CN103374575B - Cyp4v2基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明“CYP4V2基因突变体及其应用”，属于医学分子生物学领域。本发明一方面请求保护分离到的原发性结晶样视网膜变性疾病的CYP4V2新突变致病基因及其突变体多肽，其特征在于所述突变致病基因的核酸样本与编码野生型CYP4V2蛋白的基因，如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相比，第219位碱基发生T>A的突变。本发明基于该分离到的致病突变体基因，进一步提供了筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的方法、筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的系统，用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的试剂盒以及筛选治疗或预防原发性结晶样视网膜变性疾病的药物的方法。

Description

CYP4V2基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及医学分子生物学领域，具体地，涉及分离的CYP4V2突变体的核酸，分离的多肽，以及筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的方法、筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的系统，用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的试剂盒以及筛选治疗或预防原发性结晶样视网膜变性疾病的药物的方法。

背景技术

原发性结晶样视网膜变性（Bietti’s crystalline dystrophy，在本文中有时也简称为“BCD”）是常见的遗传性致盲疾病，在全世界的发病率约为1/24000，其高发人群是中国人，在我国的发病率约为1/4000。BCD患者通常20—30岁发病，40—50岁致盲，目前已经成为威胁全球青年和中年人群视觉功能、视觉质量的主要眼部疾病，最终严重影响患者的生活质量，给家庭和社会带来了巨大的负担。BCD是由于视网膜感光细胞（包括视锥细胞和视杆细胞）和视网膜色素上皮细胞变性,伴随进行性脉络膜血管萎缩、硬化而导致的致盲性眼病。

BCD的遗传方式主要是常染色体隐性遗传（autosoma recessive BCD，简称为ARBCD）。到目前为止，通过连锁分析或候选基因筛选已经确定了1个基因位点，并已经得到克隆(RetNet:http://www.sph.uth.tmc.edu/retnet/sum-dis.htm)。尽管现在发现了一个BCD致病基因，但仍存在着相当一部分未知致病基因位点，预计在人类基因组中可能仍然存在多个位点与BCD相关。

因此，目前对原发性结晶样视网膜变性疾病的研究仍有待深入。

发明内容

以下概括描述本发明要求保护的技术方案：

1.根据本发明的一方面，本发明提供一种分离的原发性结晶样视网膜变性疾病的CYP4V2新突变致病基因，其特征在于，所述突变致病基因的核苷酸序列与编码野生型CYP4V2蛋白的基因相比，第219位碱基发生T>A的突变。

本发明通过Sanger外显子测序和基因突变验证的方法确定了原发性结晶样视网膜变性疾病（BCD）新的致病基因突变（CYP4V2c.219C>G p.F73L）。

CYP4V2基因突变体

根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：1相比，该核酸具有p.F73L突变。在本文中所使用的表达方式“编码CYP4V2突变体的核酸”，是指与编码CYP4V2突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与CYP4V2突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码CYP4V2突变体的核酸为DNA。

根据本发明的实施例，发明人确定了CYP4V2基因的新突变体，这些新突变体与原发性结晶样视网膜变性疾病的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性疾病，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感原发性结晶样视网膜变性疾病。

该编码CYP4V2突变体的核酸，是本申请的发明人通过Sanger法测序验证方法确定的原发性结晶样视网膜变性疾病的致病基因上的新突变。CYP4V2基因突变位点如：c.802-8_810del17insGC,c.992A>C,and c.1091-2A>G已经在其他发表的文章中被证实与BCD相关，但本次发现的突变位点为新的，在现有技术中并未被提到。

野生型CYP4V2基因的核苷酸序列具有4711nt,其中第305～1882nt之间为编码区（如SeqID No.1所示），其编码Theoretical pI/Mw:7.19/60.72KDa大小的CYP4V2蛋白(编码区)，该蛋白质含有525个氨基酸，具有Seq ID No.2所示的氨基酸序列。

发明人发现的新突变体与SEQ ID NO：2相比，具有p.F73L突变，即相对于野生型CYP4V2基因，本发明的CYP4V2基因突变体的cDNA中第219位的T突变为A，由此，其所编码的产物与CYP4V2蛋白（SEQ ID NO：2）相比，具有p.F73L突变，即219位的F（苯丙氨酸）突变为L（亮氨酸）。

已知，CYP4V2基因所编码全长19.28kp，包含11个外显子,编码产物为525个氨基酸的蛋白质，该蛋白属于CYP450家族,在脂肪酸代谢中发挥重要作用，基于CYP4家族酶的保守性和一些早期的CYP4V2同源模型的分析和体内体外实验证实，很多氨基酸的缺失和替代导致转录蛋白严重的结构变化，酶活性的丧失,影响CYP4V2的活性，使其不能发挥正常的功能。

2.根据本发明的实施例，本发明还提供一种分离的原发性结晶样视网膜变性疾病的CYP4V2新突变体，其特征在于，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2相比，具有p.F73L突变。

根据本发明的实施例，本发明还提供一种发明人确定了CYP4V2的新突变体结构，该新突变体与原发性结晶样视网膜变性疾病（BCD）的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性疾病。

本发明的实施例根据获得的突变基因获得了分离的突变体多肽，该多肽与SEQ ID NO：2相比，具有p.F73L突变。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码CYP4V2突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性疾病，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感原发性结晶样视网膜变性疾病。

3.本发明的实施例还提供了筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的方法，包括以下步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有p.F73L突变是所述生物样品易感原发性结晶样视网膜变性疾病的指示。

通过根据本发明实施例的筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的方法，可以有效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品。

筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的方法

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的方法可以包括以下步骤：

首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品CYP4V2是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中CYP4V2是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含CYP4V2编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的效率。

另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集CYP4V2外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用CYP4V2外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集CYP4V2外显子（尤其是第2号外显子），从而能够进一步提高筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的效率。

根据本发明的实施例，CYP4V2外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些CYP4V2外显子特异性引物具有SEQ ID NO：5和6所示的核苷酸序列：

ACCTGGCTTCCTCTAACAGTAACA（SEQ ID NO：5）

TTTTTGTGCTGAAATGGCTGAA（SEQ ID NO：6）

发明人惊奇地发现，通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对CYP4V2外显子的扩增。需要说明的是，SEQ ID NO：5和6所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide（Part#1005361;Feb2010）或Paired-End SamplePrep Guide（Part#1005063；Feb2010），通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads）作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应CYP4V2的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有p.F73L突变，则指示生物样品易感原发性结晶样视网膜变性疾病。由此，通过根据本发明实施例的筛选易感原发性结晶样视网膜色素变性疾病的生物样品的方法，可以有效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

4.本发明的实施例还提供了筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的系统，该系统包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有p.F73L突变，判断所述生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性疾病。

参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的系统1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增，富集CYP4V2外显子，进一步提高筛选易感原发性结晶样视网膜色素变性疾病的生物样品的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设置有CYP4V2外显子特异性引物，以便利用CYP4V2外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，CYP4V2外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：5和6所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的区别判断生物样品是否易感原发性结晶样视网膜色素变性疾病。具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有p.F73L突变，判断生物样品是否易感原发性结晶样视网膜变性疾病。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有p.F73L突变，是生物样品易感原发性结晶样视网膜变性疾病的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品。

5.本发明的实施例还提供用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的试剂盒，包括：适于检测CYP4V2基因突变体的试剂，所述CYP4V2基因突变体是指其与SEQ IDNO：1相比，具有p.F73L突变。

根据本发明的实施例，该用于筛选易感原发性结晶样视网膜色素变性疾病的生物样品的试剂盒包括：适于检测CYP4V2基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该CYP4V2基因突变体具有p.F73L突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测CYP4V2基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测CYP4V2编码基因的试剂，也可以是检测CYP4V2突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针，由此，可以高效地筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品。

需要说明的是，在本文前面筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

6.本发明还提供筛选治疗或预防原发性结晶样视网膜变性疾病的药物的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：

将能够表达CYP4V2基因突变体的生物样品在存在候选试剂的情况下进行培养，其中所述CYP4V2基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有p.F73L突变；

同时将所述能够表达CYP4V2基因突变体的生物样品在不存在所述候选试剂的情况下进行培养；

确定所述能够表达CYP4V2基因突变体的生物样品在存在所述候选试剂和不存在所述候选试剂的情况下，细胞凋亡率的变化，其中存在所述候选试剂时，所述细胞凋亡率低于不存在所述候选试剂时的细胞凋亡率，是所述候选试剂作为治疗或预防原发性结晶样视网膜变性疾病的药物的指示。

根据本发明的实施例，该筛选治疗或预防原发性结晶样视网膜变性疾病的药物的方法可以包括以下步骤：

首先，将能够表达CYP4V2基因突变体的生物样品在存在候选试剂的情况下进行培养，其中CYP4V2基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有p.F73L突变。这里所使用的术语“培养”应做广义理解，是指使得生物样品以有活性的状态存在。根据本发明的实施例，生物样品的类型不受特别限制，只要该生物样品能够表达这样一种CYP4V2基因突变体即可，该突变体与SEQ ID NO：1相比，具有p.F73L突变。根据本发明的一些具体示例，生物样品可以为选自细菌、酵母、人体视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞中的至少一种。

其次，将上述生物样品在不存在该候选试剂的情况下进行培养。接着，确定上述生物样品在存在候选试剂和不存在候选试剂的情况下，细胞凋亡率的变化，其中存在所述候选试剂时，所述细胞凋亡率低于不存在所述候选试剂时的细胞凋亡率，是所述候选试剂作为治疗或预防原发性结晶样视网膜变性疾病的药物的指示。

利用本发明的筛选治疗或预防原发性结晶样视网膜变性疾病的药物的方法，能够有效地筛选治疗或预防原发性结晶样视网膜变性疾病的药物。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1A为根据本发明实施例的筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的系统的示意图；

图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图；

图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了发明人在重庆长寿区收集到的1例BCD家系的谱系图；

图3显示了BCD患者的眼底像；

图4显示了根据本发明实施例的Sanger法测序验证CYP4V2(exon2，219C>G)杂合突变与BCD之间相关性的部分代表性结果；

图5显示了根据本发明实施例的对多个物种CYP4V2蛋白的序列进行比对的结果。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。

一般方法

2008年，发明人在贵州遵义收集到1例BCD患者（如图2所示），该家系成员共4人，其中患者1人，正常成员3人。参与本发明研究的共3人，其中患者1人，正常成员（父母）2人，所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书。

在该家系中，患者30岁出现夜盲，眼底检查表现为典型结晶样视网膜变性改变：后极部视网膜可见少量的结晶样颗粒沉积，脉络膜血管硬化，毛细血管萎缩，视网膜色素上皮萎缩。图3显示了BCD患者的眼底像：双眼眼底视盘边界清楚，色蜡黄，视网膜血管变细，后极部及中周部视网膜可见骨细胞样色素沉着，视网膜色素上皮层弥漫性萎缩。该家系中结晶样视网膜变性的表型表现为隐性遗传模式，患者的双亲未患病，是杂合携带者；双亲无病的子女不患病，符合常染色体完全隐性遗传特征。

随后，发明人用Sanger测序方法对先证者（图2中黑色实心圆所代表成员）的外显子组序列进行了测序。

具体如下：

对经过验证的3个de novo SNP位点在家系成员中和正常人群对照组基因组DNA中进行扫描，最终确定CYP4V2基因c.219T→A杂合突变导致CYP4V2蛋白发生F73L错义突变，此基因突变在该常染色体隐性遗传结晶样视网膜变性家系中与疾病表型共分离，并在正常对照人群中未检出该突变。

通过对CYP4V2蛋白在不同物种间保守性的分析，提示该突变位点在物种间高度保守。对CYP4V2p.F73L蛋白结构模拟，提示该突变位于2个CYP4V2功能域之间的连接区域，突变可以导致周围蛋白的空间构象发生改变，并影响蛋白表面电荷的分布，从而引起该蛋白解螺旋功能的异常。综上推测，CYP4V2基因c.219T>A突变极有可能为该BCD家系的致病基因。

实施例1对候选CYP4V2进行Sanger法测序验证

针对CYP4V2(exon1-11)序列设计引物，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得有关序列。

1.1DNA提取

BCD家系中的先证者（图2中的Ⅱ：1）外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/微升，总量不少于30微克。

1.2引物设计

PCR反应引物设计参考人类基因组序列，具体见下表1

PCR反应体系：25微升

体系组成	体积
		DNA模板(20ng/微升)	1微升
2×GC BufferⅠ(加入了Mg2+)	2.5微升

2mM dNTP	2微升
		LA Taq酶（5U/微升）	0.25微升
引物（100ng/微升）正/反向	各1微升
		去离子水	加至25微升

反应条件：

实施例2F73L突变位点在正常人群对照组中的Sanger法测序验证

分别对图2所示家系中BCD患者和100名家系外正常人基因进行检测。其中，针对CYP4V2(exon2219T>A)序列设计引物，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得有关序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证以上杂合突变与BCD之间相关性。具体方法步骤如下：

2.1DNA提取：分别对家系中（图2）2例正常成员（Ⅰ：1、Ⅰ：2）和100名与家系无血缘关系的正常人外周静脉血按照实施例1中1.1部分所描述的方法提取基因组DNA，分光光度计测DNA含量。

2.2引物设计及PCR反应：采用实施例1中1.2部分中所述的目标引物（primer2F/R）和PCR条件，对所得到的基因组DNA进行PCR扩增。

新突变体引物序列

2.3Sanger法测序验证结果：将所获得的PCR扩增产物直接进行Sanger法测序验证，其中图4显示了Sanger法测序验证CYP4V2(exon2219T>A)杂合突变与BCD之间相关性的部分代表性结果。由图4可知，CYP4V2基因野生型为219A/A纯合，突变型为219T/A杂合型，突变导致CYP4V2蛋白的219位苯丙氨酸改变为亮氨酸。此外，通过验证发现CYP4V2c.219T→A杂合突变在家系中不表现为疾病表型共分离，即患者均携带该复合杂合突变（2个等位基因）而未受累的家族成员（父母）各自携带致病的单个突变（1个等位基因）。同时，发明人在100个与该BCD家无亲缘关系的正常对照中排查均未发现该突变位点。

实施例3CYP4V2p.F73L物种保守性分析

发明人使用NCBI数据库对CYP4V2基因的物种同源性进行了比较(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=Retrieve&db=homologene&dopt=MultipleAlignment&list_uids=5859)，结果见图5。图5显示了多个物种CYP4V2蛋白的序列对比结果。由图5可知CYP4V2F73L在哺乳动物中高度保守，表明CYP4V2蛋白的73位苯丙氨酸在物种间是保守的。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种分离的原发性结晶样视网膜变性疾病的CYP4V2新突变致病基因，其特征在于，所述突变致病基因的核酸样本与编码野生型CYP4V2蛋白的基因，如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相比，第219位碱基发生T>A的突变，所述突变致病基因的核酸样本指人工分离或合成的单链DNA、双链DNA、RNA或DNA与RNA的聚合物。

2.一种分离的原发性结晶样视网膜变性疾病的CYP4V2新突变体多肽，其特征在于，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2相比，具有p.F73L突变。

3.筛选易感原发性结晶样视网膜变性疾病的生物样品的试剂盒，包括：适于检测CYP4V2基因突变体的试剂，所述CYP4V2基因突变体是指其与SEQ ID NO：1相比，具有p.F73L突变。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述检测CYP4V2基因突变体的试剂指检测CYP4V2突变编码基因的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述检测CYP4V2突变编码基因的试剂是核酸探针。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，所述检测CYP4V2基因突变体的试剂指检测CYP4V2突变体多肽的试剂。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，所述检测CYP4V2基因突变体的试剂是特异性识别所述突变体位点的抗体。