KR101141546B1

KR101141546B1 - Ａｎｋｒｄ15, ｈｐｄ, ｐｓｍｄ9, ｗｄｒ66, ｇｐｃ6, ｐａｘ9, ｌｒｒｃ28, ｔｎｓ4, ａｘｌ, 및 ｈｎｒｐｕｌ1 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 분석방법

Info

Publication number: KR101141546B1
Application number: KR1020090100060A
Authority: KR
Inventors: 곽규범; 편정아; 김지혜; 이광재; 조성원
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-21
Filing date: 2009-10-21
Publication date: 2012-05-03
Also published as: KR20110043100A

Abstract

본 발명은 ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, 및 HNRPUL1 유전자로부터 유래된 단일염기다형(Single-Nucleotide Polymorphism; SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 장형 위암(Intestinal type of gastric cancer) 의 임상적 진단의 표지 인자로서, 사용될 수 있다.

ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, HNRPUL1, 장형 위암

Description

ＡＮＫＲＤ15, ＨＰＤ, ＰＳＭＤ9, ＷＤＲ66, ＧＰＣ6, ＰＡＸ9, ＬＲＲＣ28, ＴＮＳ4, ＡＸＬ, 및 ＨＮＲＰＵＬ1 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 분석방법{Polynucleotides derived from ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, and HNRPUL1 genes comprising single nucleotide polymorphisms, microarrays and diagnostic kits comprising the same, and analytic methods using the same}

본 발명은 ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, 및 HNRPUL1 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 장형 위암(intestinal type of gastric cancer) 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 장형 위암 진단용 프로브; 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이; 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 이용한 장형 위암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.

인간의 게놈은 모두 22쌍의 상동 염색체와 두 개의 성염색체로 이루어져 있 다. 그러나 모든 인간이 각기 다른 외모와 성격을 갖는다. 이는 개개인이 같은 수의 염색체를 가지고 있기는 하지만, 그 염색체로부터 발현되는 유전자들에 의한 표현형이 모두 다르기 때문이다. 개개인의 이러한 유전자 발현의 다양성은 곧 유전자를 가지고 있는 게놈의 유전적 다양성 때문이다. 이러한 유전적 다양성은 많은 연구가 수행되어 왔으며, 최근 인간게놈프로젝트의 완성으로 그 구조가 모두 밝혀졌다.

게놈에서의 유전적 다양성을 대표하는 것으로는 Transposable element, STR (short tandem repeats), Microsatellites, STS (sequence tagged site), VNTR (variable number tandem repeat), SNP (single nucleotide polymorphism : 단일염기다형) 등이 알려져 있다. 이중 SNP는 단일염기다형으로서, 인간 게놈 상에서 약 1000개의 뉴클레오티드 중 1개의 빈도로 나타나며 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. 이러한 단일염기다형이 나타내는 유전학에서의 의미는 그 위치에 따라 각 개체에 큰 차이를 가져온다. 예를 들면, 단일염기다형이 단백질을 암호화하고 있는 위치에 존재할 경우, 단백질의 구조에 영향을 미칠 수 있게 되어 단백질 기능이 달라질 수 있게 되며, 질병과도 연관될 수 있다. 다른 예로 단일염기다형이 단백질을 암호화하지 않는 다른 유전자상에서 존재할 경우, 즉 프로모터(promoter) 또는 인트론(intron)에 존재할 경우, 각각에 대하여 단백질의 발현 수준에 차이를 가져와 그 단백질의 전체적인 활성이 줄어들 수 있고, 변성적인 인트론 제거 과정(alternative splicing)을 통하여 단백질이 비정상적으로 발현될 수도 있다.

단일염기다형들은 질병과 같은 특정 표현형(phenotype)의 지표로 사용될 수 있고, 이를 위해서는 가장 우선적으로 인간 유전체에 존재하는 대량의 단일염기다형을 발굴하고 발굴된 단일염기다형은 다수의 인간 유전체 시료에서 전체 인간집단의 1% 이상 존재하는 유전변이형 마커인지를 조사하는 검정작업을 거치게 된다. 검정된 SNP은 특정 질병 또는 약물반응과 같은 유전적 차이에 기인된 원인을 찾기 위한 연관성 연구에 사용되게 된다. 예를 들면, 특정 단일염기다형이 환자군과 대조군 간의 비교에서 유의적인 빈도의 차이가 관측된다면 아주 유용한 단일염기다형으로 선발되어 임상실험을 거치게 될 것이며 임상실험의 결과가 계속적으로 진행되어 그 결과가 좋을 때는 경제적으로 아주 유용한 가치를 지니는 유전지표로 실제 임상에 사용할 수 있게 될 것이다.

이러한 단일염기다형의 발견을 위한 종래 기술로는 제한효소를 이용한 제한 단편화 길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP), 대립형질 특이적 혼성화(Allele-specific hybridization)를 이용한 TaqMan^TM 프로브 방법, 용융온도(melting temperature; Tm)을 이용한 역동적 대립형질 특이적 혼성화(Dynamic Allele-Specific Hybridization; DASH)방법, 중합반응을 이용한 pyrosequencing등이 있다. 최근, 마이크로어레이 기술은 단일 염기 신장(Single Base Extension), 또는 대립인자 특이적 프라이머 신장(Allele Specific Primer Extension)이라는 원리를 이용한 프로브들을 조그만 기판위에 집적화시켜 심은 후, 목적 DNA들과의 혼성화와 신장(Extension)을 시킴으로써 단일염기다형을 발견해 내 고 있다.

한편, 위암의 발생률과 사망률은 감소하고 있으나, 아직도 전 세계에서 두 번째로 많이 발생하는 악성 종양이다. 우리나라의 경우, 남성과 여성에서의 암 발생률은 위암이 1위를 차지하고 사망률의 경우 2위를 차지한다. 위암과 깊게 관련되는 Helicobacter pylori (H. pylori) 감염은 사람에서 가장 흔한 만성 감염으로서 전 세계 인구의 50% 이상이 감염되어 있다. 우리나라의 H. pylori 감염률은 전 국민에서 46.6%, 16세 이상의 성인에서는 69.4%, 40대 에서는 78.5% 라는 높은 감염률을 보인다. 위암은 로렌 분류법(Lauren classification) 에 의해 장형 위암(Intestinal type of gastric cancer) 과 미만형 위암(Diffuse type of gastric cancer)로 분류 된다. 장형 위암은 H. pylori 감염과 관련되어 만성 위염(chronic gastritis), 위축성 위염(atrophic gastritis), 장상피화생(intestinal metaplasia), 이형성증(displasia), 장형 위암(Intestinal type of gastric cancer)의 순서로 진행된다. 반면 미만형 위암은 정상적인 점막으로 부터 H. pylori 감염과 관계없이 유발 될 수 있다. 우리나라에서 H. pylori 감염률이 높다는 것은 장형 위암에 대한 위험이 높다는 것을 의미 한다.

조기 위암은 5년 생존률이 95～100%로 높지만 증상을 나타내지 않는 경우가 80% 를 차지한다. 이는 조기 진단의 중요성과 함께 적절한 조기 진단법의 개발이 필요함을 뜻한다. H. pylori 감염된 100명 중 1～2명에서만 위암이 발생하기 때문에 H. pylori 감염만으로 위암 발생 위험군으로 판단 내리는 것은 적합하지 않다. 위암의 전 단계에 속하는 만성 위염 환자 사이에서 장형 위암이 발생할 위험성이 있는 사람을 미리 예측하는 것과 위암 발생에 관여하는 인자를 규명하는 것은 국민 보건에 중요하며 위암을 예방하기 위한 검사의 필수 요건이다. 장형 위암에 특이적으로 나타날 수 있는 단일염기다형을 찾아내는 것은 장형 위암을 조기에 진단할 수 있으며, 더 나아가 병태생리학적 경로를 밝히고 치료 방법을 개발하는데까지 이용될 수 있을 것이다.

본 발명자들은 한국인의 장형 위암 환자에서 특이적으로 나타나는 단일염기다형을 찾아내고자 연구를 거듭한 결과, ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, 및 HNRPUL1 유전자로부터 장형 위암환자에 특이적으로 나타나는 단일염기다형 부위를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 장형 위암과 관련된 단일염기다형으로서 ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, 및 HNRPUL1 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 장형 위암 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 장형 위암 진단용 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 이용한 장형 위암 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, 및 HNRPUL1 유전자로부터 유래된 특정 단일염기다형을 포함하 는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 장형 위암 진단을 위한 증폭용 프라이머가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 장형 위암 진단용 프로브 및 이를 포함한 마이크로어레이가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 장형 위암 진단용 키트가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 장형 위암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21의 폴리뉴클레오티드로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 장형 위암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 반수체형의 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (n)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드는 장형 위암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 또는 프로브, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 포함하는 키트는 장형 위암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 분석방법은 장형 위암 진단에 필요한 정보를 제공하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 장형 위암과 관련된 것으로 새롭게 밝혀진 ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, 및 HNRPUL1 유전자로부터 유래하는 하기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (n)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 즉, 본 발명은 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 401번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 401번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (a); 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 401번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 401번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (b); 서열번호 4의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (c); 서열번호 7의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 101번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 101번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (d); 서열번호 8의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (e); 서열번호 11의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기(다형성 부위)가 T이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (f); 서열번호 14의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (g); 서열번호 15의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (h); 서열번호 16의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (i); 서열번호 17의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (j); 서열번호 18의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 101번째 염기(다형성 부위)가 T이고, 상기 101번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (k); 서열번호 19의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 501번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (l); 서열번호 20의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (m); 및 서열번호 21의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (n)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21의 DNA 서열은 만성 위염 환자군과 장형 위암 환자군에서 통계학적으로 유의성 있는 차이(유의수준 p value < 0.05)를 보이는 단일염기다형으로서, 이들은 ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, 및 HNRPUL1 유전자에 존재한다.

본 발명자들은 장형 위암과 관련된 후보 유전자군으로서 ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, 및 HNRPUL1 유전자를 선정하여, 장형 위암 진단에 있어서 분자 수준에서의 진단 지표를 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 한국인 만성 위염 환자 326명과 장형 위암 환자 153명을 대상으로 유전자형 분석 및 통계학적 분석을 수행하였으며, 놀랍게도 수많은 단일염기다형 중 극히 일부의 단일염기다형만이 만성 위염 환자군과 장형 위암 환자군에서 통계적으로 유의성 있는 차이를 나타낸다는 것을 발견하였다. 특히, 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21의 단일염기다형은 하디-와인버그 평형 (Hardy-Weinberg Equilibrium) 및 로지스틱 회기분석 결과, 각각의 다형성 부위에 위험대 립인자가 존재함을 확인하였다.

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (n)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 길이는 10 내지 100 뉴클레오티드, 바람직하게는 20 내지 60 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 뉴클레오티드이다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (n)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열 (polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위 (polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위 (polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (n)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 장형 위암 진단을 위한 증폭용 대립형질 특이적 프라이머를 포함한다. 여기서 "프라이머(primer)"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트(ATP,GTP,CTP,TTP) 및 DNA 폴리머라제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 100, 바람직하게는 10 내지 80 뉴클레오티드이다. 짧은 프라 이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 3'-말단이 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21의 단일염기다형과 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 DNA에서 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 증폭된 산물만을 특이적으로 염색하여 시각화한다. 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 여기서 사용되는 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드들이 다른 변성화 과정을 거치게 되면, GoldenGate Assay 뿐만 아니라 다른 방법들에 의해서도 사용될 수 있다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (n)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 장형 위암 진단용 프로브 및 이를 포함하는 장형 위암 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (n)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 장형 위암 진단용 키트를 포함한다.

본 발명은 또한 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하는 프라이머 또는 프로브를 이용한 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 단일염기다형의 분석방법으로서, 상기 단일염기다형은 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (n)로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열(단, 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (n)은 상기에서 정의한 바와 같다)로 구성되는 것을 특징으로 하는 분석방법을 포함한다. 상기 분석 방법에서 상기 DNA 서열의 길이는 10 내지 100 뉴클레오티드, 바람직하게는 20 내지 60 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명은 또한 장형 위암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21의 폴리뉴클레오티드로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 검출 방법에 있어서, 상기 DNA 서열의 다형성 부위는 다음 표 1과 같다.

서열번호	다형성 부위
1	401
2	401
4	201
7	101
8	301
11	201
14	201
15	301
16	201
17	251
18	101
19	501
20	201
21	301

상기 검체는 혈액, 조직, 세포 등을 포함하며, 핵산 시료는 통상의 방법에 따라 얻을 수 있다. 예를 들어 혈액에 경우 다음과 같이 핵산 시료를 얻을 수 있다. 혈액을 원심분리 실험관으로 옮기고 낮은 농도의 염 성분 완충용액(low-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, and 2mM EDTA))을 5ml 첨가한다. 그리고 Nonidet P-40을 첨가한 다음, 얻어진 용액을 잘 섞어준 후, 상온에서 10분간 2,200 rpm으로 원심분리한다. 이때 얻어진 덩어리는 고농도의 염 성분 완충용액(high-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, 0.4M NaCl, and 2mM EDTA))으로 재현탁한다. 게놈 DNA는 50ul의 10% SDS와 섞은 후, 55℃에서 밤새 반응시킨다. 반응 후에, 각 게놈 DNA들은 1.5ml 용량의 원심분리 실험관으로 옮겨, 6M NaCl을 0.3ml 첨가한다. 게놈 DNA들을 잘 섞어준 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리한다. 원심분리 후, 게놈 DNA가 들어있는 상층을 모아서 새로운 시험관으로 옮기고, 상온에서 동량의 100% 에탄올을 첨가한다. 게놈 DNA들이 침전될 때까지 잘 섞어 주고, 침전이 되면 70% 에탄올로 게놈 DNA들을 세척한다. 이 과정이 끝나면 실험관 뚜껑을 열어, 용액성분이 마르도록 놓아둔다. 그리고 TE 완충용액(pH 8.0)을 넣어 게놈 DNA를 재현탁함으로써, 핵산 시료를 얻을 수 있다.

여기에서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열로서 다형성 부위(단, 상기 다형성 부위는 표 1에서 정의한 바와 같다)를 포함하는 서열을 주형으로 하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 상기에서 설명한 바와 같다.

또한, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (n)으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화 시키는 단계; 및 얻어진 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함하여 수행될 수 있으며, 상기 마이크로어레이에 고정되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 DNA 서열의 길이는 각각 10 내지 100 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법에 따라 얻어진 결과는 장형 위암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있으며 예를 들어, 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21의 다형성 부위의 염기가 각각 G, C, A, A, C, T, C, A, C, C, T, G, G, A (위험 대립인자)인 것이 하나 이상 존재하는 경우, 장형 위암에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다. 상기 위험 대립 인자를 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 위험군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.

또한, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21의 다형성 부위의 대립인자형(allele) 또는 유전자형(genotype) 분석을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 서열번호 1의 DNA 서열의 다형성 부위의 대립인자형(allele), 공우성 유전자형(co-dominant genotype), 우성 유전자형(dominant genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 2의 DNA 서열의 다형성 부위의 대립인자형(allele), 공우성 유전자형(co-dominant genotype), 우성 유전자형(dominant genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 4의 DNA 서열의 다형성 부위의 열성 유전자형(recessive genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 7의 DNA 서열의 다형성 부위의 대립인자형(allele), 공우성 유전자형(co-dominant genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 8의 DNA 서열의 다형성 부위의 대립인자형(allele), 공우성 유전자형(co-dominant genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 11의 DNA 서열의 다형성 부위의 대립인자형(allele), 공우성 유전자형(co-dominant genotype), 우성 유전자형(dominant genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 14의 DNA 서열의 다형성 부위의 대립인자형(allele), 공우성 유전자형(co-dominant genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 15의 DNA 서열의 다형성 부위의 대립인자형(allele), 공우성 유전자형(co-dominant genotype), 열성 유전자형(recessive genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 16의 DNA 서열의 다형성 부위의 대립인자형(allele), 공우성 유전자형(co-dominant genotype)을 포함하거나, 서열번호 17의 DNA 서열의 다형성 부위의 우성 유전자형(dominant genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 18의 DNA 서열의 다형성 부위의 열성 유전자형(recessive genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 19의 DNA 서열의 다형성 부위의 대립인자형(allele) 분석을 포함하거나, 서열번호 20의 DNA 서열의 다형성 부위의 대립인자형(allele), 공우성 유전자형(co-dominant genotype), 우성 유전자형(dominant genotype) 분석을 포함하거나, 서열번호 21의 DNA 서열의 다형성 부위의 대립인자형(allele), 공우성 유전자형(co-dominant genotype), 우성 유전자형(dominant genotype) 분석을 포함할 수 있다.

예를 들어, 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 18, 서열번호 20 내지 21의 다형성 부위가 각각 유전자형이 G/G(서열번호 1), A/C와 C/C(서열번호 2), A/A(서열번호 4), A/A(서열번호 7), C/C(서열번호 8), C/T와 T/T(서열번호 11), C/C(서열번호 14), A/A(서열번호 15), C/C(서열번호 16), C/C(서열번호 17), T/T(서열번호 18), A/G와 G/G(서열번호 20), G/A와 A/A(서열번호 21)가 하나 이상 존재하는 경우 장형 위암에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 상기 위험 유전자형을 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 위험군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명은 또한, 장형위암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 핵산 시료로부터 반수체형(haplotype)을 분석하는 단계를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법을 포함한다. 구체적으로, 상기 반수체형 분석은 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 3 내지 6의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정되는 반수체형; 서열번호 7 내지 14의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정되는 반수체형; 서열번호 22 및 23의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정되는 반수체형; 및 서열번호 24 내지 27의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정되는 반수체형으로 이루어진 군으로부터 선택된 반수체형을 분석함으로써 수행될 수 있다. 단, 반수체형 분석에 있어서, 상기 DNA 서열의 다형성 부위는 다음 표 2와 같다.

서열번호	다형성 부위
3	264
4	201
5	301
6	301
7	101
8	301
9	201
10	510
11	201
12	550
13	516
14	201
22	201
23	501
24	501
25	301
26	501
27	301

즉, 서열번호 3 내지 6, 서열번호 7 내지 14, 서열번호 22 및 23, 및 서열번호 24 내지 27의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정된 반수체형 분석결과, 서열번호 3 내지 6의 DNA 서열이 G-G-G-C 반수체형을 둘 다 가지는 경우(즉, 이배체형(diplotype)을 가지는 경우), 그렇지 않은 사람보다 장형위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있고(표 9, 도 1a 및 1b 참조), 서열번호 7 내지 14의 DNA 서열이 A-C-C-G-T-G-C-C 반수체형을 하나라도 갖는 경우, 그렇지 않은 사람보다 장형위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있으며, G-T-T-G-C-G-C-A 반수체형을 나타내는 경우 장형 위암에 저항성을 갖는 것으로 판정할 수 있고(표 9, 도 2a 및 2b 참조), 서열번호 22 및 23 의 DNA 서열이 C-T 반수체형을 하나라도 갖는 경우, 그렇지 않은 사람보다 장형위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있고(표 9, 도 3a 및 3b 참조), 서열번호 24 내지 27의 DNA 서열이 G-A-T-T 반수체형을 갖는 경우, 그렇지 않은 사람보다 장형위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있다(표 9, 도 4a 및 4b 참조).

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 피검자 선정

본 실험은 한국 아주대 병원으로부터 임상적으로 장형 위암으로 진단받은 153명의 환자들과 만성 위염으로 진단받은 326명의 환자들로부터 동의를 받아서 실험과 연관성 분석이 수행되었다. 479명의 환자 모두가 Helicobacter pylori에 감염된 환자이다. 사용된 군집의 크기는 다음 표 3과 같다.

그룹	만성 위염 환자군	장형 위암 환자군	총합계
조사인원	326	153	479

2. 게놈 DNA의 준비

게놈 DNA(genomic DNA; gDNA)를 준비하기 위하여 장형 위암 환자와 만성 위염 환자들로부터 혈액을 채취하였다. 전체 정맥혈의 5ml은 각 지원자들의 전주정맥으로부터 얻었고 15% EDTA가 들어있는 Vacutainer tube로 옮겨졌다. 게놈 DNA를 추출하기 위하여, 혈액을 원심분리 실험관으로 옮기고 낮은 농도의 염 성분 완충용액(low-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, and 2mM EDTA))을 5ml 첨가 하였다. 그리고 Nonidet P-40을 첨가하였다. 얻어진 용액을 잘 섞어준 후, 상온에서 10분간 2,200 rpm으로 원심분리 하였다. 이 때 얻어진 덩어리는 고농도의 염 성분 완충용액(high-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, 0.4M NaCl, and 2mM EDTA))으로 재현탁 하였다. 이 게놈 DNA는 50ul의 10% SDS와 섞은 후, 55℃에서 밤새 반응시켰다.

반응 후에, 각 게놈 DNA들은 1.5ml 용량의 원심분리 실험관으로 옮겨, 6M NaCl을 0.3ml 첨가하였다. 게놈 DNA들을 잘 섞어준 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 게놈 DNA가 들어있는 상층을 모아서 새로운 시험관으로 옮기고, 상온에서 동량의 100% 에탄올을 첨가하였다. 게놈 DNA들이 침전될 때까지 잘 섞어 주고, 침전이 되면 70% 에탄올로 게놈 DNA들을 세척하였다. 이 과정이 끝나면 실험관 뚜껑을 열어, 용액성분이 마르도록 놓아둔다. 그리고 TE 완충용액(pH 8.0)을 넣어 게놈 DNA를 재현탁하였다.

준비된 게놈 DNA는 GoldenGate Assay를 위해 Quant-iT^TM PicoGreen dsDNA reagent (Molecular Probes, Invitrogen)을 사용하여 250ng/5uL의 농도로 조정하였다.

3. 게놈 DNA의 증폭 및 유전자형 분석 - Goldengate assay

Goldengate assay 방법에 따라, Sentrix array matrix chip을 사용하여 유전자형을 분석하였다. 일루미나사(Illumina Inc.)로부터 GoldenGate assay를 위한 모든 시약과 Sentrix array matrix chip을 구입하여 사용하였다. 모든 과정은 일루미나사의 GoldenGate assay 방법에 따라 시행하였다.

게놈 DNA 시료(250 ng/5 ㎕)는 96웰 플레이트에서 5 ul의 GS#-MS1 시약과 혼합하였다. 플레이트를 밀봉하고 250×g에서 1 분 동안 원심분리하고, 95 ℃ heat block에서 30 분간 반응시켰다. 여기에 5 ul GS#-SUD를 넣고 혼합한 후 5 ul 2-프로판올을 넣고, 다시 혼합한 후에 3,000×g에서 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하고 펠렛을 건조시켰다. 건조된 DNA는 10 ul의 GS#-RS1 시약을 넣고 잘 풀어주었다. 여기에 10 ul의 GS#-OPA와 30 ul의 GS#-OB1를 넣고, 잘 혼합한 후 70℃ heat block에 넣고 30℃가 될 때까지 천천히 식혔다. GS#-ASE 플레이트를 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치하였다. 상등액을 제거하고, 50 ul GS#-AM1을 넣어주고 잘 혼합하였다. 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치한 후 상등액을 제거하고, 50 ul GS#-AM1을 넣어주고 잘 혼합하였다. 위와 동일한 방법으로 50 ul GS#-UB1로 세척 후, 상등액을 제거하고, 37 ul GS#-MEL을 넣어주고 잘 혼합한 후에 45℃에서 15분간 배양하였다. 위 플레이트를 다시 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치한 후 상등액을 제거하고, 50 ul GS#-UB1을 넣어주었다. 다시 위 과정을 반복하고, 35 ul GS#-IP1을 넣어주고 잘 혼합한 후 95℃ heat block에서 1분간 배양(incubation)하였다. 플레이트를 마그네틱 플레이트 위에 올리고 2분간 방치하였다. 상등액 30 ul를 GS#-PCR 플레이트에 옮긴 후 64 ul의 illumina-recommended DNA polymerase와 100 ul UDG를 GS#-MMP tube에 넣어준후 잘 섞어주고, 표 4에 나타낸 조건으로 증폭시켰다.

	온도	각 온도에서의 시간
	37℃	10 min
	95℃	3 min
34 사이클	95℃	35 sec
	56℃	35 sec
	72℃	2 min
	72℃	10 min
	4℃	5 min

반응 후에 20 ul의 GS#MPB를 넣고 잘 혼합한 후, 96웰 필터 플레이트에 옮기고, 암실에서 60분 동안 방치하였다. 필터 플레이트 어댑터를 96웰 V-bottom에 놓고, 원심 분리하여 상등액을 제거하였다. 다시 필터 플레이트에 50 ul GS#-UB2를 넣고 1000 x g에서 5 분간 원심 분리하였다. 30 ul의 GS#_MH1가 들어있는 GS#-INT 플레이트를 필터 플레이트위에 놓고, 30 ul의 0.1N NaOH를 필터 플레이트에 넣었다. 1000 xg에서 5 분간 원심 분리하여 PCR 생산물을 수거하였다.

칩을 GS#-UB2와 NaOH에서 전 처리하고, 수거한 PCR 산물을 384웰에 옮기고 여기에 전처리한 칩을 올렸다. 60 ℃에서 30 분 동안 혼성화시키고 다시 온도를 45℃로 바꾸고 14시간 이상 혼성화시켰다. GS#UB2, GS#IS1에서 세척한 후에 상온에서 건조시킨 후, 분석을 위해서 이미지 스캐닝(image scanning)을 실시하였다.

유전자형 분석 이미지 파일로부터의 유전자형의 분석은 Illumina사의 Beadstudio를 사용하여 각 다형성에 대한 유전자형를 확인하였다. Beadstudio는 두 개의 대립인자를 인식하는 프로브들 사이의 발색의 세기에 대한 비율을 가지고 전형적인 유전자형의 패턴을 나타낸다.

4. 통계학적 분석

단일염기다형들을 구성하는 대립인자들에 대한 집단내의 유전학적 분포여부에 대하여 하아디-와인버그 평형 검정을 하였다. 여기에서 단일염기다형의 기준이 되는 HWE p value > 0.05와 작은 대립인자 빈도(Minor Allele Frequency; MAF) > 0.1의 기준을 적용하였다. 장형 위암 환자군과 만성 위염 환자군간의 출현빈도를 이용하여 질병에 대한 각 단일염기다형들의 연관성분석은 유의수준을 < 0.05로 정하였으며, SAS software version 9.1.3를 사용하여 분석하였다. 연관성분석은 대립인자들 간의 장형 위암 환자군과 만성 위염 환자군에서의 출현빈도로 나누어 유의성 있는 차이를 비교하였으며, 유의수준을 < 0.05로 하였다. 오즈 비(Odds Ratio)는 로지스틱 회귀모형을 통하여 산출하였으며 대립인자(Allele), 우성 (Dominant), 열성 (Recessive) 및 공우성(Co-Dominant) 모형을 적용하였다. 각 모형에 따른 질병과의 유의성을 분석함에 있어 다수 대립인자를 A1이라 하고 소수 대립인자를 A2라 하면 대립인자(Allele) 모형은 A1의 빈도와 A2의 빈도를 비교하는 것이고, 우성 (Dominant) 모형은 A1A1의 빈도와 A1A2와 A2A2의 빈도에 대한 합을 비교하는 것이고, 열성 (Recessive) 형질 모형은 A1A1과 A1A2의 합과 A2A2의 빈도를 비교하는 것이고, 공우성 (Co-Dominant) 형질 모형은 A1A1, A1A2 및 A2A2에 대한 각각의 빈도를 비교하는 것이다.

단일염기다형들 간의 연관비평형 검정을 하였다. 이는 Haploview (ver. 4.1)을 사용하였다. 장형 위암 환자군과 만성 위염 환자군 모두에서 형성되는 각 단일염기다형들간의 상호연관성에 대한 분석에서 형성된 연관비평형블록으로부터 반수체형이 형성되었으며, 이들을 장형 위암 환자군과 만성 위염 환자군으로 나누어 장형 위암 환자군 특이적인 반수체형을 분석하였다.

5. 결과

(1) ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, 및 HNRPUL1 유전자에 존재하는 유의성을 나타내는 단일염기다형

하기 표 5는 상기 만성 위염 환자군과 장형 위암 환자군이 참여하여 장형 위암과의 연관성을 분석한 결과 유의성 있는 차이를 나타낸 서열의 목록으로서, 이 중 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21의 다형성 서열은 통계학적으로 유의성 있는 차이를 나타내는 것을 분석되었다.

ㆍ서열번호는 각 단일염기다형을 나타내는 서열번호이다.

ㆍReference SNP ID는 표준단일염기다형의 명칭 (Reference SNP ID; rs)을 의미하며, 이는 인간게놈프로젝트 후, 미국 국립보건원 산하 생물공학정보연구소 (NCBI)의 데이터베이스에서 각 단일염기다형을 구분하기 위하여 붙인 이름이다.

ㆍ대립인자는 각 단일염기다형에서의 Major allele과 Minor allele을 나타낸다.

ㆍ염색체는 각 단일염기다형들이 몇 번 염색체에 위치하고 있는지를 나타내주고 있다.

ㆍ위치는 염색체상에서 표준염기서열의 위치를 의미한다(NCBI Genome build 36.3).

ㆍSNP 역할은 상기 단일염기다형들이 유전자상에서 어디에 위치하고 있는지를 나타내주고 있다. 따라서 각각의 단일염기다형들이 유전자의 발현과 기능에 있어서 어떻게 작용하는지를 알 수 있다.

ㆍ아미노산의 변화는 상기 단일염기다형들이 유전자가 발현되어 단백질을 생성할 때, 그 단백질을 이루는 아미노산에 변화를 주고 있는지에 대한 설명이다.

(2) 유전자형(genotype) 및 위험대립인자 분석

하기 표 6a 및 표 6b는 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21의 DNA 서열의 대립인자 빈도와 각 유전자형에 대한 만성 위염 환자군과 장형 위암 환자군 각각의 빈도를 나타내며 표 7a 및 표 7b는 표 6a 및 표 6b의 유전자형 빈도를 토대로 진행한 하아디-와인버그 평형 검정(Hardy-Weinberg Equilibrium Test) 결과와 장형 위암 연관성 분석[즉, 케이스-컨트롤 연관 분석(Case-control association study)] 결과로서, 하기 연관성 분석에 의해 장형 위암에 영향을 미칠 수 있는 단일염기다형들과 이들의 유전자형을 확인할 수 있다.

ㆍ서열번호는 각 단일염기다형을 나타내는 서열번호이다.

ㆍ 대립인자형 빈도(allele frequency) 란에서는 집단 내에서 관찰되는 각각의 대립인자들의 빈도를 나타내고 있다. 여기서 대립인자란 단일염기다형 부위에 실제로 존재하고 있는 뉴클레오티드의 염기서열을 뜻하며, 하나의 단일염기다형은 그 특성상 두 개의 대립인자를 가질 수 있다. 이들 대립인자 빈도의 고저에 따라 다수 대립인자(Major allele)와 소수 대립인자(Minor allele)로 나뉜다. 특히 소수 대립인자의 빈도(Minor allele frequency; MAF)는 0.1을 기준으로 하여 단일염기다형과 단일염기변이(point mutation)을 나누는 유전학적 기준으로 사용된다. 이러한 기준은 다형성 자체의 안정성을 뜻하기 때문에(즉, 단일염기다형이 일어나는 부위는 일정하다라는 의미), 유전적 표지인자로써의 사용 가능성을 대변해 준다.

ㆍ 유전자형은 각 단일염기다형을 형성하는 각각의 대립인자들로 이루어지며, 단일염기다형 부위가 존재하는 유전자좌(locus)에 어떠한 대립인자들이 있는지를 나타내 주고 있다.

ㆍ 유전자형 빈도수(genotype frequency)와 유전자형 빈도 % 란은 각각의 유전자형에 해당하는 사람들의 수를 만성 위염 환자군과 장형 위암 환자군으로 나누어 나타낸다. 이를 관측치라고 할 수 있다.

표 7a 및 표 7b는 하나의 단일염기다형을 이루는 두 개의 대립인자와 이로 인하여 형성되는 3가지 형태의 유전자형에 대한 만성 위염 환자군-장형 위암 환자군 간의 빈도차이를 비교하여 어떠한 대립인자가 또는 어떠한 유전자형이 질병과 연관되어 있는지를 분석한 결과이다. 이러한 연관성 분석은 대립인자형(allele model), 공동-우성 유전자형(Co-dominant model), 우성 유전자형(Dominant model), 그리고 열성 유전자형(Recessive model)이라는 네 가지 항목에서 실시하였다. 표 7a 및 표 7b에 있어서 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다.

ㆍ서열번호는 각각의 단일염기다형을 나타내는 번호이다.

ㆍHWE는 하아디-와인버그 평형 (Hardy-Weinberg Equilibrium)의 상태를 나타내는 것이다. 카이제곱 (df=1) 검정에서 chi-value = 3.84(p-value=0.05, df=1)을 기준으로, 3.84보다 큰 경우에는 하아디-와인버크 평형 HWE (Hardy-Weinberg Equilibrium)으로 판단하고, 3.84보다 작은 경우에는 하아디-와인버그 비평형 (Hardy-Weinberg Disequilibrium)으로 판단하였다. 이는 만성 위염 환자군과 장형 위암 환자군 모두에서 관찰된 각 단일염기다형들의 유전적 표지인자로서의 기능과 이들로 이루어지는 유전자형의 분포가 일반적인 것들인지를 나타낸다.

ㆍ오즈 비율 (odds ratio, OR)은 장형 위암 환자 중에서 위험 대립인자를 가질 오즈에 대한 만성 위염 환자군 중에서 위험 대립인자를 가질 오즈의 비율을 나타낸다. 95% 신뢰하한과 95% 신뢰상한은 오즈 비율의 95% 신뢰구간을 나타낸다. 신뢰구간은 1을 포함하는 경우에는 질병과의 연관성을 유의하다고 판단할 수 없다. 오즈비율이 1보다 크고 95%신뢰구간에 1이 포함되어 있지 않은 경우 소수 대립인자가 질환군에서 더 높은 빈도를 가지며, 오즈비율이 1보다 작은 경우에는 다수 대립인자가 질환군에서 더 높은 빈도를 가진다.

ㆍ연관성 분석에서 Logit p value는 오즈비에 대한 통계적 유의성을 나타낸다. 이는 오즈비 만큼 만성 위염 환자군과 장형 위암 환자군간에 차이에 대한 유의성을 뜻한다. 여기서 유의성있는 차이가 있다고 판단하는 기준은 Logit_p value가 0.05 이하의 값을 나타낼 경우이다. 이러한 값은 로지스틱 회귀(logistic regression) 분석을 통하여 얻었다.

ㆍ위험 대립 인자 (risk allele)는 p-value에 유의성이 있는 경우 오즈비가 1 보가 크면 소수 대립인자, 오즈비가 1 보다 작으면 다수 대립인자로 하였다.

ㆍ각 네가지 분석모델에 따른 질병과의 유의성을 분석함에 있어 다수 대립인자를 A1이라 하고 소수 대립인자를 A2라 하면 우성 (Dominant) 모형은 A1A1의 빈도와 A1A2와 A2A2의 빈도에 대한 합을 비교하는 것이고, 열성 (Recessive) 형질 모형은 A1A1과 A1A2의 합과 A2A2의 빈도를 비교하는 것이고, 공우성 (Co-Dominant) 형질 모형은 A1A1, A1A2 및 A2A2에 대한 각각의 빈도를 비교하는 것이다.

각 네가지 분석모델에 대한 연관성 분석은 대립형질들이 만성 위염 환자군과 장형 위암 환자군 사이에서 출현되는 빈도수의 비율을 통하여 위험 대립인자가 장형 위암에 어느 정도의 연관성 (위험도)를 가지고 있는지 확인할 수 있다. 95% 신뢰구간에 1을 포함하고 있을 경우 유의성이 없기 때문에, 상기 표 7a 및 표 7b로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 1, 2, 4, 7, 8, 11, 및 14 내지 21의 다형성 부위의 염기가 각각 G, C, A, A, C, T, C, A, C, C, T, G, G, A (위험 대립인자)인 것이 하나 이상 존재하는 경우, 장형 위암에 걸릴 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

서열번호 21은 공우성 유전자형(co-dominant genotype), 우성 유전자형(dominant genotype), 열성 유전자형(recessive genotype)에서 유의성을 나타내며, 서열번호 1 내지 2, 서열번호 11, 서열번호 20은 공우성 유전자형(co-dominant genotype), 우성 유전자형(dominant genotype)에서 유의성을 보이며, 서열번호 15는 공우성 유전자형(co-dominant genotype), 열성 유전자형(recessive genotype)에서 유의성을 나타내며, 서열번호 17은 우성 유전자형(dominant genotype)에서 유의성을 보이며, 서열번호 4, 서열번호 18은 열성 유전자형(recessive genotype)에서 유의성을 나타내고, 서열번호 7 내지 8, 서열번호 14, 서열번호 16은 공우성 유전자형(co-dominant genotype)에서 유의성을 나타내었다. 상기 결과로 부터 서열번호 1 내지 2, 서열번호 4, 서열번호 7 내지 8, 서열번호 11, 서열번호 14 내지 18, 서열번호 20 내지 21의 다형성 부위가 각각 유전자형이 G/G, A/C와 C/C, A/A, A/A, C/C, C/T와 T/T, C/C, A/A, C/C, C/C, T/T, A/G와 G/G, G/A와 A/A가 하나 이상 존재하는 경우 장형 위암에 걸릴 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 상기 위험 유전자형을 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 위험군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.

(3) 반수체형 분석

표 8 및 도 1a 내지 도 4a는 서열번호 3 내지 6, 서열번호 7 내지 14, 서열번호 22 및 23, 서열번호 24 내지 27에 대한 다형성 부위간의 연관성을 나타내며, 도 1b 내지 도 4b는 이를 토대로, 도 1a 내지 도 4a로부터 형성된 연관 비평형 블록(Linkage Disequilibrium Block)으로부터 유전자형의 분석결과와 대비하여 형성된 반수체형(Haplotype)을 나타낸다. 표 9a 내지 표 9c는 각 블록의 반수체형에 대한 장형 위암과의 연관성 검정 결과이다.

표 8은 도 1a 내지 도 4a에 나타난 각 단일염기다형들 사이의 연관비평형 블록의 조밀함을 수치화하여 나타낸 것으로 D' 값과 r²값을 나타내고 있다. D' 값이 0.8 이상이 될 때, 각 단일염기다형들은 연관비평형 관계에 있다고 판단하며, 도 1a 내지 도 4a에서 보듯이 붉은 색으로 표시된다. 이러한 D' 값의 범위는 0 ～ 1까지 이며, 각 단일염기다형들 사이의 게놈 DNA 상에서의 떨어져 있는 거리에 대한 계산이 포함되어 있다. 또한 r² 값은 각 단일염기다형들 간의 상관관계를 나타내는 것으로 r² 값이 0.3 이상이면 그 값에 해당하는 단일염기다형들이 매우 조밀하게 묶여있다는 것을 뜻한다. 이는 앞서 언급한 도 1a 내지 도 4a와 표 8에서 뜻하는 바는 3 내지 6, 서열번호 7 내지 14, 서열번호 22 및 23, 서열번호 24 내지 27의 단일염기다형들이 서로 밀접하게 연관되어 있어 유전적 단위체를 형성한다는 것이다. 또한 이렇게 형성된 단위체들은 다음 세대로 유전될 때, 같이 묶여서 전달 되게 된다. 따라서 연관비평형 블록들이 환자군 특이적으로 나타나 질병을 일으키는데, 많은 영향을 미칠 경우, 그 블록 자체가 다음 세대로 전달되기 때문에, 다음 세대의 자손에 대한 질병이 일어날 수 있는 빈도를 예측할 수 있다.

연관비평형 블록들로부터 형성되는 유전적 단위체는 각 단일염기다형의 대립인자형 분석으로부터 그 유형이 결정되는데, 이를 반수체형(haplotype)이라고 한다 (도 1b 내지 도 4b). 도 1b 내지 도 4b는 각각 도 1a 내지 도 4a로부터 형성된 연관비평형 블록으로부터 유전자형의 분석결과와 대비하여 형성된 반수체형이다. 도 1a 내지 도 4a에서 나타난 한 개의 연관비평형 블록으로부터 각각 도 1b 내지 도 4b에 상응하는 반수체형이 나타나며, 각각의 블록에서 환자군에서 특이적으로 많이 나타나는 반수체형과 정상인군에서 특이적으로 많이 나타나는 반수체형이 관찰 되었다(표 9a 내지 표 9c). 반수체형은 다음 세대로 유전되기 때문에, 이러한 반수체형이 질병과 연관되는지를 분석할 필요가 있다. 총체적으로 연관비평형블록과 반수체형에 대한 질병관련 분석은 지금 세대에서의 질병의 예측 뿐 만아니라, 그 질병의 다음 세대로의 전달까지 예측할 수 있게 한다. 표 9a 내지 표 9c는 도 1b 내지 도 4b의 반수체형들의 빈도수가 환자군과 정상인군 사이에서 나타나는 빈도에 유의성 있는 차이를 조사한 표이다.

서열번호 3 내지 6, 서열번호 7 내지 14, 서열번호 22 및 23, 서열번호 24 내지 27의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정된 반수체형 분석결과, 서열번호 3 내지 6의 DNA 서열이 G-G-G-C 반수체형을 둘 다 가지는 경우, 그렇지 않은 사람보다 장형위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있고, 서열번호 7 내지 14의 DNA 서열이 A-C-C-G-T-G-C-C 반수체형을 하나라도 갖는 경우, 그렇지 않은 사람보다 장형위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있으며, G-T-T-G-C-G-C-A 반수체형을 나타내는 경우 장형 위암에 저항성을 갖는 것으로 판정할 수 있고, 서열번호 22 내지 23 의 DNA 서열이 C-T 반수체형을 하나라도 갖는 경우, 그렇지 않은 사람보다 장형위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있고, 서열번호 24 내지 27의 DNA 서열이 G-A-T-T 반수체형을 갖는 경우, 그렇지 않은 사람보다 장형위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있다.

도 1a 및 1b는 각각 서열번호 3 내지 6의 단일염기다형들 간의 연관비평형블록 및 상기 연관비평형블록으로부터 형성된 반수체형을 나타낸다.

도 2a 및 2b는 각각 서열번호 7 내지 14의 단일염기다형들 간의 연관비평형블록 및 상기 연관비평형블록으로부터 형성된 반수체형을 나타낸다.

도 3a 및 3b는 각각 서열번호 22 및 23의 단일염기다형들 간의 연관비평형블록 및 상기 연관비평형블록으로부터 형성된 반수체형을 나타낸다.

도 4a 및 5b는 각각 서열번호 24 내지 27의 단일염기다형들 간의 연관비평형블록 및 상기 연관비평형블록으로부터 형성된 반수체형을 나타낸다.

<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Polynucleotides derived from ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, ALX, and HNRPUL1 genes comprising single nucleotide polymorphisms, microarrays and diagnostic kits comprising the same, and analytic methods using the same <130> PN0317 <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 801 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ccaaactaat ttcctctctc ctcattcaat ccctcagaaa gaagtgcaag aggagtatac 60 attacatttg catcagcatt cagtatttac atttgtcttt caacacttca acagaattga 120 cttaggtaat aatttactca attgatttca gtgcaagact ctaagataaa agcaaatttt 180 ctgagagtaa aacaaaacaa acccaaactt caatggacag aaaattgctt tgaaatccta 240 gttatctagg caacttgcta ttatccgttc attattaaag agaataaaaa attagtttga 300 gaaaagacat acatttaaca cacaaactcc agagcacagg gttacctgag gcactgccgt 360 taacctttgt ggtgtgagcc atgctggctt gagtccaatg rgagatccag aaaggagtga 420 ggagtcatgc aaattttatg catcaagttc tcaaaggcat tcaacctgaa acaataaaga 480 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gatcagaggt ccccaggcct ggaaccttcc agggctgggc tcagctcccc 240 accccatccc ccaggtaggc caggaggcct gggcgggacc tgcttggggt taaatactcc 300 rgcccagcac tccccaggcc tctagtccca gtaggaggtt tgactaagat caatcatggt 360 aagtgccatg gccatctccc cttgggtggg acatcttcag taacgcttcc agaagcacct 420 tgtgttggaa cctccaagtc tcactgtcct tctttttctc cttagacgac ttacagtgac 480 aaaggggcaa aggtaagcag gcgaaatgtg ggaaatgtag gggcctgagt ctagaagggg 540 gtcggagtgc agggagactg gggtttcagc agagagcaga agaggaagga ctggagtgga 600 t 601 <210> 6 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ttgcgtgggg atccattgct tccgacgcta ctcctgccgg gtcaccacag gcgcacgtgt 60 tccggcaggg cgcggcttcc ggtgacccag ctccgcccta agccccatcc caagccccgc 120 cccttgactg ttctcgcgtt cgcggacggc tgtggtgttt tggcgcatgg gcggagccgt 180 agttacggtc gactggggcg tcgtccctag cccgggagcc gggtctctgg agtcgcggcc 240 cggggttcac gatgtccgac gaggaagcga ggcagagcgg aggctcctcg caggccggcg 300 ycgtgactgt cagcgacgtc caggagctga tgcggcgcaa ggaggagata gaagcgcaga 360 tcaaggccaa ctatgacgtg ctggaaagcg 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tttattttat 120 tttatttttg agacggagtc ttgccctgtc acccaggctg gagtgaagtg gtgcgatctc 180 agctcattgc aacctctgtc tcttgggttc aagtgatttt cctgcctcag cctccccagt 240 agctgggact acaggcatgt gccaccacac acggctaatt tttgtatttt tttgtagaga 300 cagagattcg ccatgttgcc caggctggtc ttgaactcct ggactcaagt gatccacctg 360 cctctgcctc ccagagtgct gggattacag gcgtaagcca ctgtgcccag caaaagaaat 420 atttttaaca actggtacag cagggcactg acccatcagg gtgcccactg gagcaagagc 480 gtggccaggc tttacccctt kagttccctt tgagggaagg ttcagggggt ccagaggagg 540 agctggggtg gaagtagagg ggtgctcagg gcagttgcta attttaaatc agtgcagaag 600 tatgtcagtg tttcaacaat ggatctatcc ctactggtgg gtgaatgtca cctgaatgtc 660 agccctgctc catgactctg tccaccccaa ccttgcatgc a 701 <210> 24 <211> 706 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gtaatcccag ctactcggga ggctgaggca ggagaatcgc ttgaacctca caggcggaga 60 ttgcagtgag ccgagatcgt gccactgccc tccagcctgg gcgacagagc aagactccgt 120 ctgaaaaaaa aaaaaaatta aaacacacac acgcacacat gggcgacaca accaccacca 180 agggaatacc agaagcagag agagggtgaa ataccctggc ttctcccttt ctccccgcta 240 cctgccagtc tcccataagg gcctacctcc cattggcaaa tcccaagagg aaaccactag 300 gaaagggagc ctgggaaatg tagttttcag gggccggccc actgtgatac atagtggagc 360 aggagaagct ctagaatgag gcatacctgg ctgaatcatt taccagctat gcgatctcag 420 gcaaatgact ttccctctct gagcctccca cctgtcatct ggaaaaaagg accctaatgt 480 ccccaccttc caaagctgtt ktgaggcaaa gcacttcatg ctgagggtgg caagtaggac 540 atgcttgtta atgtggagta ggactatatt atttccatta tcagagaggg caggagccat 600 ttcagggtta cacagcacag gaagtccagg gctaagttct tcacacacag ggaaggagaa 660 gcatagggca ttcagattgg ggctggtggt gaatagagaa tgatcc 706 <210> 25 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tctcaaaaaa agaaaaatat atatatataa aaaatacttg acacgggtat acacatgaat 60 aagtaacttt tgtggatgca tacacatgct caccatcaca cacatataca cacttcatgg 120 acacatgagc tcatgtgcca ctctgcacac cctggctgtc cacattctat gagtgtgcgc 180 acatgcacgc ataatcactg cagcttcttc taacctaaac tgtctacatt gctaccatgc 240 acacgtgggc ctgtatttat cctgggcatg tacacaccac tattcagaga tgcccaccat 300 rccccaagac atgcccagcc catgtggaca agcccctgca aagggaagcc cacatgtccc 360 tgtgaccctt gcatccacag ccacccaggc atagtgtgtg atggtcaggc catgccctcc 420 catggttccc cactcttggc gggagtgcac ctaccacatc gctcttgctg gtgtagacac 480 ggtcagctag actctcaatg gcaatccact tgactggcat cttggcgata cgtccctggc 540 ggtagtagtc cccattgtag atcttcttgg agagcccgaa gtccgccaca cacacggaca 600 t 601 <210> 26 <211> 701 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tgaaagttgg atactgggaa cagcttagca gggtgatttt ggttcaggat ctctaatgaa 60 gttacaaaga tatcactggg ggctgcagtc atctgaaggt tgggactgga ggattgcttt 120 caaggtggct tactcacatg gctgtagcag gaggcttcag ttcgttgcca tgtggacccc 180 tttgtggcac tgcttgagct tactcacaac atggcaaccc aggagaaagt gcgaggaagc 240 cacatgcctt ttatgaccta gtctcagaag tcacacacac catcacttct gccaaatcag 300 aagcaagtca ctaagtcctg cccatgctca agaggagagg atttattctc cgtcttttgc 360 agggaggagg gtcaaagaat ttatggacct attttaaacc agcacagctt gtaagtggca 420 tagccaggct ttgatgcaag tctgttctgg ggagctggaa ggtctgttct agcaaaccct 480 catcagaata ctactccata yacagacagg tttcccgaga cccttcccag ctcctgagtc 540 tcccaggacc caactcagaa attcttggga attcccaaat ccccatagat ggcctcaaac 600 tgctgaggct ccctataacc ctctaaaatg cccccagtcc cctgagtgtc ctaaaatgtc 660 cccaggcttc cagaatgcac cccttctgag tccctgctca a 701 <210> 27 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 ctctatggtc gggtacctga cgtggaacgg gcgctctgca cgcgaccata gagccttccc 60 ctcccgaaag acatccagaa gttcaccgac cgctctcccg aatcctctaa tcggctgttc 120 ccgtaaatcg ggctgtctgg cgtctgtacc gacaagctca accccacgga tccgtcatta 180 accttcgcgc tcaggaatac aaaagccaca gagcttccca gtgtctaacg ctgcaccacc 240 tgtcgcctct aactcaaaac aaaactcgag taagacgcaa tcgggataca tgatgcagac 300 kcccactgcc tcctgagcca cacgttaagc ccgcaaaagc cacacactat ctctactcag 360 acaaaggcac accccgcagt cgtaaacaaa caggcgtgcg tcagatcaga cgcatccagt 420 tctttttttt gttgttcttt tttttttttt tttttttttg agacggagtc tcgctcttgt 480 taccctggct ggagtgcagg gcctctatct cagctcaccg caacctccgc ctcccgtgtt 540 caagcgattc tcctgcctca gccttccgag tagctgggat tacaggtccc cgccaccatg 600 c 601

Claims

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서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 401번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 401번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드) 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 401번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 401번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프로브를 포함하는 장형 위암 진단용 마이크로어레이.
서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 401번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 401번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 401번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 401번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 장형 위암 진단용 키트.
장형 위암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법(단, 상기 다형성 부위는 서열번호 1의 서열의 경우 401번째 염기, 서열번호 2의 서열의 경우 401번째 염기를 각각 의미한다).
제7항에 있어서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계가 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열로서 다형성 부위를 포함하는 서열을 주형으로 하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계가 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 401번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 401번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 401번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 401번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 얻어진 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 마이크로어레이에 고정되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 DNA 서열의 길이가 각각 10 내지 100 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계가 서열번호 1 또는 2의 DNA 서열의 다형성 부위의 유전자형(genotype) 또는 대립인자형(allele) 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
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