JP4444576B2 - ２型糖尿病関連遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２型糖尿病に関連する遺伝子に関する。本発明は、さらに、２型糖尿病に関連する変異を検出するためのプライマー又はプローブ、２型糖尿病に関連する多型における変異を検出するためのキット、２型糖尿病の発症前診断キット、および２型糖尿病の予備的検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
２型糖尿病は世界で１億人以上の人が罹患している病気である。２型糖尿病は、末梢組織におけるインスリン抵抗性と膵臓ランゲルハンス島のβ細胞の機能障害が原因と考えられているが、正確な原因と機序はいまだ不明である。
糖尿病の発病と進行には、遺伝的要因が深く関わっていることが知られていて、これまで、若年発症家族性糖尿病（ＭＯＤＹ;maturity-onset diabetes of the young）やミトコンドリア糖尿病のような特異的な病態を示す糖尿病の原因遺伝子がいくつか同定されている。しかし、これらの遺伝子変化により説明される特異的病態を示す糖尿病は、全体のごくわずかの症例でしかない。すなわち、糖尿病に罹りやすい体質であるかどうかに影響を与える遺伝子は、そのほとんどが同定されていないものと考えられている。特に日本人の糖尿病患者における既知の糖尿病関連遺伝子の関与は低いため、他に未知の関連遺伝子が存在すると考えられる。
【０００３】
今日まで、２型糖尿病との関連が示唆されている遺伝子は、ほとんど同定されていない。これは、個々の遺伝子の効果が、複雑な遺伝的及び環境的背景により非常に小さくなるため、古典的なアプローチでは疾患の原因となる対立遺伝子を同定することは、非常に困難であることが原因と考えられている。
一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれる、配列決定されたゲノムにおいて高頻度に検出される遺伝的変異が、糖尿病を含む種々の病気の有用なマーカーとなっている。発明者らは、インベーダー法とマルチプレックスＰＣＲとの組合せによるハイスループットＳＮＰ遺伝子解析法を用いて、ＳＮＰを用いたゲノムワイドな関連研究を着手して、糖尿病に関連する遺伝子座の特定を進めている。
【０００４】
２型糖尿病患者の多くは、遺伝的な要因に、環境因子（肥満、運動不足、脂肪の多い食生活など）が加わって発症すると考えられている。したがって、糖尿病に関与する遺伝因子を事前に診断し、発症前に糖尿病に罹患する可能性が高いとわかった人に対しては食事や運動面において注意することによって、糖尿病の発症を未然に防ぐことが可能となる。そのため、遺伝的に糖尿病に罹患する可能性が高い人を事前に検出するため、また、糖尿病発症についてのメカニズムを遺伝学的に解明するために、２型糖尿病に関連する多型を検出することが求められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の事情に鑑みて達成されたものであり、２型糖尿病に関連する遺伝子の変異に関する情報を提供することを目的とする。さらに、２型糖尿病に関連する遺伝子を用いた、２型糖尿病を発症する可能性の高い人を発症前に検出するための方法及びキットを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、２型糖尿病に関連する遺伝子を同定するために、ゲノム上の５５０００個以上の一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子座について遺伝子型を決定した。その結果、そのイントロンにおける多型と２型糖尿病との有意な関連から、染色体６ｐ１２に存在する転写因子活性化タンパク質２β（ＴＦＡＰ−２β）をコードする遺伝子が有望な候補であるという証拠が挙がり、本発明をするに至った。なお、ＴＦＡＰ−２β遺伝子とは、ＴＦＡＰ−２βのコード領域のみならず、イントロン、５'フランキング、３'フランキングをも含む領域をいう。
【０００７】
すなわち、本発明は、２型糖尿病に罹りやすい人を検出するための、配列番号１で表されるＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、２型糖尿病患者、その予備軍、または遺伝的に２型糖尿病に罹りやすいと考えられる人が、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域に正常の人と比べて高い頻度で有すると考えられる。
なお、本明細書では、一般に「オリゴヌクレオチド」と呼ばれるものを含む広い意味で「ポリヌクレオチド」という用語を用いることとする。
【０００８】
また、本発明は、２型糖尿病に罹りやすい人を検出するための、配列番号２で表されるヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目のグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に置換されているポリヌクレオチドの７個以上の塩基配列または全部の配列を含むポリヌクレオチドであって、少なくとも７７４番目の塩基を含むポリヌクレオチドを提供する。配列番号２は、ヒトＴＦＡＰ−２βの第一イントロンのポリヌクレオチド配列を示したものである。
ここで、塩基の位置は、ＤＮＡにおいて、第一イントロンの５'側から３'側に数える。たとえば、７７４番目の塩基とは、第一イントロンの５'側から数えて７７４塩基だけ下流に位置するＤＮＡにおける塩基である。
なお、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目のグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に置換されているポリヌクレオチドは、７７４番目の塩基以外の位置において、１個若しくは数個の塩基が欠失、挿入または置換されていてもよい。
また、本発明は、ヒトＴＦＡＰ−２βの第一イントロンにおける７７４番目の塩基がチミン（Ｔ）であれば、必要に応じ、任意の長さの断片が可能である。
【０００９】
また、本発明は、上述のポリヌクレオチドを検出するためのプローブに関する。さらに、本発明は、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目の塩基がチミン（Ｔ）であるものを検出するための配列番号３のプローブ、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目の塩基がグアニン（Ｇ）であるものを検出するための配列番号４のプローブを提供する。
これらのプローブを使用して、ヒトＴＦＡＰ−２βの第一イントロン領域において７７４番目の塩基がグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換による変異を検出することが可能である。
【００１０】
本発明は、さらに、配列番号３及び配列番号４のプローブを含む、ヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換を検出するためのキットを提供する。また、本発明は、そのようなプローブを含む２型糖尿病発症前診断キットをも提供する。これらのキットにより、２型糖尿病に罹患する可能性が高い人を検出することが可能となる。これらのキットは、配列番号５のプローブをさらに含んでもよい。配列番号５のプローブをさらに含んだキットは、ＤＮＡの増幅を伴わない迅速な多型検出法であるインベーダー解析に用いることができる。
本発明のプローブ及びプローブを含むキットは、上記のような配列番号１のポリヌクレオチドまたは配列番号２で表されるヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目のグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に置換されているポリヌクレオチドの７個以上の塩基配列または全部の配列を含むポリヌクレオチドであって、少なくとも７７４番目の塩基を含むポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを検出できるものを含む。
【００１１】
さらにまた、本発明は、上述のポリヌクレオチドを増幅するために用いられるプライマーを提供する。プライマーは、目的とするポリヌクレオチドが増幅される限り、任意の塩基の長さ及び配列を有するものを使用することができる。好適には、配列番号６と配列番号７のプライマーを使用することができる。
【００１２】
さらに、本発明は、上記プライマーを含むヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換を検出するためのキットを提供する。また、本発明は、上記プライマーを含む２型糖尿病の発症前診断キットをも提供する。これらのキットにより、２型糖尿病に罹患する可能性が高い人を検出することが可能となる。
【００１３】
さらに、本発明は、（ＧＹＧＧＶＭＫＡＧ）n（ここで、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはチミン、Ｙはチミン又はシトシン、Ｍはアデニン又はシトシン、Ｋはグアニン又はチミン、Ｖはアデニン又はグアニン又はシトシンを表す。ｎは８又は９である）で表されるタンデムリピート多型を含むポリヌクレオチドを提供する。また、このようなタンデムリピート多型を検出するためのプライマーを提供する。ここでプライマーは、目的とするタンデムリピートが検出される限り、任意の塩基の長さ及び配列を有することができ、特に限定されない。
【００１４】
そして、本発明は、上記プライマーを含む、ヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンのタンデムリピート多型が（ＧＹＧＧＶＭＫＡＧ）8〜9であるか（ＧＹＧＧＶＭＫＡＧ）10であるかを判別するためのキットを提供する。さらに、本発明は、上記プローブまたはプライマーを含む２型糖尿病発症前診断キットをも提供する。これらのキットにより、２型糖尿病に遺伝的に罹りやすい人を検出することができる。
【００１５】
さらに、本発明は、１個若しくは数個の塩基が欠失、挿入または置換された多型またはタンデムリピート多型であって、前記多型の存在が２型糖尿病に罹りやすい形質を有することを示すことを特徴とするヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における多型を含むポリヌクレオチドを提供する。
上記多型は、たとえば、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換、第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換、第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピート、第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換、第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換、第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換、第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換を例示することができる。
ここで、５'フランキング領域の−５１２位の塩基とは、転写開始点より５１２塩基分５'上流に位置する塩基をいう。
【００１６】
また、本発明は、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換、第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換、第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピート、第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換、第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換、第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換、第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換を検出するためのプローブに関する。
【００１７】
上記の置換を検出するためのプローブを以下に例示する。
５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号４４〜４６からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号３〜５からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号４７〜４９からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号５０〜５２からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号５３〜５５からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号５６〜５８からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
【００１８】
また、本発明は、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換、第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換、第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピート、第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換、第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換、第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換、第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換を検出するためのプライマーに関する。
【００１９】
上記の置換を検出するためのプライマーを以下に例示する。
５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号５９及び６０からなる一対のプライマーが挙げられる。
第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号６及び７からなる一対のプライマーが挙げられる。
第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピートを有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号８及び９からなるからなる一対のプライマーが挙げられる。
第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号６１及び６２からなる一対のプライマーが挙げられる。
第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号６３及び６４からなる一対のプライマーが挙げられる。
第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号６５及び６６からなる一対のプライマーが挙げられる。
第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号６７及び６８からなる一対のプライマーが挙げられる。
【００２０】
また、本発明は、上記変異を含むポリヌクレオチドの相補鎖またはアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドをも含む。
さらに、本発明は、上記変異を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖またはアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドを検出することによる、２型糖尿病に罹患する可能性に関連した変異の検出方法を提供する。
本発明は、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の発現量を測定するための試薬を含む２型糖尿病発症前診断キットを提供する。このキットを用いて、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の発現量を測定して、正常人よりも発現量が多い人を２型糖尿病を発症しやすい人としてより精密な検査を行い、発病前の予防を図ることができる。
以下に説明するように、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子上の多型、特に、上に具体的に示した多型は、２型糖尿病と密接に関連している。本発明の検出方法により、糖尿病発症前に、これらの多型における変異の有無を検出し、変異があると判断された人に関しては、２型糖尿病に罹りやすい体質を遺伝的に有しているとして、発症前に食事や運動に気をつけるよう指導し、必要があれば、予防的な治療を行って２型糖尿病の発症を予防することが可能である。また、糖尿病患者の近縁者が、糖尿病に罹りやすい体質を受け継いでいるかに関しても判断することが可能である。さらに、糖尿病との関連が示唆されている他の遺伝子の変異の有無も併せて検出すれば、２型糖尿病に関してより高いリスクのグループをより高い精度で検出することが可能となる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明は、２型糖尿病に関連する多型を有するポリヌクレオチドに関する。本明細書でいう多型とは、同一集団上において、ある遺伝子座にある対立遺伝子が二種類以上存在し、その頻度が１％以上ある状態をいい、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、タンデムリピート多型、マイクロサテライト多型、挿入／欠失型多型などを含む。
具体的には、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換、第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換、第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピート、第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換、第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換、第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換、第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換のいずれかであるポリヌクレオチドに関する。なお、第一イントロンの７７４番目の塩基における多型、第一イントロンのタンデムリピート多型、および第三イントロンの第５１４番目の多型は、本発明者により初めて見出されたものである。２型糖尿病と関連があると考えられる第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピートの配列を配列番号７３及び７４に示す。また、正常人が有する第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの１０回のタンデムリピートの配列を配列番号７５に示す。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ，及びその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡ、アンチセンス鎖を含み、一部に修飾塩基を有するものをも含んでもよい。また、上記多型以外の位置において、１個若しくは数個の塩基が欠失、挿入または置換されているものをも含む。
【００２３】
このようなポリヌクレオチドは、２型糖尿病に罹りやすい体質を付与する原因遺伝子の一つである。したがって、このようなポリヌクレオチドを有するか否かを調べるためのプローブ、プライマー及びキットは、２型糖尿病に罹る可能性の高いグループ及び２型糖尿病の近縁者への遺伝を調べる遺伝子診断に用いることが可能である。
【００２４】
本発明のプローブは、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域の配列の一部と実質的に相補的なプローブであればよく、特に限定されない。ここで、実質的に相補的とは、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域の配列とハイブリッドできる程度に相補的であればよいことを意味する。さらに、これらのプローブは、５'側または３'側、またはその両方に、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域の配列と相補的ではない配列を含んでも、第一イントロン領域の配列とハイブリッドできる限り、本発明のプローブに含まれるものとする。例えば、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることができる。また、検出しやすいように５'末端を標識したものを用いることもでき、そのような標識としては、たとえば、ビオチン、蛍光、または32Ｐなどが例示できる。
【００２５】
本発明のプライマーは、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の多型の上流及び下流の配列の一部と実質的に相補的なプライマー対であればよく、特に限定されない。ここで、実質的に相補的とは、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域の配列とアニーリングできる程度に相補的であればよいことを意味する。たとえば、これらのプライマーは、５'側または３'側、またはその両方に、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域の配列と相補的ではない配列を含んでも、第一イントロン領域の配列とハイブリッドできる限り、本発明のプライマーに含まれるものとする。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子と相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。
【００２６】
好適なプライマーの例としては、配列番号６及び７のプライマーが挙げられる。配列番号６及び７の１組のプライマーを使用して、ＰＣＲ等により２型糖尿病に関連する多型における変異を有するポリヌクレオチドを増幅することができる。
【００２７】
２型糖尿病に関連する多型を有するポリヌクレオチドを検出する方法としては、特に限定されない。多型における変異の検出方法としては、たとえばサンガー法、パイロシーケンシングなどにより塩基配列を直接決定してもよいが、サザンブロッティング、ＰＣＲ、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、インベーダーアッセイ、ＴａｑＭａｎＰＣＲ、ＳｎｉＰｅｒ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法、質量分析、ＲＣＡ法、ＤＮＡチップ、ＡＲＭＳ、ＢＡＭＰＥＲ、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、アレル特異的ＰＣＲのように配列を決定することなく間接的に検出してもよい。
また、本発明で言う「検出」とは、目的とする配列を直接的に検出する場合のみならず、目的とする配列と相補的な配列を検出することによる間接的な検出をも含む広い意味で、「検出」という用語を用いることとする。例えば、第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換の検出は、当該位置の塩基の相補的な塩基がシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）に置換されていることを検出することに基づくものであってもよい。
【００２８】
本発明のキットは、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における２型糖尿病に関連する多型における変異を有するポリヌクレオチドを、そのような変異を有さないポリヌクレオチドと区別して特異的にハイブリダイゼーションできるプローブ、またはそのような変異を有するポリヌクレオチドのみを、増幅できるプライマーを含む。キットに含まれる試薬としては、塩基の置換を検出できる方法により適宜変更可能である。たとえば、相補鎖を合成するタイプの変異の検出方法であれば、ｄｄＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、緩衝液などを含み、ＲＦＬＰのように制限酵素の切断に基づき検出する場合には適当な制限酵素を含む。
【００２９】
なお、本発明の２型糖尿病の発症前検出キットは、ヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子における変異、たとえば第一イントロンにおける７７４番目の塩基のグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換を検出するためのものである。本発明の２型糖尿病の発症前検出キットにより、２型糖尿病に体質的に罹りやすい人の発見及び２型糖尿病の早期治療に有効である。
【００３０】
本発明により変異の有無を検出されるＤＮＡは、ヒトの毛髪、血液、体液、唾液、培養細胞、切除された組織などから得ることができ、特に限定されない。
遺伝子発現量の測定は、当業者に公知の方法により行なうことができる（例えば「新遺伝子工学ハンドブック」改定第３版、松村正實、山本雅編集、１９９９年９月１０日、羊土社を参照）。例えば、ノザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を用いることができるがこれらに限定されない。また、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の発現量を測定するための試薬として、ＴＦＡＰ−２β遺伝子とハイブリダイゼーションするプローブまたはプライマーなどが例示できる。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例をあげて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらにより本発明を制限することを意図するものではない。
実施例１：糖尿病関連ＳＮＰの検出
滋賀医科大学、東京女子医科大学、順天堂大学、川崎医科大学または岩手医科大学の外来診療室に定期的に通院している２型糖尿病の日本人患者から、書面のインフォームド・コンセントを各患者から得たうえでＤＮＡサンプルを調製した。ＤＮＡの抽出は、次のような標準的なフェノール−クロロホルム沈殿法により行った。
末梢血液約１０ｍｌを３０００ｒｐｍ、５分間遠心し血清を除去した後、赤血球溶解液を加え室温で２０分放置した。その後、３０００ｒｐｍで５分間遠心し沈殿（白血球成分）を残し、上清は除去した。沈殿をプロテイナーゼＫにより３７℃、４時間以上処理し、タンパク質を除去した後、等量のフェノールを加え、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心後、上層（水層）を新しいチューブに移し、フェノールクロロホルム処理した。さらに遠心して、水層を新しいチューブに移しクロロホルム処理し、上層（水層）を新しいチューブに移してイソプロパノールでＤＮＡを沈殿させた。遠心して沈殿したＤＮＡを７０％エタノール処理し、その後ＴＥ溶液に溶解した。
【００３２】
まず、得られたＤＮＡサンプルのうち、１８８人分を用いて、５８２６７個の一塩基多型（ＳＮＰ）について２型糖尿病患者の遺伝子型を解析し、対立遺伝子頻度又は遺伝子型頻度を糖尿病の患者でない者（対照）と比較した。遺伝子型特定実験のためのＳＮＰはＩＭＳ−ＪＳＴ日本ＳＮＰデータベース（http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp）から無作為に選択した。各ＳＮＰの遺伝子座位における遺伝子型は、インベーダーアッセイによって決定した。
インベーダーアッセイを行う前に、マルチプレックスＰＣＲ(Multiplex ＰＣＲ)により標的部位を増幅した。マルチプレックスＰＣＲは、16.6 mMの(NH4)2SO4, 67 mMのTris (pH 8.8)、6.7 mMのMgCl2、10 mMの2-メルカプトエタノール、6.7μMのEDTA、1.5 mMのdNTP、10×Taq mix (2.5U/μl Taqポリメラーゼ、31.25U/μlのTaq抗体)、0％又は10％のDMSO、0.25μMの各プライマーの反応液中で、変性９５℃、アニーリング６０℃、伸長７２℃のサイクルを４０回繰り返して行った。
得られたＰＣＲ産物を希釈して、３８４プレートに分注した後、風乾して、３μｌのインベーダー反応液及びプローブミックスを加えた。６３℃で２０分間反応させた後、蛍光測定し、遺伝子型を判定した。
【００３３】
解析した５８２６７個のＳＮＰのうち、１４９７個のＳＮＰ遺伝子座における対立遺伝子頻度及び／又は遺伝子頻度が、糖尿病患者と対照との間で有意な相違を示した（ｐ＜０．０１）。この糖尿病患者と対照との間で有意な違いを示すＳＮＰをさらに別の糖尿病患者７５８人を加えて合計９４６人の患者で２回目のインベーダーアッセイを行った。この結果、ＴＦＡＰ−２β遺伝子内に糖尿病患者と対照との間で有意な相違を示すＳＮＰを同定し遺伝子型を特定した。
【００３４】
ＴＦＡＰ−２β遺伝子を含むゲノム領域のＤＮＡ配列について、ＧｅｎＢａｎｋの情報に基づき（アクセッション番号ＮＴ＿００７５９２）、ＰＣＲプライマーをデザインし、ゲノムＤＮＡの適当な断片を増幅した後、ダイレクトシークエンス法によりＳＮＰの同定を行った。用いたプライマーは、配列番号１０〜４３に示されるとおりである。繰り返しエレメントは、Ｓｅｋｉらにより記載された方法に従って、ＲＥＰＥＡＴ ＭＡＳＫＥＲコンピュータプログラムを使用して、解析から除いた。上記により同定されたＳＮＰは、インベーダーアッセイにより遺伝子型が特定された。ＶＮＴＲ座位は、ＰＣＲ法により、標的部位を増幅した後、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７００自動化ＤＮＡシーケンサーとＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェア（Ｇｅｎｏ Ｔｙｐｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて対立遺伝子の大きさの違いを判定することにより解析した。ＰＣＲ条件は、10 mMのTris-HCl (pH 8.3)、50 mMのKCl、1.5 mMのMgCl2、250μMのdNTP、5UのTaqポリメラーゼの反応液中で、変性９４℃、アニーリング６０℃、伸長７２℃のサイクルを３０回繰り返して行い、プライマーは配列番号８及び配列番号９のものを用いた。
【００３５】
関連性、ハプロタイプ頻度及びハーディ・ワインベルグ平衡を決定するための統計的手法およびＬＤ係数（Ｄ'）の計算は、公知の方法により行った。トランスフェクション実験の検定においては、３以上のグループの間での比較は、被験者間要因分析（one-way analysis of variance）により解析し、その後２つのグループ間の統計的な相違を見積もるためにシェフェの方法を行った。
【００３６】
この結果、染色体６ｐ１２におけるＴＦＡＰ−２β遺伝子の第二イントロンにおけるランドマークＳＮＰの遺伝子型の分布が、２型糖尿病に密接に関連していることがわかった（カイ２乗値ｃｈｉ2＝１５．２、危険率ｐ＝０．００００７）。ＮＣＢＩデータベースによれば、６個のほかの遺伝子がＴＦＡＰ−２β遺伝子の２５０ｋｂ上流または下流に位置すると予測された。これらの遺伝子内に存在する１８個の他のＳＮＰ遺伝子座を１８８人の患者について解析したが、いずれも２型糖尿病との間に有意な関連性はなかった（ｐ＞０．０１、データは示さず）。そのため、ＴＦＡＰ−２β遺伝子自体が２型糖尿病に関連が深い遺伝子であると考えられた。
【００３７】
他の多型についてＴＦＡＰ−２βをスクリーニングして、２８個のＳＮＰ、８個の挿入／欠失多型、および４個のタンデムリピート多型を同定した。図１に、ＴＦＡＰ−２β遺伝子において同定された多型を示す。図１において、＊の記号が付いたものは挿入／欠失による多型であり、†の記号が付いたものはタンデムリピート多型であり、‡の記号の付いたものはゲノムワイドなスクリーニングに使用されたランドマークＳＮＰであり、記号の付いていないものは、その後のスクリーニングで見出されたＳＮＰである。ＴＦＡＰ−２β遺伝子のコード領域にはＳＮＰはないことがわかった。
【００３８】
全体で９６４人の患者と９２２人の対照において、これらの遺伝子型を配列番号３〜５、４４〜５８のプローブ、配列番号６、７、５９〜６８のプライマーを用いて上述のようなインベーダーアッセイ又はＰＣＲを用いて特定することにより、これらの変異のうちいくつかは、肥満（肥満度ＢＭＩ≧２５）と関連した２型糖尿病と有意に相関があることがわかった。この相関は、特に９塩基の単位配列が直列に繰り返して連なる配列の繰り返し回数の違いによる多型（variable number of tandem repeat：ＶＮＴＲ）と強い相関があり（カイ２乗値ｃｈｉ2＝１１．０、危険率ｐ＝０．０００９、オッズ比＝１．５３、９５％信頼区間１．１９〜１．９８）、さらに第一イントロンにおける２個のＳＮＰについても強い相関があることがわかった（カイ２乗値ｃｈｉ2＝１１．２、ｐ＝０．０００８、オッズ比＝１．５４、９５％信頼区間１．２０〜１．９９、ｐ＝０．０００５、オッズ比＝１．５６、９５％信頼区間１．２１−２．０２）。これらの結果を表１にまとめる。
【００３９】
【表１】
表中、major/major、major/minor、minor/minorは、それぞれ、多型について野生型ホモ接合、野生型と変異型のヘテロ接合、変異型のホモ接合を表す。カッコ内の数値は、頻度を表す。
【００４０】
この表から、危険率ｐの最も小さい第一イントロンの＋７７４（第一イントロンの７７４番目の塩基）のＳＮＰ及び第一イントロンのＶＮＴＲ、第一イントロンの＋２０９３のＳＮＰ（第一イントロンの２０９３番目の塩基）が非常に密接に２型糖尿病と関連している可能性が高いことがわかった。
【００４１】
実施例２：ヒト組織におけるＴＦＡＰ−２βの発現
マウスでは、ｍＴＦＡＰ−２βの発現は、生後有意に減少するが、転写産物は生後２ヶ月のマウスでも、腎臓において検出される。ＴＦＡＰ−２βを欠損したマウスは、多発性嚢胞による腎不全により生後１日または２日以内に死亡する。ヒトでは、ＴＦＡＰ−２βの変異は、動脈管開存症と様々な程度の顔面形態形成異常と手の異常を特徴とするシャー症候群（char syndrome）を引き起こす。これらの特徴は、ＴＦＡＰ−２βが、各種組織の胚発生に重要な役割を果たしていることを意味する。しかし、現在まで、２型糖尿病におけるＴＦＡＰ−２βの役割を示す証拠は全くない。
【００４２】
２型糖尿病へのＴＦＡＰ−２βの関与の可能性を調べるために、ＴＦＡＰ−２βの発現パターンを、複数のヒトの組織から得られたＲＮＡを用いて逆転写（ＲＴ）ＰＣＲによって調べた。また、複数の組織に由来するヒトｃＤＮＡをＣｌｏｎｔｈｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，カリフォルニア州、アメリカ）から入手した。第一鎖または二本鎖ｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅した。フォワードプライマーには、ｈＡＰ２ＲＴ−Ｆ（５'−ＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＡＡＴＧＡ−３'）を用い、リバースプライマーには、ｈＡＰ２ＲＴ−Ｒ（５'−ＧＴＡＡＣＧＴＧＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＧ−３'）を用いた（それぞれ、配列番号６９、７０）。
ＲＴ−ＰＣＲは次の手順で行った。全RNAをoligodT primerと逆転写酵素で６０分反応させることにより、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを標的部位に特異的なプライマーを用いて増幅した。その際のＰＣＲ条件は以下の通りである。10mMのTris-HCl (pH 8.3)、50 mMのKCl、1.5 mMのMgCl2、250μMのdNTP、5UのTaqポリメラーゼの反応液中で、変性９４℃、アニーリング６０℃、伸長７２℃のサイクルを３０回繰り返して行った。増幅産物をアガロースゲル電気泳動にて解析した。
【００４３】
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図２に示す。この結果は、以前にＭｏｓｅｒらにより報告されたパターンとよく似たものであるが（"Genes & Dev." 11, p. 1983-1948 (1997)）、Ｍｏｓｅｒらを含め従来の研究では発現を報告されていなかった脂肪組織において、高レベルのＴＦＡＰ−２βの発現が確認された。
【００４４】
実施例３：ＴＦＡＰ−２βの脂肪細胞における発現
マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞を、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（日本、大阪府）から入手して、集密になるまで培養し、脂肪細胞に分化誘導した。分化誘導から０、３、５、７または１０日後に、ＲＴ−ＰＣＲによってＴＦＡＰ−２βの発現を調べた。第一鎖のｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライミングにより、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩリバーストランスクリプターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞から得た全ＲＮＡ抽出物の逆転写により調製した。フォワードプライマーとして、ｍＡＰ２ＲＴ−Ｆ（５'−ＧＣＧＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＡＴＣ−３'）を用い、リバースプライマーとしてｍＡＰ２ＲＴ−Ｒ（５'−ＧＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＧＣ−３'）を用いた（それぞれ、配列番号７１、７２）。結果を図３に示す。脂肪組織でのマウスＴＦＡＰ−２βの発現は、分化の程度に応じて増加することがわかった。
【００４５】
実施例４：多型のエンハンサー効果
続いて、糖尿病に関連すると推定されるＳＮＰ及びＶＮＴＲについて、異なる分化段階における３Ｔ３−Ｌ１細胞に対する効果を調べた。
実施例１で２型糖尿病との密接な関連が示唆された第一イントロンの７７４番目の塩基のＳＮＰ及び第一イントロンのＶＮＴＲ（ＧＹＧＧＣＶＭＫＡＧ）に対応する部分を含む断片を作製した。作製された断片は、正常人が有する第一イントロンの７６６から７８５番目の塩基に対応する配列を１コピー又は３コピー含む配列、糖尿病に関連すると考えられる７７４番目の塩基にチミン（Ｔ）を１コピーまたは３コピー含む配列、第一イントロンの７６６から７８５番目の塩基に対応する配列を１コピーと第一イントロンのＶＮＴＲの１０回繰り返しを含む３００ｂｐ配列、及び７７４番目のチミン（Ｔ）のＳＮＰを１コピーと第一イントロンのＶＮＴＲの９回繰り返しを含む３００ｂｐ配列である。
【００４６】
調製したＴＦＡＰ−２β遺伝子の各種ＤＮＡ断片をＳＶ４０プロモーターの上流のＰＧＬ３−プロモーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導後３又は５日経過後に、リポソームトランスフェクション（ＦｕＧｅｎｅ６，Ｒｏｃｈｅ）により、ウミシイタケのルシフェラーゼ対照ベクターであるｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに各構築物を細胞に導入した。トランスフェクションの４８時間後、ルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。
結果を図４に示す。図４では、ルシフェラーゼの活性値は、平均値±標準偏差で表される。＊は、ｐ＜０．０１対プロモーター単独であり、＃はｐ＜０．０００１対他の構築物である。分化した脂肪細胞において、７７４番目のチミン（Ｔ）のＳＮＰを１コピーと第一イントロンのＶＮＴＲの９回繰り返しを含む断片は、他の断片に比べてエンハンサー活性が高いことが示された。分化していない細胞では、正常人が有する断片と糖尿病関連対立遺伝子の間にエンハンサー活性の有意な差はなかった。
【００４７】
実施例５：ゲルシフトアッセイ
実施例１で特定されたＳＮＰに対応する断片は、Ｅ２Ｆ結合モチーフに類似していたので、ゲルシフトアッセイを行い、タンパク質のこの領域への結合を調べた。
分化誘導から０、３、５または７日後の３Ｔ３−Ｌ１細胞から得られた核抽出物は、Ｓａｄｏｗｓｋｉらの方法に従って調製された。核抽出物は、１μｇのポリ（ｄＡｄＴ）とともに室温で１０分間、プレインキュベートされた。
【００４８】
プローブには、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７６６から７８５番目の２０ｂｐの塩基配列を含み、７７４番目の塩基がチミン（Ｔ）であるＴプローブと、７７４番目の塩基がグアニン（Ｇ）であるＧプローブの２種類を調製した。ＴプローブとＧプローブは、二本鎖プローブであり、そのうち、片側の鎖の塩基配列をそれぞれ配列番号７６、配列番号７７に示した。ＴプローブまたはＧプローブを核抽出物とともにさらに１５分間インキュベートした後、サンプルを０．５×ＴＢＥ中の４％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。オートラジオグラフィー後、タンパク質のＤＮＡへの特異的結合を反映していると考えられる４つのバンドを観察した。結果を図５に示す。４つのバンドはα、β、γおよびδと示されている。興味深いことに、αバンドは、７７４番目のチミンを含むＴプローブを、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞から得られた核酸抽出物とともにインキュベートしたときのみ観察された。αバンドとβバンドを分けるためにＴプローブを用いてより長時間の泳動（４時間）を行ったものを図６に示す。図５及び図６の結果から、第一イントロンの７７４番目の塩基は、ＴＦＡＰ−２βの発現の制御に関与し、それによって分化した脂肪細胞におけるＴＦＡＰ−２βにより誘導される他の遺伝子の発現に影響を与えている可能性があることを示している。
しかし、この２０ｂｐの断片の単一コピーまたは複数コピーは、３Ｔ３−Ｌ１細胞においてエンハンサー活性を示さなかった（図４）。これは、７７４番目の塩基を含む２０ｂｐの断片は、単独で機能しないが、ＶＮＴＲと共同して他の遺伝子の発現を制御する可能性があることを示す。
【００４９】
また、別の実験として、ＴＦＡＰ−２βの32Ｐで標識した断片を添加する前に、各種のコンペティターＤＮＡをさらに加えた。３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導から７日後の核抽出物を、Ｅ２Ｆ結合コンセンサスモチーフに対応する１００倍過剰の非標識Ｔプローブ又はＧプローブとともにプレインキュベートし、その後32Ｐで標識されたＴプローブまたはＧプローブとともにインキュベートして泳動後、オートラジオグラフィーした。結果を図７に示す。
Ｅ２Ｆ結合コンセンサスモチーフに対応する１００倍過剰の非標識オリゴヌクレオチドは、タンパク質−ＤＮＡ複合体の形成と競合することができなかったため、Ｅ２Ｆ以外の一以上のタンパク質がこの配列に結合して、ＴＦＡＰ−２βの発現の制御を行うと考えられる。
【００５０】
実施例６：２−デオキシ−Ｄ−［ 3 Ｈ］グルコースの取り込み
２型糖尿病におけるＴＦＡＰ−２β遺伝子の役割を調べるため、分化した脂肪細胞のインスリン反応性について、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の過剰発現の効果を調べた。分化した３Ｔ３細胞をアデノ−ＴＦＡＰ−２βまたはアデノ−ＬａｃＺによりトランスフェクトし、５０時間後に、各種濃度のインスリンを培地に加えて、２−デオキシ−Ｄ−［3Ｈ］グルコースの取り込みを測定した。
２−デオキシ−Ｄ−［3Ｈ］グルコースの取り込みは、J. Biol. Chem. 277, 38863-38869に記載されている方法に従って決定された。簡単に説明すれば、０．４％のＢＳＡを含む培地中で飢餓条件のもと１６時間培養した後、細胞を1時間０．４％のＢＳＡと、インスリン無添加または各種濃度のインスリンを加えて１時間３７℃で培養した。１０μｌの基質（２−デオキシ−Ｄ−［3Ｈ］グルコース：０．２μＣｉ、最終濃度（０．１ｍｍｏｌ／ｌ））を加え、２−デオキシ−Ｄ−［3Ｈ］グルコースの取り込みを５分間室温にて測定した。タンパク質濃度はブラッドフォード法により決定した。取り込みは各実験につき４回測定した。
結果を図８に示す。ＴＦＡＰ−２βを過剰発現している細胞における２０ｎＭのインスリンに応答する２−デオキシグルコースの取り込みの増加が対照細胞と比べて大いに低下していた（基礎のＴＦＡＰ−２βおよびＬａｃＺそれぞれの１６１±１２％対１９３±１８％、ｐ＝０．００８）。
【００５１】
【発明の効果】
以上の本発明者の実験により、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の多型を調べることが２型糖尿病に罹患しやすい人を診断するのに有効であることが示された。したがって、本発明によれば、２型糖尿病患者の早期発見と、２型糖尿病にかかる可能性の高い人を従来の報告にない高い頻度で検出することができる。本発明の多型における変異を検出することによって、糖尿病診断前に２型糖尿病にかかる可能性の高いグループを検出することができ、糖尿病診断前に予防または早期の治療を行うことができる。さらに、他の糖尿病との関連が示唆されている遺伝子の変異の検出と組み合わせることにより、２型糖尿病に罹る可能性がより高い人をより高い精度で検出することができる。本発明の２型糖尿病診断キットまたは方法を用いて、たとえ糖尿病の発症が確認される前であっても、希望により本発明の変異を有しているかどうかを調べ、２型糖尿病にかかりやすい形質が遺伝しているかどうかを推定できる点で有益である。
【００５２】
さらに、本発明により、ＴＦＡＰ−２βは分化した脂肪細胞、すなわち、インスリンの標的及びインスリン耐性の中心となる組織としてよく知られている細胞に発現していることが初めて示された。ＴＦＡＰ−２βは、インスリン抵抗性に重要な組織である脂肪細胞で分化依存的に特異的に発現する。in vitroにおける機能解析において、本発明で見出された２型糖尿病に関連する対立遺伝子を含むＤＮＡ断片は、未分化の脂肪前駆細胞と比べて分化した脂肪細胞において高いエンハンサー活性を示した。これらの結果によれば、ＴＦＡＰ−２β遺伝子自体、またはその上流又は下流にある遺伝子、あるいはＴＦＡＰ−２βタンパク質が関与する転写経路が、分化した脂肪細胞において他の遺伝子の発現を制御することにより２型糖尿病の病因に関与するものと考えられる。さらには、ＴＦＡＰ−２β遺伝子を脂肪細胞において過剰発現させた場合、インスリン刺激に応答した糖類吸収が減少した。このことから、ＴＦＡＰ−２βの発現量の増加と２型糖尿病の発症には相関があり、ＴＦＡＰ−２βの発現量を測定することにより２型糖尿病の予備的な診断が行なえることが示唆された。また、ＴＦＡＰ−２βの発現を抑制することにより２型糖尿病の改善が図れることが予測される。
このように、ＴＦＡＰ−２βは、２型糖尿病の治療または予防のための有望なターゲットとなりうるものである。したがって既に２型糖尿病と診断されている患者においても本発明の多型における変異を解析することにより、その治療に役立てることが可能である。
【配列表】
【００５３】
この出願に関連する先行技術文献情報としては次のものがある。
【非特許文献１】
Zimmet, P., Alberti, K. G.M.M., Shaw, J., Global and societal implications of the diabetes epidemic. "Nature" 414, p. 782-786 (2001)
【非特許文献２】
Kahn, B.B., Type 2 diabetes: When insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. "Cell" 92, p. 593-596 (1988)
【非特許文献３】
Saltiel, A. R., New perspectives into the molecular pathogenesis and treatment of type 2 diabetes. "Cell" 104, 517-529 (2001）
【非特許文献４】
Fajans, S.S., Bell, G.I., Polonsky K.S., Molecular mechanisms and clinical pathophysiology of maturity-onset diabetes of the young., "N. Engl. J. Med." 345, p. 971-980 (2001)
【非特許文献５】
Kadowaki, T. et al., A subtype of diabetes mellitus associated with a mutation of mitochondorial DNA. "N. Engl. J. Med." p. 330, 962-968 (1994)
【非特許文献６】
International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and the analysis of human genome. "Nature" 409, p. 860-921 (2001)
【非特許文献７】
Ohnishi, Y. et al., A high-throughput SNP typing system for genome-wide association studies. "J. Hum. Genet." 46, p. 471-477 (2001)
【非特許文献８】
Moser, M. et al., Cloning and characterization of a second AP-2 transcription factor: Ap-2b. "Development" 121, p. 2779-2788 (1995)
【非特許文献９】
Moser, M. et al., Enhanced apoptotic cell death of renal epithelial cells in mice lacking transcription factor AP-2b. "Genes & Dev." 11, p. 1983-1948 (1997)
【非特許文献１０】
Satoda, M. et al., Mutation in TFAP2B cause Char syndrome, a familial form of patent ductus arteriosus. "Nature Genet." 25, p. 42-46 (2000)
【非特許文献１１】
Horikawa, Y. et al., Genetic variation in the gene encoding calpain-10 is associated with type 2 diabetes mellitus. "Nature Genet." 26, p. 163-175 (2000)
【非特許文献１２】
Ong, K.K.L. et al., The insulin gene VNTR, type 2 diabetes and birth weight. "Nature Genet." 21, p. 262-263 (1999)
【非特許文献１３】
Spiglman B.M., Flier J.S., Adipogenesis and Obesity: Rounding out the big picture. "Cell" 87, p. 377-389 (1996)
【非特許文献１４】
Matsuzawa, Y., Funahashi, T., Nakamura, T., Molecular mechanism of metabolic syndrome X: contribution of adipocytokines, adipocyte-deriverd bioactive substances. "Ann. N. Y. Acad. Sci." 892, p. 146-154 (1999)
【非特許文献１５】
Kroeger, K. M., Abraham L.J. Indentification of an AP-2 element in the -323 to -285 region of the TNF-alpha gene. "Biochem. Mol. Biol." Int. 40, p. 43-51 (1996)
【非特許文献１６】
Isse, N. et al. Structural organization and chromosomal assignment of the human obese gene. "J. Biol. Chem." 270, p. 27728-27733 (1995)
【非特許文献１７】
Takahashi, M. et al. Genomic structure and mutations in adipose-specific gene, adiponectin. "Int. J. Obes." 24, p. 861-868 (2000)
【非特許文献１８】
Hirakawa, M. et al. JSNP:a database of common gene variations in the Japanese population. "Nucleic Acids Res." 30, p. 158-162 (2002)
【非特許文献１９】
Seki, T., Tanaka, T., Nakamura, Y. Genomic structure and multiple *single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of the thiopurine S-methyltransferase (TPMT) gene. "J. Hum. Genet." 45, p. 299-302 (2000)
【非特許文献２０】
Saito, S. et al. Identification of 197 genetic variations in six humanmethyltransferase genes in the Japanese population "J. Hum. Genet." 46,p. 529-537 (2001)
【非特許文献２１】
Kishida, K. et al. Genomic structure and insulin-mediated repression of the Aquaporin adipose (AQPap), adipose-specific glycerol channel. "J. Biol. Chem." 275, p. 20896-20902 (2000)
【非特許文献２２】
Sadowski, H.B., Gilman M. Z., Cell-free activation of a DNA-binding protein by epidermal growth factor. "Nature" 362, p. 79-83 (1993)
【非特許文献２３】
Yamada, R. et al. Association between a single-nucleotide polymorphismin the human interleukin-3 gene and rheumatoid arthritis in Japanese patients, and maximum-likelifood estimation of combinational effect that two genetic loci have on susceptibility to the disease. Am. "J. Hum. Genet." 68, p. 674-685 (2001)
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子において同定された多型を示す。
【図２】ヒト組織におけるＴＦＡＰ−２βの発現を調べるためのＲＴ−ＰＣＲの結果を表す。
【図３】分化誘導後のＴＦＡＰ−２βの脂肪細胞における発現を調べるためのＲＴ−ＰＣＲの結果を表す。
【図４】ＴＦＡＰ−２βの第一イントロンにおける多型によるエンハンサー活性への影響を表す。
【図５】分化誘導後の３Ｔ３−Ｌ１細胞の核抽出物とＴＦＡＰ−２βによるゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図６】分化誘導後の３Ｔ３−Ｌ１細胞の核抽出物とＴＦＡＰ−２βによるゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図７】コンペティターをさらに加えた場合における、分化誘導後の３Ｔ３−Ｌ１細胞の核抽出物とＴＦＡＰ−２βによるゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図８】アデノ−ＴＦＡＰ−２βまたはアデノ−ＬａｃＺによりトランスフェクトされた分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における、インスリンにより刺激された２−デオキシグルコース（２ＤＯＧ）の取り込みを示すグラフである。データを６回の独立した実験から得られた平均±標準偏差により示した。黒丸はアデノ−ＴＦＡＰ−２βをトランスフェクトした細胞であり、黒四角はアデノ−ＬａｃＺをトランスフェクトした細胞である。＊はアデノ−ＬａｃＺに対してｐ＝０．００８。
【発明の属する技術分野】
本発明は、２型糖尿病に関連する遺伝子に関する。本発明は、さらに、２型糖尿病に関連する変異を検出するためのプライマー又はプローブ、２型糖尿病に関連する多型における変異を検出するためのキット、２型糖尿病の発症前診断キット、および２型糖尿病の予備的検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
２型糖尿病は世界で１億人以上の人が罹患している病気である。２型糖尿病は、末梢組織におけるインスリン抵抗性と膵臓ランゲルハンス島のβ細胞の機能障害が原因と考えられているが、正確な原因と機序はいまだ不明である。
糖尿病の発病と進行には、遺伝的要因が深く関わっていることが知られていて、これまで、若年発症家族性糖尿病（ＭＯＤＹ;maturity-onset diabetes of the young）やミトコンドリア糖尿病のような特異的な病態を示す糖尿病の原因遺伝子がいくつか同定されている。しかし、これらの遺伝子変化により説明される特異的病態を示す糖尿病は、全体のごくわずかの症例でしかない。すなわち、糖尿病に罹りやすい体質であるかどうかに影響を与える遺伝子は、そのほとんどが同定されていないものと考えられている。特に日本人の糖尿病患者における既知の糖尿病関連遺伝子の関与は低いため、他に未知の関連遺伝子が存在すると考えられる。
【０００３】
今日まで、２型糖尿病との関連が示唆されている遺伝子は、ほとんど同定されていない。これは、個々の遺伝子の効果が、複雑な遺伝的及び環境的背景により非常に小さくなるため、古典的なアプローチでは疾患の原因となる対立遺伝子を同定することは、非常に困難であることが原因と考えられている。
一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれる、配列決定されたゲノムにおいて高頻度に検出される遺伝的変異が、糖尿病を含む種々の病気の有用なマーカーとなっている。発明者らは、インベーダー法とマルチプレックスＰＣＲとの組合せによるハイスループットＳＮＰ遺伝子解析法を用いて、ＳＮＰを用いたゲノムワイドな関連研究を着手して、糖尿病に関連する遺伝子座の特定を進めている。
【０００４】
２型糖尿病患者の多くは、遺伝的な要因に、環境因子（肥満、運動不足、脂肪の多い食生活など）が加わって発症すると考えられている。したがって、糖尿病に関与する遺伝因子を事前に診断し、発症前に糖尿病に罹患する可能性が高いとわかった人に対しては食事や運動面において注意することによって、糖尿病の発症を未然に防ぐことが可能となる。そのため、遺伝的に糖尿病に罹患する可能性が高い人を事前に検出するため、また、糖尿病発症についてのメカニズムを遺伝学的に解明するために、２型糖尿病に関連する多型を検出することが求められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の事情に鑑みて達成されたものであり、２型糖尿病に関連する遺伝子の変異に関する情報を提供することを目的とする。さらに、２型糖尿病に関連する遺伝子を用いた、２型糖尿病を発症する可能性の高い人を発症前に検出するための方法及びキットを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、２型糖尿病に関連する遺伝子を同定するために、ゲノム上の５５０００個以上の一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子座について遺伝子型を決定した。その結果、そのイントロンにおける多型と２型糖尿病との有意な関連から、染色体６ｐ１２に存在する転写因子活性化タンパク質２β（ＴＦＡＰ−２β）をコードする遺伝子が有望な候補であるという証拠が挙がり、本発明をするに至った。なお、ＴＦＡＰ−２β遺伝子とは、ＴＦＡＰ−２βのコード領域のみならず、イントロン、５'フランキング、３'フランキングをも含む領域をいう。
【０００７】
すなわち、本発明は、２型糖尿病に罹りやすい人を検出するための、配列番号１で表されるＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、２型糖尿病患者、その予備軍、または遺伝的に２型糖尿病に罹りやすいと考えられる人が、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域に正常の人と比べて高い頻度で有すると考えられる。
なお、本明細書では、一般に「オリゴヌクレオチド」と呼ばれるものを含む広い意味で「ポリヌクレオチド」という用語を用いることとする。
【０００８】
また、本発明は、２型糖尿病に罹りやすい人を検出するための、配列番号２で表されるヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目のグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に置換されているポリヌクレオチドの７個以上の塩基配列または全部の配列を含むポリヌクレオチドであって、少なくとも７７４番目の塩基を含むポリヌクレオチドを提供する。配列番号２は、ヒトＴＦＡＰ−２βの第一イントロンのポリヌクレオチド配列を示したものである。
ここで、塩基の位置は、ＤＮＡにおいて、第一イントロンの５'側から３'側に数える。たとえば、７７４番目の塩基とは、第一イントロンの５'側から数えて７７４塩基だけ下流に位置するＤＮＡにおける塩基である。
なお、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目のグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に置換されているポリヌクレオチドは、７７４番目の塩基以外の位置において、１個若しくは数個の塩基が欠失、挿入または置換されていてもよい。
また、本発明は、ヒトＴＦＡＰ−２βの第一イントロンにおける７７４番目の塩基がチミン（Ｔ）であれば、必要に応じ、任意の長さの断片が可能である。
【０００９】
また、本発明は、上述のポリヌクレオチドを検出するためのプローブに関する。さらに、本発明は、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目の塩基がチミン（Ｔ）であるものを検出するための配列番号３のプローブ、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目の塩基がグアニン（Ｇ）であるものを検出するための配列番号４のプローブを提供する。
これらのプローブを使用して、ヒトＴＦＡＰ−２βの第一イントロン領域において７７４番目の塩基がグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換による変異を検出することが可能である。
【００１０】
本発明は、さらに、配列番号３及び配列番号４のプローブを含む、ヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換を検出するためのキットを提供する。また、本発明は、そのようなプローブを含む２型糖尿病発症前診断キットをも提供する。これらのキットにより、２型糖尿病に罹患する可能性が高い人を検出することが可能となる。これらのキットは、配列番号５のプローブをさらに含んでもよい。配列番号５のプローブをさらに含んだキットは、ＤＮＡの増幅を伴わない迅速な多型検出法であるインベーダー解析に用いることができる。
本発明のプローブ及びプローブを含むキットは、上記のような配列番号１のポリヌクレオチドまたは配列番号２で表されるヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目のグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に置換されているポリヌクレオチドの７個以上の塩基配列または全部の配列を含むポリヌクレオチドであって、少なくとも７７４番目の塩基を含むポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを検出できるものを含む。
【００１１】
さらにまた、本発明は、上述のポリヌクレオチドを増幅するために用いられるプライマーを提供する。プライマーは、目的とするポリヌクレオチドが増幅される限り、任意の塩基の長さ及び配列を有するものを使用することができる。好適には、配列番号６と配列番号７のプライマーを使用することができる。
【００１２】
さらに、本発明は、上記プライマーを含むヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換を検出するためのキットを提供する。また、本発明は、上記プライマーを含む２型糖尿病の発症前診断キットをも提供する。これらのキットにより、２型糖尿病に罹患する可能性が高い人を検出することが可能となる。
【００１３】
さらに、本発明は、（ＧＹＧＧＶＭＫＡＧ）n（ここで、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはチミン、Ｙはチミン又はシトシン、Ｍはアデニン又はシトシン、Ｋはグアニン又はチミン、Ｖはアデニン又はグアニン又はシトシンを表す。ｎは８又は９である）で表されるタンデムリピート多型を含むポリヌクレオチドを提供する。また、このようなタンデムリピート多型を検出するためのプライマーを提供する。ここでプライマーは、目的とするタンデムリピートが検出される限り、任意の塩基の長さ及び配列を有することができ、特に限定されない。
【００１４】
そして、本発明は、上記プライマーを含む、ヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンのタンデムリピート多型が（ＧＹＧＧＶＭＫＡＧ）8〜9であるか（ＧＹＧＧＶＭＫＡＧ）10であるかを判別するためのキットを提供する。さらに、本発明は、上記プローブまたはプライマーを含む２型糖尿病発症前診断キットをも提供する。これらのキットにより、２型糖尿病に遺伝的に罹りやすい人を検出することができる。
【００１５】
さらに、本発明は、１個若しくは数個の塩基が欠失、挿入または置換された多型またはタンデムリピート多型であって、前記多型の存在が２型糖尿病に罹りやすい形質を有することを示すことを特徴とするヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における多型を含むポリヌクレオチドを提供する。
上記多型は、たとえば、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換、第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換、第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピート、第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換、第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換、第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換、第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換を例示することができる。
ここで、５'フランキング領域の−５１２位の塩基とは、転写開始点より５１２塩基分５'上流に位置する塩基をいう。
【００１６】
また、本発明は、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換、第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換、第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピート、第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換、第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換、第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換、第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換を検出するためのプローブに関する。
【００１７】
上記の置換を検出するためのプローブを以下に例示する。
５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号４４〜４６からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号３〜５からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号４７〜４９からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号５０〜５２からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号５３〜５５からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプローブとしては、配列番号５６〜５８からなる群から選択される一以上のプローブが挙げられる。
【００１８】
また、本発明は、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換、第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換、第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピート、第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換、第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換、第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換、第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換を検出するためのプライマーに関する。
【００１９】
上記の置換を検出するためのプライマーを以下に例示する。
５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号５９及び６０からなる一対のプライマーが挙げられる。
第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号６及び７からなる一対のプライマーが挙げられる。
第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピートを有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号８及び９からなるからなる一対のプライマーが挙げられる。
第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号６１及び６２からなる一対のプライマーが挙げられる。
第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号６３及び６４からなる一対のプライマーが挙げられる。
第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号６５及び６６からなる一対のプライマーが挙げられる。
第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換を有するポリヌクレオチドを検出するためのプライマーとしては、配列番号６７及び６８からなる一対のプライマーが挙げられる。
【００２０】
また、本発明は、上記変異を含むポリヌクレオチドの相補鎖またはアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドをも含む。
さらに、本発明は、上記変異を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖またはアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドを検出することによる、２型糖尿病に罹患する可能性に関連した変異の検出方法を提供する。
本発明は、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の発現量を測定するための試薬を含む２型糖尿病発症前診断キットを提供する。このキットを用いて、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の発現量を測定して、正常人よりも発現量が多い人を２型糖尿病を発症しやすい人としてより精密な検査を行い、発病前の予防を図ることができる。
以下に説明するように、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子上の多型、特に、上に具体的に示した多型は、２型糖尿病と密接に関連している。本発明の検出方法により、糖尿病発症前に、これらの多型における変異の有無を検出し、変異があると判断された人に関しては、２型糖尿病に罹りやすい体質を遺伝的に有しているとして、発症前に食事や運動に気をつけるよう指導し、必要があれば、予防的な治療を行って２型糖尿病の発症を予防することが可能である。また、糖尿病患者の近縁者が、糖尿病に罹りやすい体質を受け継いでいるかに関しても判断することが可能である。さらに、糖尿病との関連が示唆されている他の遺伝子の変異の有無も併せて検出すれば、２型糖尿病に関してより高いリスクのグループをより高い精度で検出することが可能となる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明は、２型糖尿病に関連する多型を有するポリヌクレオチドに関する。本明細書でいう多型とは、同一集団上において、ある遺伝子座にある対立遺伝子が二種類以上存在し、その頻度が１％以上ある状態をいい、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、タンデムリピート多型、マイクロサテライト多型、挿入／欠失型多型などを含む。
具体的には、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における５'フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換、第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換、第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピート、第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換、第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換、第三イントロンの第５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換、第三イントロンの第２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換のいずれかであるポリヌクレオチドに関する。なお、第一イントロンの７７４番目の塩基における多型、第一イントロンのタンデムリピート多型、および第三イントロンの第５１４番目の多型は、本発明者により初めて見出されたものである。２型糖尿病と関連があると考えられる第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８又は９回のタンデムリピートの配列を配列番号７３及び７４に示す。また、正常人が有する第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの１０回のタンデムリピートの配列を配列番号７５に示す。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ，及びその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡ、アンチセンス鎖を含み、一部に修飾塩基を有するものをも含んでもよい。また、上記多型以外の位置において、１個若しくは数個の塩基が欠失、挿入または置換されているものをも含む。
【００２３】
このようなポリヌクレオチドは、２型糖尿病に罹りやすい体質を付与する原因遺伝子の一つである。したがって、このようなポリヌクレオチドを有するか否かを調べるためのプローブ、プライマー及びキットは、２型糖尿病に罹る可能性の高いグループ及び２型糖尿病の近縁者への遺伝を調べる遺伝子診断に用いることが可能である。
【００２４】
本発明のプローブは、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域の配列の一部と実質的に相補的なプローブであればよく、特に限定されない。ここで、実質的に相補的とは、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域の配列とハイブリッドできる程度に相補的であればよいことを意味する。さらに、これらのプローブは、５'側または３'側、またはその両方に、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域の配列と相補的ではない配列を含んでも、第一イントロン領域の配列とハイブリッドできる限り、本発明のプローブに含まれるものとする。例えば、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることができる。また、検出しやすいように５'末端を標識したものを用いることもでき、そのような標識としては、たとえば、ビオチン、蛍光、または32Ｐなどが例示できる。
【００２５】
本発明のプライマーは、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の多型の上流及び下流の配列の一部と実質的に相補的なプライマー対であればよく、特に限定されない。ここで、実質的に相補的とは、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域の配列とアニーリングできる程度に相補的であればよいことを意味する。たとえば、これらのプライマーは、５'側または３'側、またはその両方に、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロン領域の配列と相補的ではない配列を含んでも、第一イントロン領域の配列とハイブリッドできる限り、本発明のプライマーに含まれるものとする。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子と相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。
【００２６】
好適なプライマーの例としては、配列番号６及び７のプライマーが挙げられる。配列番号６及び７の１組のプライマーを使用して、ＰＣＲ等により２型糖尿病に関連する多型における変異を有するポリヌクレオチドを増幅することができる。
【００２７】
２型糖尿病に関連する多型を有するポリヌクレオチドを検出する方法としては、特に限定されない。多型における変異の検出方法としては、たとえばサンガー法、パイロシーケンシングなどにより塩基配列を直接決定してもよいが、サザンブロッティング、ＰＣＲ、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、インベーダーアッセイ、ＴａｑＭａｎＰＣＲ、ＳｎｉＰｅｒ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法、質量分析、ＲＣＡ法、ＤＮＡチップ、ＡＲＭＳ、ＢＡＭＰＥＲ、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、アレル特異的ＰＣＲのように配列を決定することなく間接的に検出してもよい。
また、本発明で言う「検出」とは、目的とする配列を直接的に検出する場合のみならず、目的とする配列と相補的な配列を検出することによる間接的な検出をも含む広い意味で、「検出」という用語を用いることとする。例えば、第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換の検出は、当該位置の塩基の相補的な塩基がシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）に置換されていることを検出することに基づくものであってもよい。
【００２８】
本発明のキットは、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における２型糖尿病に関連する多型における変異を有するポリヌクレオチドを、そのような変異を有さないポリヌクレオチドと区別して特異的にハイブリダイゼーションできるプローブ、またはそのような変異を有するポリヌクレオチドのみを、増幅できるプライマーを含む。キットに含まれる試薬としては、塩基の置換を検出できる方法により適宜変更可能である。たとえば、相補鎖を合成するタイプの変異の検出方法であれば、ｄｄＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、緩衝液などを含み、ＲＦＬＰのように制限酵素の切断に基づき検出する場合には適当な制限酵素を含む。
【００２９】
なお、本発明の２型糖尿病の発症前検出キットは、ヒトのＴＦＡＰ−２β遺伝子における変異、たとえば第一イントロンにおける７７４番目の塩基のグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換を検出するためのものである。本発明の２型糖尿病の発症前検出キットにより、２型糖尿病に体質的に罹りやすい人の発見及び２型糖尿病の早期治療に有効である。
【００３０】
本発明により変異の有無を検出されるＤＮＡは、ヒトの毛髪、血液、体液、唾液、培養細胞、切除された組織などから得ることができ、特に限定されない。
遺伝子発現量の測定は、当業者に公知の方法により行なうことができる（例えば「新遺伝子工学ハンドブック」改定第３版、松村正實、山本雅編集、１９９９年９月１０日、羊土社を参照）。例えば、ノザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を用いることができるがこれらに限定されない。また、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の発現量を測定するための試薬として、ＴＦＡＰ−２β遺伝子とハイブリダイゼーションするプローブまたはプライマーなどが例示できる。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例をあげて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらにより本発明を制限することを意図するものではない。
実施例１：糖尿病関連ＳＮＰの検出
滋賀医科大学、東京女子医科大学、順天堂大学、川崎医科大学または岩手医科大学の外来診療室に定期的に通院している２型糖尿病の日本人患者から、書面のインフォームド・コンセントを各患者から得たうえでＤＮＡサンプルを調製した。ＤＮＡの抽出は、次のような標準的なフェノール−クロロホルム沈殿法により行った。
末梢血液約１０ｍｌを３０００ｒｐｍ、５分間遠心し血清を除去した後、赤血球溶解液を加え室温で２０分放置した。その後、３０００ｒｐｍで５分間遠心し沈殿（白血球成分）を残し、上清は除去した。沈殿をプロテイナーゼＫにより３７℃、４時間以上処理し、タンパク質を除去した後、等量のフェノールを加え、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心後、上層（水層）を新しいチューブに移し、フェノールクロロホルム処理した。さらに遠心して、水層を新しいチューブに移しクロロホルム処理し、上層（水層）を新しいチューブに移してイソプロパノールでＤＮＡを沈殿させた。遠心して沈殿したＤＮＡを７０％エタノール処理し、その後ＴＥ溶液に溶解した。
【００３２】
まず、得られたＤＮＡサンプルのうち、１８８人分を用いて、５８２６７個の一塩基多型（ＳＮＰ）について２型糖尿病患者の遺伝子型を解析し、対立遺伝子頻度又は遺伝子型頻度を糖尿病の患者でない者（対照）と比較した。遺伝子型特定実験のためのＳＮＰはＩＭＳ−ＪＳＴ日本ＳＮＰデータベース（http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp）から無作為に選択した。各ＳＮＰの遺伝子座位における遺伝子型は、インベーダーアッセイによって決定した。
インベーダーアッセイを行う前に、マルチプレックスＰＣＲ(Multiplex ＰＣＲ)により標的部位を増幅した。マルチプレックスＰＣＲは、16.6 mMの(NH4)2SO4, 67 mMのTris (pH 8.8)、6.7 mMのMgCl2、10 mMの2-メルカプトエタノール、6.7μMのEDTA、1.5 mMのdNTP、10×Taq mix (2.5U/μl Taqポリメラーゼ、31.25U/μlのTaq抗体)、0％又は10％のDMSO、0.25μMの各プライマーの反応液中で、変性９５℃、アニーリング６０℃、伸長７２℃のサイクルを４０回繰り返して行った。
得られたＰＣＲ産物を希釈して、３８４プレートに分注した後、風乾して、３μｌのインベーダー反応液及びプローブミックスを加えた。６３℃で２０分間反応させた後、蛍光測定し、遺伝子型を判定した。
【００３３】
解析した５８２６７個のＳＮＰのうち、１４９７個のＳＮＰ遺伝子座における対立遺伝子頻度及び／又は遺伝子頻度が、糖尿病患者と対照との間で有意な相違を示した（ｐ＜０．０１）。この糖尿病患者と対照との間で有意な違いを示すＳＮＰをさらに別の糖尿病患者７５８人を加えて合計９４６人の患者で２回目のインベーダーアッセイを行った。この結果、ＴＦＡＰ−２β遺伝子内に糖尿病患者と対照との間で有意な相違を示すＳＮＰを同定し遺伝子型を特定した。
【００３４】
ＴＦＡＰ−２β遺伝子を含むゲノム領域のＤＮＡ配列について、ＧｅｎＢａｎｋの情報に基づき（アクセッション番号ＮＴ＿００７５９２）、ＰＣＲプライマーをデザインし、ゲノムＤＮＡの適当な断片を増幅した後、ダイレクトシークエンス法によりＳＮＰの同定を行った。用いたプライマーは、配列番号１０〜４３に示されるとおりである。繰り返しエレメントは、Ｓｅｋｉらにより記載された方法に従って、ＲＥＰＥＡＴ ＭＡＳＫＥＲコンピュータプログラムを使用して、解析から除いた。上記により同定されたＳＮＰは、インベーダーアッセイにより遺伝子型が特定された。ＶＮＴＲ座位は、ＰＣＲ法により、標的部位を増幅した後、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７００自動化ＤＮＡシーケンサーとＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェア（Ｇｅｎｏ Ｔｙｐｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて対立遺伝子の大きさの違いを判定することにより解析した。ＰＣＲ条件は、10 mMのTris-HCl (pH 8.3)、50 mMのKCl、1.5 mMのMgCl2、250μMのdNTP、5UのTaqポリメラーゼの反応液中で、変性９４℃、アニーリング６０℃、伸長７２℃のサイクルを３０回繰り返して行い、プライマーは配列番号８及び配列番号９のものを用いた。
【００３５】
関連性、ハプロタイプ頻度及びハーディ・ワインベルグ平衡を決定するための統計的手法およびＬＤ係数（Ｄ'）の計算は、公知の方法により行った。トランスフェクション実験の検定においては、３以上のグループの間での比較は、被験者間要因分析（one-way analysis of variance）により解析し、その後２つのグループ間の統計的な相違を見積もるためにシェフェの方法を行った。
【００３６】
この結果、染色体６ｐ１２におけるＴＦＡＰ−２β遺伝子の第二イントロンにおけるランドマークＳＮＰの遺伝子型の分布が、２型糖尿病に密接に関連していることがわかった（カイ２乗値ｃｈｉ2＝１５．２、危険率ｐ＝０．００００７）。ＮＣＢＩデータベースによれば、６個のほかの遺伝子がＴＦＡＰ−２β遺伝子の２５０ｋｂ上流または下流に位置すると予測された。これらの遺伝子内に存在する１８個の他のＳＮＰ遺伝子座を１８８人の患者について解析したが、いずれも２型糖尿病との間に有意な関連性はなかった（ｐ＞０．０１、データは示さず）。そのため、ＴＦＡＰ−２β遺伝子自体が２型糖尿病に関連が深い遺伝子であると考えられた。
【００３７】
他の多型についてＴＦＡＰ−２βをスクリーニングして、２８個のＳＮＰ、８個の挿入／欠失多型、および４個のタンデムリピート多型を同定した。図１に、ＴＦＡＰ−２β遺伝子において同定された多型を示す。図１において、＊の記号が付いたものは挿入／欠失による多型であり、†の記号が付いたものはタンデムリピート多型であり、‡の記号の付いたものはゲノムワイドなスクリーニングに使用されたランドマークＳＮＰであり、記号の付いていないものは、その後のスクリーニングで見出されたＳＮＰである。ＴＦＡＰ−２β遺伝子のコード領域にはＳＮＰはないことがわかった。
【００３８】
全体で９６４人の患者と９２２人の対照において、これらの遺伝子型を配列番号３〜５、４４〜５８のプローブ、配列番号６、７、５９〜６８のプライマーを用いて上述のようなインベーダーアッセイ又はＰＣＲを用いて特定することにより、これらの変異のうちいくつかは、肥満（肥満度ＢＭＩ≧２５）と関連した２型糖尿病と有意に相関があることがわかった。この相関は、特に９塩基の単位配列が直列に繰り返して連なる配列の繰り返し回数の違いによる多型（variable number of tandem repeat：ＶＮＴＲ）と強い相関があり（カイ２乗値ｃｈｉ2＝１１．０、危険率ｐ＝０．０００９、オッズ比＝１．５３、９５％信頼区間１．１９〜１．９８）、さらに第一イントロンにおける２個のＳＮＰについても強い相関があることがわかった（カイ２乗値ｃｈｉ2＝１１．２、ｐ＝０．０００８、オッズ比＝１．５４、９５％信頼区間１．２０〜１．９９、ｐ＝０．０００５、オッズ比＝１．５６、９５％信頼区間１．２１−２．０２）。これらの結果を表１にまとめる。
【００３９】
【表１】
【００４０】
この表から、危険率ｐの最も小さい第一イントロンの＋７７４（第一イントロンの７７４番目の塩基）のＳＮＰ及び第一イントロンのＶＮＴＲ、第一イントロンの＋２０９３のＳＮＰ（第一イントロンの２０９３番目の塩基）が非常に密接に２型糖尿病と関連している可能性が高いことがわかった。
【００４１】
実施例２：ヒト組織におけるＴＦＡＰ−２βの発現
マウスでは、ｍＴＦＡＰ−２βの発現は、生後有意に減少するが、転写産物は生後２ヶ月のマウスでも、腎臓において検出される。ＴＦＡＰ−２βを欠損したマウスは、多発性嚢胞による腎不全により生後１日または２日以内に死亡する。ヒトでは、ＴＦＡＰ−２βの変異は、動脈管開存症と様々な程度の顔面形態形成異常と手の異常を特徴とするシャー症候群（char syndrome）を引き起こす。これらの特徴は、ＴＦＡＰ−２βが、各種組織の胚発生に重要な役割を果たしていることを意味する。しかし、現在まで、２型糖尿病におけるＴＦＡＰ−２βの役割を示す証拠は全くない。
【００４２】
２型糖尿病へのＴＦＡＰ−２βの関与の可能性を調べるために、ＴＦＡＰ−２βの発現パターンを、複数のヒトの組織から得られたＲＮＡを用いて逆転写（ＲＴ）ＰＣＲによって調べた。また、複数の組織に由来するヒトｃＤＮＡをＣｌｏｎｔｈｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，カリフォルニア州、アメリカ）から入手した。第一鎖または二本鎖ｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅した。フォワードプライマーには、ｈＡＰ２ＲＴ−Ｆ（５'−ＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＡＡＴＧＡ−３'）を用い、リバースプライマーには、ｈＡＰ２ＲＴ−Ｒ（５'−ＧＴＡＡＣＧＴＧＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＧ−３'）を用いた（それぞれ、配列番号６９、７０）。
ＲＴ−ＰＣＲは次の手順で行った。全RNAをoligodT primerと逆転写酵素で６０分反応させることにより、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを標的部位に特異的なプライマーを用いて増幅した。その際のＰＣＲ条件は以下の通りである。10mMのTris-HCl (pH 8.3)、50 mMのKCl、1.5 mMのMgCl2、250μMのdNTP、5UのTaqポリメラーゼの反応液中で、変性９４℃、アニーリング６０℃、伸長７２℃のサイクルを３０回繰り返して行った。増幅産物をアガロースゲル電気泳動にて解析した。
【００４３】
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図２に示す。この結果は、以前にＭｏｓｅｒらにより報告されたパターンとよく似たものであるが（"Genes & Dev." 11, p. 1983-1948 (1997)）、Ｍｏｓｅｒらを含め従来の研究では発現を報告されていなかった脂肪組織において、高レベルのＴＦＡＰ−２βの発現が確認された。
【００４４】
実施例３：ＴＦＡＰ−２βの脂肪細胞における発現
マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞を、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（日本、大阪府）から入手して、集密になるまで培養し、脂肪細胞に分化誘導した。分化誘導から０、３、５、７または１０日後に、ＲＴ−ＰＣＲによってＴＦＡＰ−２βの発現を調べた。第一鎖のｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライミングにより、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩリバーストランスクリプターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞から得た全ＲＮＡ抽出物の逆転写により調製した。フォワードプライマーとして、ｍＡＰ２ＲＴ−Ｆ（５'−ＧＣＧＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＡＴＣ−３'）を用い、リバースプライマーとしてｍＡＰ２ＲＴ−Ｒ（５'−ＧＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＧＣ−３'）を用いた（それぞれ、配列番号７１、７２）。結果を図３に示す。脂肪組織でのマウスＴＦＡＰ−２βの発現は、分化の程度に応じて増加することがわかった。
【００４５】
実施例４：多型のエンハンサー効果
続いて、糖尿病に関連すると推定されるＳＮＰ及びＶＮＴＲについて、異なる分化段階における３Ｔ３−Ｌ１細胞に対する効果を調べた。
実施例１で２型糖尿病との密接な関連が示唆された第一イントロンの７７４番目の塩基のＳＮＰ及び第一イントロンのＶＮＴＲ（ＧＹＧＧＣＶＭＫＡＧ）に対応する部分を含む断片を作製した。作製された断片は、正常人が有する第一イントロンの７６６から７８５番目の塩基に対応する配列を１コピー又は３コピー含む配列、糖尿病に関連すると考えられる７７４番目の塩基にチミン（Ｔ）を１コピーまたは３コピー含む配列、第一イントロンの７６６から７８５番目の塩基に対応する配列を１コピーと第一イントロンのＶＮＴＲの１０回繰り返しを含む３００ｂｐ配列、及び７７４番目のチミン（Ｔ）のＳＮＰを１コピーと第一イントロンのＶＮＴＲの９回繰り返しを含む３００ｂｐ配列である。
【００４６】
調製したＴＦＡＰ−２β遺伝子の各種ＤＮＡ断片をＳＶ４０プロモーターの上流のＰＧＬ３−プロモーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導後３又は５日経過後に、リポソームトランスフェクション（ＦｕＧｅｎｅ６，Ｒｏｃｈｅ）により、ウミシイタケのルシフェラーゼ対照ベクターであるｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに各構築物を細胞に導入した。トランスフェクションの４８時間後、ルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。
結果を図４に示す。図４では、ルシフェラーゼの活性値は、平均値±標準偏差で表される。＊は、ｐ＜０．０１対プロモーター単独であり、＃はｐ＜０．０００１対他の構築物である。分化した脂肪細胞において、７７４番目のチミン（Ｔ）のＳＮＰを１コピーと第一イントロンのＶＮＴＲの９回繰り返しを含む断片は、他の断片に比べてエンハンサー活性が高いことが示された。分化していない細胞では、正常人が有する断片と糖尿病関連対立遺伝子の間にエンハンサー活性の有意な差はなかった。
【００４７】
実施例５：ゲルシフトアッセイ
実施例１で特定されたＳＮＰに対応する断片は、Ｅ２Ｆ結合モチーフに類似していたので、ゲルシフトアッセイを行い、タンパク質のこの領域への結合を調べた。
分化誘導から０、３、５または７日後の３Ｔ３−Ｌ１細胞から得られた核抽出物は、Ｓａｄｏｗｓｋｉらの方法に従って調製された。核抽出物は、１μｇのポリ（ｄＡｄＴ）とともに室温で１０分間、プレインキュベートされた。
【００４８】
プローブには、ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンの７６６から７８５番目の２０ｂｐの塩基配列を含み、７７４番目の塩基がチミン（Ｔ）であるＴプローブと、７７４番目の塩基がグアニン（Ｇ）であるＧプローブの２種類を調製した。ＴプローブとＧプローブは、二本鎖プローブであり、そのうち、片側の鎖の塩基配列をそれぞれ配列番号７６、配列番号７７に示した。ＴプローブまたはＧプローブを核抽出物とともにさらに１５分間インキュベートした後、サンプルを０．５×ＴＢＥ中の４％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。オートラジオグラフィー後、タンパク質のＤＮＡへの特異的結合を反映していると考えられる４つのバンドを観察した。結果を図５に示す。４つのバンドはα、β、γおよびδと示されている。興味深いことに、αバンドは、７７４番目のチミンを含むＴプローブを、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞から得られた核酸抽出物とともにインキュベートしたときのみ観察された。αバンドとβバンドを分けるためにＴプローブを用いてより長時間の泳動（４時間）を行ったものを図６に示す。図５及び図６の結果から、第一イントロンの７７４番目の塩基は、ＴＦＡＰ−２βの発現の制御に関与し、それによって分化した脂肪細胞におけるＴＦＡＰ−２βにより誘導される他の遺伝子の発現に影響を与えている可能性があることを示している。
しかし、この２０ｂｐの断片の単一コピーまたは複数コピーは、３Ｔ３−Ｌ１細胞においてエンハンサー活性を示さなかった（図４）。これは、７７４番目の塩基を含む２０ｂｐの断片は、単独で機能しないが、ＶＮＴＲと共同して他の遺伝子の発現を制御する可能性があることを示す。
【００４９】
また、別の実験として、ＴＦＡＰ−２βの32Ｐで標識した断片を添加する前に、各種のコンペティターＤＮＡをさらに加えた。３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導から７日後の核抽出物を、Ｅ２Ｆ結合コンセンサスモチーフに対応する１００倍過剰の非標識Ｔプローブ又はＧプローブとともにプレインキュベートし、その後32Ｐで標識されたＴプローブまたはＧプローブとともにインキュベートして泳動後、オートラジオグラフィーした。結果を図７に示す。
Ｅ２Ｆ結合コンセンサスモチーフに対応する１００倍過剰の非標識オリゴヌクレオチドは、タンパク質−ＤＮＡ複合体の形成と競合することができなかったため、Ｅ２Ｆ以外の一以上のタンパク質がこの配列に結合して、ＴＦＡＰ−２βの発現の制御を行うと考えられる。
【００５０】
実施例６：２−デオキシ−Ｄ−［ 3 Ｈ］グルコースの取り込み
２型糖尿病におけるＴＦＡＰ−２β遺伝子の役割を調べるため、分化した脂肪細胞のインスリン反応性について、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の過剰発現の効果を調べた。分化した３Ｔ３細胞をアデノ−ＴＦＡＰ−２βまたはアデノ−ＬａｃＺによりトランスフェクトし、５０時間後に、各種濃度のインスリンを培地に加えて、２−デオキシ−Ｄ−［3Ｈ］グルコースの取り込みを測定した。
２−デオキシ−Ｄ−［3Ｈ］グルコースの取り込みは、J. Biol. Chem. 277, 38863-38869に記載されている方法に従って決定された。簡単に説明すれば、０．４％のＢＳＡを含む培地中で飢餓条件のもと１６時間培養した後、細胞を1時間０．４％のＢＳＡと、インスリン無添加または各種濃度のインスリンを加えて１時間３７℃で培養した。１０μｌの基質（２−デオキシ−Ｄ−［3Ｈ］グルコース：０．２μＣｉ、最終濃度（０．１ｍｍｏｌ／ｌ））を加え、２−デオキシ−Ｄ−［3Ｈ］グルコースの取り込みを５分間室温にて測定した。タンパク質濃度はブラッドフォード法により決定した。取り込みは各実験につき４回測定した。
結果を図８に示す。ＴＦＡＰ−２βを過剰発現している細胞における２０ｎＭのインスリンに応答する２−デオキシグルコースの取り込みの増加が対照細胞と比べて大いに低下していた（基礎のＴＦＡＰ−２βおよびＬａｃＺそれぞれの１６１±１２％対１９３±１８％、ｐ＝０．００８）。
【００５１】
【発明の効果】
以上の本発明者の実験により、ＴＦＡＰ−２β遺伝子の多型を調べることが２型糖尿病に罹患しやすい人を診断するのに有効であることが示された。したがって、本発明によれば、２型糖尿病患者の早期発見と、２型糖尿病にかかる可能性の高い人を従来の報告にない高い頻度で検出することができる。本発明の多型における変異を検出することによって、糖尿病診断前に２型糖尿病にかかる可能性の高いグループを検出することができ、糖尿病診断前に予防または早期の治療を行うことができる。さらに、他の糖尿病との関連が示唆されている遺伝子の変異の検出と組み合わせることにより、２型糖尿病に罹る可能性がより高い人をより高い精度で検出することができる。本発明の２型糖尿病診断キットまたは方法を用いて、たとえ糖尿病の発症が確認される前であっても、希望により本発明の変異を有しているかどうかを調べ、２型糖尿病にかかりやすい形質が遺伝しているかどうかを推定できる点で有益である。
【００５２】
さらに、本発明により、ＴＦＡＰ−２βは分化した脂肪細胞、すなわち、インスリンの標的及びインスリン耐性の中心となる組織としてよく知られている細胞に発現していることが初めて示された。ＴＦＡＰ−２βは、インスリン抵抗性に重要な組織である脂肪細胞で分化依存的に特異的に発現する。in vitroにおける機能解析において、本発明で見出された２型糖尿病に関連する対立遺伝子を含むＤＮＡ断片は、未分化の脂肪前駆細胞と比べて分化した脂肪細胞において高いエンハンサー活性を示した。これらの結果によれば、ＴＦＡＰ−２β遺伝子自体、またはその上流又は下流にある遺伝子、あるいはＴＦＡＰ−２βタンパク質が関与する転写経路が、分化した脂肪細胞において他の遺伝子の発現を制御することにより２型糖尿病の病因に関与するものと考えられる。さらには、ＴＦＡＰ−２β遺伝子を脂肪細胞において過剰発現させた場合、インスリン刺激に応答した糖類吸収が減少した。このことから、ＴＦＡＰ−２βの発現量の増加と２型糖尿病の発症には相関があり、ＴＦＡＰ−２βの発現量を測定することにより２型糖尿病の予備的な診断が行なえることが示唆された。また、ＴＦＡＰ−２βの発現を抑制することにより２型糖尿病の改善が図れることが予測される。
このように、ＴＦＡＰ−２βは、２型糖尿病の治療または予防のための有望なターゲットとなりうるものである。したがって既に２型糖尿病と診断されている患者においても本発明の多型における変異を解析することにより、その治療に役立てることが可能である。
【配列表】
この出願に関連する先行技術文献情報としては次のものがある。
【非特許文献１】
Zimmet, P., Alberti, K. G.M.M., Shaw, J., Global and societal implications of the diabetes epidemic. "Nature" 414, p. 782-786 (2001)
【非特許文献２】
Kahn, B.B., Type 2 diabetes: When insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. "Cell" 92, p. 593-596 (1988)
【非特許文献３】
Saltiel, A. R., New perspectives into the molecular pathogenesis and treatment of type 2 diabetes. "Cell" 104, 517-529 (2001）
【非特許文献４】
Fajans, S.S., Bell, G.I., Polonsky K.S., Molecular mechanisms and clinical pathophysiology of maturity-onset diabetes of the young., "N. Engl. J. Med." 345, p. 971-980 (2001)
【非特許文献５】
Kadowaki, T. et al., A subtype of diabetes mellitus associated with a mutation of mitochondorial DNA. "N. Engl. J. Med." p. 330, 962-968 (1994)
【非特許文献６】
International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and the analysis of human genome. "Nature" 409, p. 860-921 (2001)
【非特許文献７】
Ohnishi, Y. et al., A high-throughput SNP typing system for genome-wide association studies. "J. Hum. Genet." 46, p. 471-477 (2001)
【非特許文献８】
Moser, M. et al., Cloning and characterization of a second AP-2 transcription factor: Ap-2b. "Development" 121, p. 2779-2788 (1995)
【非特許文献９】
Moser, M. et al., Enhanced apoptotic cell death of renal epithelial cells in mice lacking transcription factor AP-2b. "Genes & Dev." 11, p. 1983-1948 (1997)
【非特許文献１０】
Satoda, M. et al., Mutation in TFAP2B cause Char syndrome, a familial form of patent ductus arteriosus. "Nature Genet." 25, p. 42-46 (2000)
【非特許文献１１】
Horikawa, Y. et al., Genetic variation in the gene encoding calpain-10 is associated with type 2 diabetes mellitus. "Nature Genet." 26, p. 163-175 (2000)
【非特許文献１２】
Ong, K.K.L. et al., The insulin gene VNTR, type 2 diabetes and birth weight. "Nature Genet." 21, p. 262-263 (1999)
【非特許文献１３】
Spiglman B.M., Flier J.S., Adipogenesis and Obesity: Rounding out the big picture. "Cell" 87, p. 377-389 (1996)
【非特許文献１４】
Matsuzawa, Y., Funahashi, T., Nakamura, T., Molecular mechanism of metabolic syndrome X: contribution of adipocytokines, adipocyte-deriverd bioactive substances. "Ann. N. Y. Acad. Sci." 892, p. 146-154 (1999)
【非特許文献１５】
Kroeger, K. M., Abraham L.J. Indentification of an AP-2 element in the -323 to -285 region of the TNF-alpha gene. "Biochem. Mol. Biol." Int. 40, p. 43-51 (1996)
【非特許文献１６】
Isse, N. et al. Structural organization and chromosomal assignment of the human obese gene. "J. Biol. Chem." 270, p. 27728-27733 (1995)
【非特許文献１７】
Takahashi, M. et al. Genomic structure and mutations in adipose-specific gene, adiponectin. "Int. J. Obes." 24, p. 861-868 (2000)
【非特許文献１８】
Hirakawa, M. et al. JSNP:a database of common gene variations in the Japanese population. "Nucleic Acids Res." 30, p. 158-162 (2002)
【非特許文献１９】
Seki, T., Tanaka, T., Nakamura, Y. Genomic structure and multiple *single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of the thiopurine S-methyltransferase (TPMT) gene. "J. Hum. Genet." 45, p. 299-302 (2000)
【非特許文献２０】
Saito, S. et al. Identification of 197 genetic variations in six humanmethyltransferase genes in the Japanese population "J. Hum. Genet." 46,p. 529-537 (2001)
【非特許文献２１】
Kishida, K. et al. Genomic structure and insulin-mediated repression of the Aquaporin adipose (AQPap), adipose-specific glycerol channel. "J. Biol. Chem." 275, p. 20896-20902 (2000)
【非特許文献２２】
Sadowski, H.B., Gilman M. Z., Cell-free activation of a DNA-binding protein by epidermal growth factor. "Nature" 362, p. 79-83 (1993)
【非特許文献２３】
Yamada, R. et al. Association between a single-nucleotide polymorphismin the human interleukin-3 gene and rheumatoid arthritis in Japanese patients, and maximum-likelifood estimation of combinational effect that two genetic loci have on susceptibility to the disease. Am. "J. Hum. Genet." 68, p. 674-685 (2001)
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子において同定された多型を示す。
【図２】ヒト組織におけるＴＦＡＰ−２βの発現を調べるためのＲＴ−ＰＣＲの結果を表す。
【図３】分化誘導後のＴＦＡＰ−２βの脂肪細胞における発現を調べるためのＲＴ−ＰＣＲの結果を表す。
【図４】ＴＦＡＰ−２βの第一イントロンにおける多型によるエンハンサー活性への影響を表す。
【図５】分化誘導後の３Ｔ３−Ｌ１細胞の核抽出物とＴＦＡＰ−２βによるゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図６】分化誘導後の３Ｔ３−Ｌ１細胞の核抽出物とＴＦＡＰ−２βによるゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図７】コンペティターをさらに加えた場合における、分化誘導後の３Ｔ３−Ｌ１細胞の核抽出物とＴＦＡＰ−２βによるゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図８】アデノ−ＴＦＡＰ−２βまたはアデノ−ＬａｃＺによりトランスフェクトされた分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における、インスリンにより刺激された２−デオキシグルコース（２ＤＯＧ）の取り込みを示すグラフである。データを６回の独立した実験から得られた平均±標準偏差により示した。黒丸はアデノ−ＴＦＡＰ−２βをトランスフェクトした細胞であり、黒四角はアデノ−ＬａｃＺをトランスフェクトした細胞である。＊はアデノ−ＬａｃＺに対してｐ＝０．００８。
Claims (5)
- ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子における
（１）５’フランキング領域の−５１２位の塩基のチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）への置換、
（２）第一イントロンの７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換、
（３）第一イントロンのＤＮＡ配列におけるＧＹＧＧＶＭＫＡＧの８回又は９回のタンデムリピート（ここで、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはチミン、Ｙはチミン又はシトシン、Ｍはアデニン又はシトシン、Ｋはグアニン又はチミン、Ｖはアデニン又はグアニン又はシトシンを表す）、
（４）第一イントロンの２０９３番目の塩基のアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）への置換、
（５）第二イントロンの５８番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換、
（６）第三イントロンの５１４番目のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換、
（７）第三イントロンの２１３４番目のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換、または
（８）上記（１）〜（７）のいずれか２以上の組み合わせ
の有無を検出し、変異を検出した場合に２型糖尿病を発症する可能性の高い人として検出することを含む方法。 - ヒトＴＦＡＰ−２β遺伝子の第一イントロンのＤＮＡ配列における
（ｉ）７７４番目の塩基におけるグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換、
（ｉｉ）ＧＹＧＧＶＭＫＡＧ（ここで、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはチミン、Ｙはチミン又はシトシン、Ｍはアデニン又はシトシン、Ｋはグアニン又はチミン、Ｖはアデニン又はグアニン又はシトシンを表す）の８又は９回のタンデムリピート、または
（ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）の両方
の有無を検出し、変異を検出した場合に２型糖尿病を発症する可能性の高い人として検出することを含む方法。 - 変異の検出方法が、サンガー法、パイロシーケンシング、サザンブロッティング、ＰＣＲ、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、インベーダーアッセイ、ＴａｑＭａｎＰＣＲ、ＳｎｉＰｅｒ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法、質量分析、ＲＣＡ法、ＤＮＡチップ、ＡＲＭＳ、ＢＡＭＰＥＲ、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ及びアレル特異的ＰＣＲからなる群から選択される請求項１又は２に記載の方法。
- 変異の検出方法が、インベーダーアッセイである請求項３に記載の方法。
- （１）被験者のサンプルにおけるＴＦＡＰ−２β遺伝子の発現量を測定する工程と、
（２）上記（１）の工程で得られた発現量を、正常人のＴＦＡＰ−２β遺伝子の発現量と比較する工程と
（３）正常人よりも発現量が多い人を２型糖尿病を発症しやすい人として検出する工程と
を含む、２型糖尿病を発症する可能性の高い人を検出するための方法。
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