KR101167942B1

KR101167942B1 - Ａｌｇ12 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법

Info

Publication number: KR101167942B1
Application number: KR1020100013323A
Authority: KR
Inventors: 곽규범; 정주호; 남민; 원성식; 강현준
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2010-02-12
Filing date: 2010-02-12
Publication date: 2012-07-23
Also published as: KR20110093339A

Abstract

본 발명은 22번 염색체상의 유전자, 특히, ALG12 (asparagine-linked glycosylation 12, alpha-1,6-mannosyltransferase homolog (S. cerevisiae)) 유전자로부터 유래된 단일염기다형(Single-Nucleotide Polymorphism; SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 자폐스펙트럼 장애 (Autism Spectrum disorder, ASD) 의 임상적 진단의 표지 인자로서 사용될 수 있다.

Description

ＡＬＧ12 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법{Polynucleotides derived from ALG12 gene comprising single nucleotide polymorphisms, microarrays and diagnostic kits comprising the same, and analytic methods for autism spectrum disorders using the same}

본 발명은 1번 염색체상의 유전자, 특히, ALG12 (asparagine-linked glycosylation 12, alpha-1,6-mannosyltransferase homolog (S. cerevisiae)) 유전자로부터 유래된 단일염기다형(Single-Nucleotide Polymorphism; SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 자폐 스펙트럼 장애 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 자폐 스펙트럼 장애 진단용 프로브; 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이; 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.

인간의 게놈은 모두 22쌍의 상동 염색체와 두 개의 성염색체로 이루어져 있다. 그러나 모든 인간이 각기 다른 외모와 성격을 갖는다. 이는 개개인이 같은 수의 염색체를 가지고 있기는 하지만, 그 염색체로부터 발현되는 유전자들에 의한 표현형이 모두 다르기 때문이다. 개개인의 이러한 유전자 발현의 다양성은 곧 유전자를 가지고 있는 게놈의 유전적 다양성 때문이다. 이러한 유전적 다양성은 많은 연구가 수행되어 왔으며, 최근 인간게놈프로젝트의 완성으로 그 구조가 모두 밝혀졌다.

게놈에서의 유전적 다양성을 대표하는 것으로는 Transposable element, STR (short tandem repeats), Microsatellites, STS (sequence tagged site), VNTR (variable number tandem repeat), SNP (single nucleotide polymorphism : 단일염기다형) 등이 알려져 있다. 이중 SNP는 단일염기다형으로서, 인간 게놈 상에서 약 1000개의 뉴클레오티드 중 1개의 빈도로 나타나며 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. 이러한 단일염기다형이 나타내는 유전학에서의 의미는 그 위치에 따라 각 개체에 큰 차이를 가져온다. 예를 들면, 단일염기다형이 단백질을 암호화하고 있는 위치에 존재할 경우, 단백질의 구조에 영향을 미칠 수 있게 되어 단백질 기능이 달라질 수 있게 되며, 질병과도 연관될 수 있다. 다른 예로 단일염기다형이 단백질을 암호화하지 않는 다른 유전자상에서 존재할 경우, 즉 프로모터(promoter) 또는 인트론(intron)에 존재할 경우, 각각에 대하여 단백질의 발현 수준에 차이를 가져와 그 단백질의 전체적인 활성이 줄어들 수 있고, 변성적인 인트론 제거 과정(alternative splicing)을 통하여 단백질이 비정상적으로 발현될 수도 있다.

단일염기다형들은 질병과 같은 특정 표현형(phenotype)의 지표로 사용될 수 있고, 이를 위해서는 가장 우선적으로 인간 유전체에 존재하는 대량의 단일염기다형을 발굴하고 발굴된 단일염기다형은 다수의 인간 유전체 시료에서 전체 인간집단의 1% 이상 존재하는 유전변이형 마커인지를 조사하는 검정작업을 거치게 된다. 검정된 SNP은 특정 질병 또는 약물반응과 같은 유전적 차이에 기인된 원인을 찾기 위한 연관성 연구에 사용되게 된다. 예를 들면, 특정 단일염기다형이 환자군과 대조군 간의 비교에서 유의적인 빈도의 차이가 관측된다면 아주 유용한 단일염기다형으로 선발되어 임상실험을 거치게 될 것이며 임상실험의 결과가 계속적으로 진행되어 그 결과가 좋을 때는 경제적으로 아주 유용한 가치를 지니는 유전지표로 실제 임상에 사용할 수 있게 될 것이다.

이러한 단일염기다형의 발견을 위한 종래 기술로는 제한효소를 이용한 제한 단편화 길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP), 대립형질 특이적 혼성화(Allele-specific hybridization)를 이용한 TaqMan^TM 프로브 방법, 용융온도(melting temperature; Tm)을 이용한 역동적 대립형질 특이적 혼성화(Dynamic Allele-Specific Hybridization; DASH)방법, 중합반응을 이용한 pyrosequencing등이 있다. 최근, 마이크로어레이 기술은 단일 염기 신장(Single Base Extension)이라는 원리를 이용한 프로브들을 조그만 기판위에 집적화시켜 심은 후, 목적 DNA들과의 혼성화와 신장(Extension)을 시킴으로써 단일염기다형을 발견해 내고 있다.

한편, 자폐 스펙트럼 장애(Autism Spectrum Disorder; ASD)는 전반적인 발달장애(Pervasive Developmental Disorder; PDD)로서 사회적 상호작용의 장애, 의사소통의 장애, 반복적이고 상동증적인 행동을 보이는 신경발달장애이다. 자폐 스펙트럼 장애는 다양한 형태로 나타나고 개인에 따라 심각한 정도가 다르며, 자폐장애(autistic disorder), 레트장애(Rett's disorder), 소아기 붕괴장애(childhood disintegrative disorder), 아스퍼거 증후군(Asperger's syndrome), 특정불능의 전반적 발달장애(Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified; PDD-NOS)를 포함한다.

자폐 스펙트럼 장애의 대부분은 소아기 자폐로 10,000 명당 2～5 명의 유병률을 보이고, 아스퍼거 증후군 등 전반적 발달장애를 포함하는 경우 10,000명당 20～50 명까지 보이며, 남녀 성비는 약 4:1 로서 여자보다 남자에서 발생 빈도가 높게 나타난다. 자폐 스펙트럼 장애는 여러 가지 병인에 의해서 나타날 수 있으며, 환경적인 병인과 유전적인 영향에 의해 나타날 수 있다. 자폐증은 강한 유전적 소인을 가지는 질병으로 알려져 있다. 따라서 기존에 보고된 연구들을 바탕으로 질병과 연관된 많은 유전학적 연구들이 보고되고 있다. 한국 내 소아자폐증의 비율은 2003년에서 2007년간 환자 수가 1.65배 증가하였다. 소아자폐증 환자가 증가하는 추세에 있다. 자폐 스펙트럼 장애 발병의 원인 규명 및 조기진단, 조기 치료가 소아 건강 및 국민의료 재정에 주요하며, 자폐 스펙트럼 장애의 조기 진단은 그 치료를 위한 필수적인 요소이다. 또한, 자폐 스펙트럼 장애에 특이적으로 나타날 수 있는 단일염기다형을 찾아내는 것은 자폐 스펙트럼 장애를 조기에 진단할 수 있으며, 더 나아가 병태생리학적 경로를 밝히고 치료 방법을 개발하는데 까지 이용될 수 있을 것이다.

본 발명자들은 한국인의 자폐 스펙트럼 장애에서 특이적으로 나타나는 단일염기다형을 찾아내고자 연구를 거듭한 결과, 22번 염색체상의 유전자, 특히, ALG12 유전자로부터 자폐증 환자에 특이적으로 나타나는 단일염기다형 부위를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애와 관련된 단일염기다형으로서 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 자폐 스펙트럼 장애 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 자폐 스펙트럼 장애 진단용 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 331번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 331번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (a); 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (b); 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (c); 및 서열번호 5의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (d)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐 스펙트럼 장애 진단을 위한 증폭용 프라이머가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐 스펙트럼 장애 진단용 프로브 및 이를 포함한 마이크로어레이가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애 진단용 키트가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 자폐 스펙트럼 장애 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 1 내지 3 및 5의 폴리뉴클레오티드로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계(단, 상기 다형성 부위는 서열번호 1의 DNA 서열의 경우 331번째 염기, 서열번호 2의 DNA 서열의 경우 251번째 염기, 서열번호 3의 DNA 서열의 경우 301번째 염기, 서열번호 5의 DNA 서열의 경우 201번째 염기를 각각 의미한다)를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 자폐 스펙트럼 장애 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 1 및 2 또는 서열번호 3 내지 5의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정되는 반수체형의 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법(단, 상기 다형성 부위는 서열번호 1의 DNA 서열의 경우 331번째 염기, 서열번호 2의 DNA 서열의 경우 251번째 염기, 서열번호 3의 DNA 서열의 경우 301번째 염기, 서열번호 4의 DNA 서열의 경우 301번째 염기, 서열번호 5의 DNA 서열의 경우 201번째 염기를 각각 의미한다)이 제공된다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 자폐 스펙트럼 장애의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 또는 프로브, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트는 자폐 스펙트럼 장애의 예측진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 분석방법은 자폐 스펙트럼 장애 진단에 필요한 정보를 제공하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 서열번호 1 내지 5의 단일염기다형들 간의 연관비평형블록을 나타낸다.
도 2는 상기 연관비평형블록으로부터 형성된 반수체형을 나타낸다.

본 발명은 자폐 스펙트럼 장애와 관련된 것으로 새롭게 밝혀진 ALG12 유전자로부터 유래하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 즉, 본 발명은 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 331번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 331번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (a); 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (b); 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (c); 및 서열번호 5의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (d)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 서열번호 1 내지 3 및 5의 DNA 서열은 대조군과 자폐 스펙트럼 장애 환자군에서 통계학적으로 유의성 있는 차이(유의수준 p value < 0.05)를 보이는 단일염기다형으로서, 이들은 ALG12 유전자에 존재한다.

본 발명자들은 자폐 스펙트럼 장애와 관련된 후보 유전자로서 ALG12를 선정하여, 자폐 스펙트럼 장애 진단에 있어서 분자 수준에서의 진단 지표를 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 한국인 자폐증을 가지지 않는 188명과 자폐 스펙트럼 장애 환자 44명을 대상으로 유전자형 분석 및 통계학적 분석을 수행하였으며, 놀랍게도 수많은 단일염기다형 중 일부의 단일염기다형만이 대조군과 자폐 스펙트럼 장애 환자군에서 통계적으로 유의성 있는 차이를 나타낸다는 것을 발견하였다. 특히, 서열번호 1 내지 3 및 5의 단일염기다형은 하디-와인버그 평형 (Hardy-Weinberg Equilibrium) 및 로지스틱 회귀분석 결과, 각각의 다형성 부위에 위험 대립인자가 존재함을 확인하였으며, 상기 위험 대립인자로부터 자폐 스펙트럼 장애의 진단이 가능하다는 것을 확인하였다.

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 길이는 10 내지 100 뉴클레오티드, 바람직하게는 20 내지 60 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 뉴클레오티드이다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열 (polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위 (polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위 (polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐 스펙트럼 장애 진단을 위한 증폭용 대립형질 특이적 프라이머를 포함한다. 여기서 "프라이머(primer)"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트(ATP,GTP,CTP,TTP) 및 DNA 폴리머라제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 100, 바람직하게는 10 내지 80 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 3'-말단이 서열번호 1 내지 3 및 5의 단일염기다형과 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 DNA에서 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 증폭된 산물만을 특이적으로 염색하여 시각화한다. 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 여기서 사용되는 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드들이 다른 변성화 과정을 거치게 되면, Infinium^TM Assay II 뿐만 아니라 다른 방법들에 의해서도 사용될 수 있다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐 스펙트럼 장애 진단용 프로브 및 이를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 자폐 스펙트럼 장애 진단용 키트를 포함한다.

본 발명은 또한 자폐 스펙트럼 장애 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 1 내지 3 및 5의 폴리뉴클레오티드로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계(단, 상기 다형성 부위는 서열번호 1의 DNA 서열의 경우 331번째 염기, 서열번호 2의 DNA 서열의 경우 251번째 염기, 서열번호 3의 DNA 서열의 경우 301번째 염기, 서열번호 5의 DNA 서열의 경우 201번째 염기를 각각 의미한다)를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 검체는 혈액, 조직, 세포 등을 포함하며, 핵산 시료는 통상의 방법에 따라 얻을 수 있다. 예를 들어 혈액에 경우 다음과 같이 핵산 시료를 얻을 수 있다. 혈액을 원심분리 실험관으로 옮기고 낮은 농도의 염 성분 완충용액(low-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, and 2mM EDTA))을 5ml 첨가한다. 그리고 Nonidet P-40을 첨가한 다음, 얻어진 용액을 잘 섞어준 후, 상온에서 10분간 2,200 rpm으로 원심분리한다. 이때 얻어진 덩어리는 고농도의 염 성분 완충용액(high-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, 0.4M NaCl, and 2mM EDTA))으로 재현탁한다. 게놈 DNA는 50ul의 10% SDS와 섞은 후, 55℃에서 밤새 반응시킨다. 반응 후에, 각 게놈 DNA들은 1.5ml 용량의 원심분리 실험관으로 옮겨, 6M NaCl을 0.3ml 첨가한다. 게놈 DNA들을 잘 섞어준 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리한다. 원심분리 후, 게놈 DNA가 들어있는 상층을 모아서 새로운 시험관으로 옮기고, 상온에서 동량의 100% 에탄올을 첨가한다. 게놈 DNA들이 침전될 때까지 잘 섞어 주고, 침전이 되면 70% 에탄올로 게놈 DNA들을 세척한다. 이 과정이 끝나면 실험관 뚜껑을 열어, 용액성분이 마르도록 놓아둔다. 그리고 TE 완충용액(pH 8.0)을 넣어 게놈 DNA를 재현탁함으로써, 핵산 시료를 얻을 수 있다.

여기에서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 서열번호 1 내지 3 및 5의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열로서 다형성 부위를 포함하는 서열(단, 상기 다형성 부위는 서열번호 1의 DNA 서열의 경우 331번째 염기, 서열번호 2의 DNA 서열의 경우 251번째 염기, 서열번호 3의 DNA 서열의 경우 301번째 염기, 서열번호 5의 DNA 서열의 경우 201번째 염기를 각각 의미한다)을 주형으로 하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 상기에서 설명한 바와 같다.

또한, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계는 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계 (단, 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (d)는 상기에서 정의한 바와 같다); 및 얻어진 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함하여 수행될 수 있으며, 상기 마이크로어레이에 고정되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 DNA 서열의 길이는 각각 10 내지 100 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법에 따라 얻어진 결과는 자폐 스펙트럼 장애 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있으며 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 및 5의 다형성 부위의 염기가 각각 C, C, C, C (위험 대립인자)인 것이 하나 이상 존재하는 경우, 자폐 스펙트럼 장애에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 다형성 부위에서 T 대립인자형을 갖는 사람에 비해 C 대립인자형을 갖는 사람이 자폐 스펙트럼 장애에 대한 위험도가 약 1.904배 정도 높은 것으로 판단할 수 있다(하기 표4 참조). 또한, 이와 유사하게, 서열번호 2, 3, 및 5의 다형성 부위에서 T 대립인자형을 갖는 사람에 비해 C 대립인자형을 갖는 사람이 자폐 스펙트럼 장애에 대한 위험도가 각각 약 3.757배, 약 2.32배, 약 2.113배 정도 높은 것으로 판단 할 수 있다(하기 표4 참조). 상기 위험 대립 인자를 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 위험군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명은 또한, 자폐 스펙트럼 장애 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 핵산 시료로부터 반수체형(haplotype)을 분석하는 단계를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법을 포함한다. 구체적으로, 상기 반수체형 분석은 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 1 및 2 또는 서열번호 3 내지 5의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정되는 반수체형으로 이루어진 군으로부터 선택된 반수체형을 분석함으로써 수행될 수 있다. 단, 상기 다형성 부위는 서열번호 1의 DNA 서열의 경우 331번째 염기, 서열번호 2의 DNA 서열의 경우 251번째 염기, 서열번호 3의 DNA 서열의 경우 301번째 염기, 서열번호 4의 DNA 서열의 경우 301번째 염기, 서열번호 5의 DNA 서열의 경우 201번째 염기를 각각 의미한다.

즉, 반수체형 분석결과 서열번호 1 및 2로부터 형성되는 연관비평형블록 1에 있어서, 서열번호 1 및 2의 DNA 서열이 T-T인 반수체형 1을 가지는 경우, 그렇지 않은 사람보다 자폐 스펙트럼 장애에 걸릴 위험이 낮은 것으로 판정할 수 있으며, 이와 반대로 서열번호 1 및 2의 DNA 서열이 C-C인 반수체형 2를 가지는 경우, 그렇지 않은 사람보다 자폐 스펙트럼 장애에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있다. 또한, 반수체형 분석결과 서열번호 3 내지 5로부터 형성되는 연관비평형블록 2에 있어서, 서열번호 3 내지 5의 DNA 서열이 T-T-T인 반수체형1을 가지는 경우, 그렇지 않은 사람보다 자폐 스펙트럼 장애에 걸릴 위험이 낮은 것으로 판정할 수 있으며, 이와 반대로 서열번호 3 내지 5의 DNA 서열이 C-C-C인 반수체형 2를 가지는 경우, 그렇지 않은 사람보다 자폐 스펙트럼 장애에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정할 수 있다(표 6, 도 1 및 2 참조).

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 피검자 선정

본 실험은 자폐 스펙트럼 장애 환자 (평균 나이: 15.27±3.34)로 2004년에서 2006년까지 한국 내 3개의 특수학교의 학생 및 병원의 외래환자들을 대상으로 44명을 선정하였으며, 이들 모두 DSM-IV(American Psychiatric Association, 1994), 임상 면접시험, 증후 등급(symptom rating)을 시행하였으며, Childhood Autism Rating Scale, Korean version (K-CARS) 점수 30 이상의 환자를 선정하였다. 모든 진단은 독립된 2명의 경험 있는 정신과 의사 및 심리학자에 의해 수행되었다. 대조군은 유전학적, 신경학적 병인이 없는 자폐증에 대해 대조인 188명을 대상으로 선정하였다. 사용된 군집의 크기는 다음 표 1과 같다.

그룹	대조군	자폐 스펙트럼 장애 환자군	총합계
조사인원	188	44	232

2. 게놈 DNA의 준비

게놈 DNA(genomic DNA; gDNA)를 준비하기 위하여 자폐 스펙트럼 장애 환자와 대조군으로부터 정맥 혈액을 채취하였다. 전체 정맥혈(약 0.3 ml)은 각 지원자들의 전주정맥으로부터 얻었고 15% EDTA가 들어있는 Vacutainer tube로 옮겼다. 게놈 DNA를 추출하기 위하여, 혈액을 원심분리 실험관으로 옮기고 낮은 농도의 염 성분 완충용액(low-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, and 2mM EDTA)을 5ml 첨가 하였다. 그리고 Nonidet P-40을 첨가하였다. 얻어진 용액을 잘 섞어준 후, 상온에서 10분간 2,200 rpm으로 원심분리하였다. 이 때 얻어진 덩어리는 고농도의 염 성분 완충용액(high-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, 0.4M NaCl, and 2mM EDTA))으로 재현탁 하였다. 이 게놈 DNA는 50ul의 10% SDS와 섞은 후, 55℃에서 밤새 반응시켰다.

반응 후에, 각 게놈 DNA들은 1.5ml 용량의 원심분리 실험관으로 옮겨, 6M NaCl을 0.3ml 첨가하였다. 게놈 DNA들을 잘 섞어준 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 게놈 DNA가 들어있는 상층을 모아서 새로운 시험관으로 옮기고, 상온에서 동량의 100% 에탄올을 첨가하였다. 게놈 DNA들이 침전될 때까지 잘 섞어 주고, 침전이 되면 70% 에탄올로 게놈 DNA들을 세척하였다. 이 과정이 끝나면 실험관 뚜껑을 열어, 용액성분이 마르도록 놓아둔다. 그리고 TE 완충용액(pH 8.0)을 넣어 게놈 DNA를 재현탁하였다.

준비된 게놈 DNA는 Infinium II Assay를 위해 Quant-iT^TM PicoGreen dsDNA reagent (Molecular Probes, Invitrogen)을 사용하여 750ng/15uL의 농도로 조정하였다.

3. 게놈 DNA의 증폭 및 유전자형 분석

Infinium-II assay 방법에 따라, Humanexon 510S-Duo chip을 사용하여 유전자형을 분석하였다. 일루미나사(Illumina Inc.)로부터 Infinium-II assay를 위한 모든 시약과 Humanexon 510S-Duo v1 chip을 구입하여 사용하였다. 모든 과정은 일루미나사의 Humanexon 510S-Duo v1 chip 방법에 따라 시행하였다.

전체 게놈의 증폭(Whole-genome amplification(WGA)) - 게놈 DNA (750ng/15uL)를 상온(22℃)에서 녹인 후, 0.8mL 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 옮겼다. 0.1N NaOH를 15uL 첨가하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 270uL의 MP1 용액(상기 chip에 첨부된 Neutralization solution)과 300uL의 AMM 용액(상기 chip에 첨부된 Amplification Master Mix)을 차례로 첨가한 후, 뒤집어가며 잘 섞어주었다. 280g에서 원심분리하여(pulse centrifugation) 37℃ 오븐에서 20시간 동안 반응시켰다.

증폭된 게놈 DNA의 단편화와 정제 - 전체 게놈 DNA 증폭 단계가 끝나면 50g에서 1분간 원심분리(pulse centrifugation)한 후, 150uL 씩 3개의 여분의 웰로 옮겼다. 결과적으로 4개의 웰이 같은 게놈 DNA가 된다. 각 웰에 FRG 용액(상기 chip에 첨부된 Fragmentation solution)을 50uL 첨가한 후, 1600rpm으로 1분 동안 와동(vortex)하였다. 상온에서 50g로 원심분리(pulse centrifugation)한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 게놈 DNA를 50g에서 원심분리하고, PA-1 용액(상기 chip에 첨부된 Precipitation solution)을 100uL 첨가하고 1600rpm으로 와동하여, 상온에서 50g로 원심분리(pulse centrifugation)한 후, 37℃에서 5분 동안 방치하였다. 상온에서 50g로 1분 동안 원심분리하고, 100% 아이소프로판올을 300uL 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 4℃에서 3000g로 20분 동안 원심분리하고 게놈 DNA 덩어리를 확인한 다음, 마이크로타이터 플레이트를 뒤집어 상층을 제거하였다. 상온에서 1시간 동안 게놈 DNA를 말린 다음, RA1 용액(상기 chip에 첨부된 Resuspension, hybridization, and wash solution)을 42uL 넣고, 48℃ 오븐에서 1시간 동안 반응시켰다.

Sentrix^R BeadChip의 준비와 활성화 - 증폭된 게놈 DNA를 RA1 용액(상기 chip에 첨부된 Resuspension, hybridization, and wash solution)에서 재현탁하는 동안, (Sentrix^R) BeadChip을 준비하였다. BeadChip을 꺼내어 게놈 DNA를 첨가하기 전까지 PB2 용액(상기 chip에 첨부된 Humidifying buffer used during hybridization)이 든 혼성화 챔버(Hybridization chamber)에 넣어 두었다.

혼성화 증폭된 게놈 DNA의 재현탁 (48℃, 1시간 반응)이 끝나면, 1800rpm으로 1분 동안 와동하고 280g에서 원심분리(pulse centrifugation)한 다음, 95℃ heat block에서 20분 동안 증폭된 게놈 DNA를 변성화 한 후, 280g로 원심분리(pulse centrifugation)하였다. 4개의 웰로 나누어진 게놈 DNA를 하나의 웰로 모으고, 280g로 원심분리(pulse centrifugation)하였다. 혼성화 챔버(Hybridization Chamber)로부터 BeadChip Chamber를 꺼내어 게놈 DNA를 넣어준 다음, BeadChip Chamber를 다시 혼성화 챔버(Hybridization Chamber)에 넣고, 48℃에서 18시간 동안 적정속도로 흔들면서 반응시켰다.

단일 염기 신장(Single Base Extension; SBE)에 의한 염색 - 18시간의 혼성화가 끝나면, BeadChip 을 꺼내어 150uL의 RA1 용액(상기 chip에 첨부된 Resuspension, hybridization, and wash solution)을 넣고 30동안 반응시키고 이 과정을 5번 반복하였다. XC1 용액(상기 chip에 첨부된 XStain BeadChip solution 1) 450uL와 XC2 용액(상기 chip에 첨부된 XStain BeadChip solution 2) 450uL, TEM 용액(상기 chip에 첨부된 Two-color Extension Master mix) 200uL에 차례로 각각 10분, 5분, 15분 동안 반응시키고, 450uL의 95% 포름아마이드/1mM EDTA를 흘려 보냈다. 450uL의 XC3 용액(상기 chip에 첨부된 XStain BeadChip solution 3)을 흘려보내고, Illumina's 프로토콜에 따라 LTM과 ATM 용액(상기 chip에 첨부된 Labeling Two-color Master Mix, Anti-Stain Two-color Master Mix)으로 게놈 DNA을 염색하였다. BeadChip chamber를 분해하여 BeadChip을 PB1 용액(상기 chip에 첨부된 Reagent used to prepare Beadchips for hybridization)과, XC4 용액(상기 chip에 첨부된 XStain BeadChip solution 4)을 이용하여 차례로 세척하고, 진공 데시케이터를 이용하여 말렸다. 마지막 단계로 Illumina BeadArray reader을 사용하여 스캔함으로써 각 BeadChip에 대한 이미지 파일을 저장하였다.

유전자형 분석 이미지 파일로부터 유전자형의 분석은 Bead Studio Version 3.3 software를 사용하여 각 단일염기다형에 대한 유전자형을 정하였다.

4. 통계학적 분석

단일염기다형들을 구성하는 대립인자들에 대한 집단내의 유전학적 분포여부에 대하여 하아디-와인버그 평형 검정을 하였다. 여기에서 단일염기다형의 기준이 되는 HWE p value > 0.05와 작은 대립인자 빈도(Minor Allele Frequency; MAF) > 0.05의 기준을 적용하였다. 대조군과 자폐 스펙트럼 장애 환자군간의 출현빈도의 차이를 이용하여 질병에 대한 각 단일염기다형들의 연관성분석은 유의수준을 < 0.05로 정하였으며, PLINK version 1.6을 사용하여 분석하였다. 연관성분석은 대립인자들 간의 대조군과 자폐 스펙트럼 장애 환자군간의 출현빈도로 나누어 유의성 있는 차이를 비교하였으며, 유의수준을 < 0.05로 하였다. 오즈 비(Odds Ratio)는 로지스틱 회귀모형을 통하여 산출하였으며 우성 (Dominant), 열성 (Recessive) 및 공우성 (Additive) 모형을 적용하였다. 각 모형에 따른 질병과의 유의성을 분석함에 있어 다수 대립인자를 A1이라 하고 소수 대립인자를 A2라 하면 우성 (Dominant) 모형은 A1A1과 A1A2 빈도의 합과 A2A2의 빈도를 비교하는 것이고, 열성 (Recessive) 형질 모형은 A1A1과 A1A2와 A2A2 합의 빈도를 비교하는 것이고, 공우성 (Additive) 형질 모형은 A1A1, A1A2 및 A2A2에 대한 각각의 빈도를 비교하는 것이다.

단일염기다형들간의 연관비평형 검정을 하였다. 이는 Haploview (ver. 4.1)을 사용하였다. 대조군과 자폐 스펙트럼 장애 환자군 모두에서 형성되는 각 단일염기다형들간의 상호연관성에 대한 분석에서 형성된 연관비평형블록으로부터 반수체형이 형성되었으며, 반수체형의 유의성은 다중 검정 방법의 하나인 permutation test를 유의수준 0.05에서 검정하였다.

5. 결과

(1) ALG12 유전자에 존재하는 단일염기다형

하기 표 2는 참여한 대조군과 자폐 스펙트럼 장애 환자군으로부터 자폐 스펙트럼 장애와의 연관성 분석에 사용된 단일염기다형의 서열 목록으로서, 이 중 서열번호 1 내지 3, 5의 다형성 서열은 통계학적으로 유의성 있는 차이를 나타내었다.

서열번호	Reference SNP ID	대립인자	염색체	위치	유전자	SNP역할	아미노산 변화
1	rs8135963	T>C	22	48687480	ALG12	synonymous	변화없음
2	rs9627644	T>C	22	48687668	ALG12	intron	변화없음
3	rs9616204	T>C	22	48689534	ALG12	intron	변화없음
4	rs7511620	T>C	22	48693936	ALG12	intron	변화없음
5	rs9616380	T>C	22	48698229	ALG12	5flanking	변화없음

ㆍ서열번호는 각 단일염기다형을 나타내는 서열번호이다.

ㆍReference SNP ID는 표준단일염기다형의 명칭 (Reference SNP ID; rs)을 의미하며, 이는 인간게놈프로젝트 후, 미국 국립보건원 산하 생물공학정보연구소 (NCBI)의 데이터베이스에서 각 단일염기다형을 구분하기 위하여 붙인 이름이다.

ㆍ대립인자는 각 단일염기다형에서의 Major allele과 Minor allele을 나타낸다.

ㆍ염색체는 각 단일염기다형들이 몇 번 염색체에 위치하고 있는지를 나타내주고 있다.

ㆍ위치는 염색체상에서 표준염기서열의 위치를 의미한다(NCBI Genome build 36.3).

ㆍSNP 역할은 상기 단일염기다형들이 유전자상에서 어디에 위치하고 있는지를 나타내주고 있다. 따라서 각각의 단일염기다형들이 유전자의 발현과 기능에 있어서 어떻게 작용하는지를 알 수 있다.

ㆍ아미노산의 변화는 상기 단일염기다형들이 유전자가 발현되어 단백질을 생성할 때, 그 단백질을 이루는 아미노산에 변화를 주고 있는지에 대한 설명이다.

(2) 유전자형(genotype) 및 위험대립인자 분석

하기 표 3은 서열번호 1 내지 5의 DNA 서열의 대립인자 빈도와 각 유전자형에 대한 대조군과 자폐 스펙트럼 장애 환자군 각각의 빈도를 나타내며 표 4는 표 3의 유전자형 빈도를 토대로 진행한 하아디-와인버그 평형 검정(Hardy-Weinberg Equilibrium Test) 결과와 자폐 스펙트럼 장애와의 연관성 분석[즉, 케이스-컨트롤 연관 분석(Case-control association study)] 결과로서, 하기 연관성 분석에 의해 자폐 스펙트럼 장애에 영향을 미칠 수 있는 단일염기다형들과 이들의 유전자형을 확인할 수 있다.

ㆍ서열번호는 각 단일염기다형을 나타내는 서열번호이다.

ㆍ 대립인자형 빈도(allele frequency) 란에서는 집단 내에서 관찰되는 각각의 대립인자들의 빈도를 나타내고 있다. 여기서 대립인자란 단일염기다형 부위에 실제로 존재하고 있는 뉴클레오티드의 염기서열을 뜻하며, 하나의 단일염기다형은 그 특성상 두 개의 대립인자를 가질 수 있다. 이들 대립인자 빈도의 고저에 따라 다수 대립인자(Major allele)와 소수 대립인자(Minor allele)로 나뉜다. 특히 소수 대립인자의 빈도(Minor allele frequency; MAF)는 0.01을 기준으로 하여 단일염기다형과 단일염기변이(point mutation)을 나누는 유전학적 기준으로 사용된다. 이러한 기준은 다형성 자체의 안정성을 뜻하기 때문에(즉, "단일염기다형이 일어나는 부위는 일정하다"라는 의미), 유전적 표지인자로써의 사용 가능성을 대변해 준다.

ㆍ 유전자형은 각 단일염기다형을 형성하는 각각의 대립인자들로 이루어지며, 단일염기다형 부위가 존재하는 유전자좌(locus)에 어떠한 대립인자들이 있는지를 나타내 주고 있다.

ㆍ 유전자형 빈도수(genotype frequency)와 유전자형 백분율란은 각각의 유전자형에 해당하는 사람들의 수를 대조군과 자폐 스펙트럼 장애 환자군으로 나누어 나타낸다. 이를 관측치라고 할 수 있다.

표 4는 하나의 단일염기다형을 이루는 두 개의 대립인자와 이로 인하여 형성되는 3가지 형태의 유전자형에 대한 대조군 - 자폐 스펙트럼 장애 환자군 간의 빈도차이를 비교하여 어떠한 대립인자가 또는 어떠한 유전자형이 질병과 연관되어 있는지를 분석한 결과이다. 이러한 연관성 분석은 대립인자형(allele model), 공동-우성 유전자형(Co-dominant model), 우성 유전자형(Dominant model), 그리고 열성 유전자형(Recessive model)이라는 네 가지 항목에서 실시하였다. 표 4에 있어서 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다.

ㆍ서열번호는 각각의 단일염기다형을 나타내는 번호이다.

ㆍHWE는 하아디-와인버그 평형 (Hardy-Weinberg Equilibrium)의 상태를 나타내는 것이다. 카이제곱 (df=1) 검정에서 chi-value = 3.84(p-value=0.05, df=1)을 기준으로, 3.84보다 큰 경우에는 하아디-와인버크 평형 HWE (Hardy-Weinberg Equilibrium)으로 판단하고, 3.84보다 작은 경우에는 하아디-와인버그 비평형 (Hardy-Weinberg Disequilibrium)으로 판단하였다. 이는 대조군과 자폐장애스펙트럼장애 환자군 모두에서 관찰된 각 단일염기다형들의 유전적 표지인자로서의 기능과 이들로 이루어지는 유전자형의 분포가 일반적인 것들인지를 나타낸다.

ㆍ오즈 비율 (odds ratio, OR)은 대조군과 자폐장애스펙트럼장애 환자군 중에서 위험 대립인자를 가질 오즈의 비율을 나타낸다. 95% 신뢰하한과 95% 신뢰상한은 오즈 비율의 95% 신뢰구간을 나타낸다. 신뢰구간은 1을 포함하는 경우에는 질병과의 연관성을 유의하다고 판단할 수 없다. 오즈비율이 1보다 크고 95%신뢰구간에 1이 포함되어 있지 않은 경우 소수 대립인자가 질환군에서 더 높은 빈도를 가지며, 오즈비율이 1보다 작은 경우에는 다수 대립인자가 질환군에서 더 높은 빈도를 가진다.

ㆍ연관성 분석에서 Logit p value는 오즈비에 대한 통계적 유의성을 나타낸다. 이는 오즈비 만큼 대조군과 자폐 스펙트럼 장애 환자군 사이의 차이에 대한 유의성을 뜻한다. 여기서 유의성 있는 차이가 있다고 판단하는 기준은 Logit_p value가 0.05 이하의 값을 나타낼 경우이다. 이러한 값은 로지스틱 회귀(logistic regression) 분석을 통하여 얻었다.

ㆍcase-control 데이터를 이용하여 유전형의 분포를 구하여 case-control 그룹에 대한 상대적 위험도(OR: odds ratio)를 구했으며, 이를 통해 위험 대립 인자 (risk allele)를 정하였다. 대조군과 자폐 스펙트럼 장애 환자군 사이의 대립인자의 빈도를 chi-square test를 통해 비교하였으며, 유의성 있는 차이가 있다고 판단하는 기준은 chi-square p value가 0.05 이하의 값을 나타낼 경우이다.

ㆍ각 세 가지 유전자형 분석모델에 따른 질병과의 유의성을 분석함에 있어 다수 대립인자를 A1이라 하고 소수 대립인자를 A2라 하면 우성 (Dominant) 모형은 A1A1과 A1A2의 합과 A2A2의 빈도를 비교하는 것이고, 열성 (Recessive) 형질 모형은 A1A1과 A1A2과 A2A2의 합의 빈도를 비교하는 것이고, 공우성 (Co-dominant model or Additive) 형질 모형은 A1A1, A1A2 및 A2A2에 대한 각각의 빈도를 비교하는 것이다.

ㆍ각 세 가지 유전자형 분석모델에 대한 연관성 분석은 대립형질들이 대조군과 자폐 스펙트럼 장애 환자군 사이에서 출현되는 빈도수의 비율을 통하여 위험 대립인자가 자폐 스펙트럼 장애 환자군에 어느 정도의 연관성 (위험도)를 가지고 있는지 확인할 수 있다. 95% 신뢰구간에 1을 포함하고 있지 않을 경우 유의성이 있기 때문에, 상기 표 4로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 1 내지 3 및 5의 다형성 부위의 염기가 각각 C, C, C, C (위험 대립인자)인 것이 하나 이상 존재하는 경우, 자폐 스펙트럼 장애에 걸릴 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

(3) 반수체형 분석

표 5 및 도 1, 2는 서열번호 1 내지 5에 대한 다형성 부위간의 연관성을 나타낸다. 도 1은 형성된 두 개의 연관비평형블록(Linkage Disequilibrium Block)을 나타내며, 도 2는 각 연관비평형블록으로부터 추정된 반수체형을 나타낸다.

표 5는 도 1에 나타난 각 단일염기다형들 사이의 연관비평형블록의 조밀함을 수치화하여 나타낸 것으로 D' 값과 r²값을 나타내고 있다. D' 값이 0.8 이상이 될 때, 각 단일염기다형들은 연관비평형 관계에 있다고 판단하며, 도 1에서 보듯이 붉은 색으로 표시된다. 이러한 D' 값의 범위는 0 ～ 1까지 이며, 각 단일염기다형들 사이의 게놈 DNA 상에서의 떨어져 있는 거리에 대한 계산이 포함되어 있다. 또한 r² 값은 각 단일염기다형들 간의 상관관계를 나타내는 것으로 r² 값이 0.3 이상이면 그 값에 해당하는 단일염기다형들이 매우 조밀하게 묶여있다는 것을 뜻한다. 이는 앞서 언급한 도 1과 표 5에서 뜻하는 바는 서열번호 1 내지 5의 단일염기다형들이 서로 밀접하게 연관되어 있어 유전적 단위체를 형성한다는 것이다. 또한 이렇게 형성된 단위체들은 다음 세대로 유전될 때, 같이 묶여서 전달 되게 된다. 따라서 연관비평형 블록들이 환자군 특이적으로 나타나 질병을 일으키는데, 많은 영향을 미칠 경우, 그 블록 자체가 다음 세대로 전달되기 때문에, 다음 세대의 자손에 대한 질병이 일어날 수 있는 빈도를 예측할 수 있다.

연관비평형 블록들로부터 형성되는 유전적 단위체는 각 단일염기다형의 대립인자형 분석으로부터 그 유형이 결정되는데, 이를 반수체형(haplotype)이라고 한다 (도 2). 도 2는 도 1로부터 형성된 연관비평형 블록으로부터 유전자형의 분석결과와 대비하여 형성된 반수체형이다. 도 1에서 나타난 한 개의 연관비평형블록으로부터 각각 도 1에 상응하는 반수체형이 나타나며, 각각의 블록에서 환자군에서 특이적으로 많이 나타나는 반수체형과 대조군에서 특이적으로 많이 나타나는 반수체형이 관찰 되었다(표6). 반수체형은 다음 세대로 유전되기 때문에, 이러한 반수체형이 질병과 연관되는지를 분석할 필요가 있다. 총체적으로 연관비평형블록과 반수체형에 대한 질병관련 분석은 지금 세대에서의 질병의 예측 뿐 만아니라, 그 질병의 다음 세대로의 전달까지 예측할 수 있게 한다. 표 6은 도 2의 반수체형들의 빈도수가 환자군과 대조군 사이에서 나타나는 빈도에 유의성 있는 차이를 조사한 표이다.

서열번호 1 내지 2의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정된 반수체형 분석결과 T-T 반수체형을 포함하는 경우, 포함하지 않은 사람보다 자폐 스펙트럼 장애에 걸릴 위험성이 낮은 반면, C-C 반수체형을 포함하는 경우 자폐 스펙트럼 장애에 걸릴 위험성이 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한, 서열번호 3 내지 5의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 결정된 반수체형 분석결과 T-T-T 반수체형을 포함하는 경우, 포함하지 않은 사람보다 자폐 스펙트럼 장애에 걸릴 위험성이 낮은 반면, C-C-C 반수체형을 갖는 경우 자폐 스펙트럼 장애에 걸릴 위험성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

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서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐 스펙트럼 장애 진단을 위한 증폭용 프라이머.
서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 자폐 스펙트럼 장애 진단용 프로브.
제4항에 따른 자폐 스펙트럼 장애 진단용 프로브를 포함하는 마이크로어레이.
서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 자폐 스펙트럼 장애 진단용 키트.
자폐 스펙트럼 장애 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (i) 인체로부터 분리된 혈액으로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 핵산 시료로부터, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계(단, 상기 다형성 부위는 서열번호 2의 DNA 서열의 251번째 염기를 의미한다)를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계가 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 서열로서 다형성 부위를 포함하는 서열(단, 상기 다형성 부위는 서열번호 2의 DNA 서열의 251번째 염기를 의미한다)을 주형으로 하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 다형성 부위의 염기 서열을 분석하는 단계가 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 251번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 251번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 얻어진 혼성화 결과를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 마이크로어레이에 고정되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 DNA 서열의 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 검출하는 방법.
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