CN102206701B - 遗传性疾病相关基因的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种遗传性家族疾病的相关基因的鉴定方法，其包括以下步骤：1)获得遗传性疾病家系的DNA样本；2)进行相关基因的染色体初步定位；3)任选地，进一步进行相关基因的染色体精确定位和单体型分析；4)结合染色体定位结果，取一定数量的DNA样本，利用人基因组外显子捕获技术确定相关基因。本发明还涉及遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因的鉴定方法，以及分析遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因的试剂盒。

Description

遗传性疾病相关基因的鉴定方法

技术领域

本发明属于遗传学、分子生物学，具体涉及遗传性疾病致病基因的鉴定方法，特别是遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因的鉴定方法。

背景技术

传统的单基因遗传性疾病致病基因的定位方法为：

1)收集家系样本，提取每个样本的基因组DNA，进行全基因组扫描和连锁分析，以初步定位致病基因；

2)接着进行精细定位和构建单体型图，确定致病基因的染色体定位；

3)对致病基因染色体定位区带内的基因进行生物信息学分析，以确定位置候选基因；

4)最后对位置候选基因进行突变筛查，找到家系内和疾病共分离的致病基因。

由于利用这种方法得到的致病基因染色体定位区间内常存在较多候选基因，以至于后续的突变筛查工作量巨大。

研究表明，90％以上的遗传性家族疾病的致病基因发生在外显子上，因此在外显子序列中检测致病基因是更经济和高效的方法。人基因组外显子捕获技术(exome sequenc ing)是通过外显子序列捕获芯片结合目前Solexa高通量测序技术直接解读人类外显子信息。目前一张2.1M芯片能同时捕获约18万个外显子和约550个miRNA，几乎覆盖了所有人类外显子区域，相对于传统的PCR方法该方法极大的提高了对于人类基因组中外显子区域的研究效率，并显著降低了研究成本。

人基因组外显子捕获技术可以应用于单基因病的致病基因的克隆，多态位点的发现，复杂疾病比如癌症、糖尿病、肥胖、高血压等的致病基因和位点等的研究。有研究利用人基因组外显子捕获技术，成功地验证或鉴定出弗里曼谢尔登综合征(Freeman Sheldon syndrome)、米勒综合症(Miller syndrome)和巴特综合症(Bartter syndrome)的突变基因(Ng et al.Targeted capture and massively parallelsequencing of 12human exomes.Nature(2009)vol.461(7261)pp.272-6；Ng et al.Exome sequencing identifies the cause of amendelian disorder.Nat Gene t(2010)vo l.42(1)pp.30-35；ChoiM，Scholl UI，Ji W，Liu T，Tikhonova IR，Zumbo P，et al.Geneticdiagnosis by whole exome capture and massively parallel DNAsequencing.Proc Natl Acad Sci U S A 2009；106：19096-101.)。

但利用人基因组外显子捕获技术发现致病基因的方法，也有其缺点和不足，如每个样本都需要经过外显子序列捕获芯片检测和Solexa高通量测序，所需费用很高，不利于该技术的大规模应用。

因此亟需一种既能利用人基因组外显子捕获技术的高效快捷、又能有效降低检测成本的方法。

发明内容

为了解决上述问题，找到一种既高效快捷又经济的致病基因获得方法，发明人经过不懈地努力和大量地实验，确定了将传统的致病基因定位方法和崭新的人基因组外显子捕获技术相结合的方法，在对相关基因进行染色体初步定位的基础上，利用人基因组外显子捕获技术找到遗传性疾病的相关基因，建立了一种寻找遗传性疾病相关基因的新方法。具体地，

本发明的一个方面涉及一种遗传性疾病相关基因的鉴定方法，其包括以下步骤：

1)针对遗传性疾病家系基因突变个体的全基因组DNA以及正常个体的全基因组DNA进行连锁分析，得到疾病相关基因的染色体初步定位；以及任选地，进一步进行疾病相关基因的染色体精细定位和单体型分析；

2)根据步骤1)的分析结果，利用人基因组外显子捕获技术对选自1)中的基因突变个体的全基因组DNA进行外显子捕获和分析，以此鉴定遗传性疾病的相关基因。

在本发明中，遗传性疾病是指单基因遗传性疾病，在本发明的一个实施方案中，所述单基因遗传性疾病为遗传性脊髓小脑型共济失调。

在本发明中，DNA样本来自于组织、血液或各种体液等。

在本发明中，染色体初步定位方法为连锁分析，所述连锁分析包括全基因组扫描的步骤，所述全基因组扫描可以为微卫星全基因组扫描或SNP全基因组扫描，在本发明的一个实施方案中，所述全基因组扫描为SNP全基因组扫描。

在本发明的一个实施方案中，染色体初步定位方法为：首先应用HumanLinkage-12Panels(Illumina，San Diego，CA)对经纯化的待测样本的基因组DNA(gDNA)进行全基因组扫描；然后应用Des igner软件及Linkage软件进行孟德尔遗传模式的校对与检查；使用Linkageversion 5.2软件包中的MLI NK程序进行两点连锁分析；初步确定相关基因的染色体定位。连锁分析设置的参数为：微卫星标记的等位基因频率相等，在男女中的重组相等，假设的发病率为0.0001，外显率为95％(Lathrop GM，Lalouel JM.Easy calculations of lod scores andgenetic risks on small computers.Am J Hum Genet 1984；36：460-5.)。

在本发明的一个实施方案中，染色体精细定位和单体型分析的方法为：

1、选取Marshfield数据库中初步定位区间周围的微卫星标记Marker。

2、每个Marker对应的引物分别标有不同颜色的荧光染料，用这些微卫星标记进行多重PCR。

3、然后对PCR产物进行处理及毛细管凝胶电泳测序仪测序、数据收集、转换与处理。

4、使用Des igner软件及Linkage软件检测基因型数据的错误并进行孟德尔遗传模式的校对与检查。

5、构建单体型图，根据单体型图中的交换，确定共分离区的边界，再结合步骤4的结果，进一步缩小致病基因在染色体上的区间位置。

在本发明中的一个实施方案中，人基因组外显子捕获技术包括以下步骤：

1)取样品DNA利用超声法随机打断至片段大小为200-300bp；

2)在打断的DNA片段两端加上“接头”；

3)将加上接头的DNA片段和Nimblegen公司的芯片HD2.1array杂交；

4)对杂交后洗脱下来的DNA片段进行扩增；

5)纯化扩增产物；

6)利用Illumina公司的测序仪GA II对扩增产物进行测序；

7)将测序结果与数据库中人基因组序列进行比对。

本发明的另一方面涉及一种样品中遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因的鉴定方法，其包括以下步骤：

1)测定待测样品中转谷氨酰胺酶6基因编码序列第1550位碱基或该基因10号外显子第214位碱基；

2)相应位置的碱基为T，则所述遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因为野生型，相应位置的碱基为G，则所述遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因为突变型。

在本发明的一个实施例中，步骤1)中转谷氨酰胺酶6基因第1550位碱基或其10号外显子的第214位碱基序列的测定采用PCR的方法，所述PCR引物对例如可以为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示序列。

本发明的还一方面涉及一种遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因的检测剂，其至少包括根据转谷氨酰胺酶6基因编码序列或其10号外显子序列设计的PCR引物，所述引物用于PCR扩增，其扩增产物包含转谷氨酰胺酶6基因编码序列第1550位碱基或其10号外显子的第214位碱基序列，所述引物例如为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示序列。

本发明的还一方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒至少包括：

1)根据转谷氨酰胺酶6基因编码序列或其10号外显子序列设计的引物，所述引物用于PCR扩增，其扩增产物包含转谷氨酰胺酶6基因编码序列第1550位碱基或其10号外显子序列的第214位碱基序列；所述引物例如为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示序列；

2)任选地，包含用于PCR的DNA扩增酶和相应缓冲液。

所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

1)在试剂盒的试剂中加入待测样品DNA，进行PCR反应，得到PCR产物；可选地，将PCR产物进行分离纯化，得到纯化产物；

2)对PCR产物或纯化产物进行测序；

3)判断测序结果中转谷氨酰胺酶6基因编码序列第1550位碱基是否由T变为G，或者其10号外显子序列的第214位碱基是否由T变为G。

本发明的还一方面涉及所述试剂盒用于鉴定遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因的用途。

在本发明的一个实施方案中，发明人以遗传性脊髓小脑型共济失调(hereditary spinocerebellar ataxias，SCAs)为例，检测出一个新的疾病相关基因。具体方法如下：

发明人采集到一个四代遗传的常染色体显性SCA家系，对家系内9名患者、18名正常人和3名临床诊断不清者，利用基因扫描与连锁分析对相关基因进行染色体初步定位，在20号染色体单核苷酸多态(SNP)标记rs12624577和rs2225471之间(20p13-12.2)发现阳性LOD值，区间内rs976192处为最大LOD值，Z＝3.85(θ＝0.00)，提示该SCA家系的相关基因与该区域连锁。进一步精细定位和单体型分析将致病区域确定在D20S199和D20S917之间，两者的遗传距离为18.45厘摩(cM)，内含91个基因。

在定位的基础上，取该家系中一个患者(基因突变个体)的基因组DNA，利用人基因组外显子捕获技术，在定位区间内成功地克隆了一个新的SCA相关基因——转谷氨酰胺酶6基因(transglutaminase 6，TGM6)，发现了相关的基因突变——TGM6基因10号外显子(exon10)上杂合突变T1550G，导致转谷氨酰胺酶6(TG6)氨基酸序列517位亮氨酸(Leu)被色氨酸(Trp)替代。该突变在家系中所有在世的9名患者中存在，家系内正常人无该突变。进一步对500个正常人的TGM6基因突变筛查未发现T1550G突变，排除了单个核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)的可能性，确定TGM6基因T1550G突变是该常染色体显性遗传SCA家系的相关基因突变。

在本发明中，所述遗传性疾病是指生殖细胞或受精卵的遗传物质(染色体和基因)发生突变(或畸变)所引起的疾病，通常具有垂直传递的特征，具有以上特征的家族成员及其关系称为遗传性疾病家系。

发明的有益效果

本发明将致病基因的染色体定位和人基因组外显子捕获技术相结合，在相关基因染色体定位的基础上，利用人基因组外显子捕获技术发现遗传性疾病的相关基因，建立了一种寻找遗传性疾病相关基因的新方法。该方法方便、快捷，而且由于只需取一个基因突变样本进行人基因组外显子序列捕获，大大降低了成本。

附图说明

图1该SCA家系先证者(先证者指家族性遗传疾病中第一个被诊断为该病的患者)头部磁共振成像(MRI)

MRI显示小脑中度萎缩和脑干轻度萎缩

图2该SCA家系单体型分析

图3A：正常人转谷氨酰胺酶6基因编码序列(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)中的1546位-1554位碱基测序结果以及对应编码的氨基酸；B：家系中SCA患者转谷氨酰胺酶6基因编码序列(SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5)的1546位-1554位碱基测序结果显示第1550位碱基发生了突变，由T突变为G，并引起相应编码的第517位氨基酸由亮氨酸到色氨酸的改变。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1SCA家系相关基因的染色体定位

遗传性脊髓小脑型共济失调(hereditary spinocerebellarataxias，SCAs)是一组具有高度的临床和遗传异质性的神经系统退行性疾病，其遗传方式多呈常染色体显性遗传(autosomal dominant，AD)，患者多于中青年发病，临床上以小脑性共济失调为主要特征，同时还可伴有眼球运动障碍、慢眼活动、视神经萎缩、视网膜色素变性、锥体束征、锥体外系表现、肌萎缩、周围神经病和痴呆等表现。发病率约为5-7/100,000。该病发病机制未完全明确，目前尚无有效的治疗方法。

随着分子遗传学研究的发展，到目前共发现SCA有31个定位位点，已克隆的19个致病基因包括ATAXIN1、ATAXIN2、MJD、Puratrophin-1、SPTBN2、CACNA1A、ATXN7、ATXN8OS/ATXN8、ATXN10、TTBK2、PPP2R2B、KCNC 3、PRKCG、ITPR1、TBP、FGF14、AFG 3L2、PLEKHG4以及DRPLA(DiBella D，Lazzaro F，Brusco A，et al.Mutations in themitochondrial protease gene AFG3L2cause dominant hereditaryataxia SCA28.Nat Genet 2010；42：313-21；Matilla-DuenasA，SanchezI，Corral-Juan M，et al.Cellular and molecular pathwaystriggering neurodegeneration in the spinocerebellar ataxias.Cerebellum 2010；9：148-66；SatoN，Amino T，KobayashiK，et al.Spinocerebellar ataxia type 31 is associated with″inserted″penta-nucleotide repeats containing(TGGAA)n.Am JHum Genet 2009；85：544-57.)。但仍有12个SCA亚型的致病基因尚未发现，全球范围内约有33％的SCA患者分型不明。新的SCA相关基因的克隆有利于明确SCA患者的分子诊断及分子分型，并可用于分型明确的SCA患者产前诊断，指导优生优育。此外，新的SCA相关基因的克隆将为研究SCA的发病机理提供重要线索，对SCA的诊断治疗具有十分重要而深远的意义。

发明人采集到一个四代遗传的常染色体显性SCA家系，家系内患者表现为进行性加重的行走困难和小脑性构音障碍，绝大部分患者存在腱反射活跃/亢进，部分患者伴有手部震颤和痉挛性斜颈，头部核磁共振成像检查(MRI)示小脑中度萎缩及脑干轻度萎缩(图1)。

对家系内9名患者(男5名，女4名)和18名正常人(男7名，女11人)，3名临床诊断不明确(男2名，女1名)采集外周静脉血并提取基因组DNA，利用基因扫描与连锁分析对相关基因进行染色体初步定位，在20号染色体单核苷酸多态(SNP)标记rs12624577和r s2225471之间(20p13-12.2)发现阳性LOD值，区间内rs976192处为最大LOD值，Z＝3.85(θ＝0.00)，提示该SCA家系的相关基因与该区域连锁。

基因扫描与连锁分析的具体方法为，首先应用HumanLinkage-12Panels(Illumina，San Diego，CA)对经纯化的待测样本的基因组DNA(gDNA)进行全基因组扫描；然后应用Designer软件及Linkage软件进行孟德尔遗传模式的校对与检查；使用Linkage version 5.2软件包中的MLINK程序进行两点连锁分析；初步确定相关基因的染色体定位。连锁分析设置的参数为：微卫星标记的等位基因频率相等，在男女中的重组相等，假设的发病率为0.0001，外显率为95％(Lathrop GM，Lalouel JM.Easy calculations of lod scores and genetic risks onsmall computers.Am J Hum Genet 1984；36：460-5.)。

进一步进行精细定位和单体型分析，其具体方法为：

1)选取Marshfield数据库中rs12624577和rs2225471周围13个微卫星标记Marker。

2)每个Marker对应的引物分别标有不同颜色的荧光染料，用这些微卫星标记进行多重PCR。

3)然后对PCR产物进行处理及毛细管凝胶电泳测序仪测序、数据收集、转换与处理。

4)使用Designer软件及Linkage软件检测基因型数据的错误并进行孟德尔遗传模式的校对与检查。

然后根据家系中交换数最少的原则对单体型进行人工修正，构建家系的单体型图，用来确定共分离区的边界。家系内和疾病共分离是指家系内所有患者均携带有完全相同的单体型，家系内正常人均不带有该单体型。最终将致病区域确定在D20S199和D20S917之间，两者的遗传距离为18.45厘摩(cM)，内含91个基因(精细定位结果详见表1，单体型分析结果详见图2)。

表1精细定位结果

实施例2利用人基因组外显子捕获技术捕获该SCA家系相关基因

在定位的基础上，发明人利用人基因组外显子捕获技术，在定位区间内成功地克隆了一个新的SCA相关基因-转谷氨酰胺酶6(TGM6)的基因突变体。具体操作步骤如下：

1)取该SCA家系中一个患者的基因组DNA；

2)利用超声法随机打断外周血DNA至片段大小为200-300bp；

3)在打断的DNA片段两端加上“接头”；

4)将加上接头的DNA片段和Nimblegen公司的芯片HD2.1array杂交72小时(具体操作方法参见说明书)；

5)对杂交后洗脱下来的DNA片段进行扩增；

6)纯化扩增产物；

7)利用Illumina公司的测序仪GA II对扩增产物进行测序。

以上DNA随机打断、加接头和测序方法可参考Accurate wholehuman genome sequencing using reversible terminator chemistry.Nature 456，53-59(6November 2008)。

在本实施例中，只需取该SCA家系中一个患者的基因组DNA进行人基因组外显子序列捕获，而无需进行所有患者的检测，因而大大降低了成本。

测序后，得到很多一段段的测序序列，将这些序列与NCBI、UCSC等公认的权威数据库中人基因组序列进行比对，就可以得出任一序列在基因组中位于什么位置，如在哪个基因内或在该基因的哪个外显子，以及该碱基序列与参考序列相比有没有改变。由此得到了5000多个和参考序列不同的突变位点。将这些突变位点结果与实施例1中的定位结果进行比对，最终得到与SCA相关基因相关的突变位点。具体分析步骤为：

(1)去除原始序列中的测序引物。

(2)将所有序列比对到人基因组(NCBI HG18)。

(3)使用soapsnp软件获得所有突变位点。

(4)过滤掉质量较低的突变，保留深度大于等于4，质量值大于等于20的突变。

(5)过滤已知突变，得到与SCA相关基因相关的突变位点。

在本实施例中，我们外显子捕获并测序得到了一段序列(SEQ IDNO：6)。经比对，该段序列位于TGM6基因的10号外显子区(其参考序列为SEQ ID NO：3所示序列)，该基因编码序列的1550位碱基在参考序列中是T(参见SEQ ID NO：1)，而测序序列中是G(参见SEQID NO：4)，提示测序样本中该位点发生了T→G的突变(即T1550G突变)，该突变为杂合突变，导致TG6氨基酸序列中第517位的亮氨酸(Leu)被色氨酸(Trp)替代(TGM6基因未突变核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示，该基因突变的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示)。

由于TGM6还存在另一种剪接形式，其编码序列如SEQ ID NO：2所示，因此，当10号外显子发生上述的T→G的突变时，SEQ ID NO：2的第1550位碱基由T变为G(即变为SEQ ID NO：5)，其编码的第517氨基酸由亮氨酸(Leu)突变为色氨酸(Trp)。

实施例3PCR检测TGM6基因是否发生T1550G突变

分别对实施例1中所述家系内9名SCA患者、18名正常人和3名临床诊断不清者的基因组中遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因进行检测，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因10号外显子的序列，根据序列测定结果属于突变型遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因还是野生型遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因，验证遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因与SCA的相关性。具体方法步骤如下：

1)DNA提取：

分别采取9名SCA患者、18名正常人和3名临床诊断不清者的外周静脉血，每人5mL，经枸橼酸钠抗凝，常规酚/氯仿法提取基因组DNA，分光光度计测DNA含量，并稀释至20ng/μL；

2)引物设计及PCR反应

a)引物序列：

根据遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因10号外显子的核苷酸序列设计如下的引物：

正向引物：5′gCCAgTTTgACTTCCATgAgCC 3′(SEQ ID NO：7)

反向引物：5′CCTCTgACCTCCACAACCCTCC 3′(SEQ ID NO：8)

b)反应体系：10μL

LA Taq酶(5U/μL)          0.1μL

2×GC Buffer I(加入了Mg²⁺)5μL

2mM dNTP                  0.4μL

正向引物(100ng/μL)       0.2μL

反向引物(100ng/μL)       0.2μL

DNA模板                   1μL

dH₂O                      加至10μL

c)反应条件：

3)将步骤2中获得的获自18名正常人、3名临床诊断不清者以及获自9名SCA患者的PCR扩增产物直接进行DNA 序。

对于获自该SCA家系内的18名正常人的PCR扩增样品，以及3名临床诊断不清者中的两名，测得的序列如SEQ I DNO：9所示。

GCCAGTTTGACTTCCATGAGCCATAGTAAATTAAAGGAGCAAGGGGGTGCCTGCC GCTGACGTTGTGTGATGCCCTGCAGGGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACAGGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAAGGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGACCTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGCATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCTGAGACTGGCCCTGTGCTGGCCAACCTCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATCCTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAGATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAGGTAAGTGTACGCTGGCTTGGTGGAATCAGGCCAAACCACCTCCTTT TTCAGGAGGGTTGTGGAGGTCAGAGG(SEQ ID NO：9)

对于获自9名SCA患者的PCR扩增样品，以及3名临床诊断不清者中的1名，测得的序列如SEQ ID NO：10所示。

GCCAGTTTGACTTCCATGAGCCATAGTAAATTAAAGGAGCAAGGGGGTGCCTGCCG CTGACGTTGTGTGATGCCCTGCAGGGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACAGGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAAGGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGACCTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGCATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCTGAGACTGGCCCTGTGCTGGCCAACCTCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATCCTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAGATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAGGTAAGTGTACGCTGGCTTGGTGGAATCAGGCCAAACCACCTCCTTTT TCAGGAGGGTTGTGGAGGTCAGAGG(SEQ ID NO：10)

结果分析：

1)9名患者遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因的10号外显子的第214位均发生了T→G的突变。3名临床诊断不清者，其中一名10号外显子的第214位也发生了T→G的突变，该结果和连锁分析，单体型结果一致。。

2)10号外显子第214位的T→G突变(即由SEQ ID N0：3变为SEQ IDNO：6)，对应于遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因第1550位碱基发生了T→G的突变，该突变导致遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因的编码蛋白质的第517位氨基酸序列由亮氨酸(Leu)变为色氨酸(Trp)。

此外，本发明人还进一步对500个正常人的遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因进行了突变筛查，未发现上述的T→G突变，排除了单个核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的可能性，确定上述的T→G突变是该常染色体显性遗传SCA家系的相关基因突变，可以作为遗传性脊髓小脑型共济失调的辅助诊断方法。

实施例4：检测突变的试剂盒的组成及使用方法

A：试剂盒组成

引物：

gCCAgTTTgACTTCCATgAgCC 0.3μL(SEQ ID NO：7)

CCTCTgACCTCCACAACCCTCC 0.3μL(SEQ ID NO：8)

LA Taq酶(5U/μL)            0.1μL

2×GC Buffer I(加入了Mg²⁺) 5μL

2mM dNTP                    0.4μL

B：使用方法

1)在试剂盒的组成成分中加入待测DNA样品后进行PCR反应；

2)PCR反应产物经纯化后测序，将所得到的序列与TGM6正常基因序列比对，确定TGM6基因10号外显子第214位碱基是否存在T→G的突变。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (8)

1.一种遗传性疾病相关基因的鉴定方法，其包括以下步骤：

1)针对遗传性疾病家系基因突变个体的全基因组DNA以及正常个体的全基因组DNA进行连锁分析，得到疾病相关基因的染色体初步定位，所述的连锁分析方法包括全基因组扫描的步骤；以及进一步进行疾病相关基因的染色体精细定位和单体型分析；

2)根据步骤1)的分析结果，利用人基因组外显子捕获技术对选自1)中的基因突变个体的全基因组DNA进行外显子捕获和分析，以此鉴定遗传性疾病的相关基因；所述外显子捕获后的分析包括将外显子捕获后获得的测序序列与人参考基因组序列进行比对，由此得到和参考序列不同的突变位点，将这些突变位点与步骤1)的结果进行比对，最终得到该遗传性疾病的相关基因；

所述染色体精细定位和单体型分析的方法为：

1)选取Marshfield数据库中初步定位区间周围的微卫星标记Marker；

2)每个Marker对应的引物分别标有不同颜色的荧光染料，用这些微卫星标记进行多重PCR；

3)然后对PCR产物进行处理及毛细管凝胶电泳测序仪测序、数据收集、转换与处理；

4)使用Designer软件及Linkage软件检测基因型数据的错误并进行孟德尔遗传模式的校对与检查；

5)构建单体型图，根据单体型图中的交换，确定共分离区的边界，再结合步骤4的结果，进一步缩小致病基因在染色体上的区间位置。

2.权利要求1的方法，其中所述遗传性疾病是指单基因遗传性疾病。

3.权利要求2的方法，其中所述单基因遗传性疾病是指遗传性脊髓小脑型共济失调。

4.权利要求1的方法，其中步骤1)中所述的全基因组扫描为微卫星全基因组扫描或SNP全基因组扫描。

5.一种遗传性脊髓小脑型共济失调相关基因的检测剂，其至少包括根据转谷氨酰胺酶6基因编码序列或其10号外显子序列设计的PCR引物，所述引物用于PCR扩增，其扩增产物包含转谷氨酰胺酶6基因编码序列第1550位碱基或其10号外显子的第214位碱基序列；

所述转谷氨酰胺酶6基因为人转谷氨酰胺酶6基因。

6.权利要求5的检测剂，其中所述引物为SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所示序列。

7.试剂盒，所述试剂盒至少包括：

1)根据转谷氨酰胺酶6基因编码序列或其10号外显子序列设计的引物，所述引物用于PCR扩增，其扩增产物包含转谷氨酰胺酶6基因编码序列第1550位碱基或其10号外显子的第214位碱基序列；

2)任选地，包含用于PCR的DNA扩增酶和相应缓冲液；

所述转谷氨酰胺酶6基因为人转谷氨酰胺酶6基因。

8.权利要求7的试剂盒，其中所述引物为SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所示序列。