KR100861493B1 - 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는마이크로어레이 및 진단키트, 및 그를 이용한 조기폐경진단방법 - Google Patents

단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는마이크로어레이 및 진단키트, 및 그를 이용한 조기폐경진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PTHB1 (parathyroid hormone-responsive B1) 유전자로부터 유래된 단일염기다형(Single-Nucleotide Polymorphism; SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 조기폐경(Premature Ovarian Failure; POF)의 임상적 진단의 표지 인자로서, 사용될 수 있다.
조기폐경 , 단일염기다형, PTHB1

Description

단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 그를 이용한 조기폐경 진단방법{Polynucleotides comprising single nucleotide polymorphism, microarrays and diagnostic kits comprising the same, and methods for diagnosing premature ovarian failure using the same}
도 1은 PTHB1 유전자의 게놈 DNA와 전사되는 엑손들의 위치 및 검색된 각각의 단일염기다형들의 위치를 나타낸다.
도 2는 PTHB1 유전자에서 밝혀진 단일염기다형들 간에 연관비평형블록을 나타내는 도면이다.
도 3은 형성된 연관비평형블록으로부터 형성된 반수체형들을 나타낸다. 반수체형들 간의 연결한 굵은 선은 연결된 반수체형들 사이에 조합하여 나타날 빈도가 크다는 것을 의미한다.
본 발명은 조기폐경과 관련된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오 티드로 이루어진 조기폐경 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 조기폐경 진단용 프로브; 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이; 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 이용한 조기폐경 진단 방법에 관한 것이다.
인간의 게놈은 모두 22쌍의 상동 염색체와 두 개의 성염색체로 이루어져 있다. 그러나 모든 인간이 각기 다른 외모와 성격을 갖는다. 이는 개개인이 같은 수의 염색체를 가지고 있기는 하지만, 그 염색체로부터 발현되는 유전자들에 의한 표현형이 모두 다르기 때문이다. 개개인의 이러한 유전자 발현의 다양성은 곧 유전자를 가지고 있는 게놈의 유전적 다양성 때문이다. 이러한 유전적 다양성은 많은 연구가 수행되어 왔으며, 최근 인간게놈프로젝트의 완성으로 그 구조가 모두 밝혀졌다.
게놈에서의 유전적 다양성을 대표하는 것으로는 Transposable element, STR (short tandem repeats), Microsatellites, STS (sequence tagged site), VNTR (variable number tandem repeat), SNP (single nucleotide polymorphism : 단일염기다형) 등이 알려져 있다. 이중 SNP는 단일염기다형으로서, 인간 게놈 상에서 약 1000개의 뉴클레오티드 중 1개의 빈도로 나타나며 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. 이러한 단일염기다형이 나타내는 유전학에서의 의미는 그 위치에 따라 각 개체에 큰 차이를 가져온다. 예를 들면, 단일염기다형이 단백질을 암호화하고 있는 위치에 존재할 경우, 단백질의 구조에 영향을 미칠 수 있게 되어 단백질 기능이 달라질 수 있게 되며, 질병과도 연관될 수 있다. 다른 예로 단일염기다형이 단백질을 암호화하지 않는 다른 유전자상에서 존재할 경우, 즉 프로모터(promoter) 또는 인트론(intron)에 존재할 경우, 각각에 대하여 단백질의 발현 수준에 차이를 가져와 그 단백질의 전체적인 활성이 줄어들 수 있고, 변성적인 인트론 제거 과정(alternative splicing)을 통하여 단백질이 비정상적으로 발현될 수도 있다.
또 다른 관점에서 단일염기다형들은 제놈 상에서 표지인자로서 사용될 수 있다. 이는 단일염기다형이 유전자에서 일어나는 다른 종류의 다양성들에 대한 정보를 제공해 준다는 것을 의미한다. 예를 들면 연관비평형 분석을 통하여 선택된 단일염기다형들이 연관비평형을 이루고 있다면, 그 단일염기다형들 내에 일어나는 유전자상의 변화들도 같은 연관비평형을 이루고 있기 때문에, 그 단일염기다형의 대립형질을 분석함으로써 유전자 상에서의 돌연변이 유무를 알 수 있게 된다. 따라서 단일염기다형은 유전자 상의 돌연변이와 같은 변화로 어떠한 질병이 나타나게 되었는지를 확인할 수 있는 중요한 단서로서의 의미를 지니게 된다. 이러한 연관비평형은 게놈 DNA에서의 재조합의 중요부분을 예측할 수 있으므로 다음 세대로의 유전 및/또는 유전적 질병에 대하여도 예측할 수 있는 실마리를 제공한다.
이러한 단일염기다형의 발견을 위한 종래 기술로는 제한효소를 이용한 제한 단편화 길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP), 대립형질 특이적 혼성화(Allele-specific hybridization)를 이용한 TaqManTM 프로브 방법, 용융온도(melting temperature; Tm)을 이용한 역동적 대립형질 특이적 혼성화(Dynamic Allele-Specific Hybridization; DASH)방법, 중합반응을 이용한 pyrosequencing등이 있다. 최근, 마이크로어레이 기술은 대립형질 특이적 신장(Allele-Specific Extension)이라는 원리를 이용한 프로브들을 조그만 기판위에 집적화시켜 심은 후, 목적 DNA들과의 혼성화와 신장(Extension)을 시킴으로써 단일염기다형을 발견해 내고 있다.
한편, 여성이 나이가 들면 난소의 기능이 중단되어 에스트로겐의 생성이 줄고, 월경이 멈추는데, 이를 폐경이라 한다. 정상적으로 폐경은 약 45세에서 56세 사이에 일어나지만, 약 1%의 여성에게서 조기 폐경, 즉 조기 난소 부전이 발생한다. 조기폐경은 40세 이전에 폐경이 오는 것을 임상적 기준으로 정하고 있다. 이러한 조기폐경은 여성에게 있어서 생리적인 호르몬의 변화에 따른 여러 가지 증상을 일으키고 있으며, 불임이라는 정신적인 고통 또한 수반한다. 또한 이러한 불임은 질병이라는 개인의 고통을 떠나서 가정의 불화로 이어질 수 있으므로 이는 사회적인 문제이기도 하다. 따라서, 조기폐경 환자에 특이적으로 나타날 수 있는 단일염기다형을 찾아낼 경우, 조기폐경을 진단할 수 있는 표지인자로서 사용될 수 있으며, 이러한 진단이 조기진단으로 발전하면 생식기능이 가능한 나이 이전부터 치료 방법의 개발로 까지 이어질 수 있을 것이다. 뿐만 아니라 조기폐경이 후대에까지 어떻게 영향을 미치는지까지 예측할 수 있을 것이다.
현재, 조기폐경과 관련된 단일염기다형은 여포자극호르몬수용체(Follicle Stimulating Hormone Receptor; FSHR), 인히빈 알파 단위체(Inhibin alpha subunit; INHα)에서 몇 개의 단일염기다형 부위가 확인된 바 있다. 그러나, 이들 대부분은 이미 조기폐경으로 진단된 환자의 유전자형을 확인하는 수준에서 사용되 며, 대조군과의 유의성 있는 차이를 보이지 못하고 있다. 또한 단일염기다형은 인종 특이성(population specificity)을 가지고 있기 때문에 타 인종에서 연구된 결과가 한국인에게 적용되지 않는 경우도 발생한다. 따라서, 한국인 여성에서 조기폐경과 관련된 새로운 단일염기다형 부위를 찾아내는 것이 당업계에 요구된다.
본 발명자들은 여성, 특히 한국인 여성에 있어서 조기폐경에 특이적으로 나타나는 단일염기다형을 찾아내고자 연구를 거듭한 결과, PTHB1 (parathyroid hormone-response B1) 유전자로부터 조기폐경 환자에 특이적으로 나타나는 단일염기다형 부위를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 조기폐경과 관련된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 조기폐경 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 조기폐경 진단용 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 이용한 조기폐경 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티 드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (a); 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (b); 서열번호 4의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 141번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 141번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (c); 서열번호 6의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 501번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (d); 서열번호 7의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (e); 서열번호 8의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (f); 서열번호 9의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 371번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 371번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (g); 서열번호 10의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 857번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 857번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (h); 서열번호 11의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오 티드 (i); 서열번호 12의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 510번째 염기(다형성 부위)가 T이고, 상기 510번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (j); 및 서열번호 15의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단을 위한 증폭용 프라이머가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단용 프로브 및 이를 포함한 마이크로어레이가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 이용한 조기폐경 진단 방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 조기폐경과 관련되는 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명자들은 PTHB1 (parathyroid hormone-response B1) 유전자 상에 존재 하는 23개의 후보 단일염기다형에 대하여 조기폐경과의 연관성을 분석하였다. 도 1은 PTHB1 유전자에 존재하는 단일염기다형들의 위치를 나타낸다. 상기 후보 단일염기다형들은 환자군과 정상인 군을 합친 표본집단에서 통계학적으로 고르게 분포되어 있음을 알 수 있다. 이는 상기 23개의 단일염기다형이 일반적으로 흔하게 나타나는 형태라는 것을 뜻하며, 이는 다시 안정된 형태의 유전적 표지인자(stable genitic marker)로써 사용될 수 있음을 의미한다. 그러나 서열번호 1의 경우는 minor allele frequency (MAF) < 0.1 이므로 단일염기다형성이라고 정의될 수 없어, 표지인자로서 기능할 수 없는 것으로 나타났다.
상기 23개의 후보 단일염기다형들 중, 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 단일염기다형은 환자군과 정상인군에서 통계학적으로 유의성 있는 차이(유의수준 p value < 0.05)를 보이는 단일염기다형으로서, 이들은 PTHB1 (ParaThyroid Hormone-response, B1) 유전자에 존재한다. PTHB1 유전자는 7번 염색체상에 존재하며, 4가지 형태의 전사 다양체(transcription variants)를 갖는 것으로 알려져 있다. 그 중 25개의 엑손으로 이루어진 전사체(transcripts)가 대표적으로 알려져 있다. PTHB1 유전자는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone)에 의해 발현 수준(expression level)이 저해되며, 발현이 되면 구형의 세포내 단백질로써 신호전달자로서의 역할을 수행한다. PTHB1 유전자가 조기폐경과 연관되어진다는 것은 생리학적으로 볼 때, 인간의 내분비계통의 양대 산맥 중 하나인 시상하부-뇌하수체-갑상선 축(H-P-T axis)이 조기폐경과 관련된다는 것을 뜻하게 된다. 따라서 조기폐경과 연관된 PTHB1 유전자의 발견은 내분비계의 두 가지 축 사이의 상호연관성을 의미하게 되며, 이는 매우 놀라운 것이다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 길이는 10 내지 100 뉴클레오티드, 바람직하게는 20 내지 60 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 뉴클레오티드이다.
본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열 (polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위 (polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위 (polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드 중 일부는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드는 조기폐경에 관련된다. 이는 조기폐경 환자와 정상인으로부터 유래한 혈액 시료로부터 얻어진 DNA에서 각 단일염기다형에서 나타나는 대립형질(allele)의 유전자형을 분석한 결과를 통하여 확인할 수 있었다. 본 발명에 있어서, 정상인 및 환자군은 각각 16명씩 참여하였으며 데이터 분석에 활용하였다. 유전자형 분석에 사용된 군집의 크기는 다음 표 1과 같다.
그룹 정상인 환자군 총합계
조사인원 16 16 32
하기 표 2a, 표 2b, 및 표 3은 서열번호 1 내지 23의 DNA 서열의 조기폐경과의 연관성 및 상기 다형성 서열의 특성을 나타낸 것이다.
서열번호 SNPs 유전자형분석방법 대립인자형빈도 유전자형 빈도 χ2 value χ2 p value Exact p value
Major allele Minor allele Major homo Hetero Minor homo
1 rs12536300 InfiniumTM Assay I 0.984(T) 0.016(C) 31 1 0 0.008 1 1
2 rs12671333 InfiniumTM Assay I 0.594(G) 0.406(T) 11 16 5 0.042 0.837 1
3 rs4723263 InfiniumTM Assay I 0.641(C) 0.359(G) 12 17 3 0.757 0.465 0.699
4 rs1009355 InfiniumTM Assay I 0.719(G) 0.281(A) 16 14 2 0.216 1 1
5 rs10486519 InfiniumTM Assay I 0.766(A) 0.234(T) 18 13 1 0.557 0.646 0.652
6 rs1592465 InfiniumTM Assay I 0.672(C) 0.328(A) 15 13 4 0.198 0.703 0.693
7 rs3884597 InfiniumTM Assay I 0.594(G) 0.406(T) 11 16 5 0.042 0.837 1
8 rs4604335 InfiniumTM Assay I 0.516(A) 0.484(G) 9 15 8 0.121 0.728 0.731
9 rs6944723 InfiniumTM Assay I 0.516(A) 0.484(T) 9 15 8 0.121 0.728 0.731
10 rs6462477 InfiniumTM Assay I 0.688(A) 0.321(G) 14 16 2 0.857 0.44 0.679
11 rs10225698 InfiniumTM Assay I 0.688(G) 0.321(C) 14 16 2 0.857 0.44 0.679
12 rs2041417 InfiniumTM Assay I 0.562(T) 0.438(C) 9 18 5 0.653 0.42 0.718
서열번호 SNPs 유전자형분석방법 대립인자형빈도 유전자형 빈도 χ2 value χ2 p value Exact p value
Major allele Minor allele Major homo Hetero Minor homo
13 rs1986867 InfiniumTM Assay I 0.766(C) 0.234(T) 20 9 3 1.498 0.327 0.313
14 rs11762294 InfiniumTM Assay I 0.812(A) 0.188(T) 20 12 0 1.704 0.565 0.557
15 rs6462484 InfiniumTM Assay I 0.609(A) 0.391(G) 11 17 4 0.43 0.713 0.714
16 rs1882039 InfiniumTM Assay I 0.609(T) 0.391(C) 11 17 4 0.43 0.713 0.714
17 rs6971448 InfiniumTM Assay I 0.719(G) 0.281(C) 16 14 2 0.216 1 1
18 rs1050719 InfiniumTM Assay I 0.656(C) 0.344(T) 11 20 1 4.75 0.05 0.051
19 rs1050721 InfiniumTM Assay I 0.797(T) 0.203(C) 19 13 0 2.079 0.297 0.301
20 rs2392252 InfiniumTM Assay I 0.781(T) 0.219(C) 19 12 1 0.302 1 1
21 rs4723317 InfiniumTM Assay I 0.594(C) 0.406(T) 11 16 5 0.042 0.837 1
22 rs921413 InfiniumTM Assay I 0.734(A) 0.266(G) 16 15 1 1.299 0.386 0.392
23 rs7811261 InfiniumTM Assay I 0.609(C) 0.391(G) 12 15 5 0.008 1 1
표 2a 및 2b는 조기폐경 환자군과 정상인군 모두에서 관찰된 각 단일염기다형들의 유전적 표지인자로서의 기능과 이들로 이루어지는 유전자형의 분포가 일반적인 것들인지를 나타내주고 있다. 여기서 일반적이란 환자군과 정상인군에서 고르게 분포되어져 있음을 말한다. 대립인자형빈도 항목에서 굵게 표시된 대립인자들은 연관성 분석에서 위험인자(risk allele)로 분석된 것들이다. 표 2와 같은 분석을 하아디-와인버그 평형(Hardy-Weinburg Equilibrium) 검정이라고 한다. 이를 바탕으로 표 3에서 조기폐경 환자군과 그에 대한 정상인군으로 나누어 다시 분석 후, 환자군 특이적인 대립인자와 유전자형을 찾아냈다. 이를 연관성분석(association study)라고 한다. 이렇게 찾아진 것들은 한국인에게서 일반적으로 나타나는 것이며, 그 중에서 특히 조기폐경 환자군에 특이적인 대립인자와 유전자형을 갖는다는 의미를 얻게 되어 유전적 표지인자로서의 기능을 갖추게 된다.
표 2a 및 2b 에 있어서, 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다.
ㆍ 서열번호는 각각의 단일염기다형을 나타내는 번호이다.
ㆍ SNP는 단일염기다형을 나타내는 것으로, 여기서 rs란 reference sequence의 약자이며, 뒤의 숫자는 dbSNP라는 데이터베이스에서 제공하는 각각의 단일염기다형을 구분 짓는 고유 숫자(accession number)이다.
ㆍ분석방법은 Illumina사의 InfiniumTM Assay 방법을 사용하였으며, 환자군(case)와 정상인군(control)을 각각 16씩, 합계 32명의 지원자의 동의서를 받아 수행되어졌다.
ㆍ 대립인자형 빈도(allele frequency) 란에서는 각각의 단일염기다형을 구성하는 두 개의 뉴클레오티드 염기를 표시하며, 실험된 집단 내에서 관찰되는 각각의 대립인자들의 빈도를 나타낸다. 여기서 대립인자란 단일염기다형 부위에 실제로 존재하고 있는 뉴클레오티드의 염기서열을 뜻하며, 하나의 단일염기다형은 그 특성상 두 개의 대립인자를 가질 수 있다. 이들 대립인자 빈도의 고저에 따라 큰 대립인자(Major allele)와 작은 대립인자(Minor allele)로 나뉜다. 특히 작은 대립인자의 빈도(Minor allele frequency; MAF)는 0.1을 기준으로 하여 단일염기다형과 단일염기변이(point mutation)을 나누는 유전학적 기준으로 사용된다. 이러한 기준은 다형성 자체의 안정성을 뜻하기 때문에(즉, 단일염기다형이 일어나는 부위는 일정하다라는 뜻), 유전적 표지인자로서의 사용 가능성을 대변한다.
ㆍ 유전자형 빈도(genotype frequency) 란은 단일염기다형을 형성하는 각각의 대립인자들로 이루어지며, 단일염기다형 부위가 존재하는 유전자 좌(locus)에 어떠한 대립인자들이 있는지를 나타낸다. 여기서 큰 대립인자들로만 구성되어 있는 유전자형을 큰 동형유전자형(Major homotype), 큰 대립인자와 작은 대립인자로 이루어진 유전자형을 이형유전자형(Heterotype), 그리고 작은 대립인자들로만 이루어진 유전자형을 작은 동형유전자형(Minor homotype)이라고 한다. 숫자들은 각각의 유전자형에 해당하는 사람들의 수를 나타낸다. 이를 관측치라고 할 수 있다.
ㆍ χ2 value는 각각의 단일염기다형을 이루는 대립인자들의 빈도로 계산되어진 유전자형의 빈도와 실제 관측된 유전자형의 수의 차이를 계산한 값이다. 이는 관측된 대립인자형빈도에 의해 이론적으로 분포될 유전자형빈도와 실제 유전자형빈도와의 차이를 나타내는 것이므로, 이 두 값들의 차이가 유의성 있는 차이가 없다는 것은 관찰되는 대립인자들이 통계적으로 각각의 유전자형으로 고르게 분포되어져 있다는 것을 의미한다. 여기서 유의성 있는 차이가 있다라고 판단하는 경우는 χ2 value가 3.85 이상인 경우를 뜻하며, 이는 곧 χ2 p value가 0.05 이하임을 뜻한다. 이러한 것을 유전학적 생물학적 관점에서 분석하여, 본 발명자들은 χ2 value가 3.85 이하인 값을 갖는 단일염기다형들을 선택하여 환자군-정상인군 간의 질병과의 연관성 분석을 하였다. 여기서 사용한 χ2 test는 통계적으로 이산확률분포에 속하는 변량들을 계산할 때 사용하며, 단일염기다형 분석에 있어서 각 빈도들은 이산확률분포에 속하는 변량들이다.
ㆍ χ2 p value는 χ2 value로 얻어진 값들에 대한 누적밀도함수 값이다. χ2 p value < 0.05 라는 것은 어떤 단일염기다형을 구성하는 두 개의 대립인자로 이루어지는 유전자형들의 관찰값이 두 개의 대립인자 빈도로부터 얻어지는 기대값과 유의성 있는 차이를 나타내고 있음을 뜻한다. 이는 모집단에서 관찰된 그 단일염기다형이 일반적으로 나타난다고 말할 수 없음을 뜻하며, 이는 그 단일염기다형이 유전적 표지인자로서의 기능을 상실하고 있음을 뜻한다.
ㆍ Exact p value는 Fisher's Exact test를 통하여 산출된 p value를 말한다. 이 통계방식은 기대빈도가 5 이하의 값을 나타낼 때, 사용되는 매우 적절한 통계 방식이다. 위의 표 2a 및 2b의 자료를 분석할 때 기대빈도가 5 이하로 나오는 값들이 있으므로 Exact p value가 통계적으로 χ2 p value보다 더 정확한 확률값을 나타낸다. 여기서 기대빈도란 대립인자 빈도로 계산되는 유전자형 빈도의 값이 5 이하인 것들을 말한다.
표 2a 및 표 2b의 분석을 토대로 조기폐경 연관성 분석을 하였다. 이를 표 3에 나타내었다. 조기폐경 연관성 분석을 통하여 조기폐경이라는 질병에 영향을 미칠 수 있는 단일염기다형들과 그 들의 유전자형을 알아볼 수 있다.
Figure 112007018428116-pat00001
표 3은 하나의 단일염기다형을 이루는 두 개의 대립인자와 이로 인하여 형성되는 3가지 형태의 유전자형에 대한 환자-정상인군 간의 빈도차이를 비교하여 어떠한 대립인자가 또는 어떠한 유전자형이 질병과 연관되어 있는지를 분석한 결과이다. 이러한 연관성 분석은 대립인자형(allele model), 공동-우성 유전자형(Co-dominant model), 우성 유전자형(Dominant model), 그리고 열성 유전자형(Recessive model)이라는 네 가지 항목에서 실시하였다. 표 3에 있어서 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다.
ㆍ서열번호는 각각의 단일염기다형을 나타내는 번호이다.
ㆍSNPs란은 연구되어진 각 단일염기다형들의 고유 숫자들을 나타내고 있다. 이 숫자들은 NCBI dbSNP에서 사용되는 것들이다.
ㆍ대립인자형에 대한 연관성 분석에서 OR (odds ratio) (95% CI) 항목은 오즈비와 그에 대한 95% 신뢰구간(confidence interval; CI)를 나타낸다. 이들 데이터에 대한 해석은 다음과 같다. 하나의 단일염기다형을 이루는 두 대립인자들 중 어떤 대립인자를 갖느냐 따라서 질병에 걸릴 비율이 몇(오즈비) 배 높다는 것을 나타낸다. 95% 신뢰구간은 이러한 주장에 대한 95%의 신뢰도를 나타낸다.
ㆍ대립인자형에 대한 연관성 분석에서 Logit_p value는 오즈비에 대한 통계적 유의성을 나타낸다. 이는 오즈비 만큼 정상인군과 환자군 간에 차이에 대한 유의성을 뜻한다. 오즈비가 1 이상이 나타날 때, 두 대립인자 중 환자군에서 그 빈도가 놓은 대립인자를 위험인자(risk allele)이라고 한다. 여기서 유의성 있는 차이가 있다고 판단하는 기준은 Logit_p value가 0.05 이하의 값을 나타낼 경우이다. 이러한 값은 로지스틱 회귀(logistic regression) 분석을 통하여 얻었다.
ㆍ대립인자형에 대한 연관성 분석에서 Exact p value 또한 Logit_p value 처럼 정상인군과 환자군 간의 차이에 대한 유의성을 뜻한다. 이 역시 p value의 값이 0.05 이하일 때, 유의성 있는 차이를 인정한다. Exact p value는 피셔의 정밀 검정(Fisher's exact test) 통계 방식을 사용하여 얻어진 값인데, 이는 환자군과 정상인군의 비교시 필요되는 기대빈도가 5 이하의 수가 있을 때, 정밀한 검정을 하기 위해 개발된 통계기법이다. 따라서 표 3에서 보여주는 데이터에는 매우 적합한 검정법이라 할 수 있다.
ㆍ대립인자형에 대한 분석에서 permutation p value는 중다비교(multiple comparison)을 통하여 나온 p value로써 환자군-정상인군 간의 대리인자들의 출현빈도의 유의성있는 차이가 우연 또는 기회에 의한 것인지를 알아보고자 하는 정밀한 분석기법이다. Permutation p value의 값이 0.05 이하 일 때, 그 단일염기다형을 이루는 대립인자들의 출현빈도가 환자군-정상인군 사이에서의 유의성이 더 많은 표본에서도 변함이 없을 것임을 예측할 수 있다. 따라서 permutation p value의 값은 예측 값이기 때문에, 집단내의 관찰 값의 실제적인 데이터라고는 할 수 없다.
ㆍ공동-우성 유전자형에 대한 연관성 분석에서 각 3개의 항목이 뜻하는 바는 대립인자형에서와 같다. 그러나 공동-우성 유전자형에서 환자군과 정상인군 사이에 비교되어지는 유전자형은 AA : AB : BB로 구분된다.
ㆍ우성 유전자형에 대한 연관성 분석에서 각 3개의 항목이 뜻하는 바는 대립인자형에서와 같다. 그러나 우성 유전자형에서 환자군과 정상인군 사이에 비교되는 유전자형은 대립인자형에 대한 연관성 분석에서 질병에 대한 위험인자(risk allele)로 결정되어진 대립인자를 위주로 나누어진다. 위험인자를 B라 하면, BB+AB : BB로 구분된다.
ㆍ열성 유전자형에 대한 연관성 분석에서 각 3개의 항목이 뜻하는 바는 대립인자형에서와 같다. 그러나 열성 유전자형에서 환자군과 정상인군 사이에 비교되는 유전자형은 위험인자(B)를 기준으로 하여, BB : AB+AA로 구분된다.
표 2a, 표 2b, 및 표 3 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 내지 23의 단일염기다형들 중 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15는 환자군-정상인군 사이에서 대립인자의 출현빈도에 유의성 있는 차이를 나타내고 있다. 즉 서열번호 2의 경우는 G, 서열번호 3은 C, 서열번호 4는 G, 서열번호 6은 C, 서열번호 7은 G, 서열번호 8은 A, 서열번호 9는 A, 서열번호 10은 A, 서열번호 11은 G, 서열번호 12는 T, 서열번호 15는 G가 각각 정상인군에 비해 환자군에서 유의성 있게 높은 출현빈도로 나타났다. 즉, 이들은 각 서열번호가 지시하는 단일염기다형 부위에서 위험인자로서 해석될 수 있다. 따라서 본 발병에 있어서 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 단일염기다형은 조기폐경과 관련되는 진단 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 구체적으로는 조기폐경의 진단을 위한 프라이머 또는 프로브로의 목표 부위(target site)로써 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 다형성 부위를 포함한 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 DNA서열로부터 유래한 10개 이상의 연속적 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드와 혼성화하는 조기폐경 진단용 대립인자 특이적 폴리뉴클레오티드(allele-specific oligonucleotide)를 포함한다. 상기 대립인자 특이적 폴리뉴클레오티드란 각 대립인자에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 여기서 혼성화란, 상기 단일염기다형이 나타내는 대립인자 중 하나에 특이적으로 결합하는 것을 말하며, 이러한 과정은 RA1 solution (Illumina's InfiniumTM Assay kit) 하에서 48℃에서 수행되어 질 수 있다.
본 발명은 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단을 위한 증폭용 대립형질 특이적 프라이머를 포함한다. 여기서 "프라이머(primer)"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트(ATP,GTP,CTP,TTP) 및 DNA 폴리머라제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 100, 바람직하게는 10 내지 80 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 3'-말단이 서열번호 1 내지 23의 단일염기다형과 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 DNA에서 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 증폭된 산물만을 특이적으로 염색하여 시각화한다. 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 여기서 사용되는 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드들이 다른 변성화 과정을 거치게 되면, InfiniumTM Assay I 뿐만 아니라 다른 방법들에 의해서도 사용될 수 있다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단용 프로브 및 이를 포함하는 조기폐경 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조기폐경 진단용 키트를 포함한다.
본 발명은 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드 중의 하나 이상의 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계 (단, 상기 다형성 부위는 상기에서 정의한 바와 같다)를 포함하는 조기폐경 진단 방법을 포함한다.
여기에서, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계는 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계 및 얻어진 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 또 다른 구체예에는, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정한 결과, 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 15의 다형성 부위의 염기가 각각 G, C, G, C, G, A, A, A, G, T, 및 G (위험 대립인자)인 것이 하나 이상 존재하는 경우, 조기폐경에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 위험 대립 인자를 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 위험군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명은 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 DNA 서열을 포함하는 PTHB1 (ParaThyroid Hormone-response B1) 유전자에 있어서 반수체형(haplotype)의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 조기폐경 유무의 진단 방법을 포함한다.
즉, 본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 분석하여 얻어진 반수체형 ht-2 (서열번호 3 및 4의 DNA 서열의 다형성 부위로 이루어짐) 및 반수체형 ht-5 (서열번호 7 내지 11의 DNA 서열의 다형성 부위로 이루어짐)가 각각 GA 및 TGTGC인 경우, 정상인으로 판정하는 단계를 포함하는 조기폐경 유무의 진단 방법이 제공된다. 또한, 상기 방법에서, 서열번호 7 내지 9의 DNA 서열의 다형성 부위가 표지 단일염기다형(Tagging SNP)으로서 각각 T, G, T인 경우, 정상인으로 판정할 수도 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 분석하여 얻어진 반수체형 ht-1 (서열번호 3 및 4의 DNA 서열의 다형성 부위로 이루어짐) 및 반수체형 ht-4 (서열번호 7 내지 11의 DNA 서열의 다형성 부위로 이루어짐)이 각각 CG 및 GAAAG인 경우, 조기폐경에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단 방법이 제공된다. 또한, 상기 방법에서, 서열번호 7 내지 9의 DNA 서열의 다형성 부위가 표지 단일염기다형(Tagging SNP)으로서 각각 G, A, A인 경우, 조기폐경에 걸릴 확률이 높은 위험군으로 판정할 수도 있다.
본 발명은 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 DNA 서열을 포함하는 PTHB1 (ParaThyroid Hormone-response B1) 유전자에 있어서 유전자형(genotype) 분석을 포함하는 조기폐경 유무의 진단 방법을 포함한다. 이는 표3의 각 단일염기다형에 대한 유전자형 분석에 의해서 얻어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 3, 및 6 내지 12의 DNA 서열의 다형성 부위의 유전자형(genotype)이 각각 GG, AA, TT, GG, TT, GG, CC, 및 CC인 경우, 정상인으로 판정하는 단계를 포함하는 조기폐경 유부의 진단 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 3, 및 6 내지 12의 DNA 서열의 다형성 부위의 유전자형(genotype)이 각각 CC, GG, GG, AA, AA, AA, GG, 및 TT인 경우, 조기폐경에 걸릴 확률이 높은 위험군으로 판정하는 단계를 포함하는 조기폐경 유무의 진단 방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 환자군(Subjects)
본 실험은 한국 차 병원으로부터 임상적으로 조기폐경으로 진단받은 16명의 환자들과 그에 상응하는 16명의 정상인들부터 동의를 받아서 수행되었고, 이들은 모두 46, XX인 핵형(karyotype)을 가지고 있다. 정상인들은 모두 자녀가 있는 사람들 중에서 선발하였다. 조기폐경의 임상적 진단 기준은 혈중 여포자극호르몬 수준(FSH level)이 40mIU/mL 이상으로 정하였다. 그리고 신장(cm), 체중(Kg), 체질량지수(BMI(Kg/m2)), 황체형성호르몬(LH(mIU/mL)), 에스트라디올(E2(pg/mL)), 프로락틴(PRL(ng/mL)), 남성호르몬(testosterone(ng/mL)), 갑상선자극호르몬(TSH(mIU/mL)) 등을 조사하였다. 16명의 조기폐경 환자 집단에서 5명은 체외수정(Invitro Fertilization; IVF) 시술을 받은 적이 있었고, 그 중 1명은 체외수정 시술에 실패하였다. 또한 가족력 조사에서 어머니나 형제들 중 무월경(amenorrhea)을 나타내는 환자가 2명이 있었다.
2. 게놈 DNA의 준비
게놈 DNA(genomic DNA; gDNA)를 준비하기 위하여 16명의 조기폐경 환자와 16명의 정상인 여성으로부터 혈액을 채취하였다. 전체 정맥혈의 5ml은 각 지원자들의 전주정맥으로부터 얻었고 15% EDTA가 들어있는 Vacutainer tube로 옮겨졌다. 게놈 DNA를 추출하기 위하여, 혈액을 원심분리 실험관으로 옮기고 낮은 농도의 염 성분 완충용액(low-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl2, and 2mM EDTA))을 5ml 첨가 하였다. 그리고 Nonidet P-40을 첨가하였다. 얻어진 용액을 잘 섞어준 후, 상온에서 10분간 2,200 rpm으로 원심분리 하였다. 이 때 얻어진 덩어리는 고농도의 염 성분 완충용액(high-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl2, 0.4M NaCl, and 2mM EDTA))으로 재현탁 하였다. 이 게놈 DNA는 50ul의 10% SDS와 섞은 후, 55℃에서 밤새 반응시켰다.
반응 후에, 각 게놈 DNA들은 1.5ml 용량의 원심분리 실험관으로 옮겨, 6M NaCl을 0.3ml 첨가하였다. 게놈 DNA들을 잘 섞어준 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 게놈 DNA가 들어있는 상층을 모아서 새로운 시험관으로 옮기고, 상온에서 동량의 100% 에탄올을 첨가하였다. 게놈 DNA들이 침전될 때까지 잘 섞어 주고, 침전이 되면 70% 에탄올로 게놈 DNA들을 세척하였다. 이 과정이 끝나면 실험관 뚜껑을 열어, 용액성분이 마르도록 놓아둔다. 그리고 TE 완충용액(pH 8.0)을 넣어 게놈 DNA를 재현탁 하였다.
준비된 게놈 DNA는 InfiniumTM Assay를 위해 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA reagent (Molecular Probes, Invitrogen)을 사용하여 750ng/15uL의 농도로 조정하였다.
3. 전체 게놈의 유전자형 분석 - InfiniumTM Assay
Infinium TM Assay 에 대한 설명 InfiniumTM Assay는 SentrixR BeadChip (Illumina)을 이용한 마이크로어레이로서 각 단일염기다형에 대한 대립형질(allele A and allele B)를 구별할 수 있는 프로브들이 하나의 bead에 심어져 있다. 이들 프로브들은 약 75개의 뉴클레오티드로 이루어져 있으며, 그 중 5' 쪽의 25개의 뉴클레오티드들은 각각의 단일염기다형들을 구분할 수 있도록 되었으며, 나머지 50개의 뉴클레오티드들은 각 단일염기다형에 대한 대립형질들을 구분할 수 있도록 만들어져 있다.
전체 게놈의 증폭( Whole - genome amplification ( WGA )) 게놈 DNA (750ng/15uL)를 상온(22℃)에서 녹인 후, 0.8mL micotiter plate의 각 well에 옮겼다. 0.1N NaOH를 15uL 첨가하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 270uL의 MP1 용액과 300uL의 AMM 용액을 차례로 첨가한 후, 뒤집어가며 잘 섞어준다. 280g에서 원심분리하여 37℃ 오븐에서 20시간 동안 반응시켰다.
증폭된 게놈 DNA 의 단편화와 정제 전체 게놈 DNA 증폭 단계가 끝나면 50g에서 1분간 원심분리 한 후, 150uL 씩 3개의 여분의 well로 옮겼다. 결과적으로 4개의 well이 같은 게놈 DNA가 된다. 각 well에 FRG 용액을 50uL 첨가한 후, 1600rpm으로 1분 동안 와동(vortex)하였다. 상온에서 50g로 원심분리한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 게놈 DNA을 50g에서 원심분리 하고, PA-1 용액을 100uL 첨가하고 1600rpm으로 와동하여, 상온에서 50g로 원심분리 한 후, 37℃에서 5분 동안 방치하였다. 상온에서 50g로 1분 동안 원심분리하고, 100% 아이소프로판올을 300uL 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 4℃에서 3000g로 20분 동안 원심분리하고 게놈 DNA 덩어리를 확인한 다음, microtiter plate를 뒤집어 상층을 제거하였다. 상온에서 1시간 동안 게놈 DNA를 말린 다음, RA1 용액을 42uL 넣고, 48℃ 오븐에서 1시간 동안 반응시켰다.
Sentrix R BeadChip 의 준비와 활성화 증폭된 게놈 DNA를 RA1 용액에서 재현탁하는 동안, (SentrixR) BeadChip을 준비하였다. BeadChip을 꺼내어 100% 에탄올에서 20번 정도 위 아래로 흔들어 주고 5분과 10분의 반응 시간간격을 두고 흔들어 주었다. 100% 에탄올에서의 반응이 끝나면, BeadChip을 PB1 용액으로 옮겨 흔들어 주고, 100% 에탄올에서와 같은 방법으로 2.5분, 5분의 시간 간격을 두고 흔들어 주었다. 상온에서 280g로 1분 동안 원심분리를 한 후, 추천된 순서(Illumina사로부터)에 따라 조립하여 BeadChip Chamber (called Flow through chamber)를 제조하였다. 100% 포름아마이드 150uL를 BeadChip Chamber에 통과시키고, RA1 용액 150uL를 두 번 반복하여 통과시켰다. 게놈 DNA를 첨가하기 전까지 BeadChip Chamber를 PB2 용액이 든 혼성화 챔버(Hybridization chamber)에 넣어 두었다.
혼성화 증폭된 게놈 DNA의 재현탁 (48℃, 1시간 반응)이 끝나면, 1800rpm으로 1분 동안 와동하고 280g에서 원심분리한 다음, 95℃ heat block에서 20분 동안 증폭된 게놈 DNA를 변성화 한 후, 280g로 원심분리하였다. 4개의 well로 나누어진 게놈 DNA를 하나의 well로 모으고, 280g로 원심분리하였다. 혼성화 챔버(Hybridization Chamber)로부터 BeadChip Chamber를 꺼내어 게놈 DNA를 넣어준 다음, BeadChip Chamber를 다시 혼성화 챔버(Hybridization Chamber)에 넣고, 48℃에서 18시간 동안 적정속도로 흔들어가면 반응시킨다.
대립형질 특이적 프라이머 신장( Allele - Specific Primer Extension ; ASPE )에 의한 염색 18시간의 혼성화가 끝나면, BeadChip chamber를 꺼내어 450uL의 RA1 용액을 4차례 흘려 보냈다. XB1 용액 450uL와 XB2 용액 450uL, EMM 용액 200uL에 차례로 각각 10분, 5분, 15분 동안 반응시키고, 450uL의 95% 포름아마이드/1mM EDTA를 흘려 보냈다. 450uL의 XB3 용액을 흘려보내고, Illuminas's 프로토콜에 따라 LMM과 ASM 용액으로 게놈 DNA을 염색하였다. BeadChip chamber를 분해하여 BeadChip을 PB1 용액으로 씻어준 다음, 280g에서 1분 동안 원심분리하여 말린 후, Illumina BeadArray reader을 사용하여 스캔함으로써 각 BeadChip에 대한 이미지 파일을 저장하였다.
유전자형 분석 이미지 파일로부터 유전자형의 분석은 Illuminas GenCall software (version 6.2.0.4)를 사용하여 각 단일염기다형에 대한 유전자형를 정하였다. GenCall은 두 개의 대립인자를 인식하는 프로브들 사이의 발색의 세기에 대한 비율을 가지고 전형적인 유전자형의 패턴을 나타나며, GenCall score로 기록된다.
4. 통계학적 분석
단일염기다형들을 구성하는 대립인자들에 대한 집단내의 유전학적 분포여부에 대하여 하아디-와인버그 평형 검정을 하였다. 이는 HapAnalyzer (ver. 1.0.1)라는 프로그램을 사용하여 시행하였다. 여기에서 단일염기다형의 기준이되는 HWE p value > 0.05와 작은 대립인자 빈도(Minor Allele Frequency; MAF) > 0.1의 기준을 적용하였으며, 이에 해당하지 않는 대립인자를 가진 단일염기다형들을 모두 제거하였다. 환자군과 정상인군 간의 출현빈도를 이용하여 질병에 대한 각 단일염기다형들의 연관성 분석은 유의수준을 < 0.05로 정하였으며, SNPAlyze (ver. 5.1)와 SPSS (ver. 14.0)를 사용하여 분석하였다. 연관성 분석은 대립인자들 간의 환자군과 정상인군에서의 출현빈도로 나누어 유의성 있는 차이를 비교하였으며, 유의수준을 < 0.05로 하였다. 이때, 오즈비(위험도; odds ratio; OR)가 1 이상의 결과 값을 나타내는 대립인자를 위험인자로 정하였으며, 이 오즈비에 대한 95% 신뢰구간(confidence interval; CI)도 측정되었다. 위험인자를 기준으로 공동-우성 유전자형, 우성 유전자형, 열성 유전자형을 정하여 환자군과 정상인군에서의 출현빈도를 비교 분석하였다. 유전자형 연관성분석에서도 출현빈도의 유의수준을 < 0.05로 하였으며, 일차적으로 logit p value < 0.05를 확인 한 후, 기대빈도수가 5 이하로 나타나는 단일염기다형들을 재확인하기 위하여 피셔의 정밀 검정(Fisher's exact test)도 시행하였으며, 이 역시 유의수준을 exact p value < 0.05로 정하였다.
단일염기다형들 간의 연관비평형 검정을 하였다. 이는 Haploview (ver. 5.0)을 사용하였다. 환자군과 정상인군 모두에서 형성되는 각 단일염기다형들간의 상호연관성에 대한 분석에서 형성된 연관비평형 블록으로부터 반수체형이 형성되었으며, 이들을 환자군과 정상인군으로 나누어 환자군 특이적인 반수체형을 분석하였다.
5. 단일염기다형의 분석에 대한 관찰
각 단일염기다형의 결과로부터 특정 단일염기다형들은 서로 밀접한 연관성을 지니고 하나의 블록단위를 형성하는 것을 알 수 있고, 이러한 블록단위를 연관비평형 블록이라 부르는데, 블록을 형성하는 단일염기다형들은 감수분열 동안 일어나는 염색체 교차(crossing over)에서 같이 움직이는 것을 예상할 수가 있다. 또한 관찰된 유전자형을 분석함으로써 연관비평형 블록의 반수체형을 알아낼 수가 있다[도 2; 표 4a (Block 1) 및 4b (Block 2)].
r2
D' value SNPs rs4723263 rs1009355
rs4723263 - 0.698
rs1009355 1 -
r2
D' value SNPs rs3884597 rs4604335 rs6944723 rs6462477 rs10225698
rs3884597 - 0.728 0.728 0.664 0.664
rs4604335 1 - 1 0.484 0.484
rs6944723 1 1 - 0.484 0.484
rs6462477 1 1 1 - 1
rs10225698 1 1 1 1 -
표 4a 및 표 4b는 각각 도 2에 나타난 각 단일염기다형들 사이의 연관비평형 블록의 조밀함을 수치화하여 나타낸 것으로 D' 값과 r2값을 나타내고 있다. 이 D' 값이 0.8 이상이 될 때, 각 단일염기다형들은 연관비평형 관계에 있다고 판단하며, 도 2에서 보듯이 붉은 색으로 표시된다. 이러한 D' 값의 범위는 0 ∼ 1까지이며, 각 단일염기다형들 사이의 게놈 DNA 상에서의 떨어져 있는 거리에 대한 계산이 포함되어 있다. 또한 r2 값은 각 단일염기다형들 간의 상관관계를 나타내는 것으로 r2 값이 0.3 이상이면 그 값에 해당하는 단일염기다형들이 매우 조밀하게 묶여있다는 것을 뜻한다. 이는 앞서 언급한 도 2과 표 4a, 표 4b에서 뜻하는 바는 상기 2개(block 1), 5개(block 2)의 단일염기다형들이 서로 밀접하게 연관되어 있어 유전적 단위체를 형성한다는 것이다. 또한 이렇게 형성된 단위체들은 다음 세대로 유전될 때, 같이 묶여서 전달되게 된다. 따라서 연관비평형 블록들이 환자군 특이적으로 나타나 질병을 일으키는데, 많은 영향을 미칠 경우, 그 블록 자체가 다음 세대로 전달되기 때문에, 다음 세대의 자손에 대한 질병이 일어날 수 있는 빈도를 예측할 수 있다.
연관비평형 블록들로부터 형성되는 유전적 단위체는 각 단일염기다형의 대립인자형 분석으로부터 그 유형이 결정되는데, 이를 반수체형(haplotype)이라고 한다 (도 3).
도 3은 도 2로부터 형성된 연관비평형 블록으로부터 유전자형의 분석결과와 대비하여 형성된 반수체형이다. 도 2에서 나타난 두 개의 연관비평형 블록 중 block 1으로부터 3개, block 2로부터 4개의 반수체형이 나타나며, 각각의 블록에서 환자군에서 특이적으로 많이 나타나는 반수체형과 정상인군에서 특이적으로 많이 나타나는 반수체형이 관찰 되었다(표 5). 반수체형은 다음 세대로 유전되기 때문에, 이러한 반수체형이 질병과 연관되는지를 분석할 필요가 있다. 총체적으로 연관비평형블록과 반수체형에 대한 질병관련 분석은 지금 세대에서의 질병의 진단 뿐 만아니라, 그 질병의 다음 세대로의 전달까지 예측할 수 있게 한다. 표 5는 도 3의 반수체형들의 빈도수가 환자군과 정상인군 사이에서 나타나는 빈도에 유의성 있는 차이를 조사한 결과이다.
Blocks 서열번호 Haplotype Frequency Case, control ratios Chi square p value
Block 1 ht-1 CG 0.641 0.781 : 0.500 5.497 0.019
ht-2 GA 0.281 0.156 : 0.406 4.947 0.026
ht-3 GG 0.078 0.062 : 0.094 0.217 0.641
Block 2 ht-4 GAAAG 0.516 0.719 : 0.312 10.573 0.001
ht-5 TGTGC 0.312 0.156 : 0.469 7.273 0.007
ht-6 TGTAG 0.094 0.063 : 0.125 0.736 0.391
ht-7 GGTAG 0.078 0.063 : 0.094 0.217 0.641
Block 1에서는 환자군과 정상인군 사이에 유의성 있는 차이를 나타내는 두 개의 반수체형이 관찰되어 졌다. 반수체형 ht-1은 CG로 나타나며 이는 환자군에 특이적으로 높은 빈도로 나타난다. 반면 반수체형 ht-2는 GA로 나타나며 이는 정상인군에 특이적으로 높은 빈도로 나타난다. Block 2에서는 환자군과 정상인군 사이에 유의성 있는 차이를 나타내는 두 개의 반수체형이 관찰되었다. 반수체형 ht-4는 GAAAG로 나타나며, 이는 환자군에 특이적으로 높은 빈도로 나타난다. 반면 반수체형 ht-5는 TGTGC로 나타나며, 이는 정상인군에 특이적으로 높은 빈도로 나타난다. 결론적으로 반수체형 ht-1과 ht-4는 환자군에서 특이적으로 나타나는 반수체형으로 이러한 반수체형을 가지고 있는 사람은 조기폐경이라는 질병에 감수성(susceptibility)을 가진다고 예측할 수 있다. 반대로 ht-2와 ht-5는 정상인군에서 특이적으로 나타나는 반수체형으로, 이 반수체형을 가진 사람들은 비교적 조기폐경과 무관하다고 할 수 있다.
상기와 같은 분석의 결과 볼 때, 각 대립인자는 각 개체에 있어서 동형접합자 (homozygote) 또는 이형접합자 (heterozygote)의 형태로 존재할 수 있다. 멘델의 유전법칙과 하디-와인버그 (Hardy-Weinberg) 법칙에 의하면, 집단을 구성하는 대립인자의 조성은 일정한 빈도로 유지되며, 통계적으로 유의한 경우 생물학적 기능상의 의미를 부여할 수 있다. 본 발명의 단일염기다형은 조기폐경 환자에게서 통계적으로 유의한 수준으로 출현되어, 더불어 이들 단일염기다형으로부터 유전적 단위까지 조기폐경의 진단과 더 나아가 예측에까지 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드는 조기폐경의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 또는 프로브, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드 키트는 조기폐경의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 진단 방법은 조기폐경을 효과적으로 진단 및 예측할 수 있다.
<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> Polynucleotides comprising single nucleotide polymorphism, microarrays and diagnostic kits comprising the same, and methods for diagnosing premature ovarian failure using the same <130> PN0099 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ttcaaagaag actatccatg aattaaatat attttctgga tattgtcacc taggggtttc 60 tcacgtatgg aatgcttttt atgtggaaac tgtacattta agatataata atttagggcc 120 ttttaatagt aatagactta agatgcctga cattatcaga agcttaaaaa caaagagata 180 agcttttgaa aataaccaaa taaagaaata aataagaagt atctacttat ttaaagttat 240 ataagtgtcc atttataatt agatgaagta gcagataacc attacttttt ggttcatagc 300 yttgaggttt taaaatgaat agttatttgg ggtagagatg ccctatcgtt tcttgaaaga 360 agtcagttca acccacaaag taagtcttcc ccctacaaga gctttgtttc aaagtacttt 420 attcttaaat ctaatttatt ttagaaaact gtttattagt ttgaactttg ggtaatatgt 480 ctgcttttta tttactgatg atattgctga tcctcttatt ttcatacaca aactttctta 540 aaattaagct tgtatttctt catcatttag aagtacgatg 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attcaaacca gacttttaga 2880 acctaaacca aatctttaga accaggtact atgtattgta tcctgctgcc cagttgtcca 2940 ccatttaaca actttcaggg aatgtggtcc tcgcacccag taaagatttt actgtccat 2999 <210> 5 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tgctaataaa agattaacgc tgttttcctc acagggaatc aatggataat gttttgatag 60 cccttgtctc accagtgaac catatggccc ttattttctc wtacatgtgg ttgaaatgtt 120 agagcgtaat gttagagaag aatctctgtg gtgtactggc tcccgttcct tgcctaggca 180 ttaaagtgta ggtgttttat t 201 <210> 6 <211> 1001 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tgtagtttat tttagagtat gtgctatgtg gtgacgagaa gaatgaatat tctgttgttt 60 tgggatggag agttttgtag atgtctatta ggtccatttg gtcaagtatt aagttcagac 120 cttgaatatc tttgttaatt ttctgcctca gtgatctgtc tcatagggtc agtggggtgt 180 tgaagtctcc cactattatt gtgtggcagt ctaaatctct tagtaggtct ctatgaaatt 240 gttttatgaa tatgggtgct tttgtgttgg gtgcatatat atttaggata gttagatctt 300 catgttgaat tgaacccttt actattatgt aatgccctta tttgtctttt ttagtctttg 360 ttggtttaaa gtctgttttg cctgaaatta ggattgcagc tcctgctttt ttccatttgc 420 ttcacagagt tttcttcatc tctttatttt gagcctacag gtgtacagca tgtgagatgg 480 gtctcttgaa ggcagcatac mattgtgtct tgctttttga tccagtttgc cactctgtgt 540 gttttaaatg ggtcatttag cctgtttaca ttcaaggtta gtattgatac gtgtggattt 600 gatcctgtca ttgttgttag ctggttatta cgcagacttg tttgtatggc tgctttatag 660 tgtcattact ccatgtattt aagtatttaa gtgttttttg tattggttag taacagtctt 720 tcttttccat atttagtgct tctttcagga gctctagtaa ggcaggtctg gtagtaacaa 780 tttcccttct catttgcttg tctgaaaaga tccttatttc tccttcacat atgaagctta 840 gtttggctgg atatgacatt cttggttgaa tattttttct ttatgaatat tgaatacagg 900 cctccaatct cttctggctt gtagggtttc tgccgaaagg tccgctatta gcctgatgga 960 gctccctttg gaggtaacct gacctttctc tctagctgcc t 1001 <210> 7 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 accttggaag caagggaagg ttgtggattt tggcaattca cttagtcaaa acttggatgg 60 ggctttatat tttcttagat tatgggttgc tctccttgga ggagcttgac agggcaccaa 120 gctttaccaa ttgtgttcgc ttacactgga accagcgggt ggcccaaatg tggagatctt 180 tggtcgaact tgaagggagc tgaatcttac aacagtttcc taagctaagt tttttggatt 240 cttgccactg gaaacaaggg tggtctttcc ccaacctcct ttcccccagt ccaatcaaag 300 kctctatctc attaatactt ccgaatctgg aaaggcatta gtggcaagaa atcaaacact 360 taagaaaaag aaataactgt cgagttccag gaatgatttg tacttttgta tagggacacc 420 tcttttaaat ctatctactg ataacgttca gacacataca tgtaataatt taggagtgca 480 ctgttaattg caataagaga tcttgtgcct taactagata acattgctca tgctaattgt 540 acccccagcc aaccaggaat tagcaccgta agtaaacata cctttccctc ccatgcagtt 600 c 601 <210> 8 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ttatttattt ttgagacagg gtctcattct cattggccca gactggagtg cagtggcact 60 atcatggctc actgcagctt cgacttcctg ggctcaagtg atcctcccac ctcagcctcc 120 tgagtagctg ggactacagg aaaacaccac ctgactaatt ttttgtattt ttagtagaga 180 cggggttttg ccatgttatc caggctggtc ttgaactcct gggctcaagc aatttgccta 240 tctcggcctc ccagagtact aagattacaa gcgtgagcca ccactcctgg cctgttttta 300 ratactaaaa tttagaaggc tttctttatt ggtgtttctt tagtgatcta tttattgaat 360 cggtaatgtt tgaagaatta atatggactt tggagtttgg cctgagtttg aatccagctc 420 taacactcac ttgatgtgta accttaggca aaaactacat tagtaatcac ttggagcctc 480 atttatttta atctgcaaaa agggggtaat gatatttgtt ttacaaggtt gttttgagga 540 tttgattaaa aagtaaatct ataaaagata tccataataa tgcttaaaat agtagacatg 600 t 601 <210> 9 <211> 775 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 aatccattcc tgcccacttg cccagtttgt gatcaattac agacatttac agaatggctg 60 cctggagcta accatgtcgt ctggccctgg aacagagctg atttaattct cccacatgga 120 gacttagccc ttgaccccaa taacccagtg ttaaaactat ttgagcttat cggaggccat 180 ttggctaact aattctagca ggccataaat gaggtgtgat tataaagtaa agtgattttt 240 ctttttcttt tttaacaagc ataccagaac ttctgcatct gaatgagggt taacacttaa 300 aatattcccc agtatctggc acagtgggtg cttactaaat gctgaatgat tacatatatg 360 aataaatgtg wtctaacagt aactttgttg ctctgaatat tttgcatttc ttctttggaa 420 gtgccttcag agcctatgtt agattctctt gagtatttca atggtgacat gtcttcatct 480 tttgaagatt gatttgatga ttgggactag ccaaatattt gttttgtgag tggatttgac 540 agtgacagtc atagtttttt taaaagtccc atgtattcca gtcatcaggc tccacttaca 600 tagtctataa acactctaca gacaatacaa gaggggaatt ttgagagaat tttgaacatt 660 atccaagtaa gcattggttc ttgggactac atttcagttt aggagtgtgt gtgcatgtgt 720 ctgtgtgtgt gtgtgtgtga gagagagaga gagagagaga gagaattacc agtca 775 <210> 10 <211> 1057 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tttttttaat taagaaaaaa aattttttga gatagggtct cattctgcca cccaggctgg 60 agtatagtga tgcaatcttg gctcgctgca gcctcgacct ccctgggctt aggatcctgc 120 cacctcagcc tcctgagttg ctggaacaac aggtgcatcc caccacatct ggttaacttt 180 tgtagttttt gtagagttgg ggttttgccg tgttgcccag gctggtctca aattcctggg 240 ctcaagcaat ctgcctacct cagcctatca aagttctggg attataggtg tgagccacca 300 tggctggctt cacatagtgt ttctatcaaa acatttatta tttgccaaaa ttaaaatcta 360 gaagactttt aaaaatttct cttgaaaaat cagtagccct ggccatacgg gacctgcatt 420 tcctcatggt gagaacaggc tgcccccttc acatgggtcc tgccttcttc tgcttgacag 480 ccttcaccac tggtattgtc tcctgacaca gcctgaggtt ctgctatctt gtatcatcaa 540 gttggtgttg ctttttgtag tttttgtaaa actataaaaa gaaagagaaa ttgttctttt 600 acccacattt gtaaaaatta gaaaaatgaa cggcaggctg agaggttttg tatattttag 660 ggttcaggac actataatga ccagtacaga tcccaagggg gctctattgc atggagacga 720 tagttactaa tttattcatt catttatgca acaaatgtta tgtgagtgcc tgttgtgtgc 780 cagaccacta agctgtgatg cacagtgatg gccaccatgc ctggccattg aagcctcaac 840 agtgcatgtg acagccrtgg tccccaatat taaggagtct ataatctatg gggttttcca 900 cgttattcca aatccatagc ttatgagcat ctcacaggtg taagtggcca ttcgaagtca 960 catggaggca gtggaggagg cagccagttg tctcctttta gtgagcaaaa aatgactctg 1020 aagctccatt gttccctttt cttttatgtg gatagaa 1057 <210> 11 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tttgctgcct gaccagcacc agacacgggg acactagtat gcacctggct tatgatgata 60 ctgttacgag gtttgggcag gaatccatgc tgaagccatg cagcaggtgc tttggttctg 120 tggcctcggg actcctgcat ttccctactc ttgtttgata gcatagccga gaaatccaca 180 gagacagaga tgatgctgag gagcccactg cttttttttc ttggaaaaga aatgttccat 240 ggaaactttt cctgtgaacc ctctttgaga gatttatgca gattataaag tcaaaagaag 300 sggtcattcc agacttttct ttccaggcag acaggccaaa acataatttt agcaggtatt 360 agtaaaaatt gagaagtatt ttgtgtatgc tgggattctt gccaggctct gtgtttgcaa 420 ctcccaagac attgctaagg tgaaagtttt tcttcactac ccttggaaga ttgttgaaac 480 aagccggcca ctattctttt ccattgcatc cgtatcatcg aggcctctct agacactgtt 540 ttgtggcatc ttgggccaac acaaattgat ttgcttttca gcgaaagaac ttcatgcaga 600 a 601 <210> 12 <211> 1031 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tggagcatgc acatgcgcag aggagtcatg tgcactcatg agttaaatgc tcatacttgc 60 atttaaaact gaattaatgt aacgattaat ggtaaaattc atgctactta tttgaaattt 120 tagttttttt cttacttaga aagctactaa aaagaaaata agaaaatacc atcagaagct 180 gtgaaagaga gagtactgaa gaaaagaaaa agctttttat tttagtggtt ttaacagcgc 240 tttcttcctg cattttgaac aagggcccct cattttcatt ttgcactggg atccacaaaa 300 taagtagtca gcctgaccat cacctagtag atgaaagaac aggattcaaa ctctggagtg 360 tgtctcactc taaattttgt ttgagacctt aagcatgttg taggttcaga gatgggcata 420 ctactactag ctgagtgtag ggggccttag gaaggaagag gtagagaaag aagcagtggt 480 atgccagaac tagctcagtc agctcctccy acatcaggag aaagaaccta ttgttcagtt 540 ttcagaaatt ttgcaagcca gctgtcacac atggccatta ctaacaatta aatcacataa 600 acttaaaact aaataaatta catttaaaac aaaggtaata aatactcaac attcattact 660 tcctactatt atctagtttc ttgaggttat ttatgcctat tgtatccata tgttggaaac 720 actttgcaat gggctacggt ttacatttct tcccaacttt gcattcaggg acctcacatt 780 ggtagcctga aatcagccat ggtggaagta tttactacat gaaaatccac aaatgttaca 840 aaatcaggct tcctaccctt ccccttcttc cccagagagc tatttactag cacaccaatg 900 agaagaggta tctgaaatgt gtcctaaaga atagatattg aaggctgggc gtgtgactca 960 cacctgtaat cccagcactt tgggaggccg aggcgggcag atcacaaggt caggcattcg 1020 agagcagcct g 1031 <210> 13 <211> 780 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 aagagcataa caagcagtat taaaatgtct tttttgattc attcttctcc aagttatgtt 60 tttatcaaat gttttgtctc attaatgact ccaaagacat aatgagtata cataccttct 120 aatctcaccg aattcagaag agagttgaaa gaattttctt ctacatgttt tgggggctat 180 gacagcagag aatgtacagg cagggtagaa aggggctttc aggagagact aagtccattc 240 acctgcctac agggataagc atgcttacat attcccagay aaataagact ttttaaagat 300 ctctcaagta agaaatacca caatctcttc tgggtaccaa ttcctacatt tagaacattt 360 atttctagga aagtcttcct ttgagtctaa ccatgcttca gggccagctt catgagcatt 420 caagctctgc agtcacaaag gggctcatgc tcagaaggac aacctgccag ccctgcctgg 480 cttaatgttt tgttgtcacc atcttgaaat ttttaataat tttacctctg aatttgtgtt 540 tcctaagtga actctgatgg agcaatgaag cacgtgtata aaaagggaag atatatgcag 600 tatgcatgcc ccctttctcc tttctgtctc attcacatgt agccccatga gctctgaatt 660 cctgtggccc catgatgagt aggggttcag ggagactcaa agcaactaca aggaaggcat 720 gttatgtcta gactgattaa gtggggacac tggtagccct gagaggcttt ccatgagaac 780 780 <210> 14 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cccacaagta ttgagaggta aaagaaagtg ctcagaagat gttttgttta tgtttcagac 60 agcactgtgt aatgatttgt tgttattttg atggtatgtg ttaaaaggca gcctaaatgc 120 aatagccaac cctggagtgt tttctcccta atgacatcag gttcacaatg caaaaatatt 180 tagaatgtgc tattgctgat gaaaagtaat gttctccaca ctatattgtc agtattttgt 240 ttaaaatgcc atttcatttg gagcagaatt aatcgttgtc tgtgatctgt ctctttaatg 300 wtgcctttcc atttttgtca ctcctcaata ctattttggg gcaaataaat gctggtatat 360 gtaaattttt aaaagtgctc aaagttatat gggccagatg tgtttttgtg gggatacccc 420 ttttcatgac agaagaacat taagtattct atttggtgtc tcctaaaaaa gctcttacac 480 ttggttccgt ttgataacct agtattgtct ctaccatctt cctgtgatga taaagaagtg 540 tcacccaaaa taatgttcta gcagagtatc agattgggca attttaaaat aaattgtttt 600 c 601 <210> 15 <211> 401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 agagacatgt agaattattg ctgtcttaca aatagaaaat ggaggcagga aaattgaaat 60 ctcttgcctt ggggtttcat ggttactgga agggttagat ctagaatcca aatctcccag 120 cccactgtgc ttccctctag accacacaga ccacagtggt acagatttgt ttttaaccag 180 agcctcctcc tgtgtaagct rttcttgatt cggccttccc cccgcccccc gcctcccccc 240 accccactta aattggtcta gcagtgtgaa aggaaaaggg cagaaatagt ttcacacagt 300 ctcttttctt ttctttgcta tgagaaatat attaaagatt tatcttatat ttgttttgtg 360 cttaattttt attatgtcca aaggtgacat gataacatta t 401 <210> 16 <211> 999 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 tcccctgcca gaacataata aattccctga gggcagggct tggattagtc tgatttacca 60 ctgtgccccc agtacctgga accatgcctg aaacatagta agcactcaaa aaatttcacc 120 ttggggtctc agtcttggct ggtatatgtt gtgtttttca atggaaataa tgtacaaagt 180 gtacaatttc cacagctaag tgattttcca tgagttaata ggttaagttt taaaaaagat 240 cacaatctgg tgtcttatct tattttgaaa gggaagattc atctctttca aaagcaggta 300 aaaatatcag gtaatttatt tacacagtac atagtcacat atactgatta ggtgctccgt 360 ttactgctgc aactaatttt atttttcttt gaaacccagc cagactccta cacctcagcc 420 cttaatatct atcaccacat ttgctcataa ctatagcggc agtcaactgg ggcctggcac 480 ccccttgcta tgatccttay gaggacaatg tatttgcttc ttattttaca actgcagtca 540 ctcccaagcc tatttttaac aaatgctaaa aatatcttag agcaaccaac aagcaaacac 600 ctgtactaaa taaaaaccat cctattggta ttagcataaa tcataacttc tgaaagttaa 660 agtgacatca ttttattttt ttggtaacat tttccacatg acactggagt atggctcaga 720 aagcagactt gaaaggaata caaaaaccct agctaactaa aataattatt tttaaataaa 780 aaattaagca tttctaaaag aaaaggctaa attttaaata atatacagag ttgagacatc 840 ctgtacacag aaatacaact aaaggtgttt actttttaga attggatatt catatgttct 900 gagaaccacc aggaacaaga taattgtttt tcattttaat ttttaattgt ttaaaaatat 960 ccacatgaca cataaatcag gacttgacta ttccaacaa 999 <210> 17 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gaaatgcgtt tctctcattt ccctcagcat cgatttctgt ttcagagttg atgcagaggc 60 gtggatagta aggtgtgttt tccttcaaac ctgggatctt gccacttccc tctcatttga 120 atgatgtggt tttgaaatca gtgctgctga taccctctct ttcctcagaa tgatgtgagc 180 ttcataaacc cctttatgca taaaaccaaa cttgagagct gaggctttgg actctgtgtg 240 tgagaagcct cagaaaaaga aatcacactt cattaacaag aagaatggct tcggaaaaaa 300 scatgtacag tatacaacat gttagtacat ttccaggaaa tgatggcaaa tcagtcaaat 360 caagttgcag atgtagtcag gaaattctct catgattgtg agtttcccat acaagatttt 420 ggtggataaa gtcaaatgag ttatacccag tacttcaaaa gcacagcagt gccagctcat 480 cctcaagtca cctttggatt gaaatcttcc acaatgcagt tcatgacttt gctgttgaat 540 tatgaagtgt ttgtgtctgt gctgtaaggt gttgggattc aggaatagaa tcaaattcca 600 g 601 <210> 18 <211> 401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tttgtgtatt cctgtcacta ttcagatctt ttctctctct ttctctctta ctctcttttt 60 ttccagaagt ttcacccctc caaggagtct cggaataatt caagtagagt tgtttggttg 120 agaggaacat ccccatctca aggccgaacc tgtgtgaacc tcatgccaag cacagatata 180 gggctggcgc aggtgcttcc yaaagcttac cttcctggag atgacatgca tagaaagagg 240 ggttgggact ttttacttca ctaggagaac ttgtaacacc atggggaagt cagctgaaac 300 ttgtcttgtt ttgccaggaa aggaagtagt tgcctttggt catccatctg ctaatagtca 360 cagaatacag tgaaatgaca tagttttggg ttagatttta t 401 <210> 19 <211> 401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 attcctgtca ctattcagat cttttctctc tctttctctc ttactctctt tttttccaga 60 agtttcaccc ctccaaggag tctcggaata attcaagtag agttgtttgg ttgagaggaa 120 catccccatc tcaaggccga acctgtgtga acctcatgcc aagcacagat atagggctgg 180 cgcaggtgct tcccaaagct yaccttcctg gagatgacat gcatagaaag aggggttggg 240 actttttact tcactaggag aacttgtaac accatgggga agtcagctga aacttgtctt 300 gttttgccag gaaaggaagt agttgccttt ggtcatccat ctgctaatag tcacagaata 360 cagtgaaatg acatagtttt gggttagatt ttataatgca a 401 <210> 20 <211> 999 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 cattttgagg gatgagcact tggcccagga taagcatata ataaatcttt gtggaatcaa 60 tgattcaaaa gaaaaataaa actgaataac attgcccaaa tgtgaagaaa actgaagcat 120 cttttaaaat gtccagttaa aacatataaa tcccatatcc taaaggaatt tcattaactg 180 tttaggactt cacttggggc ccaccagaaa taaatgctct gggattgtca gattgaataa 240 agttgataac taaggtgttt gctggagtca gaatgcaaca actgtgtctt agagtgaagg 300 tcatgaaaaa gaacttcaat ctgagggtaa cttttattca gggtgactct tggggataag 360 taaccgcgtg accttgtcag tttgttctcc gtccatcgca tgggtggtga tgattgaacc 420 agagaaatga atggggcttg tagcgctgga tgtatatggt cagtctccat aaatcatttc 480 ttccattgtc tgaatacaty tgggcatcca cagtagttta tttccaaagt atataaagaa 540 gcagaggcca agggtgtaat cttggagcta tttaaataga gtggttccag tcaagacatg 600 cagctgttcc caattattag tccatatatt ctaggtgcca gggaaaaccc acaagtgtgt 660 cactcaattg aattttaaag tgacctcctg ttcagatgaa aatctcctag ctgtgttttt 720 ttccctaaag actggtctcc tattgaacga gttagcaaca ctcttgttgt gaatgaatca 780 ttgctactgc ctatagagga aatctggatt gttccatagg gttttcaagg aatgtgaact 840 taccttccag ggaacccttt gtaaatgctg ctagccaaaa tcctgaacac aaggacaagt 900 tggaaatctt caaaagggca aactctgatg agggggcgtg gttttaatat tttaaaggca 960 tgtgagttgt gtcaaaacat gattccaagg agtgccctg 999 <210> 21 <211> 401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ctatggaagc gtcgcttcat tctatgagag ctgctcactt tccaccatgc tgccgggagg 60 ggcctcgaga cttttcccca gagatgccta acatgggctg tgaatgcata tggcccaaca 120 tggggacctt ttatttttta aaaattgtat tggaagagag taagaacttg cagattagct 180 ttcttttatt ttgtggaatg ytggacaggg aagaaaaaga gaaagaaaca gccccagggc 240 actttaataa tacttacttt taaccagcag ttaaaataat tcacaggtta ttggtgggtt 300 atttttaagg agagaaggta tttttgagaa tttccttttc aaatcaccaa aaaacccaaa 360 taacccccca aatcttgact ttattttctc gaagatttag t 401 <210> 22 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 ataaaaacgg caggttgatt ttgtggattt ttgctacacc ggctacaatc attgatccta 60 ggtattcggg actcctatga aatccttttg gtactatggc agtgtttaag tgacaccagt 120 tttgtaaagt ggcatatgca gggttgatcc ctgcctgata attaggagct tgctctcttg 180 attttgtccc atcaatattg ttcattttgc ctcagatacg tttttctccc taagatcatc 240 tccacaaacc ccagtgctga gaagaatgaa tcccagtaag acctaataaa tctgacagaa 300 raatgtgggg ttagagatcc acacagacca tgaggactgt cgcattaaag gctcctgggg 360 atttttttta cgaccttttt tttcgtcctt ctaatgcttg gtctcttgct tccataaatt 420 gtgcagcctg gcttttcatt aactcagaga gctgaaataa ttctttgtaa agaattcttt 480 agtcacacat gattcaaaag ttcaccaaga tcaaagccag cctgttttgt ggcgggccca 540 gcaccgtata tttcatgtaa atggtgtggc ttggtgcatt ctcagctgga gttcttccaa 600 t 601 <210> 23 <211> 401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 atgcttggtc tcttgcttcc ataaattgtg cagcctggct tttcattaac tcagagagct 60 gaaataattc tttgtaaaga attctttagt cacacatgat tcaaaagttc accaagatca 120 aagccagcct gttttgtggc gggcccagca ccgtatattt catgtaaatg gtgtggcttg 180 gtgcattctc agctggagtt sttccaattt cacatccttt ctgcagataa tgggaccctc 240 tgatactgtc cccggcacaa ggggctgctc tgtgcctgat cccatctccc ttagaagcct 300 gtacagatgc tgtctgtatg ggccagtgaa gtcattctga catccccctc aatattatct 360 gaaattttat gaagcatggg agtcattctt ggccctaggg g 401

Claims (16)

  1. 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10 ∼ 100 개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (a);
    서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10 ∼ 100 개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (b);
    서열번호 4의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 141번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 141번째 염기를 포함하는 10 ∼ 100 개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (c);
    서열번호 6의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 501번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 10 ∼ 100 개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (d);
    서열번호 7의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10 ∼ 100 개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (e);
    서열번호 8의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10 ∼ 100 개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (f);
    서열번호 9의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 371번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 371번째 염기를 포함하는 10 ∼ 100 개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (g);
    서열번호 10의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 857번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 857번째 염기를 포함하는 10 ∼ 100 개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (h);
    서열번호 11의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10 ∼ 100 개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (i);
    서열번호 12의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 510번째 염기(다형성 부위)가 T이고, 상기 510번째 염기를 포함하는 10 ∼ 100 개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (j); 및
    서열번호 15의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10 ∼ 100 개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (k)
    로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단을 위한 증폭용 프라이머.
  5. 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단용 프로브.
  6. 제5항에 따른 조기폐경 진단용 프로브를 포함하는 마이크로어레이.
  7. 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조기폐경 진단용 키트.
  8. 조기폐경 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드 중의 하나 이상의 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계 (단, 상기 다형성 부위는 제1항에서 정의한 바와 같다)를 포함하는 검체 중의 단일염기다형을 분석하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계가 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k) 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계(단, 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)는 제1항에서 정의한 바와 같다); 및 얻어진 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 분석하는 방법.
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  16. 조기폐경 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 DNA 서열의 다형성 부위(단, 상기 다형성 부위는 제1항에서 정의한 바와 같다)로부터 결정되는 반수체형 또는 유전자형(genotype)을 분석하는 단계를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 분석하는 방법.
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