KR20110011306A

KR20110011306A - 텔로미어 유지 유전자를 이용한 폐암 감수성 진단용 마커 및 폐암 감수성 예측 및 판단 방법

Info

Publication number: KR20110011306A
Application number: KR1020090068891A
Authority: KR
Inventors: 박재용; 이명훈; 김인산; 최진은
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2009-07-28
Publication date: 2011-02-08

Abstract

본 발명은 텔로미어(telomere) 유지 유전자인 TERT 또는 TNKS1 유전자의 다형성(polymorphism)을 이용한 폐암 감수성 진단용 마커 및 이를 이용한 폐암 예후 (또는 감수성) 예측 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 TERT 또는 TNKS1 유전자의 다형성에 근거한 폐암 감수성 진단용 마커, 폐암 감수성 진단용 조성물, 이를 이용한 폐암 감수성 예측 및 판단 방법에 관한 것이다.

폐암, 감수성, TERT, TNKS1, 다형성, SNP

Description

텔로미어 유지 유전자를 이용한 폐암 감수성 진단용 마커 및 폐암 감수성 예측 및 판단 방법{Markers for the diagnosis of susceptibility to lung cancer using telomere maintenance genes and method for predicting and analyzing susceptibility to lung cancer using the same}

텔로미어(telomere)는 핵산-단백질 복합체로서, 염색체들의 분해, 말단 대 말단 융합(end-to-end fusion), 및 비정형 재조합을 방지하는 특별한 구조이다. 따라서, 텔로미어는 염색체 안정성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 텔로미어는 "쉘터린(shelterin) 또는 텔로좀(telosome)"으로 알려진 멀티단백질 복합체에 결합된 TTAGGG 반복서열로 구성되어 있다. 텔로미어의 완전성(integrity) 및 기능은 TTAGGG 반복서열의 최소한의 길이와 쉘터린 복합체의 완전성 둘 다가 필요하다. 리보핵산단백질(ribonucleoprotein)인 텔로머라제(telomerase)는 텔로미어 역전사효소(telomere reverse transcriptase, TERT)와 텔로미어 RNA 구성성분으로 구성되어 있으며, 텔로미어 길이의 주요 양성 조절자로서, 각각의 세포 분열 후 TTAGGG 반복서열을 de novo로 더해준다.

많은 쉘터린 복합체를 구성하는 텔로머릭(telomeric) 단백질이 동정되어 있으며, 이러한 단백질은 텔로미어 구조 및 길이의 안정화를 책임진다. TTAGGG 반복서열 결합 인자 1 (TTAGGG repeat binding factor 1, TRF1(또한 TERF1으로 알려짐))는 이중가닥 텔로머릭 DNA에 결합하고, 텔로미어의 길이를 직접 또는 그들의 탠킬라제(tankylase)(telomeric ankyrin-like poly(ADP-ribose) polymerase, TNKS)와 TRF1-상호작용 핵 단백질 2(TRF1-interacting nuclear protein 2, TIN2(또한 TINF2로 알려짐))의 상호작용에 의해 조절된다. TNKS1은 TRF1의 ADP-라이보실화(ADP-ribosylation)를 촉매시키고, 이로 인해 TRF1의 텔로미어에 결합하는 능력을 억제한다. 그 결과, 텔로머라제가 텔로미어에 접근할 수 있도록 하여서 텔로미어 신장을 하게 된다. 반면에, TRF1이 TIN2 단백질에 결합하면 텔로머릭 DNA의 조밀화, T-루프(T-loop)의 안정화, 및 텔로머라제의 접근을 제한하여서 텔로미어 길이의 음성 조절자로서 작용한다. TRF1과 마찬가지로, TRF2는 이중가닥 텔로머릭 DNA에 결합한다. 비록 TRF2가 텔로미어의 길이의 음성 조절자로서도 작용하지만, 이는 말단-대-말단 융합을 방지하는 데 더 중요하다. 따라서, TRF2는 텔로미어 완전성을 유지하는데 더 중요한 역할을 한다. 억제제 활성화 단백질 1(repressor activator protein 1, RAP1(또한 TERF2 상호작용 단백질로 알려짐, TERF2 interacting protein (TERF2IP)))이 TRF2에 의해 텔로미어에 모여서, 텔로미어의 길이를 음성적으로 조절한다. POT1은 3' 단일쇄 TTAGGG 돌출부분에 결합하여, 보호한다. 게다가, 보호역할 뿐만아니라, POT1은 텔로머라제에 의한 텔로미어의 길이의 신장을 제한한다.

몇몇 연구는 같은 연령의 정상 개체간에 텔로미어의 길이 및 텔로머라제 활성에 있어서, 상당한 개체-상호간 변이가 있다고 보고하고 있다. 또한, 짧은 텔로미어를 가진 개체는 폐암을 포함한 암에 대한 위험성이 증가한다고 보고되고 있다. 다른 많은 표현형 형질과 마찬가지로, 텔로미어의 길이 및 텔로머라제 활성에 있어서의 변이는 텔로미어의 생물학에 관여하는 유전자들 내의 기능적인 다형성의 결과일 수 있다. 폐암의 발생원인 중에서 흡연이 폐암의 주요한 원인으로 생각되어 지고 있지만, 소수의 흡연자들에게서만 상기 질환이 나타나는 점을 감안하면, 발암으로 진행되는 개인적 감수성에 있어서 유전적인 인자가 중요한 역할을 하고 있음을 유추할 수 있다.

개체간의 유전적 차이는 개체간의 DNA 염기서열의 차이에 의해 초래되는데 이러한 염기서열의 차이는 변이와 다형성(polymorphism)으로 구분되는데, 다형성은 표현형의 차이를 초래하며 그 빈도가 인구의 1% 이상인 경우 다형성 유전형으로 정의한다.

단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)은 유전체 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 의미하며, 이러한 SNP 변이는 보통 유전체상의 염기서열에서 1000개당 한번 꼴로 나타나고 있다고 알려져 있다.

또한, SNP는 인간의 유전체에서 발생하는 변이의 약 90%를 차지하고 있고, 비슷한 형질이나 같은 가계도를 가지고 있는 사람들은 동일하거나 또는 비슷한 SNP 패턴을 보이기 때문에 임상에서 개체의 질병에 대한 효과 및 부작용을 예측할 수 있는 지표로 사용될 수 있을 것이다.

이에 본 발명자들은 텔로미어 길이 및 안정성에 이러한 유전자들 내의 유전적 다형성이 영향을 미칠 것이라는 가정을 세웠고, 따라서 폐암에 대한 감수성을 조절할 수 있을 것이라고 생각하여, 텔로미어 생물학에 중요한 7개의 유전자들(TERT, TRF1, TNKS1, TIN2, TRF2, RAP1 및 POT1) 내의 다형성과 폐암의 위험성과의 연관성을 밝히기 위해 예의 노력한 결과, 환자군-대조군 연구를 통해 텔로미어 유지 유전자의 다형성과 폐암 위험성의 연관성을 밝혀서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 TERT 또는 TNKS1 유전자의 다형성 부위를 포함하는 폐암 감수성 진단용 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 폐암 감수성 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 폐암 감수성 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 TERT 또는 TNKS1 유전자의 다형성 부위를 포함하는 폐암 감수성 진단용 어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 TERT 또는 TNKS1 유전자의 다형성을 이용하여 폐암 감수성을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 110번째 염기 (TERT 유전자의 전사시작점에서 -1327번째 염기) C가 T로 치환되고, 상기 110번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 2의 92번째 염기(TERT 유전자의 엑손 2 영역에서 696번째 염기) G가 A로 치환되고, 상기 92번째 염기를 포함하는 20-100개의 연 속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3의 35번째 염기(TNKS1 유전자의 인트론 3 영역에서 -34번째 염기) A가 G로 치환되고 상기 35번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 폐암 감수성 진단용 마커에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 TERT 유전자 및 TNKS1 유전자의 다형성은

1) 서열번호 1의 110번째 염기(TERT 유전자의 전사시작점에서 -1327번째 염기) C가 T로 치환된 것으로 GenBank 에 공지된 서열(접근번호 NT_006576)로서, 상기 NT_006576서열 중 1286377~1286566번 서열을 서열번호 1로 나타내었다. 한편, 상기 다형성 부위를 'TERT -1327 C>T' 또는 'TERT rs2735940 g. C>T'로 표시하고, SNP ID는 'rs2735940'으로 표시한다.

2) 서열번호 2의 92번째 염기(TERT 유전자의 엑손 2 영역에서 696번째 염기) G가 A로 치환된 것으로 GenBank 에 공지된 서열(접근번호 NT_006576)로서, 상기 NT_006576서열 중 1283995~1284198번 서열을 서열번호 2로 나타내었다. 한편, 상기 다형성 부위를 'TERT A305A(G>A)' 또는 'TERT rs2736098 g. G>A'로 표시하고, SNP ID는 'rs2736098'로 표시한다.

3) 서열번호 3의 35번째 염기 (TNKS1 유전자의 인트론 3 영역에서 -34번째 염기) A가 G로 치환된 것으로 GenBank 에 공지된 서열(접근번호 NT_077531)로서, 상기 NT_077531서열 중 2012744~2012810번 서열을 서열번호 3으로 나타내었다. 한편, 상기 다형성 부위를 'TNKS1 IVS3-34 A>G' 또는 'TNKS1 rs6985140 g. A>G'로 표 시하고, SNP ID는 'rs6985140'으로 표시한다.

본 발명에서 용어, "진단"은 질병 발생의 예측 및 질병 발생위험도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다. 또한 본 발명에서 용어, "감수성"이란 폐암에 대한 민감도, 즉 폐암 발생위험도의 증가 및 감소를 나타낸다.

본 발명에서 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명에서 용어, "대립유전자 (allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자 (biallele)를 갖는다.

본 발명에서 용어, "SNP ID"란 1998년부터 SNP 정보를 축적하기 시작한 NCBI가 초기에 등록되는 모든 SNP에 대하여 부여한 독립된 표지자인 rs-ID를 의미한다.

본 발명의 진단용 마커를 이용하여 진단할 수 있는 폐암은 전체 폐암일 수 있으며, 바람직하게는 편평상피암, 선암, 소세포암, 대세포암 또는 비소세포암일 수 있다.

본 발명자들은 한국인의 폐암 감수성 진단용 마커를 개발하기 위하여 텔로미어 유지 유전자인 TERT 유전자와 TNKS1 유전자의 다형성을 이용하였다. 짧은 텔로미어를 가진 개체는 폐암을 포함한 암의 위험성을 증가시킨다고 보고되고 있으며, 텔로미어 길이 및 안정성에 텔로미어 유지 유전자들 내의 기능적인 다형성의 결과일 것이라고 가정하여 상기 유전자의 다형성과 폐암 위험성과의 상관관계를 연구하였다. TERT 발현은 전사 수준에서 주로 조절된다. TERT 프로모터 인접 부위인, 구체적으로 전사 시작 위치의 업스트림(upstream)의 181bp 코어 프로모터(core promoter)는 TERT 유전자의 기본 전사 활성을 책임진다고 알려져있다. 상기 프로모터 부위는 c-Myc/Mad/Max 결합 위치(E-박스) 및 Sp1 결합 위치를 포함하는 다양한 전사 인자 결합 위치를 갖고 있다. TERT 유전자의 프로모터내의 rs2735940 g.C>T (-1327C>T) 및 rs2853669 g.T>C (-244T>C) 는 전사 인자 결합에 영향을 주며, 그로 인해 TERT 발현을 조절한다. TNKS1은 TRF1의 텔로미어 DNA에 결합하는 것을 비활성화시켜서 "열린(open)" 텔로미어 구조를 초래하고, 결과적으로 TERT의 텔로미어로의 접근을 가능하게 한다.

본 발명자들은 상기 TERT 및 TNKS1의 다형성이 폐암 감수성 진단용 마커임을 다음과 같은 입증을 통해 확인하였다. 본 발명자들은 폐암 발생에 관여하는 여러 유전자들 가운데 폐암 위험성과 관련성이 있는 텔로미어 유지 유전자의 다형성인 10개의 SNP를 발굴하였고(실시예 1), 폐암 발생에 관여하는 유전자의 다형성과 폐 암 위험도와의 관계를 폐암으로 진단받은 환자 720명과 정상인 720명을 대상으로 환자군-대조군 연구를 실시하여 환자군과 정상 대조군 간의 다형성의 대립형질 빈도를 조사하여 상관관계를 밝혔다(실시예 2). 그 결과, 3개의 다형성인 TERT rs2735940 g.C>T 및 rs2736098 g.G>A, 및 TNKS1 rs6985140 g.A>G가 폐암 위험성과 유의적으로 연관되었다는 것을 밝혔다(표 5).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 표의 일배체형(haplotype)을 포함하는 폐암 감수성 진단용 마커를 제공한다.

TERT 유전자에서의 위치	서열번호에서 위치	일배체형 1	일배체형 2	일배체형 3	일배체형 4
전사시작점에서 -1327번째	서열번호 1의 110번째	C	C	T	T
엑손 2 영역에서 696번째	서열번호 2의 92번째	G	A	G	A

본 발명에서 용어, "일배체형"이란, 개체로부터 단일 유전자에 대한 복수의 다형성 및 개체마다 상이한 다수의 다형성 부위에서 변이의 특정 조합을 의미한다. 최근 연구들에서는 질병과의 연관성을 예측하는 데 있어서 단일 다형성 분석보다 일배체형 분석을 더 높이 사고 있다(Sun, T., et al., Natl . Cancer Inst ., 96, 1030-1036, 2004).

따라서, 상기 일배체형이 폐암 감수성 진다용 마커임을 다음과 같은 입증을 통해 밝였다. 본 발명자들은 폐암 환자군에서 일배체형 분석을 통해, TERT rs2735940T/rs2736098A 일배체형 4가 양 좌위에서 야생형 대립유전자를 가진 rs2735940C/rs2736098G 일배체형에 비해 폐암 위험성이 유의적으로 증가하는 것과 연관되었음을 밝혔다(표 6). TNKS1 일배체형 분석에서, 군집 중에서 rs6985140G 대립유전자를 가진 유일한 일배체형인 C-G-A 일배체형 4 (rs6990097C/rs6985140G/rs7006985A)가 다른 일배체형에 비해 폐암 위험성이 유의적으로 증가하는 것과 연관되었음을 밝혔다(표 6).

본 발명자들은 다음으로 개체별 SNP 분석에서 폐암과 유의적으로 연관이 있는 것으로 밝혀진 세 개의 SNP(TERT rs2735940 g.C>T and rs2736098 g.G>A; 및 TNKS1 rs6985140 g.A>G)의 폐암 위험성에 있어서의 조합된 효과를 평가하였다. TERT 일배체형 4 및 TNKS1 rs6985140G 대립유전자는 폐암 위험성의 증가와 연관되어있기 때문에, 본 발명자들은 TERT 일배체형 및 TNKS1 rs6985140G를 위험성 대립유전자로 삼은 후, 위험성 대립유전자의 수를 바탕으로 피실험자를 4개 또는 3개의 군으로 분류하여, 상기 위험성 대립유전자의 조합된 효과를 평가하였고, 환자군에서 조합된 유전자형의 분포는 대조군의 분포와 유의적으로 다르며 폐암 위험성은 위험성 대립유전자의 수가 증가함에 따라 용량-의존적인 방식으로 증가한다는 것을 밝혀서 상기 일배체형이 폐암 감수성 진단용 마커임을 밝혔다(표7).

상기 폐암은 전체 폐암일 수 있으며, 바람직하게는 편평상피암, 선암, 소세포암, 대세포암 또는 비소세포암일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 110번째 염기 (TERT 유전자의 전사시작점에서 -1327번째 염기), 서열번호 2의 92번째 염기(TERT 유전자의 엑손 2 영역에서 696번째 염기) 및 서열번호 3의 35번째 염기(TNKS1 유전자의 인트론 3 영 역에서 -34번째 염기)를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 폐암 감수성 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 용어, "폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 제제"란 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 폐암 감수성을 진단할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다.

TERT 또는 TNKS1 유전자의 다형성 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 바람직하게는 서열번호 4 및 5, 서열번호 6 및 7, 및 서열번호 8 및 9의 서열을 가지는 프라이머 쌍이다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 바람직하게는 4 및 5, 서열번호 6 및 7, 및 서열번호 8 및 9의 서열을 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 폐암의 생존 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폐암 감수성 진단용 조성물을 포함하는 폐암 감수성 진단용 키트에 관한 것이다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 TERT 또는 TNKS1 mRNA 발현 수준을 측정하 기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, TERT 또는 TNKS1 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 폐암 감수성 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

상기 진단용 키트에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각 종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성 화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머에는 리가제 연쇄 반응 (ligase chainreaction : LCR)에서는 사용되는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 프라이머로는 바람직하게 서열번호 4 및 5, 서열번호 6 및 7, 및 서열번호 8 및 9로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 쌍일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 110번째 염기 (TERT 유전자의 전사시작점에서 -1327번째 염기) C가 T로 치환되고, 상기 110번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 2의 92번째 염기(TERT 유전자의 엑손 2 영역에서 696번째 염기) G가 A로 치환되고, 상기 92번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 35번째 염기(TNKS1 유전자의 인트론 3 영역에서 -34번째 염기) A가 G로 치환되고 상기 35번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폐암 감수성 진 단용 마이크로어레이에 관한 것이다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하여 폐암 생존 예후 예측 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 예측 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30 ℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명의 폐암과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 검체로부터 DNA를 수득하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 서열번호 1의 110번째 염기 (TERT 유전자의 전사시작점에서 -1327번째 염기), 서열번호 2의 92번째 염기(TERT 유전자의 엑손 2 영역에서 696번째 염기) 및 서열번호 3의 35번째 염기(TNKS1 유전자의 인트론 3 영역에서 -34번째 염기)로 이루어진 군에서 하나 이상의 다형성 부위를 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하여 폐암 위험성을 분석하는 단계를 포함하는 폐암 감수성 예측 방법에 관한 것이다.

본 발명의 용어, "검체"란 폐암 감수성 예측을 위한 대상 인간으로, DNA의 수득은 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료로부터 DNA를 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폐암은 전체 폐암일 수 있으나, 바람직하게는 편평상피암, 선암, 소세 포암, 대세포암 또는 비소세포암일 수 있다.

상기 (a) 단계의 게놈 DNA 수득 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다.

상기 (b) 단계의 다형성 부위를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 (c)단계의 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 PCR-RFLP 분석에 의하며, 프라이머는 서열번호 4 및 5, 서열번호 6 및 7, 및 서열번호 8 및 9의 서열을 가지는 프라이머 쌍에 의한다.

TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

상기에서, 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기 의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP을 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.

한편, 상기 (c) 단계에서 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하여 폐암 감수성을 예측 및 판단하고자 할 때, 상기 (c) 단계에서 결정된 서열번호 1의 110번째 염기(TERT 유전자의 전사시작점에서 -1327번째 염기)가 T인 경우에는 폐암 위험성이 증가되는 것으로 판단할 수 있다.

또한, 상기 (c) 단계에서 결정된 서열번호 2의 92번째 염기(TERT 유전자의 엑손 2 영역에서 696번째 염기)가 A인 경우 폐암 위험성이 증가되는 것으로 판단할 수 있다.

나아가, 상기 (c) 단계에서 결정된 서열번호 3의 35번째 염기(TNKS1 유전자의 인트론 3 영역에서 -34번째 염기)가 G인 경우 폐암 위험성이 증가되는 것으로 판단할 수 있다.

게다가, 상기 (c) 단계에서 결정된 염기가 하기 표의 일배체형 4인 경우에는 폐암 위험성이 증가되는 것으로 판단할 수 있다.

TERT 유전자에서의 위치	서열번호에서의 위치	일배체형 4
전사시작점에서 -1327번째	서열번호 1의 110번째	T
엑손 2 영역에서 696번째	서열번호 2의 92번째	A

본 발명은 텔로미어 유지 유전자인 TERT 또는 TNKS1 유전자의 다형성에 근거하여 폐암 감수성을 종합적으로 판단하는 폐암 감수성 진단용 마커, 진단용 조성물, 진단 키트, 마이크로어레이 및 폐암 감수성을 예측 및 판단방법을 제공하여, 폐암에 걸릴 유전적 소인을 가려내어 폐암에 걸릴 유전적 소인을 가려낼 수 있도록 하며, 이로 인해 폐암에 걸릴 위험도를 알아냄으로써 폐암을 예측하고 판단하는데 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 다형성 선정과 확인

7개 유전자들(TERT, TRF1, TNKS1, TIN2, TRF2, RAP1 및 POT1)의 잠재적인 기능적 변이를 스크린하기 위해서, 본 발명자들은 공개 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)를 사용하여, 유전자의 기능에 영향을 줄 것이라고 생각한 부위인 유전자의 프로모터 부위, 인트론-엑손 경계부위(인트론 양쪽의 50bp)를 포함한 모든 엑손 및 3'-UTR 부위 내에서 변이 후보자를 찾았다. 35개의 SNP를 포착하였고, 27명의 건강한 한국인을 포함한 예비 실험에서 직접적인 서열분석을 통해서 상기 SNP의 빈도를 결정하였다. 모든 SNP에 관한 정보, SNP ID 및 대립유전자(allele) 빈도는 NCBI 홈페이지에서 얻었다. 유전자 참조 서열에서, 전사시작점을 +1로 계산하였다. PCR 프라이머는 유전자 은행(GenBank) 참조 서열을 바탕으로 제작하였다. 하기 표1에 PCR에 사용한 프라이머 서열 및 어닐링(annealing) 온도를 나타냈다.

서열 변이는 두 명의 연구자에 의해 독립적으로 확인하였다. 27명의 건강한 한국인에서의 35개의 SNP의 빈도 및 LD 계수는 하기 표 2 및 도 1에 나타냈다.

^* SNP, SNP ID 및 다른 인종의 대립유전자 빈도에 대한 정보는 NCBI에서 얻었다. 참조 서열에서 전사시작점을 +1으로 계산하였다.

35개의 SNP 평가 중, 27명의 피실험자 가운데 ≥10%의 소수의 대립유전자 빈도를 가진 SNP는 17개였다. 마지막으로, 10개의 일배체형-표지 SNP(haplotype-tagging SNP)를 SNP의 LD 계수를 바탕으로 환자군-대조군 연구(case-control study)를 위해 선택하였다. 하기 10개의 SNP를 환자군-대조군 연구에서 조사하였다: TERT rs2735940 (-1327C>T) 및 rs2736098 (A305A, 엑손 2의 659G>A); TRF1 rs2975843 (-1119A>G) 및 rs2975841 (IVS2+11T>G); TNKS1 rs6990097 (-588T>C), rs6985140 (IVS3-34A>G) 및 rs7006985 (T462T, A>G); TRF2 rs251796 (IVS7-41T>C); RAP1 rs1865493 (+59G>C); 및 POT1 rs10228682 (-809A>G).

실시예 2: 환자군-대조군 연구

<2-1> 환자군-대조군 연구의 선정 및 통계학적 분석

720명의 폐암 환자와 720명의 건강한 성인을 대상으로 환자군-대조군 연구를 수행하였으며, 등록을 위해 사용한 방법은 이전에 보고된 바와 동일하게 수행하였다(Lee SJ et al. Carcinogenesis 26, 403-9, 2005). 간략히, 참가한 환자군은 2001년 1월에서 2002년 12월 사이에 경북대학교 병원(대한민국, 대구광역시)에서 새롭게 원발성 폐암으로 진단받은 환자들이다. 이들은 성별, 조직형 또는 병기의 제한은 없지만, 그러나 75세 이상의 환자 또는 이전에 암 병력을 가진 환자들은 제외하였다. 환자군의 조직형은 편평상피암(squamous cell carcinoma) 320명(44.4%), 선암(adenocarcinoma) 273명(37.9%), 소세포암(small cell carcinoma) 115명(16.0%), 및 대세포암(large cell carcinoma) 12명(1.7%)이었다. 대조군은 동일한 기간에 경북대학교 병원에 내원하여 통상적인 건강 진단을 받은 건강한 성인 자원자 중 무작위로 선택하였다. 대조군은 성별과 연령(±5살)을 바탕으로 암 환자군과 빈도 매치(1:1)하였다. 본 실험에 등록한 모든 피실험자(환자군 및 대조군)는 대구시 또는 인근 지역에 사는 한국인이었다. 본 실험은 경북대학교 병원 임상시험심사위원회의 승인을 받았고, 각각의 환자들로부터 서면 동의서를 받았다.

환자군-대조군 연구의 인구 통계학적 분석을 하기 표 3에 나타냈다.

^* t-test

^# 괄호안의 숫자는 컬럼 백분율임

^¶ χ² 테스트

^§ 현재 및 이전의 흡연자

상기 표 3에서 보듯이, 환자군과 대조군 간의 평균 연령 또는 성별의 분포에 유의적인 차이가 없었다. 그러나, 환자군 중의 현재 흡연자가 대조군보다 더 많고(P < 0.001), 환자군 중의 흡연자의 흡연량의 수가 대조군보다 유의적으로 더 높았다(흡연량이 39.8±18.1 대 32.8±18.0; P < 0.001). 이러한 차이를 나중의 다변량 분석(multivariate analyses)에서 조절하였다.

<2-2> 유전자형 분석

10개의 SNP의 유전자형은 PCR-RFLP 또는 PCR 및 형광-표지된 혼성화 프로브(fluorescence-labeled hybridization probes)를 이용한 멜팅 커브(melting-curve) 분석 (LightCycler 480, 로체 진단회사, 독일)으로 확인하였다. 프라이머 서열 및 혼성화 프로브는 하기 표 4에 나타냈다.

LightCycler를 이용한 유전자형 분석 성공 비율은 98% 이상이었다. LightCycler를 이용하여 점수를 얻지 못한 샘플들은 ABI PRISM 3700 유전학적 분석기(어플라이드 바이오시스템)를 이용한 직접적인 서열 분석으로 다시 유전자형 분석을 하였다. 모든 유전자형 분석을 정확한 결과를 도출하기 위해, 환자군 및 대조군의 상태에 대한 지식 없이 수행하였다. 또한, 시료의 약 10%를 무작위로 선택하여 다른 검사자에 의해 유전자형 분석을 하게 하였고, 그 결과 원래의 검사자가 실시한 분석결과와 100% 일치하였다.

<2-3> 통계학적 분석

환자군 및 대조군은 연속 변수에 대해서는 Student's t-테스트를 사용하여 비교하였고, 카테고리별 변수에 대해서는 χ² 테스트를 사용하여 비교하였다. 적합도 검정(goodness-of-fit) χ² 테스트를 사용하여, 하디-웨인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 조사하였고, SAS 유전학을 사용하여 수행하였다. 다형성간의 연관 비평형(linkage disequilibrium, LD)은 하플로뷰(HaploView) (http://broad.mit.edu/mpg/ haploview)를 사용하여 측정하였다. LD 블록(block)을 Gabriel et al .에 의해 제안된 정의로 추론하였다. 일배체형 및 그들의 빈도는 상 프로그램(Phase program)을 사용하여 바베시안 알고리즘(Bayesian algorithm)을 바탕으로 측정하였다. 유전자형 및 일배체형과 연관된 암 위험성은 비-조건적 로지스틱 회귀분석(unconditional logistic regression analysis)을 사용하여 대응비(odds ratio, OR) 및 95% 신뢰구간(confidence interval, CI)으로 측정하였다. 다중 비교시(multiple comparison), 다중 조사를 위한 교정된 P-값(Pc-값)은 본페로니의 부등식법(Bonferroni inequality method)을 사용하여 계산하였다.

유전자-흡연 상호작용 분석을 위해서, 본 발명자들은 하기의 두 가지 접근을 사용하여 결과의 일치성을 평가하였다: i) 유전자-흡연 결합 효과, 및 ii) 유전자형/일배체형과 흡연간의 상호작용 조건을 포함한 로지스틱 회귀 모델. 상기 분석을 위해서, 피험자를 흡연에 노출된 수준에 따라 3가지 군으로 분류하였다: 비-흡연자, 흡연량(pack-years)이 ≤33 갑인 흡연경험자(가벼운 흡연자) 및 흡연량이 > 33갑인 흡연경험자(심한 흡연자, 흡연 경험자의 흡연량 값의 중앙값). 모든 분석은 윈도우 프로그램을 위한 통계학적 분석프로그램(Statistical Analysis Software), 버전 9.1.3 (SAS사, 미국)을 사용하여 수행하였다.

그 결과, 환자군 및 대조군에서의 10개의 SNP의 유전자형 및 다형성 대립유전자 빈도를 하기 표 5에 나타냈다.

^* 환자군 및 대조군 간의 유전자형 분포나 대립유전자 빈도에 대한 two-sided χ² 테스트

^# OR (95% CI) 및 상응하는 P-값을 비-조건적 로지스틱 분석으로 계산하였다, 나이, 성별 및 흡연에 대한 팩-년수로 보정함

대조군 중의 13개의 SNP의 분포는 하디-웨인버그 평형상에 있었다. 10개의 SNP 중, 단지 3개의 SNP(TERT rs2735940 g.C>T 및 rs2736098 g.G>A; 및 TNKS1 rs6985140 g.A>G)만이 유의적으로 폐암의 위험성과 연관되었다. 각각의 우성 모델(dominant model) 및 열성 모델(ressesive model) 하에서, 각각의 SNP의 변이 대립유전자에 대하여 TERT rs2735940 g.C>T 및 rs2736098 g.G>A가 유의적으로 폐암 위험성의 증가와 연관되었다(각각, 보정된 OR = 1.31, 95% CI = 1.04-1.63, P = 0.02; 및 보정된 OR = 1.74, 95% CI = 1.21-2.51, P = 0.003). TNKS1 rs6985140 g.A>G에서, 조합된 AG 및 GG 유전자형이 AA 유전자형에 비해 폐암 위험성이 유의적으로 증가하는 것과 연관되었다(변수 G 대립유전자의 우성 모델하에서, 보정된 OR = 1.36, 95% CI = 1.06-1.76, P = 0.02).

TERT 및 TNKS1 일배체형 및 폐암 위험성 간의 연관성은 하기 표 6에 나타냈다.

^* OR (95% CI) 및 상응하는 P-값을 비-조건적 로지스틱 분석으로 계산하였다, 나이, 성별 및 흡연에 대한 팩-년수로 보정함

^# 빈도가 <5%인 두개의 일배체형은 분석에서 제와함

^¶ P=0.008 및 교정된 본페로니의 P-값(Pc)=0.024

^§ P=0.02 및 Pc=0.08

그 결과, 유전자형 분석과 일치하게, 두 좌위(loci)에서 변이 대립유전자를 가진 TERT rs2735940T/rs2736098A 일배체형(ht4)은 양 좌위에서 야생형 대립유전자를 가진 rs2735940C/rs2736098G 일배체형에 비해 폐암 위험성이 유의적으로 증가하는 것과 연관되었다(보정된 OR = 1.26, 95% CI = 1.06-1.50, P = 0.008 및 Pc = 0.024). TNKS1 일배체형 분석에서, 군집 중에서 rs6985140G 대립유전자를 가진 유일한 일배체형인 C-G-A 일배체형 (rs6990097C/rs6985140G/rs7006985A)이 다른 일배체형에 비해 폐암 위험성이 유의적으로 증가하는 것과 연관되었다(보정된 OR = 1.36, 95% CI = 1.07-1.72, P = 0.02 및 Pc = 0.08). 이러한 결과는 폐암 위험성에 있어서, TNKS1 SNP의 유전학적 효과가 다른 일배체형에 비해 rs6985140 g.A>G에서 더 많은 기여를 한다는 것을 제시한다.

본 발명자들은 다음으로 개체별 SNP 분석에서 폐암과 유의적으로 연관이 있는 것으로 밝혀진 세 개의 SNP(TERT rs2735940 g.C>T and rs2736098 g.G>A; and TNKS1 rs6985140 g.A>G)의 폐암 위험성에 있어서의 조합된 효과를 평가하였다. TERT 일배체형 4 및 TNKS1 rs6985140G 대립유전자는 폐암 위험성의 증가와 연관되어있기 때문에, 본 발명자들은 TERT 일배체형 4 및 TNKS1 rs6985140G를 위험성 대립유전자로 삼은 후, 위험성 대립유전자의 수를 바탕으로 피실험자를 4개 또는 3개의 군으로 분류하여, 상기 위험성 대립유전자의 조합된 효과를 평가하였다. 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 환자군에서 조합된 유전자형의 분포는 대조군의 분포와 유의적으로 다르며(4개의 군으로 분류시, P = 0.02 및 3개의 군으로 분류시 P = 0.01), 폐암 위험성은 위험성 대립유전자의 수가 증가함에 따라 용량-의존적인 방식으로 증가한다(P _trend < 0.001).

^* 0, ht1-3/ht1-3 + AA; 1, ht4/ht1-3 + AA, ht1-3/ht1-3 + AG; 2, ht4/ht4 + AA, ht4/ht1-3 + AG, ht1-3/ht1-3 + GG; 3, ht4/ht4 + AG, ht4/ht1-3 +GG; 및 4, ht4/ht4 + GG

^# 교정된 본페로니의 P-값(Pc)=0.009

^¶ Pc=0.002

1군은 대조군으로 사용하고, 피실험자를 3개의 군으로 분류시[위험성 대립유전자를 0개 가진 피실험자(1군), 1개 가진 피실험자(2군), 및 2-4개 가진 피실험자(3군)], 폐암에 대한 3군의 OR은 1.67이었다(95% CI = 1.23-2.27, P = 0.001). 이러한 결과는 폐암의 증가된 위험성에 있어서 TERT 일배체형 4 및 TNKS1 rs6985140G 대립유전자의 가산효과(additive effect)를 시사한다.

세 개의 SNP(TERT의 일배체형인 rs2735940 g.C>T 및 rs2736098 g.G>A 및 TNKS1 rs6985140 g.A>G 유전자형) 및 흡연 상태의 폐암 위험성에 있어서 결합 효과는 하기 표 8에 나타냈다. 위험성 대립유전자가 없는 비흡연자를 대조군으로 사용시, 2-4개의 위험성 대립유전자를 가진 심한 흡연자가 폐암 위험성이 가장 높았다(보정된 OR = 7.24, 95% CI = 3.84-13.68, P < 0.0001).

OR (95% CI) 및 상응하는 P-값을 로지스틱 회귀분석으로 계산하였고, 비흡연자의 변이 대립유전자가 0인 군을 대조군으로 사용하고, 나이 및 성별로 보정함

^* 환자군 no./대조군 no.

^# P=0.02; ^¶ P=0.008; ^§ P=0.002; ^♣ P<0.0001

도 1은 27명의 건강한 한국인에서 소수의 대립유전자 빈도가 10%인 정보적인 SNP를 사용하여 재구성한 LD 플롯(plot)을 도시한 것이다. Gabriel et al.에 의해 제안된 방법을 사용하여 하플로뷰 프로그램을 사용하여 상기 플롯을 생성하였다. 검은 박스는 강한 LD(강한 LD의 신뢰구간: 윗쪽이 0.98, 아래쪽이 0.7; 정보 비교에 있어서 강한 LD의 분획은 적어도 0.95이어야만 함)를 나타낸다. 하얀 박스는 강한 재조합(윗쪽의 신뢰구간은 최대 0.9)을 나타내고, 회색 박스는 비정보적인 발견을 나타낸다. 삼각형은 일배체형 블록을 나타낸다. 네모 안의 숫자는 ｜D'｜(x100) 값을 나타낸다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Kyungpook National University <120> Markers for the diagnosis of susceptibility to lung cancer using telomere maintenance genes and method for predicting and analyzing susceptibility to lung cancer using the same <130> PA090156KR <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 190 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggaacaaatt ttccaaaccg cccctttgcc ctagtggcag agacaattca caaacacagc 60 cctttaaaaa ggcttaggga tcactaaggg gatttctaga agagcgaccc gtaatcctaa 120 gtatttacaa gacgaggcta acctccagcg agcgtgacag cccagggagg gtgcgaggcc 180 tgttcaaatg 190 <210> 2 <211> 204 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctgccagacc cgccgaagaa gccacctctt tggagggtgc gctctctggc acgcgccact 60 cccacccatc cgtgggccgc cagcaccacg cgggcccccc atccacatcg cggccaccac 120 gtccctggga cacgccttgt cccccggtgt acgccgagac caagcacttc ctctactcct 180 caggcgacaa ggagcagctg cggc 204 <210> 3 <211> 67 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctgcctactg catttcttaa tctgtcttct gccaaatgct aacagcatga tattttgcaa 60 tcatcta 67 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TERT rs2735940 <400> 4 gccctagtgg cagagacaat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TERT rs2735940 <400> 5 tgcagggatg ctgtagctga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TERT rs2736098 <400> 6 gtggtttctg tgtggtgtca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TERT rs2736098 <400> 7 ctgaggagta gaggaagtgc 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TNKS1 rs6985140 <400> 8 tttgctgccc gtctccaagg cac 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TNKS1 rs6985140 <400> 9 gcaaaatatc atgctgttag cat 23

Claims

서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 110번째 염기 (TERT 유전자의 전사시작점에서 -1327번째 염기) C가 T로 치환되고, 상기 110번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 2의 92번째 염기(TERT 유전자의 엑손 2 영역에서 696번째 염기) G가 A로 치환되고, 상기 92번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3의 35번째 염기(TNKS1 유전자의 인트론 3 영역에서 -34번째 염기) A가 G로 치환되고 상기 35번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 폐암 감수성 진단용 마커.
하기 표의 일배체형 1 내지 일배체형 4로 이루어진 군에서 선택되는 일배체형을 포함하는 폐암 감수성 진단용 마커.

TERT 유전자에서의 위치 서열번호에서 위치 일배체형
1 일배체형
2 일배체형
3 일배체형
4 전사시작점에서 -1327번째 서열번호 1의 110번째 C C T T 엑손 2 영역에서 696번째 서열번호 2의 92번째 G A G A
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폐암은 편평상피암, 선암, 소세포암, 대세포암 또는 비소세포암인 마커.
제1항의 폐암 감수성 진단용 마커 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 폐암 감수성 진단용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 제제가 서열번호 4 및 5, 서열번호 6 및 7, 및 서열번호 8 및 9로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍인 폐암 감수성 진단용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 폐암은 편평상피암, 선암, 소세포암, 대세포암 또는 비소세포암인 폐암 감수성 진단용 조성물.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 폐암 감수성 진단용 키트.
제7항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 폐암 감수성 진단용 키트.
제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폐암 감수성 진단용 마이크로어레이.
(a) 검체로부터 DNA를 수득하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 서열번호 1의 110번째 염기 (TERT 유전자의 전사시작점에서 -1327번째 염기), 서열번호 2의 92번째 염기(TERT 유전자의 엑손 2 영역에서 696번째 염기) 및 서열번호 3의 35번째 염기(TNKS1 유전자의 인트론 3 영역에서 -34번째 염기)로 이루어진 군에서 하나 이상의 다형성 부위를 증폭하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하여 폐암 위험성을 분석하는 단계를 포함하는 폐암 감수성 예측 방법.
제10항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 결정된 서열번호 1의 110번째 염 기(TERT 유전자의 전사시작점에서 -1327번째 염기)가 T인 경우에는 폐암 위험성이 증가되는 것으로 예측하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 결정된 서열번호 2의 92번째 염기(TERT 유전자의 엑손 2 영역에서 696번째 염기)가 A인 경우 폐암 위험성이 증가되는 것으로 예측하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 결정된 서열번호 3의 35번째 염기(TNKS1 유전자의 인트론 3 영역에서 -34번째 염기)가 G인 경우 폐암 위험성이 증가되는 것으로 예측하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 결정된 염기가 하기 표의 일배체형 4인 경우에는 폐암 위험성이 증가되는 방법.

TERT 유전자에서의 위치 서열번호에서의 위치 일배체형 4 전사시작점에서 -1327번째 서열번호 1의 110번째 T 엑손 2 영역에서 696번째 서열번호 2의 92번째 A
제10항에 있어서, 상기 (c) 단계의 염기 결정은 서열 분석, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석 및 TaqMan 기법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 수행되는 것인 방법.
제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐암은 편평상피암, 선암, 소세포암, 대세포암 또는 비소세포암인 방법.