる。スクリーンされるSNPの数は、分析が必要とされている胎児DNA中のヘテロ接合SNPの数に比例する。
母体血漿中、典型的には少数の胎児ゲノムが存在する。染色体13上に位置する関心対象座のコピー数を増加させるために、各関心対象座の凡そ130塩基上流および130塩基下流にアニールするように、プライマーをデザインした。これは、少数のゲノムの操作時に生じ得て、ある対立遺伝子対他の対立遺伝子の比に影響を与え得る統計上のサンプリングエラーを減少させるために行われた(実施例11を参照)。プライマーは12塩基長であった。しかしながら、限定はしないが、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36〜45、46〜55、56〜65、66〜75、76〜85、86〜95、96〜105、106〜115、116〜125塩基、および125塩基以上などの任意の長さのプライマーが使用できる。プライマーはセンス鎖とアンチセンス鎖双方にアニールするようにデザインされた。
上記の29のSNPを包囲する染色体13上の領域を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR、本願明細書に参照として組み込んでいる米国特許第4,683,195号明細書および米国特許第4,683,202号明細書)を用いて、鋳型ゲノムDNAから増幅した。このPCR反応には、関心対象座の上流および下流の凡そ150塩基にアニールするプライマーを使用した。58種のプライマーを一緒に混合し、鋳型DNAを増幅する単独の反応に用いた。この反応は、関心対象座のコピー数を増加させて、ゲノム数の少なさから生じ得る誤差を排除するために実施された。
(1)95℃で15分;
(2)95℃で30秒;
(3)4℃で30秒;
(4)37℃で30秒;
(5)ステップ2〜4を24回反復;
(6)72℃で10分。
キアゲン・ミンエリュートPCR精製キット(キアゲン、カタログ番号28004)を用いて、反応液から未使用のプライマーおよびヌクレオチドを除去した。反応は、カラムと共に供された製造元の使用説明書に従って実施した。DNAを100μlの滅菌水中へ溶出した。
プライマーデザイン
SNP TSC0052277は、以下のプライマーセットを用いて増幅した:
(1)95℃で15分15秒;
(2)37℃で30秒;
(3)95℃で30秒;
(4)57℃で30秒;
(5)95℃で30秒;
(6)64℃で30秒;
(7)95℃で30秒;
(8)ステップ6と7とを39回反復;
(9)72℃で5分。
PCR産物をゲノム鋳型DNAから分離した。各PCR産物を、ロッシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)GmbH(ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)の2001年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号1 645 692)からのストレプタウェル(Streptawell)の透明ハイ・バインド(High−Bind)プレートの1つのウェルに入れた。あるいは、第1のプライマーは、関心対象座を分子量に基づいて分離可能なようにデザインしたので、PCR産物を1つのウェルにプールすることができる。第1のプライマーは5’ビオチンタグを含有したので、PCR産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型DNAは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー(Thermomixer)(エッペンドルフ)を37℃、1000rpmにて20分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら1×PBSで3回洗浄した(カンドパルら(Kandpal et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.1789〜1795(1990);カネオカら(Kaneoka et al.)、バイオテクニクス(Biotechniques)、10:p.30〜34(1001);グリーンら(Green et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)18:p.6163〜6164(1990))。
単離断片の制限酵素消化
第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素BsmFIにより、精製PCR産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するためPBSでウェルを3回洗浄した。
BsmFIによる制限酵素消化により、SNP部位または関心対象座および3’窪み端を含有した5’オーバーハングを有するDNA断片が得られた。5’オーバーハングは鋳型として働き、DNAポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
ストレプトアビジンマトリックスから遊離させた後、サンプルを、36cm 5%アクリルアミド(尿素)ゲル(バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ(Bio Whittaker Molecular Applications)、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス(Long Ranger Run Gel Packs)、カタログ番号50691)の1レーンに載せた。前記サンプルを3000ボルトで3分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置(ホーファーSQ3シーケンサー)上で3時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン9400バリアブルモード・イメージャー(Typhoon9400Variable Mode Imager)上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。
単一バンドが得られた(図20、レーン5を参照)。アデニン対立遺伝子に関するバンドは検出されず、母体DNAがグアニンに関してホモ接合であることを示した。
Claims (66)
- 染色体異常を検出する方法であって、
(a)鋳型DNAから関心対象座の対立遺伝子の配列を決定すること、
(b)(a)の関心対象座から同定されたヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子の相対量を定量化し、前記相対量を比率として表し、前記比率によって染色体異常の有無を示すこと、を含んでなる方法。 - 前記鋳型DNAが、ヒト、非ヒト、哺乳動物、爬虫類、ウシ、ネコ、イヌ、ヤギ、イノシシ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、雄牛、牝牛、クマ、ウマ、ヒツジ、家禽類、マウス、ラット、魚類、イルカ、クジラおよびサメよりなる群から選択される供給源から得られる請求項1に記載の方法。
- 前記鋳型DNAが、ヒト供給源から得られる請求項2に記載の方法。
- 鋳型DNAが、細胞、胎児細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、膣分泌液、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚組織、胚芽、4細胞胚芽、8細胞胚芽、16細胞胚芽、32細胞胚芽、64細胞胚芽、128細胞胚芽、256細胞胚芽、512細胞胚芽、1024細胞胚芽、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、糞便物質、または他の身体滲出液:よりなる群から選択されるサンプルから得られる請求項1に記載の方法。
- 複数の関心対象座の対立遺伝子が、塩基配列決定され、それらの相対量が定量化され、比率として表される請求項1に記載の方法。
- 前記複数の関心対象座が、複数の染色体上にある請求項5に記載の方法。
- 前記ヒトが妊娠女性である請求項3に記載の方法。
- 前記妊娠女性の鋳型DNAが、細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、膣分泌液、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、糞便物質、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、および身体滲出液:よりなる群から選択されるサンプルから得られる請求項7に記載の方法。
- 前記サンプルを細胞溶解阻害剤と混合する請求項4に記載の方法。
- 前記細胞溶解阻害剤が、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒドの誘導体、ホルムアルデヒド、ホルマリン、およびホルムアルデヒドの誘導体よりなる群から選択される請求項9に記載の方法。
- 前記サンプルが血液である請求項9に記載の方法。
- 前記サンプルが妊娠女性からの血液である請求項9に記載の方法。
- 前記血液は、胎児が0〜4、4〜8、8〜12、12〜16、16〜20、20〜24、24〜28、28〜32、32〜36、36〜40、40〜44、44〜48、48〜52週目、および52週目以上よりなる群から選択される懐胎期間のヒト妊娠女性から得られる請求項12に記載の方法。
- 前記鋳型DNAが、前記血液の血漿から得られる請求項12に記載の方法。
- 前記鋳型DNAが、前記血液の血清から得られる請求項12に記載の方法。
- 前記鋳型DNAが、母体DNAと胎児DNAとの混合物を含んでなる請求項14または請求項15に記載の方法。
- (a)の前に、母体DNAが、ホモ接合の関心対象座を同定するために塩基配列決定され、さらに前記ホモ接合の関心対象座が、(a)の鋳型DNAにおいて分析された関心対象座である請求項16に記載の方法。
- (a)前に、母体DNAが、ヘテロ接合の関心対象座を同定するために塩基配列決定され、さらに前記ヘテロ接合の関心対象座が、(a)の鋳型DNAにおいて分析された関心対象座である請求項16に記載の方法。
- 対立遺伝子の配列決定が、
(a)第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象座の対立遺伝子を増幅し、制限酵素による消化によって関心対象座を含有する5’オーバーハングが生成するように、前記第2のプライマーが、制限酵素に対する認識部位を含有するものとすること;
(b)前記第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素により前記増幅DNAを消化すること;
(c)鋳型として関心対象座を含有する5’オーバーハングを用いることにより、ヌクレオチドを(b)の消化DNAに取り込むこと;および
(d)(c)のDNA配列を決定することにより関心対象座の対立遺伝子配列を決定すること、を含んでなる請求項1に記載の方法。 - 前記第1および第2のプライマーが、可変ヌクレオチドを含有する制限酵素認識部位の一部を含有し、制限酵素認識部位全体を増幅後に生成する請求項19に記載の方法。
- 前記制限酵素認識部位が、BsaJI、BsskI、DdeI、EcoNI、Fnu4HI、HinfIおよびScrFIよりなる群から選択される制限酵素に対する部位である請求項20に記載の方法。
- 前記制限酵素が、認識部位から離れてDNAを切断する請求項19に記載の方法。
- 前記認識部位が、IIS型制限酵素に対するものである請求項22に記載の方法。
- 前記IIS型制限酵素が、AlwI、Alw26I、BbsI、BbvI、BceAI、BmrI、BsaI、Bst7lI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、EarI、FauI、FokI、HgaI、PleI、SapI、SSfaNI、およびSthi32Iよりなる群から選択される請求項23に記載の方法。
- 前記増幅方法が、ポリメラーゼ連鎖反応、自立配列決定反応、リガーゼ連鎖反応、cDNA端の高速増幅、ポリメラーゼ連鎖反応とリガーゼ連鎖反応、Q−ベータファージ増幅、ストランド置換増幅、およびスプライスオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応:よりなる群から選択される請求項19に記載の方法。
- 前記増幅方法がPCRである請求項25に記載の方法。
- PCRのサイクル1のアニーリング温度が、鋳型DNAにアニールする第2のプライマーの3’領域の一部の略融解点である請求項26に記載の方法。
- PCRのサイクル2のアニーリング温度が、鋳型DNAにアニールする第1のプライマーの3’領域の一部の略融解点である請求項27に記載の方法。
- PCRの残りのサイクルのアニーリング温度が、第2のプライマー全体の略融解点である請求項28に記載の方法。
- 前記配列決定が、対立遺伝子特異的PCR、質量分析、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、塩基配列決定、サンガー(Sanger)ジデオキシ塩基配列決定、DNAマイクロアレイ、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、およびMALDI−TOF質量分析よりなる群から選択される方法を含んでなる請求項1に記載の方法。
- 染色体上のヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子に関する前記比率を総計し、異なる染色体上のヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子に関する比率と比較して、比率の相違が染色体異常の存在を示す請求項1に記載の方法。
- 比較される染色体が、染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、XおよびYよりなる群から選択されるヒト染色体である請求項31に記載の方法。
- 染色体13、18、および21のヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子に関する比率を比較する請求項31に記載の方法。
- 前記関心対象座が、単一のヌクレオチド多型である請求項1に記載の方法。
- 前記関心対象座が突然変異である請求項1に記載の方法。
- 胎児DNAの関心対象座の配列を決定する方法であって、
(a)胎児DNAと母体DNAとを含んでなる鋳型DNA、妊娠女性のサンプルから得ること;
(b)細胞溶解阻害剤を、(a)の前記サンプルに添加すること;および
(c)(b)の前記サンプルからの鋳型DNA上の関心対象座の配列を決定すること、を含んでなる方法。 - 妊娠女性からの前記サンプルが、組織、細胞、血液、血清、血漿、尿および膣分泌液:よりなる群から選択される請求項36に記載の方法。
- 前記サンプルが血液である請求項37に記載の方法。
- 前記細胞溶解阻害剤が、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒドの誘導体、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒドの誘導体、およびホルマリンよりなる群から選択される請求項36に記載の方法。
- ステップ(c)の前に、鋳型DNAが単離される請求項36に記載の方法。
- 前記鋳型DNAが、前記血液の血漿から得られる請求項38に記載の方法。
- 前記鋳型DNAが、前記血液の血清から得られる請求項38に記載の方法。
- ステップ(c)の前に、母親の鋳型DNA上の関心対象座の配列が決定される請求項36に記載の方法。
- ステップ(c)の前に、父親の鋳型DNA上の関心対象座の配列が決定される請求項36に記載の方法。
- 前記関心対象座が、単一のヌクレオチド多型である請求項36に記載の方法。
- 前記関心対象座が突然変異である請求項36に記載の方法。
- 複数の関心対象座の配列が決定される請求項36に記載の方法。
- 複数の関心対象座が複数の染色体上にある請求項47に記載の方法。
- 配列決定が、
(a)第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象座を増幅し、制限酵素による消化が関心対象座を含有する5’オーバーハングを生成するように、前記第2のプライマーが制限酵素に対する認識部位を含有するものとすること;
(b)前記増幅DNAを、前記第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素により消化すること;
(c)鋳型として関心対象座を含有する5’オーバーハングを用いることにより、ヌクレオチドを(b)の消化DNAに取り込むこと;および
(d)(c)のDNA配列を決定することにより関心対象座の配列を決定すること、を含んでなる請求項36に記載の方法。 - 前記第1および第2のプライマーが、可変ヌクレオチドを含有する制限酵素認識部位の一部を含有し、制限酵素認識部位全体を増幅後に生成する請求項49に記載の方法。
- 前記制限酵素が、BsaJI、BsskI、DdeI、EcoNI、Fnu4HI、HinfIおよびScrFIよりなる群から選択される請求項50に記載の方法。
- 前記制限酵素が、認識部位から離れてDNAを切断する請求項19に記載の方法。
- 前記認識部位が、IIS型制限酵素に対するものである請求項52に記載の方法。
- 前記IIS型制限酵素が、AlwI、Alw26I、BbsI、BbvI、BceAI、BmrI、BsaI、Bst7lI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、EarI、FauI、FokI、HgaI、PleI、SapI、SSfaNI、およびSthi32Iよりなる群から選択される
請求項53に記載の方法。 - 前記増幅方法が、ポリメラーゼ連鎖反応、自立配列決定反応、リガーゼ連鎖反応、cDNA端の高速増幅、ポリメラーゼ連鎖反応とリガーゼ連鎖反応、Q−ベータファージ増幅、ストランド置換増幅、およびスプライスオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応:よりなる群から選択される請求項49に記載の方法。
- 前記増幅方法がPCRによるものである請求項55に記載の方法。
- PCRのサイクル1用のアニーリング温度が、鋳型DNAにアニールする第2のプライマーの3’領域の一部の略融解点である請求項56に記載の方法。
- PCRのサイクル2用のアニーリング温度が、鋳型DNAにアニールする第1のプライマーの3’領域の一部の略融解点である請求項57に記載の方法。
- PCRの残りのサイクル用のアニーリング温度が、第2のプライマー全体の略融解点である請求項58に記載の方法。
- 前記配列決定が、対立遺伝子特異的PCR、質量分析、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、蛍光分極、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、蛍光検出、塩基配列決定、サンガー(Sanger)ジデオキシ塩基配列決定、DNAマイクロアレイ、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、およびMALDI−TOF質量分析よりなる群から選択される方法を含んでなる請求項36に記載の方法。
- 胎児DNA上の関心対象座の配列を決定する方法であって、
(a)第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象座を増幅し、制限酵素による消化によって関心対象座を含有する5’オーバーハングが生成するように、前記第2のプライマーが、制限酵素に対する認識部位を含有するものとすること;
(b)前記増幅DNAを、前記第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素により消化すること;
(c)鋳型として関心対象座を含有する5’オーバーハングを用いることにより、ヌクレオチドを(b)の消化DNAに取り込むこと;および
(d)(c)のDNA配列を決定することにより関心対象座の配列を決定すること、を含んでなる方法。 - 胎児DNAおよび母体DNAを含んでなる鋳型DNAを妊娠女性のサンプルから得ること、および細胞溶解阻害剤を妊娠女性からのサンプルに添加することをさらに含んでなる請求項61に記載の方法。
- 妊娠女性からの前記サンプルが、組織、細胞、血液、血清、血漿、尿および膣分泌液:よりなる群から選択される請求項62に記載の方法。
- 前記サンプルが血液である請求項63に記載の方法。
- 前記細胞溶解阻害剤が、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒドの誘導体、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒドの誘導体、およびホルマリンよりなる群から選択される請求項62に記載の方法。
- プライマーセットおよび取扱説明書セットを含んでなる請求項1から65のいずれかの方法に使用するためのキットであって、前記第2のプライマーは、制限酵素による消化が関心対象座を含有する5’オーバーハングを生成するように、制限酵素に対する認識部位を生成する配列を含有するものとするセット。
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