CN101243193A - 半胱氨酸双加氧酶中的多态性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及半胱氨酸双加氧酶(CDO)中多态性的检测和鉴定，该鉴别用于鉴定患者患上类风湿性关节炎和/或产生众多药物副作用的倾向；编码所述多态性的核酸和分离的蛋白；用于CDO活性和用于影响CDO活性的化合物的鉴定的测定；另外，本发明还涉及干扰素γ任选联合不同化合物在治疗类风湿性关节炎中的应用。

Description

半胱氨酸双加氧酶中的多态性
技术领域
本发明涉及半胱氨酸双加氧酶(CDO)中多态性(polymorphism)的检测和鉴定，该鉴别用于鉴定患者患上类风湿性关节炎和/或产生众多药物副作用的倾向；编码所述多态性的核酸和分离的蛋白；用于CDO活性和用于影响CDO活性的化合物的鉴定的测定；另外，本发明还涉及干扰素-γ任选联合不同化合物在治疗类风湿性关节炎中的应用。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病，其特征在于患者关节中的慢性炎症和组织破坏。这种疾病是如何被引发的确切原因还未清楚。然而，存在遗传易感性和微生物传播方面的证据，但是这两方面都没有得到令人满意的描述。疾病发作时，促炎细胞因子加大释放，导致肢体关节周围的慢性炎症，慢慢促成患者失能加剧。关节周围的滑膜长得比正常大小明显要大。这种组织的增生会造成关节翳(即，在其扩散时导致韧带和骨质破坏的大量成纤维细胞)的形成。通常，随着滑液在关节周围聚集，关节会发炎。滑液本身是身体血清、淋巴细胞和分泌的许多化学信号物质的混合物。其中，所述化学信号物质是促炎细胞因子，其延续受影响的个体的慢性炎症和进程性机能不全。
在类风湿性关节炎的情况中，促炎细胞因子的两个例子是TNFα(肿瘤坏死因子α)和IL-1(白介素-1)。已知类风湿性关节炎发作早期中的信号转导因子的超表达非常有助于疾病症状的发展，而所述细胞因子的持续合成则有利于疾病状态的维持。类风湿性关节炎治疗的很多研究都基于对所述细胞因子的阻断。例如，市场上有很多的抗TNF药物(例如由Centocor制造的Ifliximab和由Amgen制造的Etanercept)。另外，已知还有抗IL-1的药物(例如由Amgen制造的Anakira)。
半胱氨酸双加氧酶(CDO)是参与含硫化合物代谢的酶。其催化半胱氨酸形成半胱氨酸磺酸。这又在很多不同途径例如生成牛磺酸、磺基丙氨酸、丙氨酸和β-亚磺酰丙酮酸等途径中得到利用。由于后一种化合物被代谢成亚硫酸盐，然后代谢成硫酸盐，因此特别受到关注。虽然存在其他的硫酸盐形成途径，但是它们明显没有那么重要。与自身免疫性或炎性组分有关的各种病况如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、原发性胆汁性硬化、克罗恩病和强直性脊柱炎已表明和患有这些疾病的患者中的高血浆水平的半胱氨酸和低血浆浓度的无机硫酸盐有关。
硫酸盐参与见于关节本身的滑液、蛋白和糖胺聚糖的磺化。磺化水平的降低导致这些物质保护性能和润滑性能的下降，从而使疾病的病况恶化。
Wilkinson L.J.和Waring R.H.(Toxicol in vitro(2002)，第481～483页)已证明，CDO是参与无机硫酸盐氧化降解的限速酶。他们留意到，炎性病况如类风湿性关节炎(RA)与患者中半胱氨酸：硫酸盐的高比率有关。他们还证明，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β(TGF-β)能够抑制某些细胞系中的CDO生成的表达。他们推断这些细胞因子可能通过降低CDO表达来参与RA的恶化。在这篇文章中，通过使用抗体和Western印迹检测CDO来测定人神经元和肝(Chang)细胞系中的CDO。
目前类风湿性关节炎测试包括类风湿性因子测试(RF)。类风湿性因子是最终存在于大部分RA患者中的抗体。然而，不是所有的RA患者的RF测试都呈阳性，尤其是在疾病早期，所述测试得到极限值的阴性结果。相反，RF测试呈阳性的其他患者从不患上这种疾病。这种测试有60％至70％类风湿性关节炎患者呈阳性，这通常是关节炎患者中诊断类风湿性关节炎而没有其他明显诊断结果的论据。然而，类风湿性因子还出现在其他疾病中。
还有很多常规的生物化学指示物为炎症的活性和程度提供一些迹象，但是这些指示物同样对类风湿性关节炎没有特异性。使用X射线或MRI(核磁共振成像)的放射学检查也可能检测到类风湿性关节炎，但是同样滞后于疾病的进展。另外，HLA分型可以用于查找与DR1和DR4有关的标记。在基于医院的调查中，70％至90％类风湿性关节炎患者具有这些标记，但是约30％的普通群体也有这些标记。因此，还需要针对类风湿性关节炎的进一步的诊断测试。
本发明人意外发现，在RA患者和具有RA家族史的人群中，有很多见于编码CDO的DNA或控制CDO表达的调节区中的多态性，因而提示RA和低浓度CDO有关。而且，他们发现了新的用于CDO表达的测定，并确定有大量的药物包括干扰素-γ(IFN-γ)增强CDO的表达，从而表明IFN-γ可以用于治疗RA。
EP 0974358A建议用IFN-γ来治疗与HTLV-1有关的疾病。HTLV-1与成人T细胞白血病有关。还推测HTLV-1可能参与大量的其他疾病，包括斯耶格伦氏综合征、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎和慢性类风湿性关节炎。现已知道，HTLV只是罕见地(如果有的话)与慢性RA有关。
本申请的发明人认为，CDO可能是用于关节组分磺化的硫酸盐的生成中的关键限制步骤。他们因此研究两类不同群体的核酸样品：患有类风湿性关节炎群体和对照群体。在对CDO基因进行测序时，他们意外地发现，与对照群体相比，类风湿性关节炎群体的突变水平很高。而且，他们还留意到，鉴定有突变之一的一个对照只有25岁，但是具有类风湿性关节炎家族史，因此表明所述突变不仅是提示类风湿性关节炎存在的标记，而且是提示个体一生中的后期可能发展为类风湿性关节炎的标记。
发明内容
因此，本发明提供了一种用于诊断CDO介导的病况的方法，该方法包括：
(i)从个体中获取样品；
(ii)检测是否存在变异性CDO蛋白、或编码CDO变体和/或CDO调节区变体的核酸；
(iii)参考CDO基因和/或其调节区中的多态性来确定所述个体的状况。
磺化量出现下降可能是由于CDO蛋白表达下降的缘故。优选的是，所述调节区是编码CDO的区域的5′。其可以是启动子区或增强子区。作为选择，可以生成CDO蛋白，但是编码该蛋白的DNA中的突变会导致CDO中的一个或多个氨基酸发生改变，从而造成CDO具有较低的酶活性。CDO蛋白生成水平的下降和CDO酶活性的下降都会导致硫酸盐生产量的下降。因此，通过查找编码CDO变体的核酸、其调节区中的多态性，或者作为选择，查找与具有正常水平CDO的正常个体比较所述变体生成的蛋白在蛋白结构上的变化，可以对变异性CDO进行检测。
据认为，CDO的正常水平为10至30皮摩尔/毫克蛋白，可能为5至100皮摩尔/毫克蛋白。认为正常CDO的酶活性为10至30皮摩尔/毫克蛋白/小时，可能为5至100皮摩尔/毫克蛋白/小时。
本发明还提供了人中CDO基因或其调节序列中的一个或多个多态性的鉴定方法，该方法包括确定编码至少一部分CDO基因和/或CDO调节区的核酸分子序列和参考CDO基因和/或其调节区中的多态性来确定该人的状况。
多态性是指群体中出现两个以上遗传决定的备选等位基因或序列。多态性标记是趋异发生的位点。例如，一个碱基(如腺嘌呤)可以被不同的碱基(如胸腺嘧啶)所替代。作为选择，一个或多个另外的碱基可以在所述位点插入。一个碱基取代另一个碱基时的多态性可能导致例如密码子的改变，使得在衍生自核酸序列的信使RNA被翻译为最终的酶时导致不同氨基酸被插入到蛋白中。例如，GCC是编码丙氨酸的密码子。如果该密码子发生改变，使得其含有腺嘌呤残基如GAC，该密码子将被错读并导致插入的是天冬氨酸残基而不是丙氨酸。一个或多个碱基的取代还可能导致例如终止密码子的产生，从而导致蛋白形成的终止。这种取代如果发生在调节序列，如发生在CDO基因上游的启动子序列，就可能会导致CDO表达水平的下降。作为选择，编码加工信号的序列也可能影响到最终CDO产物的表达。
其他突变包括当一个或多个碱基插入到DNA中时的添加突变和当一个或多个碱基从编码调节序列或CDO序列本身的DNA中缺失时的缺失突变。所述缺失可能导致截断蛋白的生成，或者作为另外一种可能，导致CDO基因表达水平的下降。
优选的是，查找两个以上的多态性。优选所述标记具有至少两个等位基因，每个等位基因以大于1％，优选至少为10％以上、15％以上、20％以上、30％以上的所选群体(例如患有RA的群体)的频率发生。
单核苷酸多态性(SNP)通常如其名称所意指的，是存在于某物种的某些成员的核酸序列中的单核苷酸变异或点变异。物种中的所述多态性变异通常被认为是整个进化过程中的自发突变的结果。
多态性还影响mRNA的合成、突变、运输和稳定性。没有导致氨基酸变化(沉默多态性)或者没有改变任意已知的保守序列的多态性例如通过改变mRNA的折叠、稳定性、拼接、转录速度、翻译速度和忠实性而仍然具有生物学作用。实际上已有报道，即使是没有导致氨基酸改变的多态性，也可以导致mRNA的结构上的不同折叠，具有潜在的不同生物学功能(Shen等(1999)PNAS USA，第96卷，第7871～7876页)。因此，发生在编码区之外(例如在内含子序列和启动子区)的改变可能影响该序列的转录和/或信使稳定性，从而影响细胞中CDO蛋白的水平。
优选所述多态性选自：
Figure A20068003036400101
已知CDO包含5个外显子。CDO的核苷酸序列可以通过Genbank(可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov登陆)获得。该核苷酸序列可以以三段获得。第一段CDO的长度为4186个核苷酸，包括外显子1(核苷酸609～1026)和外显子2(核苷酸4000～4077)，并可以由Genbank登录号U60232.1，GI：2138108获得。第二段CDO的长度为2739个核苷酸，包括外显子3(核苷酸1735～1889)，并可以由Genbank登录号U78979.1，GI：1699035获得。第三段CDO的长度为2995个核苷酸，包括外显子4(核苷酸1115～1284个)和外显子5(核苷酸2173～2907)，并可以由Genbank登录号U80055.1，GI：2138109获得。
在序列表中，第一段＝SEQ ID No.1，第二段＝SEQ ID No.2，第三段＝SEQ ID No.3，外显子1＝SEQ ID No.4，外显子2＝SEQ ID No.5，外显子3＝SEQ ID No.6，外显子4＝SEQ ID No.7，而外显子5＝SEQ IDNo.8。
以上给出的SNP坐标指的是可从NCBI数据库获得的野生型CDO核苷酸序列的SNP坐标。对于外显子1，该坐标对应于第一段(即Seq.IDNo.1)的编号。因此，所鉴定的多态性没有位于外显子1的编码序列中，而是位于外显子1的侧翼区。对于外显子3和4，SNP坐标分别对应于外显子3(即Seq.ID No.6)和外显子4(即Seq.ID No.7)的编号。
多态性可以在基因组DNA中检测到。作为选择，多态性也可以在RNA如mRNA或由所述mRNA获得的cDNA中检测到。
本发明的方法提供了指示该人具有浓度降低的CDO和/或表达酶活性降低的CDO。
可以从例如血液或其他身体组织或者口腔检查用拭子获取所述样品。所述鉴别优选在体外进行。
CDO介导的病况可以是类风湿性关节炎和/或一种或多种选自D-青霉胺和硫代苹果酸金的药物引起的副作用进程。
利用一种或多种多态性的存在与否来辅助所述诊断。
鉴定个体或人患上类风湿性关节炎的倾向的能力使得所述个体可以在形成类风湿性关节炎疼痛症状之前用例如氨甲喋呤进行治疗。这有助于防止患者发生侵蚀性类风湿性关节炎。这意味着可以早期鉴定所述个体，并能够通过防止类风湿性关节炎的完全发作来显著提高他们的生活质量。
已知D-青霉胺和硫代苹果酸金等药物在对正用这些化合物治疗的类风湿性关节炎患者中引起副作用。据认为，由于这些患者具有低水平的CDO或低水平的活性CDO，所述药物不能被正确氧化。因此，能够鉴定出可能出现所述副作用的那些患者是有帮助的，因为这可以让所述患者采用另外的药物。
鉴定核酸区中是否存在多态性的方法本身是公知的。
优选的是，在鉴定多态性之前，采用聚合酶链式反应对多态性进行扩增。这可以简单地通过如下方法来实现：使用针对多态性上游的序列的引物，扩增一段编码多态性的核酸，然后对所扩增的序列进行测序。作为选择，引物可以针对多态性位点，让引物的序列基本上与感兴趣的多态性序列互补，使得引物杂交到多态性位点上，然后用以生成PCR产物。如果所述位点不存在感兴趣的多态性，那么引物就不会结合到该位点上，也不会生成PCR产物。结果就没有检测可用的PCR产物。实时PCR可以用来鉴定SNP。由于采用例如荧光分子标记引物、探针和扩增子的各种化学方法的出现，实时PCR得到了发展。反应通常在用作比色杯的毛细管中建立，因而可以在每个循环结束时对荧光信号进行监测。这可以在同一管子中进行靶扩增和检测，形成不需要扩增后处理和检测的封闭管体系。例如，WO97/46712公开的热循环方法和设备。
WO 00/18965公开了针对检测突变或多态性的存在的方法。该方法基于杂交探针解链曲线分析，使用聚合酶链式反应和荧光标记寡核苷酸杂交探针来鉴定突变和多态性。所用的荧光团可以是本领域已知的众多不同化合物中的一种，包括溴乙锭、YO-PRO-1和SYBR Green I。荧光共振能量转移(Fluorescent resonance energy transfer，FRET)依赖于两个杂交探针的相邻退火(Lay NJ.和Wittwer CT.Clin.Chem.(1997)，第43卷，第2262～2267页)。第一探针在其3′端含有供体染料，而另一个探针在其5′端含有受体染料。当通过外源加光时，所述供体染料受到激发并在荧光共振能量转移过程中将能量转移到受体染料上。只有当两个引物在紧密靠近处退火时，才可能发生能量转移。因此，所述技术可以检测互补引物与特异多态性的结合。
作为选择，可以采用较简单的技术，例如在可能存在多态性的位点附近进行核酸的扩增。可以例如使用电泳来分离所扩增的DNA，并使用与感兴趣的多态性互补的标记探针来探测所述DNA。可以使用本领域已知的放射性标记或例如荧光标记来标记所述标记探针。
优选所用的方法包括本发明的方法，其中通过选自ARMS-等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接测定和限制性片段长度多态性(RFLP)的方法来测定核酸序列。ARMS-等位基因特异性扩增在例如EP 0332435和US 5,595,890中有描述。这种方法依赖于引物的3′末端核苷酸及其模板的互补性。引物的3′末端核苷酸与待检测的特异性突变、等位基因或多态性要么互补要么不互补。RFLP依赖于影响限制性内切酶位点的序列的改变，由此防止该位点被限制性酶所消化。
个体中是否存在一个或多个(优选为两个以上)不同多态性可以确定个人患上例如类风湿性关节炎和/或产生待测定药物副作用的倾向。与所述CDO缺陷有关的其他疾病可包括自身免疫疾病如系统性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征、葡萄膜炎、克罗恩病、强直性脊柱炎，神经退行性疾病如帕金森症和阿尔茨海默症和运动神经元病。可能与CDO缺陷有关的其他疾病包括那些涉及针对炎性细胞因子的抗体的疾病。
本发明还提供用于本发明方法的等位基因特异性探针或引物。如上所述，用以鉴定多态性的方法本身是公知的。一旦鉴定出多态性，适当的探针或引物的鉴定本身一般在本领域技术人员的知识范围之内。
优选的探针或引物包括以下序列：
外显子1：正向引物：gagggccgttggtacattcc     [SEQ ID No.9]
外显子1：反向引物：gccagtcactttgggctgc      [SEQ ID No.10]
外显子1：反向引物：ctactggccttgctgacctc     [SEQ IDNo.17]
外显子2：正向引物：gcttgtttcagcaacgaactt    [SEQ ID No.11]
外显子2：反向引物：ttttcatatgctagaaaacatgctc[SEQ ID No.12]
外显子3：正向引物：gaccatctactgagttcagttg   [SEQ ID No.13]
外显子3：反向引物：tcttcccacttgcccttaga     [SEQ ID No.14]
外显子4：正向引物：tttttccttcccggatattg     [SEQ ID No.15]
外显子4：反向引物：cagtgccaacctacagagca     [SEQ ID No.16]
开始时设计外显子1引物来与登录号为D85778.1 GI：1747325(外显子1)的序列杂交，所述登录号为D85778.1 GI：1747325的序列可从www.ncbi.nlm.nih.gov公开获得。
优选的探针特异性地与含有所述感兴趣的SNP的核酸区域杂交，并且本领域技术人员熟悉用于设计具有适当的特性例如特异性和解链温度的引物的技术。
优选的是，所述探针或引物能够检测到如下多态性：
Figure A20068003036400141
本发明的探针或引物优选对应于待检测的多态性，即它们与待检测的多态性互补。本发明的探针或引物的长度优选为17～50个核苷酸，更优选为约17～30个核苷酸。所述引物或探针可对应于多态性的约6～8个核苷酸。
如果将所述探针或引物简单作为探针使用，即作为标记使用，而不是作为PCR引物使用，可以将探针的大小减少到例如8～25，优选为8～15个碱基的长度。
优选的是，本发明的探针或引物与多态性位点具有至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。优选的是，它们与所述多态性位点相同，或作为选择与所述多态性位点互补。当然，所述探针或引物可以结合到编码CDO的核酸或其含有多态性的调节区上的链上，或者作为选择，结合到其互补链(当存在时)上。
还提供了包含一个或多个本发明探针或引物的诊断试剂盒。
本发明的另一方面提供了编码CDO或CDO调节多态性或者与所述多态性互补的具有至少5个碱基的分离的核酸。优选所述多态性选自：
Figure A20068003036400151
以及与所述序列互补的序列。优选的是，所述分离的核酸包含至少10、15、20、30或40个碱基。
更优选的是，所述分离的核酸分子编码CDO或其片段，更优选的是，所述CDO或其片段包含多态性。
还提供了可获自所述核酸分子的分离的CDO蛋白。由分离的核酸分子制备重组蛋白的方法在本领域内是众所周知的。所述分离的核酸分子可以克隆到适当的载体中并在适当的原核或真核宿主中表达。
因此，本发明还提供了含有本发明的所述分离的核酸分子的载体和宿主细胞。所述载体优选含有本领域已知类型的适当启动子和终止序列。作为选择，可以使用CDO自身的启动子和调节序列，由此使得可以研究多态性对一个或多个这些序列的影响。在后一种情况中，所述调节序列可以结合到本领域已知的适当的报告序列，如可以容易测定其表达的β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白。
如上所述，多态性可以导致CDO的氨基酸序列的变化，从而造成酶结构的变化。通过分离一个或多个抗体，如CDO蛋白特异性的单克隆抗体，可以容易地鉴定酶结构的所述变化。即，所述抗体不会同样与编码核酸序列中不含有多态性的CDO结合。单克隆抗体的制备本身是众所周知的，例如可以通过Kohler和Milstein的方法进行。
本发明的又一方面提供了确定个体具有CDO介导病况的倾向的方法，所述方法包括：
(i)从所述个体获取样品；和
(ii)使用本发明的抗体检测含有所述多态性的CDO的存在。
优选的是，本发明人意外地发现，CDO在白细胞中表达。先前已发现CDO在大脑和肺组织中。所述组织不易获得。因此，优选本发明方法中所用的具有例如变异性CDO或编码CDO的核酸或者实际上其调节序列的样品获自白细胞。
含有CDO的组织样品相对容易的获得性允许对将产生的CDO活性进行测定。因此，本发明的另一方面提供了确定化合物对CDO活性的影响的方法，所述方法包括：
(i)提供白细胞样品；
(ii)使所述白细胞与CDO底物和所述化合物接触；和
(iii)确定所述化合物对所述白细胞中的CDO使所述底物向可检测产物转化的影响。
CDO底物的例子包括半胱氨酸、S-羧甲基半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、金硫代苹果酸盐(auro thiomalate)、N-乙酰基半胱氨酸、烷基-半胱氨酸和D-青霉胺。这些底物分解生成包括半胱氨酸亚磺酸在内的产物。
所述方法可以用来鉴定用于治疗类风湿性关节炎的药物候选物。即，可以测定例如细胞因子，或者作为另一种选择的不同化合物对白细胞中CDO表达的影响。
本发明人的其他工作还表明，干扰素-γ(IFN-γ)可以提高CDO的表达。这与降低CDO表达的TNF-α相反。
由于CDO对人体吸收硫酸盐而言是关键的，而低水平的硫酸盐与类风湿性关节炎有关，因此预期IFN-γ可以用作治疗剂。
因此，本发明提供了一种治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括施用药学有效量的干扰素-γ(IFN-γ)。优选的是，所述类风湿性关节炎为非HTLV-1相关的类风湿性关节炎。如已表明的那样，HTLV-I相关的类风湿性关节炎被认为是相对罕见的。
干扰素-γ可以与一种或多种能够提高硫酸盐生成水平的化合物联合施用。所述化合物包括：半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、N-乙酰基半胱氨酸、S-烷基-半胱氨酸、γ-谷酰基半胱氨酸、白介素-4和白介素-10。
还提供用于制造用以治疗类风湿性关节炎的药物的IFN-γ，其任选与以上所列的硫酸盐诱导化合物联合。
本发明的又一方面提供了一种药用组合物，所述药用组合物包含干扰素-γ以及诸如以下一种或多种的硫酸盐诱导化合物的组合：半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、N-乙酰基半胱氨酸、S-烷基-半胱氨酸、γ-谷酰基半胱氨酸、白介素-4、S-羧甲基半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸和白介素-10。
干扰素-γ已被许可临床上用于治疗慢性肉芽肿病以有助于减少严重感染。其剂量为90毫克，每周3次。适用于治疗类风湿性关节炎的剂量预计处在类似的剂量范围内。
IFN-γ和上述可选的其他化合物可以与一种或多种诸如葡萄糖、蔗糖或海藻糖等稳定剂联合使用。可以使用IFN-γ和/或所述硫酸盐诱导化合物的药用盐。
另外，可以加入一种或多种可接受的药用稀释剂、赋形剂、填充剂、稳定剂、pH控制剂、生物活性物质等。
优选的是，所述物质形成口服剂，如胶囊剂、粉剂或片剂。作为选择，所述物质可以通过另外途径如肌肉内注射而使用。
附图说明
下面将通过参考以下附图，仅通过举例方式来描述本发明。
图1显示人CDO基因的内含子和外显子排列。
图2显示CDO的外显子1、2、3和4的内含子和外显子序列。大写字母表示外显子序列，小写黑体字母表示内含子序列。各行的数字为该编码行第一个碱基的位置。CDO序列由National Center for BiotechnologyInformation(www.ncbi.nhn.nih.gov)获得。CDO的登录号为U60232(U60232.1，GI：2138108)。
图3显示设计用于扩增CDO外显子2(A部分)、外显子3(B部分)、外显子4(C部分)和外显子1(D部分)的第一套引物的图。引物区域以小写字母但没有加粗显示，并画上下划线，旁边标以箭头而表示根据引物进行合成的方向。显示有两个不同的外显子1反向引物。在备选的外显子1反向引物(SEQ ID No 17)和外显子1的引物结合区域(即，靶区域)之间有单核苷酸不同。
图4显示降落PCR产物的凝胶图像。各泳道为(从图的左边开始数)：(1)对照外显子4；(2)对照外显子3；(3)对照外显子2；(4)DNA梯度序列。
图5显示使用对照模板并向反应物中加入DMSO所得到的PCR产物的凝胶图像。可以看到外显子2、3和4(画有圆圈)。在PCR扩增外显子1时没有使用DMSO(未示出)。
图6显示：
A)对照PCR反应的镁梯度系列。各泳道为(从左数起)：(1)E4，[MgCl2]4；(2)E3，[MgCl2]4；(3)E2，[MgCl2]4；(4)E4，[MgCl2]3；(5)E3，[MgCl2]3；(6)E2，[MgCl2]2；(7)E4，[MgCl2]2；(8)E3，[MgCl2]2；(9)E2，[MgCl2]2；(10)梯度序列。
B)类风湿性关节炎模板PCR反应(包含DMSO)的镁梯度系列。各泳道为(从左数起)：(1)E4，[MgCl2]4；(2)E3，[MgCl2]4；(3)E2，[MgCl2]4；(4)E4，[MgCl2]3；(5)E3，[MgCl2]3；(6)E2，[MgCl2]3；(7)E4，[MgCl2]2；(8)E3，[MgCl2]2；(9)E2，[MgCl2]2；(10)E4，[MgCl2]1；(11)E3[MgCl2]1；(12)E2，[MgCl2]1；(13)梯度序列。
在这些图中，由E2(外显子2)、E3(外显子3)和E4(外显子4)鉴定到外显子，所用的MgCl2的体积以微升计。例如泳道(1)显示外显子4，其在4μl MgCl2的存在下进行扩增。
图7显示降落PCR的PCR产物的凝胶图像。来自对照和RA DNA的所有外显子都得到成功扩增。
图8以举例的方式显示均来自RA外显子3的两个测序结果的比较。(A)PCR产物纯化时的结果，序列差，双重信号，有很多“N”(未确定的核苷酸)；(B)凝胶提取结果，序列好，并且碱基位置得到很好的确定。
图9显示多态性对氨基酸取代的预计影响。已包括所有潜在的SNP(见表3)，因此所示影响更加突出它们将在体内发生。以加粗箭头标出的位点表示取代SNP。较细的箭头表示添加SNP。带下划线表示不同于正常(对照)序列的氨基酸序列。(A)外显子2多态性；(B)外显子3多态性；(C)外显子4多态性。
图10显示经过滤的SNP分析。外显子3显示氨基酸序列变化明显减少，而外显子4尽管SNP数减少了，但是仍然保持非常高水平的氨基酸间断。
图11显示外显子1的PCR产物的凝胶图像。
泳道1：DNA梯度序列；泳道2～7：外显子1；泳道8：阳性对照。
具体实施方式
材料和方法
基因组DNA样品由类风湿性关节炎(RA)患者和对照志愿者(C)的血液获得。通过静脉穿刺将血液收集到经EDTA处理的管子中。按如下所述进行PCR。
引物设计
设计特异性PCR引物以扩增CDO的外显子1、2、3和4。设计引物时使用获自NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)的序列数据和基于互联网的引物设计工具Primer 3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi，该网站由Massachusetts Institute of Technology(http://web.mit.edu/index.html)主办)。寡核苷酸引物由Alta Biosciences(Birmingham，UK)合成，随后使用蒸馏水稀释至100皮摩尔(pM)/μL的浓度。
聚合酶链式反应(PCR)
CDO外显子2、3和4通过PCR进行扩增。
对于每个外显子，混合引物(母液为10pM/ml)样品各10μl，并在蒸馏水中进一步稀释至5pM/μL的浓度，而获得用于每个外显子的正向引物和反向引物的混合溶液。用于反应的模板DNA有两种：对照“C”和“RA”。可获得多个对照和患者样品。对照样品仅用数字命名，而RA患者DNA样品则用数字加前缀“A”命名。这样，模板样品有90、91、92、93和94(对照)以及A11、A12、A13、A14、A16、A17、A18和A19(RA)。PCR反应在热循环仪中进行。
在冰上在0.5ml微量离心管中建立以下反应：
DNA                3μl
10×PCR缓冲液      5μl
dNTP混合物(200μM) 2.5μl
正向引物           2.5μl
反向引物           2.5μl
聚合酶             2U
无菌水             补至50μl
dNTP混合物、聚合酶和PCR缓冲液获自Bioline(London，UK)。PCR缓冲液为NH4反应缓冲液。有些反应中也使用DMSO(二甲亚砜)。氯化镁(50nM)以1μl～5μl的体积加入。PCR混合物的总体积为50μl。
典型的PCR程序：
1.94℃，5分钟。解链步骤。
2.94℃，30秒钟，解链步骤。
3.53℃*，30秒钟。退火步骤。
4.72℃，1分钟。延伸步骤。
5.步骤2～4重复30个循环。
6.72℃，10分钟。最后的延伸步骤。
*退火温度由计算引物的解链温度并减去5℃计算确定。引物的解链温度可以使用本领域技术人员已知的公式算得。
进行初始PCR后，由于没有马上取得成功，因此促使采用降落PCR。降落PCR使用非典型的程序，其中退火温度在整个循环中定期改变。降落PCR由比预计退火温度高的温度开始，并在经过设定数目的循环(例如5个循环)后降低1℃，最终在最后一组循环中达到“降落式”的退火温度。如此进行的原因在于要确定是否需要调整PCR程序的退火温度。还已表明，降落PCR减少错误的引发(Don，RH，Cox，PT，Wainwright，BJ，Baker，K和Mattick，JS(1991)；″Touchdown″PCR to circumvent spuriouspriming during gene amplification.Nucleic Acids Research 19：4008)，即，引物在不正确的位置发生非特异性退火，导致很多不同的PCR产物生成，因而在凝胶上得到差的(弥散的或扩散的)条带。
降落PCR程序：
  1   94℃，5分钟
  2   94℃，30秒钟   ))步骤2～4重复5个循环)
  3   58℃，30秒钟
  4   72℃，1分钟
  5   94℃，30秒钟   ))步骤5～7重复5个循环)
  6   56℃，30秒钟
  7   72℃，1分钟
  8   94℃，30秒钟   ))步骤8～10重复5个循环)
  9   54℃，30秒钟
  10   72℃，1分钟
  11   94℃，30秒钟   ))步骤11～13重复5个循环)
  12   52℃，30秒钟
  13   72℃，1分钟
  14   94℃，30秒钟   ))步骤14～16重复5个循环)
  15   50℃，30秒钟
  16   72℃，1分钟
  17   94℃，30秒钟   ))步骤17～19重复5个循环)
  18   48℃，30秒钟
  19   72℃，1分钟
  20   72℃，10分钟
PCR的优化
对PCR程序进行优化以准确并可靠地扩增出半胱氨酸双加氧酶外显子2、3和4。采用多种策略进行优化，其中大部分都涉及到改变特定反应组分的浓度或者在添加剂存在或不存在的情况下进行试验。加以控制的变量包括：
·氯化镁浓度
·模板DNA浓度
·引物浓度
·引物设计
·DMSO添加/省略
然而，对于外显子1采用以下PCR程序：
步骤1.1个循环的：94℃，1分钟
步骤2.30个循环的：
                 94℃，30秒钟
                 61℃，30秒钟
                 72℃，1分钟
步骤3.1个循环的：72℃，10分钟。
并且反应组分为
DNA             3μl
10×PCR缓冲液   5μl
dNTP混合物      2.5μl
外显子引物      12.5μl(两个引物中的每一个，浓度各为10μM)
聚合酶的酶混合物2U
无菌水          补至50μl
这些实验的结果采用琼脂糖凝胶电泳和随后的DNA“质粒到曲线(Plasmid to Profile)”测序进行评价。
外显子1的PCR扩增
采用标准PCR或降落PCR，使用如SEQ ID No.9和10所示的PCR引物对外显子1进行扩增。还使用SEQ ID No.9和17通过降落PCR扩增外显子1。
琼脂糖凝胶电泳
在该研究的不同阶段使用1％、2％和3％的琼脂糖凝胶。在TAE缓冲液中制备琼脂糖凝胶。TAE缓冲液的50×母液的组成为：242g Tris碱、57.1ml冰醋酸、100ml的0.5M EDTA(pH 8)；用蒸馏水补至1升。根据标准方法制备琼脂糖凝胶(Molecular Cloning：Sambrook，Fritsch和Maniatis，1989)，并且其中含有标准浓度的溴乙锭(Sigma)。
PCR结束后，将10μl的PCR产物等分试样加到0.5ml微量离心管中的4ul体积的凝胶上样染料(这种情况下为橙G和甘油)中。然后将这些样品上样到凝胶中。除了PCR引物外，将2μl上样染料和5μl 100bpDNA梯度序列(Bioline)的混合物吸移到每块凝胶的第一个孔。将凝胶在125伏特电泳不同的时间(通常为至少1小时)，让DNA片段在凝胶上充分迁移，使得用肉眼在紫外线下可以观察到它们的分离。对电泳条件进行优化研究以获得适当的分辨率并使条带得以充分的分离。
PCR产物纯化
进行凝胶电泳后，对所选的PCR产物进行纯化，以将所述DNA与产物混合物的其他组分(变性的Taq DNA聚合酶、引物、dNTP等)分离。这采用Qiagen PCR产物纯化试剂盒(Qiagen，UK)进行。该试剂盒使用多种缓冲液(结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液)和离心柱，以从所述PCR混合物中分离出所述DNA。根据制造商说明书(与试剂盒一起提供)使用该试剂盒。该试剂盒从PCR产物中洗脱出在50μl EB缓冲液溶液(洗脱缓冲液)中的所述DNA。
凝胶提取
用以在PCR后获得纯DNA样品的另一种方法是从琼脂糖凝胶中提取感兴趣的条带。嵌入有溴乙锭使得DNA可以在紫外线下得以辨认。使用锋利的洁净刀片从凝胶上切下感兴趣的条带。将切下的条带放入1.5ml微量离心管中，使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，UK)分离所述DNA。该试剂盒有多种缓冲液(类似于PCR纯化试剂盒的缓冲液)和离心柱组成(与来自PCR纯化试剂盒的离心柱相同)。在50μl体积的洗脱缓冲液(EB缓冲液)中获得最后纯化的DNA样品。
DNA定量
DNA测序要求所提交的样品含有特定量的DNA(在目前的情况中为200ng～600ng的DNA)。因此，使用紫外分光光度计在260nm波长处对从纯化过程得到的终溶液中存在的DNA的量进行定量。为了将吸光值转换成每微升的DNA纳克数，进行以下公知计算：
UV吸光度×50×500＝DNA ng/μl
用于测序的DNA样品的制备
将浓度准确的用于进行“质粒到曲线”测序的DNA分装(由制造商进行)为200ng/ml～600ng/ml。在该研究阶段，部分实验的目的是确定测序溶液中DNA的最佳浓度以获得最佳结果。实验后，将样品稀释至适当的DNA浓度，以得到最佳的结果。最后，将含有适当引物的等分试样(0.64μl的5pM/μl的引物溶液)加到DNA样品中，以使引物在测序样品中的量为3.2pM(0.64×5＝3.2)。然后将其提交到Universityof Birmingham Functional Genomics Laboratory进行“质粒到曲线”测序。
序列分析
所完成的测序结果以ChromasTM(软件：Chromas v4.1TM和ChromasPro v1.5TM
Figure A20068003036400241
Telynesium Pty.Ltd.http://www.telynesium.com.au)格式(.abl文件)由Functional Genomics Laboratory网站获得。这些文件可以使用所述Chromas软件打开和读取。在该软件中，可以(结合互联网连接)对从测序获得的序列数据进行BLAST检索。这种检索的结果可以得到一系列的来自众多来源的基因和DNA序列，其中以同源性的顺序排列显示与所查询的序列(即，来自质粒到曲线测序的数据)的同源性。这些结果称为“BLAST命中记录(hit)”。如果测序完全顺利，顶部的BLAST命中记录将为“Homo sapiens Cysteine Dioxygenase Exon...”。在BLAST输出中也包括序列比对图，其显示查询序列和对照序列之间的匹配紧密程度。这具有两种重要作用：首先，其可以显示测序结果中存在的任何差异(由此可作为测序成功的量度)，其次，其可以显示测序样品中存在的任何多态性。这是本研究的重要目的：为了鉴定对照CDO基因和在疾病症状中具有重要影响的疾病CDO基因之间的任何多态性。如果发现多态性能够解释类风湿性关节炎患者中CDO活性的下降，例如在活性位点区域的有害多态性，这距离解释体内观察到现象(即，高血浆半胱氨酸水平)又近了一步。
结果
引物设计
使用Primer 3网络工具(Primer 3互联网引物设计工具，http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi，为MassachusettsInstitute of Technology(http://web.mit.edu/index.html)主办)来设计用于PCR反应的寡核苷酸引物。对于每一套引物，将基因的所述特定部分(例如，外显子2、3或4)的内含子和外显子序列上载到Primer 3中。然后Primer3将针对每一个外显子组装起数套可用的引物。而且还预测了额外的信息，如引物的解链温度、它们的特异性。所用的前三套引物的结果和外显子1引物的结果如图3所示。
PCR优化
PCR是一种特别灵敏的技术。其特别容易受到外源DNA的污染，反应具有很多组分，这些组分的相对比例对反应的成功具有很大的影响。要对这些变量进行试验以确定最佳浓度。理论上，可以改变反应的每一种组分，但是为本研究目的，只探究了关键的变量。以下是PCR反应中的常量和变量因素的列表。
常量：Taq DNA聚合酶浓度和体积，
      引物体积，
      缓冲液浓度和体积，
      氯化镁浓度，
      模板DNA体积。
      变量：引物浓度，
      引物序列，
      模板浓度，
      氯化镁溶液体积，
      DMSO添加剂的有无。
除了这些参数以外，在该研究中还使用了两种不同的模板DNA，因此必须根据两种模板来优化用于扩增外显子2、3和4的PCR条件。理想的是，不同模板可以在相同条件下得以成功扩增，但是在本情况下，发现对照DNA和类风湿性关节炎DNA对PCR扩增具有不同的要求(见下文结果)。
琼脂糖凝胶电泳分离
为了评价PCR反应的成功性，将10μl体积的PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳。发现2％琼脂糖凝胶最适合本研究的PCR产物，因为它们主要是小分子(＜300bp)，而且凝胶百分比越大，小分子分离越充分。还发现以120伏特进行凝胶电泳能够在条带分辨度和凝胶电泳花费的时间之间取得最佳平衡；在该电压下跑凝胶大概需要75分钟(数据未示出)。一旦上样染料(橙G和甘油)从上样孔开始迁移了四分之三的凝胶长度，就认为凝胶电泳结束。
初始PCR测试
使用典型程序(见材料与方法)和反应组分尝试进行扩增CDO外显子的初始反应显示出极为有限的成功性，表明该扩增要求进行极大的优化。电泳检测显示，在该反应中没有(或者极少)扩增到DNA，而且必须更换所提供的DNA梯度序列(在凝胶中没有看到该梯度序列)。该凝胶上没有DNA的结果暗示，对照模板DNA样品不含有任何DNA。然而，这种可能可以排除，因为对照模板样品的等分试样在凝胶上迁移，这表明对照模板DNA样品确实含有DNA。
为了探究初始不成功的可能原因，围绕针对所述3个CDO外显子设计的特异性引物设计降落PCR程序。由于平均解链温度为58℃(因此PCR退火温度为53℃)，因此降落式程序通过53℃上下的一系列温度下降，降到48℃的温度。以下是所述程序。
降落PCR 01号程序
  1   94℃，5分钟
  2   94℃，30秒钟   ))步骤2～4重复5个循环)
  3   58℃，30秒钟
  4   72℃，1分钟
  5   94℃，30秒钟   ))步骤5～7重复5个循环)
  6   56℃，30秒钟
  7   72℃，1分钟
  8   94℃，30秒钟   ))步骤8～10重复5个循环)
  9   54℃，30秒钟
  10   72℃，1分钟
  11   94℃，30秒钟   ))步骤11～13重复10个循环)
  12   52℃，30秒钟
  13   72℃，1分钟
  14   94℃，30秒钟   ))步骤14～16重复15个循环)
  15   50℃，30秒钟
  16   72℃，1分钟
  17   94℃，30秒钟   ))步骤17～19重复20个循环)
  18   48℃，30秒钟
  19   72℃，1分钟
  20   72℃，10分钟
所述程序的应用使得PCR获得部分的成功，其中CDO外显子3和4得到扩增，但是对外显子2没有成功。图4显示降落PCR产物的凝胶电泳。
图4显示，对于外显子3和4而言，PCR已经成功，但是对于外显子2没有成功。检查条带可以发现，条带解析得很差，并且在条带本身以下显示出弥散现象。这是由PCR反应得到大于目标产物的非特异性产物引起的。该结果表明，应该向PCR反应中加入添加剂二甲亚砜(DMSO)。图5显示使用DMSO添加剂进行的首次PCR的结果；该结果显示，外显子2、3和4已经得到扩增。条带强度显示溴乙锭和(隐含)该凝胶区域的DNA量的相对浓度。最亮的条带是外显子3的条带，因此可以假定目前PCR对于外显子3最为有效。
图11显示来自扩增外显子1时的PCR产物。
氯化镁浓度
通过进行“镁梯度”电泳，确定PCR混合物中的氯化镁(MgCl2)溶液的最佳浓度。在此设立了众多反应，其中采用不同体积的MgCl2，并通过在琼脂糖凝胶上分离PCR产物来评价其结果。通常，PCR反应中的MgCl2体积范围为1μl～5μl。图6显示使用对照DNA模板进行的首次镁梯度电泳。由该初始结果可以看出，该反应中扩增的DNA条带在边上较亮(表明DNA浓度较高)，其中镁浓度为4μl或2μl。然而，差异非常小。并且大部分条带发生弥散，表明没有有效地进行反应而获得一系列的不同长度的产物。
引物
在本研究的整个过程中设计了数对引物，以鉴定出获得最好的PCR结果的那套。这些引物都是采用Primer 3(Primer 3互联网引物设计工具，http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi，为MassachusettsInstitute of Technology(http://web.mit.edu/index.html主办))互联网工具来设计的。所有5套引物都进行了试验。在优化试验的整个过程中，可以优化外显子3和4的扩增而无需设计新的引物，因为所进行的PCR具有足够的一致性，因此不需要新的引物。但是PCR反应的其他组分确实需要广泛改变。
外显子2证明是最难扩增的外显子。在整个PCR试验中，外显子3和4在其扩增中显示出(一定程度)的一致性，虽然成功的水平不一样。然而外显子2通常难以预计反应的效果如何，有时得到具有很高分辨率的紧密条带，而有时却得到较差的条带，并且常常是根本没有条带。为了尝试找到具有一贯性成功的PCR，设计了另外的两套引物。在设计引物时，着眼于尝试获得具有与外显子3和4引物相同的解链温度的引物，如此可以使用相同的PCR程序对所有3种外显子进行扩增。使用如SEQ ID No.9和10所示的PCR引物，按如前所述使用不同PCR程序扩增外显子1。
模板浓度
以与氯化镁和引物浓度完全相同的方式检测模板DNA的浓度。使用不同浓度的模板DNA，采用众多的反应进行模板DNA梯度电泳。已经明确的是，PCR是一种非常灵敏的技术(见前文部分)，因此理论上模板浓度不应该是一种主要因素。模板DNA样品以水性“母液”小体积获得，从所述“母液”中获取等分试样并稀释到所需要的量。还使用分光光度计对母液溶液的DNA含量进行定量。由这些溶液得到的稀释液为1/2、1/10和1/20稀释液。所进行的一个试验是确定溶液中模板DNA的最佳浓度：将模板DNA稀释并使用这些不同的稀释液进行PCR反应。前期预测表明，由于PCR技术的灵敏性，模板浓度不应该对PCR成功具有重大影响。
表1未稀释的模板DNA样品的DNA含量。DNA含量值以ng/ml表示。
  模板样品   紫外吸光度   DNA
  90   0.057   1425
  91   0.109   2725
  92   0.056   1400
  93   0.045   1125
  94   0.082   2050
  A11   0.026   650
  A12   0.03   750
  A13   0.035   875
  A14   0.02   500
  A16   0.021   525
  A17   0.023   575
  A18   0.028   700
  A19   0.021   525
降落PCR
如上所述，研究早期采用降落PCR来进行扩增试验以获得一些前期的成功(见图7)。由于这些前期成功，所以再次研究降落PCR作为在同一PCR程序中扩增外显子2、3和4的可能手段。使用优化的PCR组分(见表1)设计两个降落PCR程序：一个程序从55℃开始，每组循环降落1℃；另一个程序从54℃开始，每个循环降落2℃。这些反应得到“混合”的结果，一组反应非常有效：有效地扩增了所有3个外显子；而另一组反应根本无效。认为最好是专注于针对每一个外显子优化不同的反应，而不是试图针对所有3个外显子定制一个程序。图7显示了一个成功的降落PCR结果。这是最有希望的技术。
优化聚合酶链式反应条件的总结
由该研究中进行的所有试验设计出了用于扩增智人(Homo sapiens)半胱氨酸双加氧酶外显子2、3和4的优化方案。这些细节如表2所示。为了验证这些成果，使用优化条件建立PCR反应，以扩增来自大量的对照和RA患者DNA样品的所有外显子。在大部分情况中，PCR是成功的。然后纯化来自这些反应的产物并提交测序。
表2  用于扩增智人CDO外显子2、3和4的优化条件的汇表
外显子1使用外显子-1特异性引物扩增，不同的反应混合物和参数如前所述。
PCR产物纯化
如前所述，使用Qiagen PCR纯化试剂盒分离和纯化PCR产物。提交3.2pM的纯化产物进行“质粒到曲线”测序。采用该技术进行初始试验之后，变得很显然的是纯化步骤可能已获得分离的所有来自PCR反应的DNA，但是所收集的DNA异源性太大，无法获得准确的测序结果。采用这种方式通过提交纯化的DNA所获得的所有测序结果极差，无法得到准确的测序结果。序列分辨率差，导致通过BLAST检索没有找到优异的匹配。
这些结果促使采用更为周全的体系来分离和纯化通过PCR扩增到的正确的DNA寡核苷酸。选择来自琼脂糖凝胶块的凝胶提取来代替PCR产物纯化。这获得了显著改善的测序结果。
凝胶提取
凝胶提取获得了具有良好纯度的DNA(如经提取和纯化的DNA的凝胶电泳所示)以及改善的测序结果。一个小的不足是由于DNA浓度降低的原因，来自凝胶提取样品的条带常常较浅，难以在紫外线下观测(由于图像差，没有包括数据)，最重要的是，由凝胶提取DNA获得的测序结果的质量要远远好于通过PCR产物纯化获得的质量。由所述两种方法获得的序列的实例如图8所示。
测序和多态性分析
初始测序尝试由于诸多原因，主要是模板DNA(扩增自患者样品)和引物的污染和不纯等原因，成功极为有限。用于纯化PCR产物的基本技术是采用使用离心柱的Qiagen PCR纯化试剂盒。使用该技术的测序结果的质量差，几乎没有可用的序列。采用凝胶提取方法获得明显要好的结果，并且在稍微进一步优化PCR条件后，得到了具有允许进行序列比较的适合质量的测序结果。将序列数据与参考序列比较，以鉴定出单核苷酸多态性(SNP)，即序列中的单碱基对差异，从中构建到可能的SNP记录。在对照和RA序列之间存在大量的多态性。为了以更形象的形式提供数据，已经将外显子2、3和4的多态性突出显示在图9中的序列上。
表3A、3B和3C在每个外显子2、3和4中发现的SNP的汇表
表3A
Figure A20068003036400311
表3B
Figure A20068003036400321
表3C
同样，对于外显子1，本发明人鉴定到55个突变。通过进一步分析，他们将其中的3个鉴定为SNP。
应当注意的是，对于如以上表3中的表3A、3B和3C所示的取代，该术语与以前所使用的相反。例如，在表3B中，在外显子3的位置15的取代被描述为+15T-A。使用标准术语(包括本申请先前使用的术语)，这应当读为15A-T。表3中的表3A、3B和3C内部是一致的并且相互间也是一致的。为清楚目的，本申请整个主体部分已经使用了标准术语，即使用标准术语描述所述优选的多态性。
所述结果表明，在所述外显子遍布有大量SNP。外显子2显示出SNP基因座的广泛分布，而在外显子4中，它们局限于明显要少的位点。然而，由测序收集到的数据必须经过滤，因为那些潜在SNP中的一部分可能只是测序设备不能确认某个特定位置的核苷酸所发生的事件。除了潜在假阳性之外，鉴定出的其他潜在SNP可能是位于错读位置中，原因在于DNA序列中该错读位置上游的多态性。为了试图对所述结果进行过滤，以得到高质量的数据，含有“N”的所有潜在SNP都被记为“潜在假阳性”，而其余的多态性应被推定为真实的结果。已经在3个所述外显子的所记载DNA序列上对这些“潜在SNP”(见表3)进行作图，并经过翻译以研究衍生自这些多态外显子的蛋白所带来的后果。图9显示，所述潜在SNP将对氨基酸序列造成巨大而(几乎可以确定是)有害的变化。在大多数情况下，几乎有一半的氨基酸序列不同于原始的氨基酸序列。在体内，个体在其CDO外显子中带有所有这些多态性将几乎可以确定会存在具有缺陷或障碍的CDO酶。
应当注意的是，术语“潜在假阳性”并不意味着本发明人已经认为这些结果与RA检测无关而放弃掉。相反，该术语的意思是强调那些标记为“潜在SNP”的结果更有可能指示RA的存在。
过滤结果
在经过测序的每一个样品中，没有一个包含在此鉴定出的所有SNP。特定SNP出现的频率非常重要，因为这可以指示CDO外显子中的高度多态性基因座。表4中给出了SNP的频率。为了得到与体内情况更为相关的表征，在图10中只单独检测并提供了最常出现的SNP(即，在本研究中出现超过一次)。
表4  在数据组中出现超过1次的潜在RA SNP的简表。
  外显子   SNP   位置   对照中的频率   RA患者中的频率
  1   A(插入)   673   0/30   10/22
  1   G(插入)   697   2/30   9/22
  1   C-A   1,103   4/30   9/22
  外显子   SNP   位置   频率   C   RA   类型   评述
  3   A-T   15   2   +   +   取代   潜在SNP
  3   T-C   16   2   -   +   取代   潜在SNP
  3   A-C   17   3   +   +   取代   潜在SNP
  3   T-A   29   2   -   +   取代   潜在SNP
  4   A-T   33   4   -   +   取代   潜在SNP
  4   G-C   34   5   -   +   取代   潜在SNP
  4   A(插入)   43   4   -   +   添加   潜在SNP
讨论
本发明人已能够成功地优化用于对智人半胱氨酸双加氧酶外显子2、3和4进行扩增和测序的PCR程序。这是通过能够显示哪些条件让各种外显子可以在相对较短的时间内得到扩增和测序的一系列PCR试验来实现的。本发明人还建立了适合用于对智人半胱氨酸双加氧酶外显子1进行扩增和测序的PCR程序。在外显子1、3和4中鉴定到各种多态性。
化合物对CDO活性的影响
本发明人认识到，CDO可能是参与类风湿性关节炎的关键酶。本发明人也已经确定TNF-α和TGF-β影响CDO活性(Wilkinson L.J.和WaringR.H.2002，见上文)。
使用Wilkinson L.J.和Waring R.H.(Toxicol in vitro(2002)，第481-483页)所述的方法测定了IFN-γ和TNF-α的效果分析。
干扰素-γ对CDO表达的效果如表5中所示。
表5
IFN-γ(ng/ml)   CDO表达(0ng/ml表达％) TNF-α(ng/ml)   CDO表达(0ng/ml表达％)
  0   100.0   0.0   100.0
  1.0   110.3±17.9   0.01   88.5±16.7
  2.5   148.8±8.8   0.05   70.1±7.9
  5.0   132.5±23.6   0.10   51.8±12.2
  7.5   157.1±6.9   0.25   42.0±18.3
  10.0   161.6±7.8   0.50   35.6±12.0
这表明可以用干扰素-γ来提高CDO的表达，并因此增加可利用的硫酸盐的量，从而减少类风湿性关节炎症状。而且，可以一起使用干扰素-γ与已知能够增加硫酸盐生成的化合物来进一步改善类风湿性关节炎的治疗，所述已知能够增加硫酸盐生成的化合物例如为半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、N-乙酰基半胱氨酸、δ-谷酰基半胱氨酸、白介素-4和白介素-10、S-羧甲基半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸。
序列表
<110>伯明翰大学
<120>半胱氨酸双加氧酶中的多态性
<130>FCI08GB0131C
<150>GB0514913.3
<151>2005-07-20
<160>17
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>4186
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
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<210>2
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ggcccaatat atcttgattg ttttatttaa ctttagcgac tatcttttca atttattttt  1440
aaaaacttat tatgttagat ccaaacatta gttgagaaat ttcaaaatgt atgcttgttt  1500
ttaaagaaaa tgttttcatt tacttgggaa atgagagtga aaactattat ttgatataac  1560
tgttactgcc atggcttact atgcataggt ctaatttgct gggccaacag ggataagttg  1620
cataattaac ctttgtaaag gttattggct gatgatataa ctaaagcaaa ttgtctgttt  1680
tgtttgccaa tgttgcttat tcttagagtt gttatgccat ttataccaca aataagaata  1740
gactatacta acatgttcct ccttgagaaa caagcatttc ctaccaaaaa taaaaaggca  1800
accaacacta atatagcagg gcagtcttct acctctgaaa taagtttgtc atttagagga  1860
atagtcttta attatcagaa tatccagaaa tagacaatgt gtgaaaatgg agacccaagc  1920
aatccttgag tcttaatgaa agcgcagcct ctgagggaag ccagggcaga attttctcat  1980
tatcgctccg cttcatcttt atcttccaca ttccaaaccc taagagatat tcttattgcg  2040
ggaaaaacaa caaggctccc ttgcccttgc tgagttttca tacactgcta caaaagcaga  2100
actatttaga aggagttaaa atgtcttttg taaagtttct tacacagctt tctttttttc  2160
ccttttttac aggcaacttc gggctcgctg gagaacaact aaggggcacc aaagccctct  2220
gaggttttac tttaaggttc gctgtatgtt tgccttggac aaaaaggcta cctaccacgt  2280
gctatccagt aatatactta aataagccaa tacttagatc tactgtaagg cagatgctaa  2340
ttataaggca ttaagtaagc aaatagtgcc ctcagctact gcagaagaaa agtcccactg  2400
aggaaaagaa agtcttgtga tttttaaagg caagttttca agtgctctca tagttctatc  2460
ctctaattcc attaaatcca tactaggagc gtcagtgagg gttttcatag cttttggaaa  2520
tactttggtc tctgaactgt aattagcgca agaagtaaaa acagaaacgt caaacgtcaa  2580
atgtttgctt tgttacctgg aggactaaat gtagatgtct ttagtatact ttgtatgttc  2640
ttaaatattg gaagataatt ttgtgaatct gtagatttta ttttttcagt cttaccttac  2700
aaatttcttt tctatgaata atagaggaac tcacggcact ctgccacttg ttaatgaaag  2760
gaagtgcaga ggatttagaa aagtacatga tccccagacc acaacaaacc aaaacataaa  2820
ctcatgtctg tgtcccatgg tcatagtcaa agattttgta ctgctaaaat taccaaataa  2880
tttaaataaa gtggatttga acacaatttg aaggtgtctt tctgattaac atgatagaaa  2940
cttcacataa atcagtttct tagatctaga tatacaaaag cactgtgaca aatgg       2995
<210>4
<211>418
<212>DNA
<213>智人
<400>4
gatttgtgtg tgcaccgcgt ctccagcgat cccggatcca ctgcgctgcc aggggcctgg  60
gggtgggtct cttgctgtct ctgcgacgac atccttacgt ttcggcactc taatgctggg  120
tttgtgcgtg tgtgtctgct tagcggtcta gcgggctgtt aggcctccct cgcccccagc  180
tccttggtcg ctcagctcct ccaccgcagc ccagcagtga gacgcgcgcg cagccagctc  240
cccacgagat ggaacagacc gaagtgctga agccacggac cctggctgat ctgatccgca  300
tcctgcacca gctctttgcc ggcgatgagg tcaatgtaga ggaggtgcag gccatcatgg  360
aagcctacga gagcgacccc atcgagtggg caatgtacgc caagttcgac cagtacag    418
<210>5
<211>78
<212>DNA
<213>智人
<400>5
gtatacccga aatcttgtgg atcaaggaaa tggaaaattt aatctgatga ttctctgttg    60
gggtgaagga catggcag                                                  78
<210>6
<211>155
<212>DNA
<213>智人
<400>6
cagtattcat gatcatacca actcccactg ctttctgaag atgctacagg gaaatctaaa  60
ggagacatta tttgcctggc ctgacaaaaa atccaatgag atggtcaaga agtctgaaag  120
agtcttgagg gaaaaccagt gtgcctacat caatg                             155
<210>7
<211>170
<212>DNA
<213>智人
<400>7
attccattgg cttacatcga gtagagaaca tcagccatac ggaacctgct gtgagccttc  60
acttgtacag tccacctttt gatacatgcc atgcctttga tcaaagaaca ggacataaaa  120
acaaagtcac aatgacattc catagtaaat ttggaatcag aactccaaat             170
<210>8
<211>735
<212>DNA
<213>智人
<400>8
gcaacttcgg gctcgctgga gaacaactaa ggggcaccaa agccctctga ggttttactt  60
taaggttcgc tgtatgtttg ccttggacaa aaaggctacc taccacgtgc tatccagtaa  120
tatacttaaa taagccaata cttagatcta ctgtaaggca gatgctaatt ataaggcatt  180
aagtaagcaa atagtgccct cagctactgc agaagaaaag tcccactgag gaaaagaaag  240
tcttgtgatt tttaaaggca agttttcaag tgctctcata gttctatcct ctaattccat  300
taaatccata ctaggagcgt cagtgagggt tttcatagct tttggaaata ctttggtctc  360
tgaactgtaa ttagcgcaag aagtaaaaac agaaacgtca aacgtcaaat gtttgctttg 420
ttacctggag gactaaatgt agatgtcttt agtatacttt gtatgttctt aaatattgga 480
agataatttt gtgaatctgt agattttatt ttttcagtct taccttacaa atttcttttc 540
tatgaataat agaggaactc acggcactct gccacttgtt aatgaaagga agtgcagagg 600
atttagaaaa gtacatgatc cccagaccac aacaaaccaa aacataaact catgtctgtg 660
tcccatggtc atagtcaaag attttgtact gctaaaatta ccaaataatt taaataaagt 720
ggatttgaac acaat                                                  735
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物-外显子1正向引物
<400>9
gagggccgtt ggtacattcc                                            20
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物-外显子1反向引物
<400>10
gccagtcact ttgggctgc                                             19
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物-外显子2正向引物
<400>11
gcttgtttca gcaacgaact t                                          21
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物-外显子2反向引物
<400>12
ttttcatatg ctagaaaaca tgctc                               25
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物-外显子3正向引物
<400>13
gaccatctac tgagttcagt tg                                  22
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物-外显子3反向引物
<400>14
tcttcccact tgcccttaga                                     20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物-外显子4正向引物
<400>15
tttttccttc ccggatattg                               20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物-外显子4反向引物
<400>16
cagtgccaac ctacagagca                               20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物-外显子1备选的反向引物
<400>17
gaggtcagca aggccagtag                               20

Claims (24)

1. CDO介导的病况的诊断方法，所述方法包括：
(i)从个体获取样品；
(ii)检测是否存在变异性CDO或编码CDO变体和/或CDO调节区变体的核酸；
(iii)参考CDO基因和/或CDO基因的调节区中的多态性来确定所述个体的状况。
2. 人中的CDO基因或CDO基因的调节序列中一个或多个多态性的鉴别方法，所述方法包括确定编码至少一部分CDO基因和/或CDO调节区的核酸分子序列和参考CDO基因和/或CDO基因的调节区中的多态性来确定该人的状况。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述多态性选自：
外显子        位置     SNP    类型
                                   
外显子1：     +673     A      插入
外显子1：     +697     G      插入
外显子1：     +1103    C-A    取代
外显子3：     +15      A-T    取代
外显子3：     +16      T-C    取代
外显子3：     +17      A-C    取代
外显子3：     +29      T-A    取代
外显子3：     +30      G      添加
外显子4：     +33      A-T    取代
外显子4：     +34      G-C    取代
外显子4：     +43      A      添加
外显子4：     +46      C-A    取代
                                          。
4. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法提供以下指示：该人具有降低的CDO浓度和/或具有酶活性降低的CDO。
5. 如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法用于鉴定个体或人患上类风湿性关节炎(RA)和/或产生选自D-青霉胺和硫代苹果酸金中的一种或多种药物的副作用的倾向。
6. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中含有多态性的所述核酸区域在鉴定该多态性之前通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。
7. 如权利要求6所述的方法，其中所述PCR是实时PCR(RT-PCR)。
8. 如权利要求1～5任一项所述的方法，其中通过选自以下的方法确定核酸序列：ARMS-等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接测定和限制片段长度多态性(RFLP)。
9. 等位基因特异性探针或引物，所述等位基因特异性探针或引物能够检测出CDO基因或CDO调节序列多态性。
10. 如权利要求9所述的等位基因特异性探针或引物，所述等位基因特异性探针或引物能够检测出以下一个或多个处的多态性：
外显子       位置     SNP    类型
                                     
外显子1：    +673     A      插入
外显子1：    +697     G      插入
外显子1：    +1103    C-A    取代
外显子3：    +15      A-T    取代
外显子3：    +16      T-C    取代
外显子3：    +17      A-C    取代
外显子3：    +29      T-A    取代
外显子3：    +30      G      添加
外显子4：    +33      A-T    取代
外显子4：    +34      G-C    取代
外显子4：    +43      A      添加
外显子4：    +46      C-A    取代
                                     。
11. 一种诊断试剂盒，该诊断试剂盒包含一个或多个如权利要求8、9或10所述的探针或引物。
12. 长度至少为5个碱基的分离的核酸，所述核酸编码选自以下多态性的CDO多态性或CDO调节区多态性：
(i)
外显子       位置     SNP    类型
                                      
外显子1：    +673     A      插入
外显子1：    +697     G      插入
外显子1：    +1103    C-A    取代
外显子3：    +15      A-T    取代
外显子3：    +16      T-C    取代
外显子3：    +17      A-C    取代
外显子3：    +29      T-A    取代
外显子3：    +30      G      添加
外显子4：    +33      A-T    取代
外显子4：    +34      G-C    取代
外显子4：    +43      A      添加
外显子4：    +46      C-A    取代
和
(ii)与所述序列互补的序列。
13. 如权利要求11所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码CDO或CDO片段。
14. 分离的CDO蛋白，所述分离的CDO蛋白能够由权利要求11或12所述的核酸分子获得。
15. 抗体，所述抗体能够特异性地与权利要求13所述的蛋白结合，但是不与不含有CDO多态性的CDO蛋白结合。
16. 确定个体对CDO介导病况的倾向的方法，所述方法包括：
(i)从所述个体获取样品；和
(ii)使用权利要求14所述的抗体检测含有所述多态性的CDO的存在。
17. 确定化合物对CDO活性的影响的方法，所述方法包括：
(i)提供白细胞样品；
(ii)使所述白细胞与CDO底物和所述化合物接触；和
(iii)确定所述化合物对所述白细胞中的CDO使所述底物向可检测产物转化的影响。
18. 鉴定用于治疗类风湿性关节炎的药物候选物的方法，所述方法包括使用权利要求17所述的方法。
19. 治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括施用药学有效量的干扰素-γ(IFN-γ)。
20. 如权利要求19所述的方法，其中所述类风湿性关节炎为非HTLV-1相关的类风湿性关节炎。
21. 如权利要求19或19所述的方法，其中所述IFN-γ与选自以下化合物中的至少一种化合物联合施用：半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、N-乙酰基半胱氨酸、δ-谷酰基半胱氨酸、白介素-4和白介素-10。
22. IFN-γ，用于制造治疗类风湿性关节炎的药物。
23. IFN-γ与以下至少一种化合物的联合，所述化合物选自半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、N-乙酰基半胱氨酸、γ-谷酰基半胱氨酸、白介素-4和白介素-10，用于制造治疗类风湿性关节炎的药物。
24. 药物组合物，所述药物组合物包含IFN-γ与以下化合物的联合，所述化合物选自半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、N-乙酰基半胱氨酸、γ-谷酰基半胱氨酸、S-羧甲基半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、白介素-4和白介素-10。
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