본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티 드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (a); 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (b); 서열번호 4의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 141번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 141번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (c); 서열번호 6의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 501번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (d); 서열번호 7의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (e); 서열번호 8의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (f); 서열번호 9의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 371번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 371번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (g); 서열번호 10의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 857번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 857번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (h); 서열번호 11의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 301번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 301번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오 티드 (i); 서열번호 12의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 510번째 염기(다형성 부위)가 T이고, 상기 510번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (j); 및 서열번호 15의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 201번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단을 위한 증폭용 프라이머가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단용 프로브 및 이를 포함한 마이크로어레이가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 이용한 조기폐경 진단 방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 조기폐경과 관련되는 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명자들은 PTHB1 (parathyroid hormone-response B1) 유전자 상에 존재 하는 23개의 후보 단일염기다형에 대하여 조기폐경과의 연관성을 분석하였다. 도 1은 PTHB1 유전자에 존재하는 단일염기다형들의 위치를 나타낸다. 상기 후보 단일염기다형들은 환자군과 정상인 군을 합친 표본집단에서 통계학적으로 고르게 분포되어 있음을 알 수 있다. 이는 상기 23개의 단일염기다형이 일반적으로 흔하게 나타나는 형태라는 것을 뜻하며, 이는 다시 안정된 형태의 유전적 표지인자(stable genitic marker)로써 사용될 수 있음을 의미한다. 그러나 서열번호 1의 경우는 minor allele frequency (MAF) < 0.1 이므로 단일염기다형성이라고 정의될 수 없어, 표지인자로서 기능할 수 없는 것으로 나타났다.
상기 23개의 후보 단일염기다형들 중, 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 단일염기다형은 환자군과 정상인군에서 통계학적으로 유의성 있는 차이(유의수준 p value < 0.05)를 보이는 단일염기다형으로서, 이들은 PTHB1 (ParaThyroid Hormone-response, B1) 유전자에 존재한다. PTHB1 유전자는 7번 염색체상에 존재하며, 4가지 형태의 전사 다양체(transcription variants)를 갖는 것으로 알려져 있다. 그 중 25개의 엑손으로 이루어진 전사체(transcripts)가 대표적으로 알려져 있다. PTHB1 유전자는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone)에 의해 발현 수준(expression level)이 저해되며, 발현이 되면 구형의 세포내 단백질로써 신호전달자로서의 역할을 수행한다. PTHB1 유전자가 조기폐경과 연관되어진다는 것은 생리학적으로 볼 때, 인간의 내분비계통의 양대 산맥 중 하나인 시상하부-뇌하수체-갑상선 축(H-P-T axis)이 조기폐경과 관련된다는 것을 뜻하게 된다. 따라서 조기폐경과 연관된 PTHB1 유전자의 발견은 내분비계의 두 가지 축 사이의 상호연관성을 의미하게 되며, 이는 매우 놀라운 것이다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 길이는 10 내지 100 뉴클레오티드, 바람직하게는 20 내지 60 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 뉴클레오티드이다.
본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열 (polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위 (polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위 (polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드 중 일부는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드는 조기폐경에 관련된다. 이는 조기폐경 환자와 정상인으로부터 유래한 혈액 시료로부터 얻어진 DNA에서 각 단일염기다형에서 나타나는 대립형질(allele)의 유전자형을 분석한 결과를 통하여 확인할 수 있었다. 본 발명에 있어서, 정상인 및 환자군은 각각 16명씩 참여하였으며 데이터 분석에 활용하였다. 유전자형 분석에 사용된 군집의 크기는 다음 표 1과 같다.
그룹 |
정상인 |
환자군 |
총합계 |
조사인원 |
16 |
16 |
32 |
하기 표 2a, 표 2b, 및 표 3은 서열번호 1 내지 23의 DNA 서열의 조기폐경과의 연관성 및 상기 다형성 서열의 특성을 나타낸 것이다.
서열번호 |
SNPs |
유전자형분석방법 |
대립인자형빈도 |
유전자형 빈도 |
χ2 value |
χ2 p value |
Exact p value |
Major allele |
Minor allele |
Major homo |
Hetero |
Minor homo |
1 |
rs12536300 |
InfiniumTM Assay I |
0.984(T) |
0.016(C) |
31 |
1 |
0 |
0.008 |
1 |
1 |
2 |
rs12671333 |
InfiniumTM Assay I |
0.594(G) |
0.406(T) |
11 |
16 |
5 |
0.042 |
0.837 |
1 |
3 |
rs4723263 |
InfiniumTM Assay I |
0.641(C) |
0.359(G) |
12 |
17 |
3 |
0.757 |
0.465 |
0.699 |
4 |
rs1009355 |
InfiniumTM Assay I |
0.719(G) |
0.281(A) |
16 |
14 |
2 |
0.216 |
1 |
1 |
5 |
rs10486519 |
InfiniumTM Assay I |
0.766(A) |
0.234(T) |
18 |
13 |
1 |
0.557 |
0.646 |
0.652 |
6 |
rs1592465 |
InfiniumTM Assay I |
0.672(C) |
0.328(A) |
15 |
13 |
4 |
0.198 |
0.703 |
0.693 |
7 |
rs3884597 |
InfiniumTM Assay I |
0.594(G) |
0.406(T) |
11 |
16 |
5 |
0.042 |
0.837 |
1 |
8 |
rs4604335 |
InfiniumTM Assay I |
0.516(A) |
0.484(G) |
9 |
15 |
8 |
0.121 |
0.728 |
0.731 |
9 |
rs6944723 |
InfiniumTM Assay I |
0.516(A) |
0.484(T) |
9 |
15 |
8 |
0.121 |
0.728 |
0.731 |
10 |
rs6462477 |
InfiniumTM Assay I |
0.688(A) |
0.321(G) |
14 |
16 |
2 |
0.857 |
0.44 |
0.679 |
11 |
rs10225698 |
InfiniumTM Assay I |
0.688(G) |
0.321(C) |
14 |
16 |
2 |
0.857 |
0.44 |
0.679 |
12 |
rs2041417 |
InfiniumTM Assay I |
0.562(T) |
0.438(C) |
9 |
18 |
5 |
0.653 |
0.42 |
0.718 |
서열번호 |
SNPs |
유전자형분석방법 |
대립인자형빈도 |
유전자형 빈도 |
χ2 value |
χ2 p value |
Exact p value |
Major allele |
Minor allele |
Major homo |
Hetero |
Minor homo |
13 |
rs1986867 |
InfiniumTM Assay I |
0.766(C) |
0.234(T) |
20 |
9 |
3 |
1.498 |
0.327 |
0.313 |
14 |
rs11762294 |
InfiniumTM Assay I |
0.812(A) |
0.188(T) |
20 |
12 |
0 |
1.704 |
0.565 |
0.557 |
15 |
rs6462484 |
InfiniumTM Assay I |
0.609(A) |
0.391(G) |
11 |
17 |
4 |
0.43 |
0.713 |
0.714 |
16 |
rs1882039 |
InfiniumTM Assay I |
0.609(T) |
0.391(C) |
11 |
17 |
4 |
0.43 |
0.713 |
0.714 |
17 |
rs6971448 |
InfiniumTM Assay I |
0.719(G) |
0.281(C) |
16 |
14 |
2 |
0.216 |
1 |
1 |
18 |
rs1050719 |
InfiniumTM Assay I |
0.656(C) |
0.344(T) |
11 |
20 |
1 |
4.75 |
0.05 |
0.051 |
19 |
rs1050721 |
InfiniumTM Assay I |
0.797(T) |
0.203(C) |
19 |
13 |
0 |
2.079 |
0.297 |
0.301 |
20 |
rs2392252 |
InfiniumTM Assay I |
0.781(T) |
0.219(C) |
19 |
12 |
1 |
0.302 |
1 |
1 |
21 |
rs4723317 |
InfiniumTM Assay I |
0.594(C) |
0.406(T) |
11 |
16 |
5 |
0.042 |
0.837 |
1 |
22 |
rs921413 |
InfiniumTM Assay I |
0.734(A) |
0.266(G) |
16 |
15 |
1 |
1.299 |
0.386 |
0.392 |
23 |
rs7811261 |
InfiniumTM Assay I |
0.609(C) |
0.391(G) |
12 |
15 |
5 |
0.008 |
1 |
1 |
표 2a 및 2b는 조기폐경 환자군과 정상인군 모두에서 관찰된 각 단일염기다형들의 유전적 표지인자로서의 기능과 이들로 이루어지는 유전자형의 분포가 일반적인 것들인지를 나타내주고 있다. 여기서 일반적이란 환자군과 정상인군에서 고르게 분포되어져 있음을 말한다. 대립인자형빈도 항목에서 굵게 표시된 대립인자들은 연관성 분석에서 위험인자(risk allele)로 분석된 것들이다. 표 2와 같은 분석을 하아디-와인버그 평형(Hardy-Weinburg Equilibrium) 검정이라고 한다. 이를 바탕으로 표 3에서 조기폐경 환자군과 그에 대한 정상인군으로 나누어 다시 분석 후, 환자군 특이적인 대립인자와 유전자형을 찾아냈다. 이를 연관성분석(association study)라고 한다. 이렇게 찾아진 것들은 한국인에게서 일반적으로 나타나는 것이며, 그 중에서 특히 조기폐경 환자군에 특이적인 대립인자와 유전자형을 갖는다는 의미를 얻게 되어 유전적 표지인자로서의 기능을 갖추게 된다.
표 2a 및 2b 에 있어서, 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다.
ㆍ 서열번호는 각각의 단일염기다형을 나타내는 번호이다.
ㆍ SNP는 단일염기다형을 나타내는 것으로, 여기서 rs란 reference sequence의 약자이며, 뒤의 숫자는 dbSNP라는 데이터베이스에서 제공하는 각각의 단일염기다형을 구분 짓는 고유 숫자(accession number)이다.
ㆍ분석방법은 Illumina사의 InfiniumTM Assay 방법을 사용하였으며, 환자군(case)와 정상인군(control)을 각각 16씩, 합계 32명의 지원자의 동의서를 받아 수행되어졌다.
ㆍ 대립인자형 빈도(allele frequency) 란에서는 각각의 단일염기다형을 구성하는 두 개의 뉴클레오티드 염기를 표시하며, 실험된 집단 내에서 관찰되는 각각의 대립인자들의 빈도를 나타낸다. 여기서 대립인자란 단일염기다형 부위에 실제로 존재하고 있는 뉴클레오티드의 염기서열을 뜻하며, 하나의 단일염기다형은 그 특성상 두 개의 대립인자를 가질 수 있다. 이들 대립인자 빈도의 고저에 따라 큰 대립인자(Major allele)와 작은 대립인자(Minor allele)로 나뉜다. 특히 작은 대립인자의 빈도(Minor allele frequency; MAF)는 0.1을 기준으로 하여 단일염기다형과 단일염기변이(point mutation)을 나누는 유전학적 기준으로 사용된다. 이러한 기준은 다형성 자체의 안정성을 뜻하기 때문에(즉, 단일염기다형이 일어나는 부위는 일정하다라는 뜻), 유전적 표지인자로서의 사용 가능성을 대변한다.
ㆍ 유전자형 빈도(genotype frequency) 란은 단일염기다형을 형성하는 각각의 대립인자들로 이루어지며, 단일염기다형 부위가 존재하는 유전자 좌(locus)에 어떠한 대립인자들이 있는지를 나타낸다. 여기서 큰 대립인자들로만 구성되어 있는 유전자형을 큰 동형유전자형(Major homotype), 큰 대립인자와 작은 대립인자로 이루어진 유전자형을 이형유전자형(Heterotype), 그리고 작은 대립인자들로만 이루어진 유전자형을 작은 동형유전자형(Minor homotype)이라고 한다. 숫자들은 각각의 유전자형에 해당하는 사람들의 수를 나타낸다. 이를 관측치라고 할 수 있다.
ㆍ χ2 value는 각각의 단일염기다형을 이루는 대립인자들의 빈도로 계산되어진 유전자형의 빈도와 실제 관측된 유전자형의 수의 차이를 계산한 값이다. 이는 관측된 대립인자형빈도에 의해 이론적으로 분포될 유전자형빈도와 실제 유전자형빈도와의 차이를 나타내는 것이므로, 이 두 값들의 차이가 유의성 있는 차이가 없다는 것은 관찰되는 대립인자들이 통계적으로 각각의 유전자형으로 고르게 분포되어져 있다는 것을 의미한다. 여기서 유의성 있는 차이가 있다라고 판단하는 경우는 χ2 value가 3.85 이상인 경우를 뜻하며, 이는 곧 χ2 p value가 0.05 이하임을 뜻한다. 이러한 것을 유전학적 생물학적 관점에서 분석하여, 본 발명자들은 χ2 value가 3.85 이하인 값을 갖는 단일염기다형들을 선택하여 환자군-정상인군 간의 질병과의 연관성 분석을 하였다. 여기서 사용한 χ2 test는 통계적으로 이산확률분포에 속하는 변량들을 계산할 때 사용하며, 단일염기다형 분석에 있어서 각 빈도들은 이산확률분포에 속하는 변량들이다.
ㆍ χ2 p value는 χ2 value로 얻어진 값들에 대한 누적밀도함수 값이다. χ2 p value < 0.05 라는 것은 어떤 단일염기다형을 구성하는 두 개의 대립인자로 이루어지는 유전자형들의 관찰값이 두 개의 대립인자 빈도로부터 얻어지는 기대값과 유의성 있는 차이를 나타내고 있음을 뜻한다. 이는 모집단에서 관찰된 그 단일염기다형이 일반적으로 나타난다고 말할 수 없음을 뜻하며, 이는 그 단일염기다형이 유전적 표지인자로서의 기능을 상실하고 있음을 뜻한다.
ㆍ Exact p value는 Fisher's Exact test를 통하여 산출된 p value를 말한다. 이 통계방식은 기대빈도가 5 이하의 값을 나타낼 때, 사용되는 매우 적절한 통계 방식이다. 위의 표 2a 및 2b의 자료를 분석할 때 기대빈도가 5 이하로 나오는 값들이 있으므로 Exact p value가 통계적으로 χ2 p value보다 더 정확한 확률값을 나타낸다. 여기서 기대빈도란 대립인자 빈도로 계산되는 유전자형 빈도의 값이 5 이하인 것들을 말한다.
표 2a 및 표 2b의 분석을 토대로 조기폐경 연관성 분석을 하였다. 이를 표 3에 나타내었다. 조기폐경 연관성 분석을 통하여 조기폐경이라는 질병에 영향을 미칠 수 있는 단일염기다형들과 그 들의 유전자형을 알아볼 수 있다.
표 3은 하나의 단일염기다형을 이루는 두 개의 대립인자와 이로 인하여 형성되는 3가지 형태의 유전자형에 대한 환자-정상인군 간의 빈도차이를 비교하여 어떠한 대립인자가 또는 어떠한 유전자형이 질병과 연관되어 있는지를 분석한 결과이다. 이러한 연관성 분석은 대립인자형(allele model), 공동-우성 유전자형(Co-dominant model), 우성 유전자형(Dominant model), 그리고 열성 유전자형(Recessive model)이라는 네 가지 항목에서 실시하였다. 표 3에 있어서 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다.
ㆍ서열번호는 각각의 단일염기다형을 나타내는 번호이다.
ㆍSNPs란은 연구되어진 각 단일염기다형들의 고유 숫자들을 나타내고 있다. 이 숫자들은 NCBI dbSNP에서 사용되는 것들이다.
ㆍ대립인자형에 대한 연관성 분석에서 OR (odds ratio) (95% CI) 항목은 오즈비와 그에 대한 95% 신뢰구간(confidence interval; CI)를 나타낸다. 이들 데이터에 대한 해석은 다음과 같다. 하나의 단일염기다형을 이루는 두 대립인자들 중 어떤 대립인자를 갖느냐 따라서 질병에 걸릴 비율이 몇(오즈비) 배 높다는 것을 나타낸다. 95% 신뢰구간은 이러한 주장에 대한 95%의 신뢰도를 나타낸다.
ㆍ대립인자형에 대한 연관성 분석에서 Logit_p value는 오즈비에 대한 통계적 유의성을 나타낸다. 이는 오즈비 만큼 정상인군과 환자군 간에 차이에 대한 유의성을 뜻한다. 오즈비가 1 이상이 나타날 때, 두 대립인자 중 환자군에서 그 빈도가 놓은 대립인자를 위험인자(risk allele)이라고 한다. 여기서 유의성 있는 차이가 있다고 판단하는 기준은 Logit_p value가 0.05 이하의 값을 나타낼 경우이다. 이러한 값은 로지스틱 회귀(logistic regression) 분석을 통하여 얻었다.
ㆍ대립인자형에 대한 연관성 분석에서 Exact p value 또한 Logit_p value 처럼 정상인군과 환자군 간의 차이에 대한 유의성을 뜻한다. 이 역시 p value의 값이 0.05 이하일 때, 유의성 있는 차이를 인정한다. Exact p value는 피셔의 정밀 검정(Fisher's exact test) 통계 방식을 사용하여 얻어진 값인데, 이는 환자군과 정상인군의 비교시 필요되는 기대빈도가 5 이하의 수가 있을 때, 정밀한 검정을 하기 위해 개발된 통계기법이다. 따라서 표 3에서 보여주는 데이터에는 매우 적합한 검정법이라 할 수 있다.
ㆍ대립인자형에 대한 분석에서 permutation p value는 중다비교(multiple comparison)을 통하여 나온 p value로써 환자군-정상인군 간의 대리인자들의 출현빈도의 유의성있는 차이가 우연 또는 기회에 의한 것인지를 알아보고자 하는 정밀한 분석기법이다. Permutation p value의 값이 0.05 이하 일 때, 그 단일염기다형을 이루는 대립인자들의 출현빈도가 환자군-정상인군 사이에서의 유의성이 더 많은 표본에서도 변함이 없을 것임을 예측할 수 있다. 따라서 permutation p value의 값은 예측 값이기 때문에, 집단내의 관찰 값의 실제적인 데이터라고는 할 수 없다.
ㆍ공동-우성 유전자형에 대한 연관성 분석에서 각 3개의 항목이 뜻하는 바는 대립인자형에서와 같다. 그러나 공동-우성 유전자형에서 환자군과 정상인군 사이에 비교되어지는 유전자형은 AA : AB : BB로 구분된다.
ㆍ우성 유전자형에 대한 연관성 분석에서 각 3개의 항목이 뜻하는 바는 대립인자형에서와 같다. 그러나 우성 유전자형에서 환자군과 정상인군 사이에 비교되는 유전자형은 대립인자형에 대한 연관성 분석에서 질병에 대한 위험인자(risk allele)로 결정되어진 대립인자를 위주로 나누어진다. 위험인자를 B라 하면, BB+AB : BB로 구분된다.
ㆍ열성 유전자형에 대한 연관성 분석에서 각 3개의 항목이 뜻하는 바는 대립인자형에서와 같다. 그러나 열성 유전자형에서 환자군과 정상인군 사이에 비교되는 유전자형은 위험인자(B)를 기준으로 하여, BB : AB+AA로 구분된다.
표 2a, 표 2b, 및 표 3 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 내지 23의 단일염기다형들 중 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15는 환자군-정상인군 사이에서 대립인자의 출현빈도에 유의성 있는 차이를 나타내고 있다. 즉 서열번호 2의 경우는 G, 서열번호 3은 C, 서열번호 4는 G, 서열번호 6은 C, 서열번호 7은 G, 서열번호 8은 A, 서열번호 9는 A, 서열번호 10은 A, 서열번호 11은 G, 서열번호 12는 T, 서열번호 15는 G가 각각 정상인군에 비해 환자군에서 유의성 있게 높은 출현빈도로 나타났다. 즉, 이들은 각 서열번호가 지시하는 단일염기다형 부위에서 위험인자로서 해석될 수 있다. 따라서 본 발병에 있어서 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 단일염기다형은 조기폐경과 관련되는 진단 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 구체적으로는 조기폐경의 진단을 위한 프라이머 또는 프로브로의 목표 부위(target site)로써 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 다형성 부위를 포함한 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 DNA서열로부터 유래한 10개 이상의 연속적 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드와 혼성화하는 조기폐경 진단용 대립인자 특이적 폴리뉴클레오티드(allele-specific oligonucleotide)를 포함한다. 상기 대립인자 특이적 폴리뉴클레오티드란 각 대립인자에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 여기서 혼성화란, 상기 단일염기다형이 나타내는 대립인자 중 하나에 특이적으로 결합하는 것을 말하며, 이러한 과정은 RA1 solution (Illumina's InfiniumTM Assay kit) 하에서 48℃에서 수행되어 질 수 있다.
본 발명은 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단을 위한 증폭용 대립형질 특이적 프라이머를 포함한다. 여기서 "프라이머(primer)"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트(ATP,GTP,CTP,TTP) 및 DNA 폴리머라제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 100, 바람직하게는 10 내지 80 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 3'-말단이 서열번호 1 내지 23의 단일염기다형과 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 DNA에서 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 증폭된 산물만을 특이적으로 염색하여 시각화한다. 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 여기서 사용되는 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드들이 다른 변성화 과정을 거치게 되면, InfiniumTM Assay I 뿐만 아니라 다른 방법들에 의해서도 사용될 수 있다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단용 프로브 및 이를 포함하는 조기폐경 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조기폐경 진단용 키트를 포함한다.
본 발명은 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드 중의 하나 이상의 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계 (단, 상기 다형성 부위는 상기에서 정의한 바와 같다)를 포함하는 조기폐경 진단 방법을 포함한다.
여기에서, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계는 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계 및 얻어진 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 또 다른 구체예에는, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정한 결과, 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 15의 다형성 부위의 염기가 각각 G, C, G, C, G, A, A, A, G, T, 및 G (위험 대립인자)인 것이 하나 이상 존재하는 경우, 조기폐경에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 위험 대립 인자를 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 위험군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명은 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 DNA 서열을 포함하는 PTHB1 (ParaThyroid Hormone-response B1) 유전자에 있어서 반수체형(haplotype)의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 조기폐경 유무의 진단 방법을 포함한다.
즉, 본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 분석하여 얻어진 반수체형 ht-2 (서열번호 3 및 4의 DNA 서열의 다형성 부위로 이루어짐) 및 반수체형 ht-5 (서열번호 7 내지 11의 DNA 서열의 다형성 부위로 이루어짐)가 각각 GA 및 TGTGC인 경우, 정상인으로 판정하는 단계를 포함하는 조기폐경 유무의 진단 방법이 제공된다. 또한, 상기 방법에서, 서열번호 7 내지 9의 DNA 서열의 다형성 부위가 표지 단일염기다형(Tagging SNP)으로서 각각 T, G, T인 경우, 정상인으로 판정할 수도 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 분석하여 얻어진 반수체형 ht-1 (서열번호 3 및 4의 DNA 서열의 다형성 부위로 이루어짐) 및 반수체형 ht-4 (서열번호 7 내지 11의 DNA 서열의 다형성 부위로 이루어짐)이 각각 CG 및 GAAAG인 경우, 조기폐경에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 진단 방법이 제공된다. 또한, 상기 방법에서, 서열번호 7 내지 9의 DNA 서열의 다형성 부위가 표지 단일염기다형(Tagging SNP)으로서 각각 G, A, A인 경우, 조기폐경에 걸릴 확률이 높은 위험군으로 판정할 수도 있다.
본 발명은 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계 및 서열번호 2 내지 4, 6 내지 12, 및 15의 DNA 서열을 포함하는 PTHB1 (ParaThyroid Hormone-response B1) 유전자에 있어서 유전자형(genotype) 분석을 포함하는 조기폐경 유무의 진단 방법을 포함한다. 이는 표3의 각 단일염기다형에 대한 유전자형 분석에 의해서 얻어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 3, 및 6 내지 12의 DNA 서열의 다형성 부위의 유전자형(genotype)이 각각 GG, AA, TT, GG, TT, GG, CC, 및 CC인 경우, 정상인으로 판정하는 단계를 포함하는 조기폐경 유부의 진단 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 3, 및 6 내지 12의 DNA 서열의 다형성 부위의 유전자형(genotype)이 각각 CC, GG, GG, AA, AA, AA, GG, 및 TT인 경우, 조기폐경에 걸릴 확률이 높은 위험군으로 판정하는 단계를 포함하는 조기폐경 유무의 진단 방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 환자군(Subjects)
본 실험은 한국 차 병원으로부터 임상적으로 조기폐경으로 진단받은 16명의 환자들과 그에 상응하는 16명의 정상인들부터 동의를 받아서 수행되었고, 이들은 모두 46, XX인 핵형(karyotype)을 가지고 있다. 정상인들은 모두 자녀가 있는 사람들 중에서 선발하였다. 조기폐경의 임상적 진단 기준은 혈중 여포자극호르몬 수준(FSH level)이 40mIU/mL 이상으로 정하였다. 그리고 신장(cm), 체중(Kg), 체질량지수(BMI(Kg/m2)), 황체형성호르몬(LH(mIU/mL)), 에스트라디올(E2(pg/mL)), 프로락틴(PRL(ng/mL)), 남성호르몬(testosterone(ng/mL)), 갑상선자극호르몬(TSH(mIU/mL)) 등을 조사하였다. 16명의 조기폐경 환자 집단에서 5명은 체외수정(Invitro Fertilization; IVF) 시술을 받은 적이 있었고, 그 중 1명은 체외수정 시술에 실패하였다. 또한 가족력 조사에서 어머니나 형제들 중 무월경(amenorrhea)을 나타내는 환자가 2명이 있었다.
2. 게놈 DNA의 준비
게놈 DNA(genomic DNA; gDNA)를 준비하기 위하여 16명의 조기폐경 환자와 16명의 정상인 여성으로부터 혈액을 채취하였다. 전체 정맥혈의 5ml은 각 지원자들의 전주정맥으로부터 얻었고 15% EDTA가 들어있는 Vacutainer tube로 옮겨졌다. 게놈 DNA를 추출하기 위하여, 혈액을 원심분리 실험관으로 옮기고 낮은 농도의 염 성분 완충용액(low-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl2, and 2mM EDTA))을 5ml 첨가 하였다. 그리고 Nonidet P-40을 첨가하였다. 얻어진 용액을 잘 섞어준 후, 상온에서 10분간 2,200 rpm으로 원심분리 하였다. 이 때 얻어진 덩어리는 고농도의 염 성분 완충용액(high-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl2, 0.4M NaCl, and 2mM EDTA))으로 재현탁 하였다. 이 게놈 DNA는 50ul의 10% SDS와 섞은 후, 55℃에서 밤새 반응시켰다.
반응 후에, 각 게놈 DNA들은 1.5ml 용량의 원심분리 실험관으로 옮겨, 6M NaCl을 0.3ml 첨가하였다. 게놈 DNA들을 잘 섞어준 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 게놈 DNA가 들어있는 상층을 모아서 새로운 시험관으로 옮기고, 상온에서 동량의 100% 에탄올을 첨가하였다. 게놈 DNA들이 침전될 때까지 잘 섞어 주고, 침전이 되면 70% 에탄올로 게놈 DNA들을 세척하였다. 이 과정이 끝나면 실험관 뚜껑을 열어, 용액성분이 마르도록 놓아둔다. 그리고 TE 완충용액(pH 8.0)을 넣어 게놈 DNA를 재현탁 하였다.
준비된 게놈 DNA는 InfiniumTM Assay를 위해 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA reagent (Molecular Probes, Invitrogen)을 사용하여 750ng/15uL의 농도로 조정하였다.
3. 전체 게놈의 유전자형 분석 - InfiniumTM Assay
Infinium TM Assay 에 대한 설명 InfiniumTM Assay는 SentrixR BeadChip (Illumina)을 이용한 마이크로어레이로서 각 단일염기다형에 대한 대립형질(allele A and allele B)를 구별할 수 있는 프로브들이 하나의 bead에 심어져 있다. 이들 프로브들은 약 75개의 뉴클레오티드로 이루어져 있으며, 그 중 5' 쪽의 25개의 뉴클레오티드들은 각각의 단일염기다형들을 구분할 수 있도록 되었으며, 나머지 50개의 뉴클레오티드들은 각 단일염기다형에 대한 대립형질들을 구분할 수 있도록 만들어져 있다.
전체 게놈의 증폭( Whole - genome amplification ( WGA )) 게놈 DNA (750ng/15uL)를 상온(22℃)에서 녹인 후, 0.8mL micotiter plate의 각 well에 옮겼다. 0.1N NaOH를 15uL 첨가하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 270uL의 MP1 용액과 300uL의 AMM 용액을 차례로 첨가한 후, 뒤집어가며 잘 섞어준다. 280g에서 원심분리하여 37℃ 오븐에서 20시간 동안 반응시켰다.
증폭된 게놈 DNA 의 단편화와 정제 전체 게놈 DNA 증폭 단계가 끝나면 50g에서 1분간 원심분리 한 후, 150uL 씩 3개의 여분의 well로 옮겼다. 결과적으로 4개의 well이 같은 게놈 DNA가 된다. 각 well에 FRG 용액을 50uL 첨가한 후, 1600rpm으로 1분 동안 와동(vortex)하였다. 상온에서 50g로 원심분리한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 게놈 DNA을 50g에서 원심분리 하고, PA-1 용액을 100uL 첨가하고 1600rpm으로 와동하여, 상온에서 50g로 원심분리 한 후, 37℃에서 5분 동안 방치하였다. 상온에서 50g로 1분 동안 원심분리하고, 100% 아이소프로판올을 300uL 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 4℃에서 3000g로 20분 동안 원심분리하고 게놈 DNA 덩어리를 확인한 다음, microtiter plate를 뒤집어 상층을 제거하였다. 상온에서 1시간 동안 게놈 DNA를 말린 다음, RA1 용액을 42uL 넣고, 48℃ 오븐에서 1시간 동안 반응시켰다.
Sentrix R BeadChip 의 준비와 활성화 증폭된 게놈 DNA를 RA1 용액에서 재현탁하는 동안, (SentrixR) BeadChip을 준비하였다. BeadChip을 꺼내어 100% 에탄올에서 20번 정도 위 아래로 흔들어 주고 5분과 10분의 반응 시간간격을 두고 흔들어 주었다. 100% 에탄올에서의 반응이 끝나면, BeadChip을 PB1 용액으로 옮겨 흔들어 주고, 100% 에탄올에서와 같은 방법으로 2.5분, 5분의 시간 간격을 두고 흔들어 주었다. 상온에서 280g로 1분 동안 원심분리를 한 후, 추천된 순서(Illumina사로부터)에 따라 조립하여 BeadChip Chamber (called Flow through chamber)를 제조하였다. 100% 포름아마이드 150uL를 BeadChip Chamber에 통과시키고, RA1 용액 150uL를 두 번 반복하여 통과시켰다. 게놈 DNA를 첨가하기 전까지 BeadChip Chamber를 PB2 용액이 든 혼성화 챔버(Hybridization chamber)에 넣어 두었다.
혼성화 증폭된 게놈 DNA의 재현탁 (48℃, 1시간 반응)이 끝나면, 1800rpm으로 1분 동안 와동하고 280g에서 원심분리한 다음, 95℃ heat block에서 20분 동안 증폭된 게놈 DNA를 변성화 한 후, 280g로 원심분리하였다. 4개의 well로 나누어진 게놈 DNA를 하나의 well로 모으고, 280g로 원심분리하였다. 혼성화 챔버(Hybridization Chamber)로부터 BeadChip Chamber를 꺼내어 게놈 DNA를 넣어준 다음, BeadChip Chamber를 다시 혼성화 챔버(Hybridization Chamber)에 넣고, 48℃에서 18시간 동안 적정속도로 흔들어가면 반응시킨다.
대립형질 특이적 프라이머 신장( Allele - Specific Primer Extension ; ASPE )에 의한 염색 18시간의 혼성화가 끝나면, BeadChip chamber를 꺼내어 450uL의 RA1 용액을 4차례 흘려 보냈다. XB1 용액 450uL와 XB2 용액 450uL, EMM 용액 200uL에 차례로 각각 10분, 5분, 15분 동안 반응시키고, 450uL의 95% 포름아마이드/1mM EDTA를 흘려 보냈다. 450uL의 XB3 용액을 흘려보내고, Illuminas's 프로토콜에 따라 LMM과 ASM 용액으로 게놈 DNA을 염색하였다. BeadChip chamber를 분해하여 BeadChip을 PB1 용액으로 씻어준 다음, 280g에서 1분 동안 원심분리하여 말린 후, Illumina BeadArray reader을 사용하여 스캔함으로써 각 BeadChip에 대한 이미지 파일을 저장하였다.
유전자형 분석 이미지 파일로부터 유전자형의 분석은 Illuminas GenCall software (version 6.2.0.4)를 사용하여 각 단일염기다형에 대한 유전자형를 정하였다. GenCall은 두 개의 대립인자를 인식하는 프로브들 사이의 발색의 세기에 대한 비율을 가지고 전형적인 유전자형의 패턴을 나타나며, GenCall score로 기록된다.
4. 통계학적 분석
단일염기다형들을 구성하는 대립인자들에 대한 집단내의 유전학적 분포여부에 대하여 하아디-와인버그 평형 검정을 하였다. 이는 HapAnalyzer (ver. 1.0.1)라는 프로그램을 사용하여 시행하였다. 여기에서 단일염기다형의 기준이되는 HWE p value > 0.05와 작은 대립인자 빈도(Minor Allele Frequency; MAF) > 0.1의 기준을 적용하였으며, 이에 해당하지 않는 대립인자를 가진 단일염기다형들을 모두 제거하였다. 환자군과 정상인군 간의 출현빈도를 이용하여 질병에 대한 각 단일염기다형들의 연관성 분석은 유의수준을 < 0.05로 정하였으며, SNPAlyze (ver. 5.1)와 SPSS (ver. 14.0)를 사용하여 분석하였다. 연관성 분석은 대립인자들 간의 환자군과 정상인군에서의 출현빈도로 나누어 유의성 있는 차이를 비교하였으며, 유의수준을 < 0.05로 하였다. 이때, 오즈비(위험도; odds ratio; OR)가 1 이상의 결과 값을 나타내는 대립인자를 위험인자로 정하였으며, 이 오즈비에 대한 95% 신뢰구간(confidence interval; CI)도 측정되었다. 위험인자를 기준으로 공동-우성 유전자형, 우성 유전자형, 열성 유전자형을 정하여 환자군과 정상인군에서의 출현빈도를 비교 분석하였다. 유전자형 연관성분석에서도 출현빈도의 유의수준을 < 0.05로 하였으며, 일차적으로 logit p value < 0.05를 확인 한 후, 기대빈도수가 5 이하로 나타나는 단일염기다형들을 재확인하기 위하여 피셔의 정밀 검정(Fisher's exact test)도 시행하였으며, 이 역시 유의수준을 exact p value < 0.05로 정하였다.
단일염기다형들 간의 연관비평형 검정을 하였다. 이는 Haploview (ver. 5.0)을 사용하였다. 환자군과 정상인군 모두에서 형성되는 각 단일염기다형들간의 상호연관성에 대한 분석에서 형성된 연관비평형 블록으로부터 반수체형이 형성되었으며, 이들을 환자군과 정상인군으로 나누어 환자군 특이적인 반수체형을 분석하였다.
5. 단일염기다형의 분석에 대한 관찰
각 단일염기다형의 결과로부터 특정 단일염기다형들은 서로 밀접한 연관성을 지니고 하나의 블록단위를 형성하는 것을 알 수 있고, 이러한 블록단위를 연관비평형 블록이라 부르는데, 블록을 형성하는 단일염기다형들은 감수분열 동안 일어나는 염색체 교차(crossing over)에서 같이 움직이는 것을 예상할 수가 있다. 또한 관찰된 유전자형을 분석함으로써 연관비평형 블록의 반수체형을 알아낼 수가 있다[도 2; 표 4a (Block 1) 및 4b (Block 2)].
|
r2 |
D' value |
SNPs |
rs4723263 |
rs1009355 |
rs4723263 |
- |
0.698 |
rs1009355 |
1 |
- |
|
r2 |
D' value |
SNPs |
rs3884597 |
rs4604335 |
rs6944723 |
rs6462477 |
rs10225698 |
rs3884597 |
- |
0.728 |
0.728 |
0.664 |
0.664 |
rs4604335 |
1 |
- |
1 |
0.484 |
0.484 |
rs6944723 |
1 |
1 |
- |
0.484 |
0.484 |
rs6462477 |
1 |
1 |
1 |
- |
1 |
rs10225698 |
1 |
1 |
1 |
1 |
- |
표 4a 및 표 4b는 각각 도 2에 나타난 각 단일염기다형들 사이의 연관비평형 블록의 조밀함을 수치화하여 나타낸 것으로 D' 값과 r2값을 나타내고 있다. 이 D' 값이 0.8 이상이 될 때, 각 단일염기다형들은 연관비평형 관계에 있다고 판단하며, 도 2에서 보듯이 붉은 색으로 표시된다. 이러한 D' 값의 범위는 0 ∼ 1까지이며, 각 단일염기다형들 사이의 게놈 DNA 상에서의 떨어져 있는 거리에 대한 계산이 포함되어 있다. 또한 r2 값은 각 단일염기다형들 간의 상관관계를 나타내는 것으로 r2 값이 0.3 이상이면 그 값에 해당하는 단일염기다형들이 매우 조밀하게 묶여있다는 것을 뜻한다. 이는 앞서 언급한 도 2과 표 4a, 표 4b에서 뜻하는 바는 상기 2개(block 1), 5개(block 2)의 단일염기다형들이 서로 밀접하게 연관되어 있어 유전적 단위체를 형성한다는 것이다. 또한 이렇게 형성된 단위체들은 다음 세대로 유전될 때, 같이 묶여서 전달되게 된다. 따라서 연관비평형 블록들이 환자군 특이적으로 나타나 질병을 일으키는데, 많은 영향을 미칠 경우, 그 블록 자체가 다음 세대로 전달되기 때문에, 다음 세대의 자손에 대한 질병이 일어날 수 있는 빈도를 예측할 수 있다.
연관비평형 블록들로부터 형성되는 유전적 단위체는 각 단일염기다형의 대립인자형 분석으로부터 그 유형이 결정되는데, 이를 반수체형(haplotype)이라고 한다 (도 3).
도 3은 도 2로부터 형성된 연관비평형 블록으로부터 유전자형의 분석결과와 대비하여 형성된 반수체형이다. 도 2에서 나타난 두 개의 연관비평형 블록 중 block 1으로부터 3개, block 2로부터 4개의 반수체형이 나타나며, 각각의 블록에서 환자군에서 특이적으로 많이 나타나는 반수체형과 정상인군에서 특이적으로 많이 나타나는 반수체형이 관찰 되었다(표 5). 반수체형은 다음 세대로 유전되기 때문에, 이러한 반수체형이 질병과 연관되는지를 분석할 필요가 있다. 총체적으로 연관비평형블록과 반수체형에 대한 질병관련 분석은 지금 세대에서의 질병의 진단 뿐 만아니라, 그 질병의 다음 세대로의 전달까지 예측할 수 있게 한다. 표 5는 도 3의 반수체형들의 빈도수가 환자군과 정상인군 사이에서 나타나는 빈도에 유의성 있는 차이를 조사한 결과이다.
Blocks |
서열번호 |
Haplotype |
Frequency |
Case, control ratios |
Chi square |
p value |
Block 1 |
ht-1 |
CG
|
0.641
|
0.781 : 0.500
|
5.497
|
0.019
|
ht-2 |
GA
|
0.281
|
0.156 : 0.406
|
4.947
|
0.026
|
ht-3 |
GG |
0.078 |
0.062 : 0.094 |
0.217 |
0.641 |
Block 2 |
ht-4 |
GAAAG
|
0.516
|
0.719 : 0.312
|
10.573
|
0.001
|
ht-5 |
TGTGC
|
0.312
|
0.156 : 0.469
|
7.273
|
0.007
|
ht-6 |
TGTAG |
0.094 |
0.063 : 0.125 |
0.736 |
0.391 |
ht-7 |
GGTAG |
0.078 |
0.063 : 0.094 |
0.217 |
0.641 |
Block 1에서는 환자군과 정상인군 사이에 유의성 있는 차이를 나타내는 두 개의 반수체형이 관찰되어 졌다. 반수체형 ht-1은 CG로 나타나며 이는 환자군에 특이적으로 높은 빈도로 나타난다. 반면 반수체형 ht-2는 GA로 나타나며 이는 정상인군에 특이적으로 높은 빈도로 나타난다. Block 2에서는 환자군과 정상인군 사이에 유의성 있는 차이를 나타내는 두 개의 반수체형이 관찰되었다. 반수체형 ht-4는 GAAAG로 나타나며, 이는 환자군에 특이적으로 높은 빈도로 나타난다. 반면 반수체형 ht-5는 TGTGC로 나타나며, 이는 정상인군에 특이적으로 높은 빈도로 나타난다. 결론적으로 반수체형 ht-1과 ht-4는 환자군에서 특이적으로 나타나는 반수체형으로 이러한 반수체형을 가지고 있는 사람은 조기폐경이라는 질병에 감수성(susceptibility)을 가진다고 예측할 수 있다. 반대로 ht-2와 ht-5는 정상인군에서 특이적으로 나타나는 반수체형으로, 이 반수체형을 가진 사람들은 비교적 조기폐경과 무관하다고 할 수 있다.
상기와 같은 분석의 결과 볼 때, 각 대립인자는 각 개체에 있어서 동형접합자 (homozygote) 또는 이형접합자 (heterozygote)의 형태로 존재할 수 있다. 멘델의 유전법칙과 하디-와인버그 (Hardy-Weinberg) 법칙에 의하면, 집단을 구성하는 대립인자의 조성은 일정한 빈도로 유지되며, 통계적으로 유의한 경우 생물학적 기능상의 의미를 부여할 수 있다. 본 발명의 단일염기다형은 조기폐경 환자에게서 통계적으로 유의한 수준으로 출현되어, 더불어 이들 단일염기다형으로부터 유전적 단위까지 조기폐경의 진단과 더 나아가 예측에까지 사용될 수 있음을 알 수 있다.