JP2000316578A

JP2000316578A - 糖尿病発症危険因子の検出方法

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Publication number: JP2000316578A
Application number: JP13195599A
Authority: JP
Inventors: Toru Egashira; 徹江頭; Makoto Nagano; 誠長野; Sachiko Sagehashi; 幸子提箸; Kana Matsui; 加奈松井; Hiroaki Hattori; 浩明服部; Azuma Kanezuka; 東金塚; Shin Takazawa; 伸高澤; Hiroshi Okamoto; 宏岡本
Original assignee: BML Inc
Current assignee: BML Inc
Priority date: 1999-05-12
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2000-11-21

Abstract

(57)【要約】【課題】１）個体が、現に罹患している糖尿病の病型を
知り、２）たとえ個体が健常人であっても、将来、糖尿
病を発症する素因を有しているか否か、さらには、罹患
するとしたら、いずれの病型の糖尿病であるか等を予見
することを可能にする危険遺伝子を見出し、その危険遺
伝子を利用して、糖尿病発症危険因子の検出手段を提供
すること。【解決手段】もともとは、ヒトリンパ球表面マーカーの
一つとして同定されていたタンパク質である、ＣＤ３８
タンパク質をコードする遺伝子を、上記の危険遺伝子と
して、その遺伝子の変異を検出することにより、被検者
における糖尿病発症危険因子を検出する、糖尿病発症危
険因子の検出方法を提供することにより、上記の課題を
解決し得ることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、疾病の検出方法に
関する技術分野の発明である。より具体的には、本発明
は、被検者における糖尿病発症危険因子を検出する方法
に関する発明である。

【０００２】

【従来の技術】今日、世界中で少なくとも３０００万人
の糖尿病患者がおり、現在、急速な人口の高齢化に伴
い、その患者数は増加している。そして、今後、さらな
る患者数増が確実視されている。この傾向は、日本にお
いても例外ではなく、現在、約６００万人が糖尿病に罹
患しており、その数は、数年後には、１０００万人に達
するであろうと考えられている。

【０００３】糖尿病は、生体、とりわけ細胞にとっての
栄養源であるグルコースが細胞内に取り込まれず、この
取り込まれないで血中に滞留しているグルコースが、高
血糖状態を惹き起こし、その結果として、尿中にグルコ
ースが排泄される疾患である。

【０００４】この糖尿病には、インスリン依存性糖尿病
（ＩＤＤＭ：Ｉ型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病
（ＮＩＤＤＭ：II型糖尿病）及びその他の糖尿病（二次
性糖尿病、膵炎等の特定の疾患に伴って発症する糖尿
病）に大別される。

【０００５】インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ：Ｉ型
糖尿病）は、比較的若年期に発症し、その発症が急激で
あり、血中代謝産物としてケトン体が蓄積し、インスリ
ン投与による治療を継続しなければ、生命の維持も危ぶ
まれる重症の糖尿病である。

【０００６】これに対し、インスリン非依存性糖尿病
（ＮＩＤＤＭ：II型糖尿病）は、成年期以降に発症する
ことが多く、その病状も耐糖能異常（ＩＧＴ）状態から
徐々に進行し、比較的緩慢であることが多く、治療上、
必ずしもインスリンを必要としない糖尿病である。

【０００７】以上のように、糖尿病には大きく２つの病
態が存在し、その病状に対する治療方法も、各々異な
る。１９９７年に、ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｂｅｔｅ
ｓＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＤＡ）は、新しい糖尿
病の分類と診断基準を発表した。日本でも、同様に、糖
尿病の概念、分類、診断基準が検討されているが、この
新しい分類では、糖尿病の成因と病態を組み合わせるこ
とを基本としている。病態は、概ね前述した通りであ
り、今後は、糖尿病の診断と分類上、糖尿病の成因を明
らかにすることがますます重要になってくる。そして、
この新しい分類で、最も注目すべきことは、第３のカテ
ゴリーである「他の特殊な病型」の中に、遺伝子異常に
よる糖尿病が組み込まれたことである。

【０００８】糖尿病発症遺伝子として、現在までに、イ
ンスリン、インスリン受容体、グルコキナーゼ（ＭＯＤ
Ｙ２）、ＨＮＦ−４α（ＭＯＤＹ１）、ＨＮＦ−１α
（ＭＯＤＹ３）、ミトコンドリアの遺伝子異常等等が知
られている。しかし、これらのいずれの遺伝子異常も、
その頻度は低い。すなわち、これらの遺伝子異常の中で
は、比較的高頻度であるミトコンドリア遺伝子の３２４
３番目の塩基であるアデニンからグアニンへの変異で、
ＮＩＤＤＭの１％未満、他の部位の変異を含めたミトコ
ンドリア遺伝子の異常全体でも２％程度の頻度と考えら
れている。従って、前述した遺伝子変異は、膨大な数の
糖尿病患者のごく一部について説明し得るだけであるこ
とは否めない。また、糖尿病は、単一の遺伝子異常を持
つだけで発症するのではなく、複数の遺伝子の異常や環
境要因が加わり発症するという考え方が一般的である。

【０００９】このような観点から、糖尿病の発症にかか
わる原因遺伝子、あるいは発症危険因子を探索し、見出
すことは、糖尿病を診断することばかりではなく、早期
に発症する可能性の高い個体を選別し、発症を遅延させ
ることが可能であり、ひいては、その発症メカニズムを
解明する糸口となり、さらに、より適切な糖尿病の治療
法を見出す助けとなる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、１）個体が、現に罹患している糖尿病の病
型を知り、２）たとえ個体が健常人であっても、将来、
糖尿病を発症する素因を有しているか否か、さらには、
罹患するとしたら、いずれの病型の糖尿病であるか等
〔以上１）２）を、本発明においては、「糖尿病発症危
険因子」ともいう〕を予見することを可能にする危険遺
伝子を見出し、その危険遺伝子を利用して、糖尿病発症
危険因子の検出手段を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、この課題の
解決に向けて、その解析により、糖尿病発症危険因子を
検出可能な危険遺伝子の検索を行った。その結果、膵臓
のランゲルハンス島β細胞において、グルコース刺激に
よるインスリン分泌を促すセカンドメッセンジャーであ
る、サイクリックＡＤＰリボース（ｃＡＤＰＲ）の産生
及び水解酵素であるＣＤ３８をコードする遺伝子（以
下、ＣＤ３８遺伝子ともいう）の異常が、糖尿病の発症
を誘因することを見出し、この遺伝子こそが、これを用
いることにより、糖尿病発症危険因子を検出することが
可能な危険遺伝子であることを見出して、本発明を完成
した。

【００１２】すなわち、本発明は、ＣＤ３８遺伝子にお
ける遺伝子の異常を検出することにより、個体における
糖尿病発症の遺伝的な素因（危険因子）を検出する方法
（以下、本発明検出方法という）を提供する。

【００１３】ＣＤ３８遺伝子がコードするＣＤ３８タン
パク質は、もともとは、ヒトリンパ球表面マーカーの一
つとして同定されていたタンパク質である。そして、こ
のＣＤ３８タンパク質と生体における糖代謝との間に、
実に深い関係が認められることは、本発明者でもある、
岡本及び高澤らの長年の研究により見出されたものであ
る。

【００１４】以下、本発明の実施の形態の説明に先立
ち、本発明の主要な要素でもある、ＣＤ３８遺伝子ない
しＣＤ３８タンパク質の、生体における糖（グルコー
ス）代謝との関係について説明する。

【００１５】グルコースは、膵ランゲルハンス島β細胞
におけるインスリンの分泌において、最も重要な刺激物
質である。インスリンの分泌においては、グルコース刺
激により、細胞内のＣａ²⁺濃度が上昇し、これが引き金
になってインスリンの分泌がなされるものと考えられて
いる。この細胞内のＣａ²⁺濃度の上昇は、細胞外からの
Ｃａ²⁺の流入と、細胞内プールからのＣａ²⁺の動員によ
りもたらされる。細胞外からの流入については、Ashcro
ftらの「ＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャンネル学説」による説明
が広くなされており、この分子機構についても、稲垣、
清野らにより、詳細な説明が既になされている（生化
学、６９：１０６７−１０８０，１９９７）。

【００１６】一方、細胞内プールからのＣａ²⁺の動員に
ついては、ヒトインスリン産生細胞を用いた実験から、
細胞内のＣａ²⁺濃度の上昇に関して、細胞外からの流入
と同時か、それよりも早期に関与していることが指摘さ
れている（Rojas E,et al.,Endocrinology,134;1771-17
81,1994 ）。また、イノシトール１，４，５三リン酸
（ＩＰ₃）が、多くの細胞で、Ｃａ²⁺動員のセカンドメ
ッセンジャーとして機能していることが報告されてい
る。インスリン産生細胞においても、Ｃａ²⁺動員のセカ
ンドメッセンジャーとして、ＩＰ₃が重要な役割を果た
していることが示唆されていた。

【００１７】本発明者である岡本らは、ストレプトゾト
シン等のインスリン産生β細胞障害物質によって、ＤＮ
Ａ損傷が惹き起こされ、その結果、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−
ｒｉｂｏｓｅ）合成酵素が活性化され、細胞内のＮＡＤ
⁺が枯渇すると、β細胞のインスリン産生機能が低下
し、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）合成酵素阻害物
質によって、細胞内のＮＡＤ⁺濃度の低下を阻止する
と、β細胞のインスリン産生機能が維持されることか
ら、この細胞のインスリン産生機能の維持に、同細胞内
のＮＡＤ⁺量の維持が必須であることを明らかにしてい
る（Yamamoto H, et al.,Nature,294:284-286,1981；Ok
amoto H, et al.,1990,in Molecular Biologyof the Is
lets of Langerhans,Okamoto H, ed,pp.209-231,Cambri
dge University Press,Cambridge ；Okamoto H, et a
l.,Biochimie,77:356-363,1995 ）。このような背景か
ら、本発明者である岡本及び高澤らにより、グルコース
によるインスリン分泌における機構において、インスリ
ン産生細胞の機能の発現に、ＮＡＤ ⁺から作られるｃＡ
ＤＰＲが機能している可能性が示唆された。

【００１８】すなわち、ラット膵ランゲルハンス島から
調製したミクロソームにおける、Fluo３を用いた、Ｃａ
²⁺の放出に着目した実験においては、ｃＡＤＰＲは、ラ
ンゲルハンス島のミクロソームから、Ｃａ²⁺の放出を惹
き起こし、連続的な添加により、Ｃａ²⁺放出応答のatte
nuation が確認され、一方、このランゲルハンス島のミ
クロソームからのＩＰ₃の添加によるＣａ²⁺の放出は起
こらないことから、ｃＡＤＰＲによるランゲルハンス島
のミクローソームからのＣａ²⁺の放出は、ＩＰ ₃による
Ｃａ²⁺放出とは異なることが、本発明者である高澤及び
岡本らにより示された（Takasawa S, et al.,Science,2
59:370-373,1993 ）、また、ｃＡＤＰＲに対する抗体を
用いたラジオイムノアッセイによる実験により、グルコ
ース刺激によるインスリン産生細胞のｃＡＤＰＲ量が増
加することも、高澤及び岡本らにより示されたことから
（Takasawa S, et al., J Biol Chem,273:2497-2500,19
98）、インスリン産生細胞におけるグルコース刺激によ
り生じるＣａ²⁺の動員は、主に、ｃＡＤＰＲによると考
えられている。

【００１９】さらに、高澤及び岡本らは、ＣＤ３８タン
パク質は、ＮＡＤ⁺を基質にするとｃＡＤＰＲを生成す
るＡＤＰ−ribosyl cyclase 活性を示し、ｃＡＤＰＲを
基質にすると、ＡＤＰＲを生成するｃＡＤＰＲ水解酵素
活性を示すことを示した（Takasawa S, et al.,J Biol
Chem,268:26052-26054,1993 ）。このｃＡＤＰＲ水解反
応は、２〜８mMのＡＴＰによって、濃度依存的に抑制さ
れ、ＮＡＤ⁺を基質にすると、ＡＴＰ濃度に依存してｃ
ＡＤＰＲの生成量が増加することが認められている。こ
のＡＴＰによるｃＡＤＰＲ水解酵素の活性を抑制する分
子機構は、ＣＤ３８タンパク質のｃＡＤＰＲ結合部位で
ある、Ｌｙｓ−１２９に、ミリモル単位の濃度のＡＴＰ
がｃＡＤＰＲと競合することによるものであることが、
Ｔｏｈｇｏ及び高澤らにより示されている（Tohgo A,Ta
kasawa S,et al.,J Biol Chem,272:3879-3882,1997）。
実際に、インスリン産生細胞のＡＴＰ濃度は、グルコー
スの刺激により、２〜８mMの範囲で変化することが報告
されており、インスリン産生細胞にＣＤ３８タンパク質
が存在すれば、ｃＡＤＰＲの量の変化は、ＡＴＰによる
ＣＤ３８タンパク質のｃＡＤＰＲ分解活性の抑制という
機構で説明されている。

【００２０】また、高澤及び岡本らは、加藤らと共に、
膵ランゲルハンス島β細胞に、ＣＤ３８タンパク質を過
剰発現するトランスジェニックマウスにおいては、グル
コースに応答するインスリン分泌が、対照のマウスに比
して有意に亢進していることを示した（J.Biol.Chem.27
0,30045-30050,1995）。

【００２１】上述したように、インスリン産生細胞にお
いて、グルコースの刺激により生じたＡＴＰによって、
ＣＤ３８タンパク質のｃＡＤＰＲ分解活性が抑制され、
この結果、ｃＡＤＰＲ量が上昇し、細胞内のＣａ²⁺プー
ルであるミクロソームから、Ｃａ²⁺が動員されて、イン
スリン分泌が起こるものと考えられている。

【００２２】さらに、岡本及び高澤らが、ｃＡＤＰＲに
よるＣａ²⁺放出機構について、ｃＡＤＰＲによるＣａ²⁺
放出がリアノジンによるＣａ²⁺放出とcross-desensitiz
ation が認められることを明らかにしたことから、小胞
体のリアノジン受容体（タイプ２）を介すると考えられ
ている。そして、膵ランゲルハンスβ細胞では、Ｃａ ²⁺
／カルモジュリン（ＣａＭ）依存性リン酸化酵素IIが、
ｃＡＤＰＲ感受性のＣａ²⁺放出チャンネルである、小胞
体リアノジン型Ｃａ²⁺放出チャンネルをリン酸化し、こ
れによりｃＡＤＰＲによるＣａ²⁺放出の感受性が増大
し、グルコース刺激により増大したリアノジン型Ｃａ²⁺
チャンネルから、Ｃａ²⁺放出を惹き起こしてインスリン
分泌が起こることを、高澤及び岡本らは明らかにした
（J.Biol.Chem.270,30257-30260,1995）。さらに、高澤
及び岡本らは、正常マウスでは、主に、ｃＡＤＰＲによ
るＣａ²⁺放出が認められるが、ob/ob マウスでは、ＩＰ
₃によるＣａ²⁺の放出が優位に起こることを明らかにし
た（Takasawa S, et al.,J Biol Chem,273:2497-2500,1
998 ）。さらに、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ポ
リメラーゼ（ＰＡＲＰ）を、ジーンターゲッティングに
より欠損したマウスにおいて、ストレプトゾトシンによ
る糖尿病の発症に対して抵抗性を示すことが報告されて
いることから、インスリン産生における、細胞内のＮＡ
Ｄ⁺の枯渇や消費が、糖尿病を惹き起こすことも示唆さ
れている（Burkart V, et al.,Nature Med,5:314-319,1
999)。すなわち、ＮＡＤ⁺を基質とするｃＡＤＰＲの産
生、細胞内Ｃａ²⁺の動員、インスリン分泌の過程が、イ
ンスリン産生細胞において重要であり、この過程にＣＤ
３８遺伝子ないしＣＤ３８タンパク質が、非常に深く係
わっていることを、本発明者でもある、岡本及び高澤ら
は、明らかにしている。ただし、ＣＤ３８遺伝子が、
糖尿病の発症と深く関連しているからといって、このＣ
Ｄ３８遺伝子の遺伝子異常を、糖尿病発症危険因子の検
出に用い得るという知見は、すでに報告されている糖尿
病に関連する遺伝子の異常が、糖尿病発症危険因子の検
出マーカーとして、臨床現場においては必ずしも有用で
ないことからも、極めて驚くべきことであった。

【００２３】具体的に、本発明検出方法において、利用
され得ることが判明しているＣＤ３８遺伝子における遺
伝子異常部位の主なものとして、ＣＤ３８遺伝子によ
ってコードされるＣＤ３８タンパク質の１４０番目のア
ルギニンをコードする部位、同２６４番目のセリンを
コードする部位及びイントロン７の−２８番目のグア
ニンが挙げられる（これらの遺伝子異常部位における変
化は、各々が独立であって相互に連鎖はしていない）。
なお、これらの遺伝子異常部位についての詳細は、後述
の実施例において記載する。

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、発明の実施の形態について
説明する。上述したように、本発明は、糖尿病発症の危
険遺伝子であるＣＤ３８遺伝子における遺伝子異常を検
出することを前提とする、糖尿病発症危険因子の検出方
法である。

【００２５】ＣＤ３８遺伝子及びこれがコードするＣＤ
３８タンパク質については、すでに解析がなされている
〔Nata K.et al.,Gene,186:285-292,1997 ：配列番号１
（塩基配列とアミノ酸配列），配列番号２（アミノ酸配
列）〕。

【００２６】このＣＤ３８遺伝子の遺伝子変異と、糖尿
病発症危険因子との相関関係を具体的に解析することに
より、本発明検出方法において利用し得る、ＣＤ３８遺
伝子の遺伝子変異を見出すことができる。すなわち、
「糖尿病患者と健常人」、「インスリン依存性糖尿病と
インスリン非依存性糖尿病」等の組み合わせにおいて、
ＣＤ３８遺伝子の変異部位と変異頻度、あるいはその変
異により生ずるタンパク質の機能を解析することによ
り、所望する遺伝子変異を見出すことができる。かかる
作業の実際については、後述する実施例において、具体
的に記載する。

【００２７】なお、本発明において、「遺伝子変異」と
は、ヒト染色体における遺伝子の変異を意味するもので
あり、遺伝子の塩基配列が野生型（正常遺伝子の塩基配
列）と異なる場合のことを意味するものである。また、
遺伝子が、その塩基配列において、個体毎に異なる特異
的な部位を保有している場合には、一般的にこれは、
「遺伝子多型」として表現され得るが、本発明において
は、この「遺伝子多型」も「遺伝子変異」の範疇に含ま
れるものとする。「遺伝子変異」は、その遺伝子の変異
頻度、そのｍＲＮＡの発現量、タンパク質発現量、ある
いはタンパク質の機能等の多角的な解析により、同定さ
れる。平均して、数百塩基に１個程度、そのような「遺
伝子変異」が存在すると考えられているが、遺伝子を直
接的又は間接的に解析することにより、これを同定する
ことが可能であり、また、その見出された遺伝子変異の
家系における解析から、父方由来の染色体（アレル）と
母方由来の染色体（アレル）とを判別することができ
る。

【００２８】遺伝子変異部位における変化には、父方と
母方由来の遺伝子のいずれかが、遺伝子変異部位におい
て、塩基配列に置換が生じており、両者のアレルの遺伝
子が、野生型の遺伝子の塩基配列と比較して、異なる塩
基との置換が起こっている場合を「ホモ接合体」、同様
に片方のアレルの塩基配列が野生型の塩基配列と比較し
て、異なる塩基との置換が起こっている場合を「ヘテロ
接合体」として認めるものである。

【００２９】本発明者は、後述するように、現在まで
に、ＣＤ３８遺伝子において見出され、糖尿病発症危険
因子と相関関係が認められる遺伝子異常部位として、
ＣＤ３８遺伝子によってコードされるＣＤ３８タンパク
質の１４０番目のアルギニンをコードする部位における
遺伝子変異（例えば、エクソン３領域における制限酵素
ＴｓｐＲＩに対する感受性の有無として特定される）、
同２６４番目のセリンをコードする部位における遺伝
子変異（例えば、エクソン７領域における制限酵素Ｔａ
ｑＩに対する感受性の有無として特定される）及びイ
ントロン７の−２８番目のグアニンにおける遺伝子変異
〔例えば、イントロン７領域（エクソン８領域）におけ
る制限酵素Ｔｒｕ９Ｉに対する感受性の有無として特定
される〕、を見出している。

【００３０】遺伝子異常部位における変化の検出方法と
しては、通常公知の方法、例えば、サザンブロット法を
用いたＲＦＬＰ法や、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＨＥＴ(het
eroduplex analysis)法、ＤＧＧＥ法(denaturing gradi
ent gel electrophoresis)法、ＤＳ(direct sequence)
法、ＣＣＭ(chemical cleavage mismatch)法、ＣＤＩ(c
arbodiimid modification)法、さらにはＰＣＲ法を用い
た一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法〔ＰＣＲ−ＳＳＣＰ
(single-stranded conformation polymorphism) 法、以
下、本明細書においてはＳＳＣＰ法という〕、ＰＣＲ／
ＧＣ−clamp法等を用いることができる〔例えば、バイ
オマニュアルシリーズ１，遺伝子工学の基礎技術，山本
雅編，羊土社（1993）等を参照のこと、特に、ＰＣＲ
／ＧＣ−clamp 法については、Myers,R.M.,Shefield,
V.,and Cox,D.R.(1988) in Genomic Analysis:A Pracli
cal Approach.K.Davies,ed.IRL Press Limited,Oxford,
pp.95-139 等を参照のこと〕が、簡便かつ正確に遺伝子
異常を特定し得るという点において、ＰＣＲ／ＧＣ−cl
amp 法を選択することが好ましい。

【００３１】なお、ＰＣＲ／ＧＣ−clamp 法は、ＤＧＧ
Ｅ法（ＤＮＡ変性剤の直線的な濃度勾配をつけたポリア
クリルアミドゲルにおける、塩基置換を含む二本鎖ＤＮ
Ａ断片と含まない二本鎖ＤＮＡ断片の、ＤＮＡを変性さ
せるべきＤＮＡ変性剤濃度の相違に基づく移動度の差異
を利用して、ＤＮＡの塩基置換を検出する方法）の変法
であり、ＤＧＧＥ法における、「複数の塩基置換がある
場合に、ポリアクリルアミドゲルにおいて、最後に融解
するドメインの塩基置換を検出することができない」と
いう欠点を、ＧＣ含量の高い領域（ＧＣ−clamp ）を、
塩基置換の検出対象であるＤＮＡ断片につなげることに
より克服した方法である〔Shefield,V.C. et al.(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:232-236等を参照のこ
と〕。

【００３２】よって、ＰＣＲ／ＧＣ−clamp 法の基本的
操作等は、ＤＧＧＥ法に準ずる〔ＰＣＲ／ＧＣ−clamp
法と同様に、Myers,R.M.,Shefield,V.,and Cox,D.R.(19
88)in Genomic Analysis:A Praclical Approach.K.Davi
es,ed.IRL Press Limited,Oxford,pp.95-139 等を参照
のこと〕が、塩基置換検出の対象となるＤＮＡ断片に、
ＧＣ−clamp を付加する工程が必要となる。

【００３３】本発明検出方法における、ＣＤ３８遺伝子
の遺伝子異常部位における変化の検出の対象となるＤＮ
Ａの出所は、特に限定されるべきものではなく、被検者
の体細胞であれば、特に限定されない。例えば、末梢血
や白血球等の血液検体を、本発明において好適に選択す
ることができる。

【００３４】被検者の検体細胞から、公知の方法を用い
てゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡにおいて、
特定の遺伝子異常部位における変化（具体的には、特定
の遺伝子異常部位における塩基の置換）を検出する。

【００３５】そして、この検出作業の結果、特定の遺伝
子の異常部位に変化が認められた場合、被検者の臨床症
状を鑑みて、被検者の糖尿病発症危険因子を検出するこ
とができる。

【００３６】すなわち、被検者が、既に糖尿病を罹患し
ている場合においては、その糖尿病の主な原因を特定す
ることが可能になる。さらに、その病態がインスリン非
依存性糖尿病であるときには、これがインスリン依存性
糖尿病へと移行する可能性を予測することが可能であ
り、その結果、病態に対応した治療あるいは予防的措置
を講ずることや、最適な治療方法の開発を行うことが可
能となる。

【００３７】また、被検者が糖尿病を発症していない場
合、あるいは異なる検査の結果、あるいは家族歴等から
その危険群である場合には、特定の遺伝子異常部位の変
化を、その被検者の遺伝的な糖尿病体質の根拠として用
いて、適切な糖尿病発症の予防的措置（例えば、運動や
食事の内容についての指導）を行うことによって、その
被検者の糖尿病の発症を予防することも可能である。

【００３８】

【実施例】以下、本発明を実施例により、さらに具体的
に説明するが、この実施例により、本発明の技術的範囲
を限定することを意味するものではない。ＣＤ３８遺伝子解析対象日本糖尿病学会の診断基準に基づいて、糖尿病と診断さ
れた２４０例を対象に、ＤＧＧＥ法によるＣＤ３８遺伝
子の変異の解析を行った。

【００３９】ゲノムＤＮＡの抽出健常人及び糖尿病患者のゲノムＤＮＡは、抗凝固剤Ｅ
ＤＴＡ３Ｋを含む真空採血管を用いて患者の末梢血を
採取した後、ＱｌＡａｍｐＢｌｏｏｄＫｉｔ（ＱＩ
ＡＧＥＮ杜）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。

【００４０】ＤＧＧＥ解析用ＰＣＲプライマーおよび泳
動条件の設定ヒトＣＤ３８タンパク質（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｃ
ｙｃｌａｓｅ／ｃｙｃｌｉｃＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ
ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）をコードする遺伝子の塩基配列
（配列番号１）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎ
ｋデータベースＡＣＣＥＳＳＩＯＮＤ８４２７８〜
８４（Nata,K.,et al., ）より入手した。

【００４１】ＣＤ３８遺伝子の各エクソンを、ＰＣＲ法
にて増幅するためのプライマー設定は、コンピューター
ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウェアー開発
社）を用いて行った。また、設定したプライマーを用い
て増幅した、ＰＣＲ断片中の融解ドメインの融解特性
（ドメインの位置と融解温度など）の推定にはコンピュ
ーターソフトＭａｃＭｅｌｔ（日本バイオラッド社）
を使用した。演算によって得られた融解特性より、ＧＣ
クランプをどちらのプライマーに付加するかを決定し、
さらに、そのＰＣＲ断片の分析に適した変性剤の濃度範
囲を決定した。

【００４２】ここに、ＣＤ３８遺伝子の各エクソンの増
幅に用いたＰＣＲプライマーの塩基配列を記載する。エクソン１５' −ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣ
ＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧ
ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＡ
ＣＣＣＣＧ−３' （Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号３）５' −ＡＣＣＧＧＴＧＣＧＣＣＴＴＡＧＴＣ
ＧＣＣＡ−３'（Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号４）エクソン２５' −ＴＡＧＡＣＴＧＣＡＴＧＴＴＡＧＡＣ
ＧＡＧＡ−３'（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号５）５' −ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣ
ＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧ
ＣＣＣＧＴＴＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＡＡＴＴ
ＧＴＴＡＣＣ−３' （Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号
６）エクソン３５' −ＧＡＣＡＴＧＣＴＡＡＡＴＴＧＡＴＣ
ＴＣＡＧ−３'（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号７）５' −ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣ
ＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧ
ＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＣＴＣＴ
ＧＴＴＣ−３' （Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号
８）エクソン４５' −ＣＣＡＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧ
ＴＣＴＴ−３'（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号９）５' −ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣ
ＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧ
ＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＧＴ
ＡＡＣＧＴＣ−３' （Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号
１０）エクソン５５' −ＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧ
ＴＧＡＴＴ−３'（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号１
１）５' −ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣ
ＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧ
ＣＣＣＧＴＴＣＡＣＴＧＴＧＡＴＡＴＴＴＧ
ＣＡＡＣＡＧＧ−３' （Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号
１２）エクソン６５' −ＧＧＴＴＧＡＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴ
ＣＴＴＴＧＴ−３'
（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号１３）５' −ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣ
ＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧ
ＣＣＣＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＴＴＴＧＴＧ
ＧＡＣＴＧＡＴＴ−３'（Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列
番号１４）エクソン７５' −ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣ
ＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧ
ＣＣＣＧＴＴＧＴＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴ
ＡＣＡＡＡ−３' （Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号
１５）５' −ＡＧＡＴＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣ
ＣＡＡＧ−３'（Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号１６）エクソン８５' −ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣ
ＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧ
ＣＣＣＧＴＴＡＧＣＧＡＡＴＴＧＧＡＣＧＡ
ＣＡＧＡＴＧ−３' （Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号
１７）５' −ＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＡＣＣＴＴＡＴ
ＴＧＴＧＧ−３'（Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号１
８）エクソン３５' −ＣＴＣＣＧＣＣＡＣＴＣＴＣＣＴＧＣ
ＡＣＡＣＡ−３'（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号１
９）５' −ＧＧＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴ
ＣＡＣ−３'（Ｒｅｖｅｒｓｅ：配列番号２０）エクソン７５' −ＴＴＧＴＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＡ
ＣＡＡＡ−３'（Ｆｏｒｗａｒｄ：配列番号２１）

【００４３】ＰＣＲ増幅各エクソンのＰＣＲ増幅は、抽出したゲノムＤＮＡ０．
５μg/μL を用いて、各０．８μM のそれぞれのエクソ
ンの合成オリゴヌクレオチドプライマー、各ヌクレオチ
ド三リン酸（ｄＮＴＰ）を２００μM 及び３％ホルムア
ミドを含有する５０μL のＰＣＲ反応液〔１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）、５０mM ＫＣｌ、
１．５mM ＭｇＣｌ₂〕に、０．５units のＴａｑＤ
ＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅ
ｒ社）を加えて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の条
件は、９４℃で３０秒、５４〜６８℃で３０秒、７２℃
で１分間のサイクルを４０回繰り返し、最後は７２℃で
１０分間反応を行い、目的のＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ
反応の確認は、５μL のＰＣＲ産物を、３％アガロース
で電気泳動を行い、０．５μg/mLエチジウムブロマイド
で染色を行い、確認した。

【００４４】なお、ＣＤ３８遺伝子の各エクソンの塩基
配列について、エクソン１は、配列番号１の１〜２３３
番まで；エクソン２は、配列番号１の２３４〜３６３番
目まで；エクソン３は、配列番号１の３６４〜４９８番
目まで；エクソン４は、配列番号１の４９９〜５８５番
目まで；エクソン５は、配列番号１の５８６〜６５９番
目まで；エクソン６は、配列番号１の６６０〜７５２番
目まで；エクソン７は、配列番号１の７５３〜８３９番
目まで；エクソン８は、配列番号１の８４０〜８９０番
目までとして表されている。

【００４５】ＤＧＧＥ法による遺伝子変異のスクリーニ
ングＤＧＧＥ法は、Ｍｙｅｒｓらの方法に従い行った。すな
わち、変性グラジエントポリアクリルアミドの作製は、
１７７×２２０mmガラス板（宝酒造社）を使用し、変性
剤の濃度が、各々のエクソンにおいて、最も適した濃度
勾配を選択し、濃度勾配の幅が３０％以内になるように
設計し、作製した。各々の最適の濃度の作製は、０％デ
ネイチャーラントの９％アクリルアミド（アクリルアミ
ド：ビスアクリルアミド＝３７．５：１）ＴＡＥ溶液
（４０mM Ｔｒｉｓ、２０mM 酢酸ナトリウム、２mM
ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）と８０％デネイチャーラント
（５．１９Ｍ尿素、３０％脱イオン化ホルムアミド）含
有９％アクリルアミドＴＡＥ溶液で、グラジエントメー
カーを用いて作製した。

【００４６】ＤＧＧＥ法によるＰＣＲ産物の遺伝子変異
スクリーニングは、上述のように得られた各エクソンの
ＰＣＲ産物（１５μL ）を５００μL のチューブに分取
し、真空乾燥機を用いて乾固し、１０μL のローディン
グ液〔２０％Ｆｉｃｏｌｌ、１mM ＥＤＴＡ及び０．５
％ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ含有１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）〕を加えて、再溶解
した後、ゲルに５μLアプライした。電気泳動は、１×
ＴＡＥ溶液（１６Ｌ）を含むＤＧＧＥ電気泳動槽（宝酒
造社）で、溶液温度を６０℃に保温し、１５０Ｖ・１６
時間で泳動した。泳動後、０．５μg/mLエチジウムブロ
マイドで染色した後、紫外線下でＤＮＡ断片を検出し、
そのパターンを判定した。

【００４７】このように、ＤＧＧＥ法による、ＣＤ３８
遺伝子の各エクソン及びイントロン領域における変異遺
伝子のスクリーニングの結果、エクソン２に１つ（第１
図）、エクソン３に２つ（第２図）、エクソン４に２つ
（第３図）、エクソン７に１つ（第４図）、及びエクソ
ン８に１つ（第５図）の野生型とは異なるバンドパター
ンを示し、異常バンドパターンであることが認められ
た。ＤＧＧＥ法における遺伝子異常のスクリーニングの
結果、得られる異常バンドパターンは、得られた検体の
ＰＣＲ産物に野生型とは異なる塩基配列が含まれている
ことを示唆しており、その明確な塩基配列は別の方法で
決定しなくてはならない。

【００４８】ダイレクトシークエンスによる塩基配列の
決定ＤＧＧＥ法で、異常パターンの認められたＰＣＲ産物に
ついて、オートシークエンサーを用いたダイレクトシー
クエンス法により塩基配列を解析した。すなわち、異常
バンドパターンの検出されたＰＣＲ産物を、ＢｉｇＤｙ
ｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇＦｓＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉ
ｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて蛍光標識し
た後、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡＳｅｑｕ
ｅｎｃｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社）を用いて塩基配列を決定した。

【００４９】このオートシークエンサーを用いた、ダイ
レクトシークエンス法による塩基配列解析の結果、エク
ソン２に異常バンドパターンが検出された個体は、３４
８番目の塩基に、野生型の塩基配列であるシトシン
（Ｃ）の他にチミン（Ｔ）が検出され、この３４８番目
の塩基に、ＣからＴへの置換が生じていることが同定さ
れた（第６図）。このＣからＴへの一塩基置換により、
１１６番目のアミノ酸に対するコドンが、ＡＣＣからＡ
ＣＴに変化するが、対応するアミノ酸は変わらずスレオ
ニン（Ｔｈｒ）であり、この一塩基置換によるアミノ酸
の置換は生じていないことが明らかになった。つまり、
この３４８番目の塩基における、ＣからＴへの置換は、
アミノ酸の置換を伴わない、いわゆるサイレント変異で
あり、異常バンドパターンが検出された個体において
は、Ｃ３４８Ｔ変異のヘテロ接合体であった。

【００５０】エクソン３に、異常バンドパターンの検出
された個体の一方は、４１８番目の塩基に、野生型の塩
基配列であるＣの他にＴが検出され、このＣからＴの一
塩基置換により、１４０番目のアミノ酸に対するコドン
がＣＧＧからＴＧＧに変化し、その結果、この１４０番
目のアミノ酸が、アルギニン（Ａｒｇ）からトリプトフ
ァン（Ｔｒｐ）に置換が生じていることが同定された
（第７図）。つまり、エクソン３に、異常バンドパター
ンが検出された個体は、上記の１４０番目のアミノ酸が
置換する、いわゆるミスセンス変異のＡｒｇ１４０Ｔｒ
ｐ変異であり、Ａｒｇ１４０Ｔｒｐ変異のヘテロ接合体
であった。

【００５１】エクソン３に、異常バンドパターンが認め
られた個体のもう一方は、シーケンスの結果、４１８番
目の塩基としてＴのみが認められ、Ａｒｇ１４０Ｔｒｐ
変異のホモ接合体であった（第８図）。

【００５２】エクソン４に、異常バンドパターンの検出
された個体の一方は、５０４番の塩基に、野生型の塩基
配列であるＡの他にＣが検出され、このＡからＣの一塩
基置換により、１６８番目のアミノ酸に対するコドン
が、ＡＴＡからＡＴＣに変化していることが同定された
（第９図）。上記の５０４番目の塩基における、Ａから
Ｃへの置換により、対応する１６８番目のアミノ酸は、
イソロイシン（Ｉｌｅ）のままであった。つまり、５０
４番目の塩基に生じていたＡからＣへの置換は、アミノ
酸の置換を伴わないサイレント変異であり、エクソン４
に異常パターンが検出された個体は、Ａ５０４Ｃ変異の
ヘテロ接合体であった。

【００５３】エクソン４に、異常バンドパターンが認め
られたもう一方の個体は、５０４番目の塩基としてＣの
みが認められる、Ａ５０４Ｃ変異のホモ接合体であった
（第１０図）。

【００５４】エクソン７に、異常バンドパターンの検出
された個体は、７９１番目の塩基に、野生型の塩基配列
であるＣの他にＴが検出され、ＣからＴへの一塩基置換
により、２６４番目のアミノ酸に対するコドンがＴＣＧ
からＴＴＧに変化し、その結果、アミノ酸がセリン（Ｓ
ｅｒ）からロイシン（Ｌｅｕ）に置換していることが同
定された（第１１図）。つまり、エクソン７に、異常バ
ンドパターンが検出された個体は、上記の７９１番目の
塩基におけるＣからＴの一塩基置換により、２６４番目
のアミノ酸に置換が生ずる、Ｓｅｒ２６４Ｌｅｕ変異の
ヘテロ接合体であった。

【００５５】エクソン８に、異常バンドパターンの検出
された個体は、ＣＤ３８遺伝子のエクソン８の上流に位
置するイントロン７において、エクソン８のスプライシ
ングに係わるアクセプター部位から、−２８塩基上流に
存在する塩基（配列番号２２で示されるイントロン７の
配列において３９番目の塩基）に、野生型であるＧの他
にＡが検出された（第１２図）。つまり、このエクソン
８において検出された異常バンドのパターンは、上記の
アクセプター部位から、−２８塩基上流に存在する塩基
に、ＧからＡへの塩基に置換が生じているイントロン７
−２８Ｇ／Ａ変異のヘテロ接合体であった。

【００５６】上述のごとく、糖尿病患者群において検出
されたＣＤ３８遺伝子の遺伝子変異に関しては、２つの
ミスセンス変異である、エクソン３のＡｒｇ１４０Ｔｒ
ｐ変異とエクソン７のＳｅｒ２６４Ｌｅｕ変異は、とも
に対応するアミノ酸が変化することにより、ＣＤ３８タ
ンパク質の機能に異常を生じさせると考えられる。事
実、Ａｒｇ１４０Ｔｒｐ変異をもつＣＤ３８タンパク質
は、ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｃｙｃｌａｓｅ活性、及
びｃｙｃｌｉｃＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ（ｃＡＤＰＲ）
ｈｙｄｒｏｌａｓｅ活性がともに低下していた（Diabet
ologia 1998 41:1024-1028）。

【００５７】一方、Ｓｅｒ２６４Ｌｅｕ変異について
は、この２６４番のアミノ酸を含む、いくつかのアミノ
酸からなる領域が、ＣＤ３８タンパク質が酵素活性を発
揮する際に、その基質となるＮＡＤ⁺と結合する上で重
要な領域であることが分かっている。すなわち、上記の
２６４番目のアミノ酸を含む領域のいずれかのアミノ酸
が、他のアミノ酸に置換したＣＤ３８タンパク質は、そ
の酵素活性が低下するか、又は失われるものと考えられ
る。

【００５８】イントロン７−２８Ｇ／Ａ変異は、ｍＲＮ
Ａへのスプライシング時のラリアート構造の形成に関与
する、いわゆる「枝分れ部位」のコンセンサス配列内に
存在すると予測された〔遺伝子（下）東京化学同人〕。
よって、イントロン７−２８Ｇ／Ａ変異は、ＣＤ３８ｍ
ＲＮＡの生成に影響を及ぼし、これにより、異常タンパ
ク質、あるいは異常ｍＲＮＡが合成されている可能性が
ある。

【００５９】ＣＤ３８遺伝子変異の頻度解析上述のごとく、検出同定されたＣＤ３８遺伝子における
変異、すなわちエクソン２のＣ３４８Ｔ変異、エクソン
３のＡｒｇ１４０Ｔｒｐ変異、エクソン４のＡ５０４Ｃ
変異、エクソン７のＳｅｒ２６４Ｌｅｕ変異、及びイン
トロン７−２８Ｇ／Ａ変異について、糖尿病患者群及び
非糖尿病患者群の両群を対象にして、その出現頻度を比
較検討した。なお、３種類の変異、エクソン３のＡｒｇ
１４０Ｔｒｐ変異、エクソン７のＳｅｒ２６４Ｌｅｕ変
異及びイントロン７−２８Ｇ／Ａ変異は、いずれも一塩
基の置換により、制限酵素の認識部位が変化することか
ら、その判定には、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いた。ま
た、エクソン２のＣ３４８Ｔ変異及びエクソン４のＡ５
０４Ｃ変異は、前述したＰＣＲ−ＤＧＧＥ法により解析
した。

【００６０】ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による遺伝子変異の解
析エクソン３Ａｒｇ１４０Ｔｒｐ変異の検出法抽出したゲノムＤＮＡ０．５μL を用いて、配列番号１
９及び２０のオリゴヌクレオチドプライマーで、上述の
ごとく、ＰＣＲ反応を行い、目的の３８１bpのＰＣＲ産
物を得た。この１０μL のＰＣＲ産物を、制限酵素Ｔｓ
ｐＲＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社）
２．５units で、６５℃で一晩消化処理をした後、３％
アガロースで電気泳動を行い、エクソン３Ａｒｇ１４０
Ｔｒｐ変異の検出をした。すなわち、野生型の場合、３
８１ｂｐのＤＮＡ断片は、３１１ｂｐと７０ｂｐの２つ
の断片に切断されるが、Ａｒｇ１４０Ｔｒｐ変異を有す
る場合、２２８ｂｐと８３ｂｐと７０ｂｐの３つの断片
に切断されることにより判定される（第１３図）。

【００６１】エクソン７Ｓｅｒ２６４Ｌｅｕ変異の検出
法抽出したゲノムＤＮＡ０．５μL を用いて、配列番号２
１及び１７のオリゴヌクレオチドプライマー及び最終濃
度が３％になるようにホルムアミドを加えたＰＣＲ溶液
で、上述のごとく、ＰＣＲ反応を行い、目的の２７４bp
のＰＣＲ産物を得た。この１０μL のＰＣＲ産物を、制
限酵素ＴａｑＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａ
ｂｓ社）５units で、６５℃で一晩消化処理をした後、
３％アガロースで電気泳動を行い、エクソン７Ｓｅｒ２
６４Ｌｅｕ変異の検出をした。すなわち、野生型の場
合、２７４ｂｐのＤＮＡ断片は、１４９ｂｐと１２５ｂ
ｐの２つの断片に切断されるが、Ｓｅｒ２６４Ｌｅｕ変
異を有する場合、全く切断されないことにより判定され
る（第１４図）。

【００６２】イントロン７−２８Ｇ／Ａ変異の検出法抽出したゲノムＤＮＡ０．５μL を用いて、配列番号１
７及び１８のオリゴヌクレオチドプライマー及び最終濃
度が３％になるようにホルムアミドを加えたＰＣＲ溶液
で、上述のごとく、ＰＣＲ反応を行い、目的の２９７bp
のＰＣＲ産物を得た。この１０μL のＰＣＲ産物を、制
限酵素Ｔｒｕ９Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）２units で、６
５℃で一晩消化処理をした後、３％アガロースで電気泳
動を行い、イントロン７−２８Ｇ／Ａ変異の検出をし
た。すなわち、野生型の場合、２９７ｂｐのＤＮＡ断片
は、全く切断されないが、イントロン７−２８Ｇ／Ａ変
異を有する場合、２２０bpと７７bpの２つの断片に切断
されることにより、判定される（第１５図）。

【００６３】各遺伝子変異の出現頻度ＤＧＧＥ法による遺伝子解析を実施した２４０例を含
め、糖尿病患者群７５７例について解析した。エクソン
２のＣ３４８Ｔ変異は、２例（２例／２４０例）に変異
が検出され、その遺伝子変異頻度は０．８％であった。
エクソン３Ａｒｇ１４０Ｔｒｐ変異は、ヘテロ接合体が
２７例（２７例／７５７例）に、同変異のホモ接合体が
１例（１例／７５７例）に検出され、その遺伝子変異頻
度は３．７％であった。エクソン４のＡ５０４Ｃ変異
は、ヘテロ接合体が５８例（５８例／２４０例）、同変
異のホモ接合体が４例（４例／２４０例）に変異が検出
され、その遺伝子変異頻度は２５．８％であった。エク
ソン７Ｓｅｒ２６４Ｌｅｕ変異は、ヘテロ接合体が９例
（９例／７５７例）に検出され、その遺伝子変異頻度は
１．２％であった。イントロン７−２８Ｇ／Ａ変異は、
ヘテロ接合体が９例（９例／７５７例）に検出され、そ
の遺伝子変異頻度は１．２％であった。

【００６４】一方、非糖尿病者２０５例を解析したとこ
ろ、エクソン３Ａｒｇ１４０Ｔｒｐ変異は、ヘテロ接合
体が３例（３例／２０５例）に、イントロン７−２８Ｇ
／Ａ変異は、へテロ接合体が２例（２例／２０５例）に
検出され、エクソン７Ｓｅｒ２６４Ｌｅｕ変異を有する
ものは、２０５例の非糖尿病群には認められなかった。

【００６５】また、Ｃ３４８Ｔ変異を有するヘテロ接合
体２例のうち、１例は、Ａ５０４Ｃ変異のヘテロ接合体
であり、他の１例は、Ａ５０４Ｃ変異が認められない野
生型の塩基配列であった。そして、５８例のＡ５０４Ｃ
変異ヘテロ接合体のうち、５７例は、他の変異を共有し
ていなかった。すなわち、この結果から、Ｃ３４８Ｔ変
異とＡ５０４Ｃ変異は、それぞれ独立した対立遺伝子上
に存在すると考えられる。

【００６６】上記のごとく、インスリン産生細胞におい
て、インスリンの分泌に密接に関与するタンパク質であ
るＣＤ３８タンパク質をコードする遺伝子の変異を解析
し、さらに、その解析の結果、同定された遺伝子変異に
ついて、糖尿病群と非糖尿病群における遺伝子変異の頻
度を解析した。その結果、少なくともＣＤ３８タンパク
質の発現量及びその機能を欠失すると考えられる変異に
おいて、糖尿病群において、エクソン３Ａｒｇ１４０Ｔ
ｒｐ変異、エクソン７Ｓｅｒ２６４Ｌｅｕ変異及びイン
トロン７−２８Ｇ／Ａ変異を有する遺伝子変異の頻度
は、６．１％（４６例／７５７例）であり、これは、非
糖尿病群における上記遺伝子変異の頻度が２．４％（５
例／２０５例）であるのに比べると、明らかに高頻度で
あることが証明された。この結果は、単一の遺伝子変異
による糖尿病の原因遺伝子異常であるミトコンドリア遺
伝子異常全体の頻度が、糖尿病群において約２％である
という結果を鑑みると、ＣＤ３８タンパク質をコードす
る遺伝子の異常の頻度が、糖尿病群において６．１％で
あるということは、ＣＤ３８遺伝子の異常は、糖尿病患
者において極めて高頻度に出現しており、これまでに報
告されている他の遺伝子の異常と比較しても際立って高
頻度である。遺伝子の変異は、国や地域によって集積や
偏りがあることは、よく知られており、今後、対象を拡
大して解析を進めることにより、上記の３種の遺伝子変
異の出現頻度が更に増加すること、あるいは、上記の３
種の遺伝子変異以外のＣＤ３８遺伝子の遺伝子変異が見
出されることが考えられ、ＣＤ３８遺伝子全体の異常に
よる糖尿病患者の特定数は、さらに増加する可能性があ
る。従って、上記の３種の遺伝子変異、あるいはさらに
追加されるであろう新たな遺伝子変異は、それぞれ個別
に検出されるべきものではなく、ＣＤ３８遺伝子全体と
してとらえることにより、糖尿病発症危険因子の検出マ
ーカーとしての有用性が向上するものである。

【００６７】

【発明の効果】本発明により、糖尿病発症危険因子の、
遺伝子を用いた検出手段が提供される。

【００６８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> BML, INC. <120> Method of Detecting Deabetogenic Risk Factor <130> PBM37 <140> <141> <160> 23 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1305 <212> DNA <213> Hominidae <220> <221> CDS <222> (1)..(900) <400> 1 -103 aaa cagaagggga ggtgcagttt cagaacccag ccagcctctc -61 tcttgctgcc tagcctcctg ccggcctcat cttcgcccag ccaaccccgc ctggagccct -1 atg gcc aac tgc gag ttc agc ccg gtg tcc ggg gac aaa ccc tgc tgc 48 Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys 1 5 10 15 cgg ctc tct agg aga gcc caa ctc tgt ctt ggc gtc agt atc ctg gtc 96 Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val 20 25 30 ctg atc ctc gtc gtg gtg ctc gcg gtg gtc gtc ccg agg tgg cgc cag 144 Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln 35 40 45 cag tgg agc ggt ccg ggc acc acc aag cgc ttt ccc gag acc gtc ctg 192 Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu 50 55 60 gcg cga tgc gtc aag tac act gaa att cat cct gag atg aga cat gta 240 Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val 65 70 75 80 gac tgc caa agt gta tgg gat gct ttc aag ggt gca ttt att tca aaa 288 Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys 85 90 95 cat cct tgc aac att act gaa gaa gac tat cag cca cta atg aag ttg 336 His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu 100 105 110 gga act cag acc gta cct tgc aac aag att ctt ctt tgg agc aga ata 384 Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile 115 120 125 aaa gat ctg gcc cat cag ttc aca cag gtc cag cgg gac atg ttc acc 432 Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr 130 135 140 ctg gag gac acg ctg cta ggc tac ctt gct gat gac ctc aca tgg tgt 480 Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys 145 150 155 160 ggt gaa ttc aac act tcc aaa ata aac tat caa tct tgc cca gac tgg 528 Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp 165 170 175 aga aag gac tgc agc aac aac cct gtt tca gta ttc tgg aaa acg gtt 576 Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val 180 185 190 tcc cgc agg ttt gca gaa gct gcc tgt gat gtg gtc cat gtg atg ctc 624 Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu 195 200 205 aat gga tcc cgc agt aaa atc ttt gac aaa aac agc act ttt ggg agt 672 Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser 210 215 220 gtg gaa gtc cat aat ttg caa cca gag aag gtt cag aca cta gag gcc 720 Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala 225 230 235 240 tgg gtg ata cat ggt gga aga gaa gat tcc aga gac tta tgc cag gat 768 Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp 245 250 255 ccc acc ata aaa gag ctg gaa tcg att ata agc aaa agg aat att caa 816 Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln 260 265 270 ttt tcc tgc aag aat atc tac aga cct gac aag ttt ctt cag tgt gtg 864 Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val 275 280 285 aaa aat cct gag gat tca tct tgc aca tct gag atc tgagccagtc 910 Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile 290 295 300 gctgtggttg ttttagctcc ttgactcctt gtggtttatg tcatcataca tgactcagca 970 tacctgctgg tgcagagctg aagattttgg agggtcctcc acaataaggt caatgccaga 1030 gacggaagcc tttttcccca aagtcttaaa ataacttata tcatcagcat acctttattg 1090 tgatctatca atagtcaaga aaaattattg tataagatta gaatgaaaat tgtatgttaa 1150 gttacttcac tttaattctc atgtgatcct tttatgttat ttatatattg gtaacatcct 1210 ttctattgaa aaatcaccac accaaacctc tcttattaga acaggcaagt gaagaaaagt 1270 gaatgctcaa gtttttcaga aagcattaca tttcc 1305 <210> 2 <211> 300 <212> PRT <213> Hominidae <400> 2 Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys 1 5 10 15 Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val 20 25 30 Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln 35 40 45 Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu 50 55 60 Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val 65 70 75 80 Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys 85 90 95 His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu 100 105 110 Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile 115 120 125 Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr 130 135 140 Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys 145 150 155 160 Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp 165 170 175 Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val 180 185 190 Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu 195 200 205 Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser 210 215 220 Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala 225 230 235 240 Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp 245 250 255 Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln 260 265 270 Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val 275 280 285 Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile 290 295 300 <210> 3 <211> 61 <212> DNA <213> Hominidae <400> 3 cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg atcttcgccc agccaacccc 60 g 61 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Hominidae <400> 4 accggtgcgc cttagtcgcc a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Hominidae <400> 5 tagactgcat gttagacgag a 21 <210> 6 <211> 62 <212> DNA <213> Hominidae <400> 6 cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg tttggaccta tgaattgtta 60 cc 62 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Hominidae <400> 7 gacatgctaa attgatctca g 21 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Hominidae <400> 8 cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg cagcagaagt cactctgttc 60 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Hominidae <400> 9 ccattctcca gcctccgtct t 21 <210> 10 <211> 62 <212> DNA <213> Hominidae <400> 10 cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg caagcactga ctgagtaacg 60 tc 62 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Hominidae <400> 11 aaactgctgg aggatggtga tt 22 <210> 12 <211> 63 <212> DNA <213> Hominidae <400> 12 cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg ttcactgtga tatttgcaac 60 agg 63 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Hominidae <400> 13 ggttgatgtt tggggttctt tgt 23 <210> 14 <211> 64 <212> DNA <213> Hominidae <400> 14 cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg tgtggattct tttgtggact 60 gatt 64 <210> 15 <211> 61 <212> DNA <213> Hominidae <400> 15 cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg ttgtccaggg cgtgctacaa 60 a 61 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Hominidae <400> 16 agattcacac agccctccaa g 21 <210> 17 <211> 62 <212> DNA <213> Hominidae <400> 17 cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg ttagcgaatt ggacgacaga 60 tg 62 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Hominidae <400> 18 tctggcattg accttattgt gg 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Hominidae <400> 19 ctccgccact ctcctgcaca ca 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Hominidae <400> 20 gggcctccag cagaagtcac 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Hominidae <400> 21 ttgtccaggg cgtgctacaa a 21 <210> 22 <211> 66 <212> DNA <213> Hominidae <400> 22 ttagcgaatt ggacgacaga tgtatcctac ggtctcttga tttccttttt tgctttcttg 60 tcatag 66

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＤ３８遺伝子のエクソン２におけるＤＧＧＥ
法による、遺伝子変異解析の異常バンドパターンを示し
た図である。

【図２】ＣＤ３８遺伝子のエクソン３におけるＤＧＧＥ
法による、遺伝子変異解析の異常バンドパターンを示し
た図である。

【図３】ＣＤ３８遺伝子のエクソン４におけるＤＧＧＥ
法による、遺伝子変異解析の異常バンドパターンを示し
た図である。

【図４】ＣＤ３８遺伝子のエクソン７におけるＤＧＧＥ
法による、遺伝子変異解析の異常バンドパターンを示し
た図である。

【図５】ＣＤ３８遺伝子のエクソン８におけるＤＧＧＥ
法による、遺伝子変異解析の異常バンドパターンを示し
た図である。

【図６】ＣＤ３８遺伝子のエクソン２におけるＤＧＧＥ
法による、異常バンドパターン例におけるダイレクトシ
ークエンス法による塩基配列の同定について、示した図
面である。

【図７】ＣＤ３８遺伝子のエクソン３におけるＤＧＧＥ
法による、異常バンドパターン例におけるダイレクトシ
ークエンス法による塩基配列の同定について、示した図
面の一方である。

【図８】ＣＤ３８遺伝子のエクソン３におけるＤＧＧＥ
法による、異常バンドパターン例におけるダイレクトシ
ークエンス法による塩基配列の同定について、示した図
面の他方である。

【図９】ＣＤ３８遺伝子のエクソン４におけるＤＧＧＥ
法による、異常バンドパターン例におけるダイレクトシ
ークエンス法による塩基配列の同定について、示した図
面の一方である。

【図１０】ＣＤ３８遺伝子のエクソン４におけるＤＧＧ
Ｅ法による、異常バンドパターン例におけるダイレクト
シークエンス法による塩基配列の同定について、示した
図面の他方である。

【図１１】ＣＤ３８遺伝子のエクソン７におけるＤＧＧ
Ｅ法による、異常バンドパターン例におけるダイレクト
シークエンス法による塩基配列の同定について、示した
図面である。

【図１２】ＣＤ３８遺伝子のエクソン８におけるＤＧＧ
Ｅ法による、異常バンドパターン例におけるダイレクト
シークエンス法による塩基配列の同定について、示した
図面である。

【図１３】ＣＤ３８遺伝子のエクソン３Ａｒｇ１４０Ｔ
ｒｐ変異を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法で判定した結果を示し
た図面である。

【図１４】ＣＤ３８遺伝子のエクソン７Ｓｅｒ２６４Ｌ
ｅｕ変異を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法で判定した結果を示し
た図面である。

【図１５】ＣＤ３８遺伝子のイントロン７−２８Ｇ／Ａ
変異を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法で判定した結果を示した図
面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者江頭徹埼玉県川越市的場1361番地１株式会社ビー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者長野誠埼玉県川越市的場1361番地１株式会社ビー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者提箸幸子埼玉県川越市的場1361番地１株式会社ビー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者松井加奈埼玉県川越市的場1361番地１株式会社ビー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者服部浩明埼玉県川越市的場1361番地１株式会社ビー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者金塚東千葉県千葉市若葉区千城台北４−６−６ (72)発明者高澤伸宮城県仙台市泉区実沢字男生山４−５ (72)発明者岡本宏宮城県仙台市青葉区角五郎２−15−３− 205 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA02 HA11 4B063 QA08 QA13 QA17 QA19 QQ02 QQ42 QR08 QR62 QS25 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＣＤ３８遺伝子の遺伝子変異を検出するこ
とにより、被検者における糖尿病発症危険因子を検出す
る、糖尿病発症危険因子の検出方法。
【請求項２】遺伝子変異が認められる部位が、ＣＤ３８
遺伝子によってコードされるＣＤ３８タンパク質の１４
０番目のアルギニンをコードする部位、同２６４番目の
セリンをコードする部位及びイントロン７の−２８番目
のグアニンから選ばれる１種又は２種以上である、請求
項１記載の糖尿病発症危険因子の検出方法。