KR102443042B1 - 직접경구용 항응고제 투여시의 출혈 부작용 예측용 snp 마커 및 이의 용도 - Google Patents

직접경구용 항응고제 투여시의 출혈 부작용 예측용 snp 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커에 관한 것으로, 보다 자세하게는 직접경구용 항응고제 투여 특이적 단일 염기 다형성 마커, 이를 포함하는 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 또는 마이크로 어레이, 상기 마커를 이용한 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

Description

직접경구용 항응고제 투여시의 출혈 부작용 예측용 SNP 마커 및 이의 용도{SNP markers for predicting bleeding side effects when administering anticoagulant for direct oral administration and use thereof}
본 발명은 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커에 관한 것으로, 보다 자세하게는 직접경구용 항응고제 투여 특이적 SNP 마커, 이를 포함하는 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 또는 마이크로 어레이, 상기 마커를 이용한 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
종래 임상에서 널리 사용되어온 항응고제는 항응고 작용시간이 길 경우 체내 순환 혈액의 응고시간을 연장시켜 출혈 위험이 있는 환자나 수술 전후 환자에게 사용할 경우 출혈성 합병증으로 인한 심각한 결과를 초래할 수 있다(김현철 외, 대한신장학회지, Vol.23(6) : 920-926, 2004).
따라서, 이러한 문제를 해결하기 위해 그동안 국소 항응고제 요법, 저 항응고제 또는 무 항응고제 요법, 저분자 항응고제 요법 등을 비롯하여 prostacucline, citrate와 같은 새로운 항응고제가 사용되고 있으나, 이들 방법 역시 전술한 바와 같은 문제점을 가지고 있다.
이에, 항응고제를 환자에게 투여하기 전에, 어떤 환자에게 출혈부작용은 적을 것인가 예측할 수 있다면 환자와 치료진의 불편을 줄이고 항응고제를 더 효율적으로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
이러한 임상적 필요성에 입각하여, 본 발명자들은 직접경구용 항응고제 투여와 연관된 SNP를 대상으로 연구를 수행하였고, 직접경구용 항응고제 투여 시 이의 출혈 부작용을 예측단할 수 있는 표지자를 찾기 위해 노력한 결과, SIGLEC(Sialic acid-binding Ig-like lectin) 유전자 내 특정 SNP들이 직접경구용 항응고제 투여 특이적 유전자형을 가지고 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 염기서열에서 144번째 염기가 A 또는 G이고; 서열번호 2의 염기서열에서 130번째 염기가 A 또는 G이고; 서열번호 3의 염기서열에서 147번째 염기가 G 또는 T이고; 서열번호 4의 염기서열에서 104번째 염기가 A 또는 G이고; 서열번호 5의 염기서열에서 44번째 염기가 C 또는 T이고; 서열번호 6의 염기서열에서 164번째 염기가 A 또는 G이고; 서열번호 7의 염기서열에서 59번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 1의 염기서열에서 144번째, 서열번호 2의 염기서열에서 130번째 염기, 서열번호 3의 염기서열에서 147번째 염기, 서열번호 4의 염기서열에서 104번째 염기, 서열번호 5의 염기서열에서 44번째 염기, 서열번호 6의 염기서열에서 164번째 염기, 서열번호 7의 염기서열에서 59번째 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 마이크로 어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 혼성화하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭되거나 혼성화된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 염기서열에서 144번째 염기가 A 또는 G이고; 서열번호 2의 염기서열에서 130번째 염기가 A 또는 G이고; 서열번호 3의 염기서열에서 147번째 염기가 G 또는 T이고; 서열번호 4의 염기서열에서 104번째 염기가 A 또는 G이고; 서열번호 5의 염기서열에서 44번째 염기가 C 또는 T이고; 서열번호 6의 염기서열에서 164번째 염기가 A 또는 G이고; 서열번호 7의 염기서열에서 59번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 1의 염기서열에서 144번째, 서열번호 2의 염기서열에서 130번째 염기, 서열번호 3의 염기서열에서 147번째 염기, 서열번호 4의 염기서열에서 104번째 염기, 서열번호 5의 염기서열에서 44번째 염기, 서열번호 6의 염기서열에서 164번째 염기, 서열번호 7의 염기서열에서 59번째 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 마커를 제공한다.
본 발명의 용어, "직접경구용 항응고제"는 생체 내의 혈전을 방지하는 항응고제 중 경구투여가 가능한 약물을 의미한다. 상기 직접경구용 항응고제는 당업계에 공지된 직접경구용 항응고제라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 예를 들면, 아픽사반(apixaban), 에독사반(edoxaban), 리바록사반(rivaroxaban) 및 다비가트란(dabigatran)일 수 있다.
종래 임상에서 널리 사용되어온 항응고제는 항응고 작용시간이 길 경우 체내 순환 혈액의 응고시간을 연장시켜 출혈 위험이 있는 환자나 수술 전후 환자에게 사용할 경우 출혈성 합병증으로 인한 심각한 결과를 초래할 수 있다.
이에, 직접경구용 항응고제 투여 특이적 마커를 제공할 수 있다면, 보다 정확한 직접경구용 항응고제의 투여가 이루어 질 수 있을 것으로 기대되는 바, 본 발명자들에 의해 최초로 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 SNP 마커가 제공되었다.
본 발명의 용어, "직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용"은 직접경구용 항응고제 복용 중 주요 출혈이 발생하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 마커는 단일 염기 다형성을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립 유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 구체적인 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 구체적으로 5% 또는 10% 이상의 발생 빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립 유전자를 가진다.
본 발명의 용어, "대립 유전자"는 상동 염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립 유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립 인자(biallele)를 갖는다.
본 발명의 용어, "rs_id"란 1998년부터 SNP 정보를 축적하기 시작한 NCBI가 초기에 등록되는 모든 SNP에 대하여 부여한 독립된 표지자인 rs-ID를 의미한다. 본 발명에서는 rs150186451과 같은 형태로 기재하였다. 이와 같은 표에 기재된 rs_id는 본 발명의 다형성 마커인 SNP 마커를 의미한다. 당업자라면 상기 rs_id를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. NCBI의 dbSNP(The Single Nucleotide Polymorphism Database) 번호인 rs_id에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 약간 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 7은 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.
상기 직접경구용 항응고제 투여 환자에 대한 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 마커는 상기 서열번호 1의 염기서열에서 144번째, 서열번호 2의 염기서열에서 130번째 염기, 서열번호 3의 염기서열에서 147번째 염기, 서열번호 4의 염기서열에서 104번째 염기, 서열번호 5의 염기서열에서 44번째 염기, 서열번호 6의 염기서열에서 164번째 염기, 서열번호 7의 염기서열에서 59번째 염기를 SNP로서 포함하고 이의 앞뒤로 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 다형성 서열로서, 상기 마커는 총 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열에서 144번째, 서열번호 2의 염기서열에서 130번째 염기, 서열번호 3의 염기서열에서 147번째 염기, 서열번호 4의 염기서열에서 104번째 염기, 서열번호 5의 염기서열에서 44번째 염기, 서열번호 6의 염기서열에서 164번째 염기, 서열번호 7의 염기서열에서 59번째 염기를 SNP로서 포함하는 마커는 SIGLEC(Sialic acid-binding Ig-like lectin) 유전자 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 서열번호 1의 염기서열은 19번 염색체의 52009544번째 염기가 G에서 A로 변이된 SNP인 rs62116178, 서열번호 2의 염기서열은 19번 염색체의 52016530번째 염기가 A에서 G로 변이된 SNP인 rs12463300, 서열번호 3의 염기서열은 19번 염색체의 52004747번째 염기가 G에서 T로 변이된 SNP인 rs2034891, 서열번호 4의 염기서열은 19번 염색체의 52010404번째 염기가 A에서 G로 변이된 SNP인 rs8110247, 서열번호 5의 염기서열은 19번 염색체의 52011044번째 염기가 C에서 T로 변이된 SNP인 rs9676254, 서열번호 6의 염기서열은 19번 염색체의 52011164번째 염기가 A에서 G로 변이된 SNP인 rs9676256, 서열번호 7의 염기서열은 19번 염색체의 52013359번째 염기가 A에서 G로 변이된 SNP인 rs7246846일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등 다양한 데이터 베이스에서 그 서열을 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 인간 유래일 수 있고, 구체적으로 SIGLEC(Sialic acid-binding Ig-like lectin) 유전자 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 상기 폴리뉴클레오티드와 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 염기서열을 포함할 수 있고, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열은 rs62116178, 서열번호 2의 염기서열은 rs12463300, 서열번호 3의 염기서열은 rs2034891, 서열번호 4의 염기서열은 rs8110247, 서열번호 5의 염기서열은 rs9676254, 서열번호 6의 염기서열은 rs9676256, 서열번호 7의 염기서열은 rs7246846를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 이와 상동성 또는 동일성이 80%, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 더욱 구체적으로 99% 이상인 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 40% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60 ℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 144번째 염기가 대립 유전자에서 AG 또는 AA인 경우, GG인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 2 의 130번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG인 경우, AA인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 3 의 147번째 염기가 대립 유전자에서 TT 또는 TG인 경우, GG인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 4 의 104번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG인 경우, AA인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 5 의 44번째 염기가 대립 유전자에서 TC 또는 TT인 경우, CC인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 6 의 164번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG인 경우, AA인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 서열번호 7 의 59번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG인 경우, AA인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 출혈에 영향을 미치는 유의미한 인자들을 통제한 후 다변량 분석한 결과, rs2034891의 대립 유전자 조정 배당률(per-allele adjusted odds ratio)은 3.6(95% CI: 1.6-8.5, p-value=0.003)으로 나타나 T 대립 유전자가 하나 증가할 때마다 출혈 위험이 3.6배 증가하고, rs62116178의 대립 유전자 조정 배당률은 4.8 (95% CI: 1.9-11.8, p-value<0.001)으로 나타나 A 대립 유전자가 하나 증가할 때마다 출혈 위험이 4.8배 증가하고, rs12463300의 대립 유전자 조정 배당률은 3.9 (95% CI: 1.7-9.2, p-value=0.002)으로 나타나 G 대립 유전자가 하나 증가할 때마다 출혈 위험이 3.9배 증가하며, rs8110247, rs9676254, rs9676256 및 rs7246846의 대립 유전자 조정 배당률은 3.6(95% CI: 1.6-8.5, p-value=0.003)으로 나타나 각각 G, T, G 및 G 대립 유전자가 하나 증가할 때마다 출혈 위험이 3.6배 증가하는 것으로 확인되었다(표 3).
상기 결과는 SIGLEC, 특히 SIGLEC6 또는 SIGLEC12의 유전 변이가 직접경구용 항응고제의 안전성에 영향을 준다는 근거를 제공하며, 실시예와 같이 직접경구용 항응고제 투여 예정이거나 투여 중인 환자들을 대상으로 SIGLEC의 유전 변이 확인을 통해 효과적인 직접경구용 항응고제 사용을 기대할 수 있다. 본 발명자들은 상기 SIGLEC의 유전 변이가 직접경구용 항응고제 투여의 출혈 부작용 예측용 마커임을 상기와 같이 입증하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 서열번호 1 내지 7 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있는 프로브 또는 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "프로브"는 대립 유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립 유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립 유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립 유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다.
본 발명에 따른 프로브는 본 발명의 SNP의 다형성 부위와 특이적으로 혼성화 반응을 통해 확인하여 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용을 예측할 수 있는 조성물에 포함될 수 있다. 상기와 같은 유전자 분석의 구체적 방법에는 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 유전자 검출 방법에 의하는 것일 수 있다.
상기 프로브는 대립 유전자를 검출하여 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 예측 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25~30 ℃의 조건이 대립 유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머라아제 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머는 본 발명의 SNP의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용을 예측할 수 있는 조성물에 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 프라이머는 직접경구용 항응고제 투여 환자에 대한 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용을 예측할 수 있는 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다.
상기 다형성 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드일 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명의 프로브 또는 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 마커는 상기 각 마커를 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 7개 모두를 포함하는 마커 세트일 수 있다. 상기 마커는 서열번호 1의 염기서열에서 144번째, 서열번호 2의 염기서열에서 130번째 염기, 서열번호 3의 염기서열에서 147번째 염기, 서열번호 4의 염기서열에서 104번째 염기, 서열번호 5의 염기서열에서 44번째 염기, 서열번호 6의 염기서열에서 164번째 염기, 서열번호 7의 염기서열에서 59번째 염기에서의 대립 유전자형에 따라 직접경구용 항응고제 투여 환자에 대한 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용을 예측할 수 있고, 마커를 2개 이상 포함할 경우 마커를 1개 포함하는 경우에 비해 출혈 부작용 예측의 정확도가 높아질 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 조성물을 포함하는 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 키트를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 분석용(예, DNA 칩) 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 키트는 본 발명의 마커의 증폭을 통해 확인하거나, 마커의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 직접경구용 항응고제 투여 예정이거나 투여 중인 환자에 대한 직접경구용 항응고제 투여의 출혈 부작용을 예측할 수 있다.
구체적인 일 구현예에서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 조성물을 포함하는 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 마이크로 어레이를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 마이크로 어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로 어레이는 본 발명의 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로 어레이로 이루어진다.
프로브를 기판상에 고정화하여 마이크로 어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측과 연관된 프로브를 기판상에 고정화하는 과정 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로 어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로 어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 상기 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 혼성화하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭되거나 혼성화된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"란 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용을 예측하기 위한 피험자일 수 있다. 상기 개체에서 분리된 머리카락, 뇨, 혈액, 각종 체액, 조직, 세포 또는 타액과 같은 시료 등으로부터 DNA를 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (a) 단계의 DNA로부터 상기 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있으며, 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)), 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 단계의 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 서열 분석, 마이크로 어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립 유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립 유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP(PCR-single strand conformation polymorphism), PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism) 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing)방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip) 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 이용 가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립 유전자가 확인될 수 있다. 이와 같은 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은, 구체적으로 수십만 개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로 어레이 중 하나인 SNP 칩을 통해 수행할 수 있다.
일례로, 상기 서열 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립 유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할 수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭 반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 구체적으로는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.
한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일 염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.
상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립 유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.
이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.
상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중, 서열번호 1의 144번째 염기가 대립 유전자에서 AG 또는 AA를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 1의 144번째 염기가 대립 유전자에서 GG를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중, 서열번호 2의 130번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 2의 130번째 염기가 대립 유전자에서 AA를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중, 서열번호 3의 147번째 염기가 대립 유전자에서 TT 또는 TG를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 3의 147번째 염기가 대립 유전자에서 GG를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중, 서열번호 4의 104번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 4의 104번째 염기가 대립 유전자에서 AA를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중, 서열번호 5의 44번째 염기가 대립 유전자에서 TC 또는 TT를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 5의 44번째 염기가 대립 유전자에서 CC를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중, 서열번호 6의 164번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 6의 164번째 염기가 대립 유전자에서 AA를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중, 서열번호 7의 59번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 7의 59번째 염기가 대립 유전자에서 AA를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 SNP 마커는 직접경구용 항응고제 투여 특이적 단일 염기 다형성 마커로서, 정확하고 객관적으로 직접경구용 항응고제 투여 환자에 대한 직접경구용 항응고제 투여의 출혈 부작용을 예측할 수 있다.
도 1은 주요 출혈에 대한 전장유전체연관분석 결과의 맨하탄 플롯(Manhattan plot)을 나타낸 도이다.
도 2는 주요 출혈에 대한 전장유전체연관분석 결과의 지역 연관 플롯(regional association plot)을 나타낸 도이다.
도 3은 각 SNP에 대한 실험대상자에서의 LD(linkage disequilibrium) 패턴을 나타낸 도이다. 칸의 숫자 값은 D'(도 3A) 및 r2(도 3B) 이며, 빈 칸은 D'=1 또는 r2=1.0을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험대상자 선별
2018년 6월부터 2019년 10월까지 서울 소재의 4개 병원에서 전향적으로 모은 환자 샘플에 대해 후향적인 연구를 진행하였다.
본 연구의 선정 기준은 직접경구용 항응고제인 아픽사반(apixaban), 에독사반(edoxaban), 리바록사반(rivaroxaban) 또는 다비가트란(dabigatran)을 복용한 환자들이며, 다음의 기준에 해당하는 환자들은 제외되었다: (1) 20세 미만, (2) 동의 거부, (3) 혈전색전증 또는 경색과 관련된 질병 발생이 관찰된 경우, 또는 (4) 주요 출혈이 아닌 출혈 또는 의료진에 의해 확인되지 않은 출혈을 경험한 경우.
출혈군은 직접경구용 항응고제 복용 중 주요 출혈이 발생한 환자로 정의되었으며, 대조군은 적어도 6개월 이상 직접경구용 항응고제 복용 후 주요 출혈이 발생하지 않은 환자로 정의하였다. 주요 출혈의 경우, ISTH(International Society on Thrombosis and Haemostasis) 기준에 따라 정의하였다: (1) 사망을 초래한 출혈, (2) 치명적인 부위나 장기에 발생한, 출혈로 인한 임상증상이 발생한 출혈 (두개내, 척수내, 안구출혈, 후복막강출혈, 관절내 출혈, 심낭주위 출혈, 분획증후군을 동반한 근육내출혈), (3) 출혈로 인해 헤모글로빈이 2이상 감소한 환자 또는 2 파인트 이상의 전혈수혈이 필요한 환자.
환자에 대한 자료는 전자의무기록을 바탕으로 수집하였으며, 수집한 정보는 성별, 나이, 체중, 키, creatinine clearance, 흡연, 음주, 공존질환, 처방받은 직접경구용 항응고제의 종류 및 용량, 병용 약물, 심근경색, 뇌졸중, 일과성 허혈성 발작, 혈전색전증 또는 출혈 과거력을 포함하였다.
그 결과, 총 131명의 환자(주요 출혈 27명, 대조군 104명)가 분석에 포함되었다. 주요 출혈군 및 대조군의 임상 정보는 하기 표 1과 같다. 환자 나이의 범위는 46세에서 94세로, 중앙값은 71세로 나타났으며, 남성의 비율은 62.6%였다. 거의 대부분의 환자는 심방세동을 가지고 있었으며, 약 70% 환자는 고혈압이었다.
본 실시예의 실험은 헬싱키 선언에 따라 각 기관의 생명윤리심의위원회의 승인을 받은 후 진행되었으며, 연구 참여 전 본 연구에 대해 설명하고 서면동의를 받아 진행되었다.
주요 출혈군
(n = 27)		 대조군
(n = 104)		 P값
성별 0.688
남성 16 (59.3) 66 (63.5)
여성 11 (40.7) 38 (36.5)
나이 74.4 ± 8.4 69.6 ± 9.0 0.012
< 65세 1 (3.7) 29 (27.9) 0.008
≥65세 26 (96.3) 75 (72.1)
체중a (kg) 63.3 ± 10.0 67.4 ± 11.0 0.082
< 60 10 (37.0) 29 (28.2) 0.370
≥60 17 (63.0) 74 (71.8)
키b (cm) 164.2 ± 9.2 164.4 ± 8.3 0.951
Creatinine clearance c (mL/min) 65.3 ± 25.1 68.5 ± 14.3 0.537
≥50 20 (76.9) 94 (92.2) 0.037
< 50 6 (23.1) 8 (7.8)
흡연 4 (14.8) 15 (14.4) 1.000
음주 4 (14.8) 30 (28.8) 0.138
공존질환
심방세동 26 (96.3) 101 (97.1) 1.000
고혈압 19 (70.4) 72 (69.2) 0.909
당뇨 6 (22.2) 27 (26.0) 0.690
심부전 5 (18.5) 25 (24.0) 0.543
과거력
심근경색 3 (11.1) 3 (2.9) 0.102
뇌졸중, 일과성 허혈성 발작, 혈전색전증 15 (55.6) 54 (51.9) 0.736
출혈 4 (14.8) 9 (8.7) 0.468
직접경구용항응고제 종류 0.013
Apixaban 6 (22.2) 51 (49.0)
Edoxaban 14 (51.9) 23 (22.1)
Rivaroxaban 4 (14.8) 21 (20.2)
Dabigatran 3 (11.1) 9 (8.7)
처방 용량d 0.306
저용량 11 (40.7) 31 (30.1)
일반 용량 15 (55.6) 71 (68.9)
과용량 1 (3.7) 1 (1.0)
병용약물e
항혈소판제 2 (7.4) 7 (6.7) 1.000
안지오텐신 전환효소억제제, 안지오텐신 수용체 차단제 15 (55.6) 43 (41.3) 0.185
베타 차단제 20 (74.1) 83 (79.8) 0.517
칼슘채널 차단제 7 (25.9) 20 (19.2) 0.444
이뇨제 13 (48.1) 24 (23.1) 0.010
HMG-CoA 환원효소 억제제 14 (51.9) 49 (47.1) 0.661
a1개의 결측값. b3개의 결측값. c5개의 결측값. d3개의 결측값 및 FDA 허가사항에 따라 용량을 분류. e2개의 결측값.
실시예 2. 유전형 분석
환자의 DNA는 혈액 또는 타액을 통해 추출하였다. 혈액의 경우 EDTA 처리 후 키트(QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN GmBH, Hilden, Germany)를 통하여 추출하였으며, 타액의 경우 OraGene-600 키트(DNA Genotek, Ottawa, Canada)를 사용하여 수집한 뒤, PrepIT 용액(DNA Genotek, Ottawa, Canada)으로 추출하였다.
추출된 200 ng의 DNA는 APMRA(AxiomTM Asia Precision Medicine Research Array, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 전장유전체에 대한 유전형을 분석하였다.
시료 수준(Sample-level)의 품질 평가를 위하여 DQC(dish quality control) 값이 0.82 미만이거나 CR(call rate) 값이 95% 미만인 경우 제외되었다. 또한, 의무기록 상의 성별과 유전정보가 일치하지 않거나 다른 환자와 높은 친인척 관계를 보이는 경우(estimated identical by descent [IBD] > 0.125) 제외하였다.
SNP 수준(SNP-level)의 품질 평가를 위하여, CR 값이 95% 이상이고, MAF(minor allele frequency)가 5% 이상이며, 하디 와인버그 평형(Hardy-weinberg equilibrium) 검증을 통과하는(p ≥ 1 Х 10-4) SNP만을 포함하였다.
연구에 포함된 모든 샘플은 DQC 값이 0.82 이상이었으며, 평균 CR 값은 99.67%였다. 전체 778,347 SNP 중 366,193이 품질 평가 기준을 통과하여 전장유전체연관분석에 사용되었다.
출혈에 대한 전장유전체연관분석은 PLINK v1.07을 사용하여 분석하였으며, 대립 유전자 연관 모델(allelic association model)을 기반으로 하였다. 암시 중요성 임계 값(Suggestive significance threshold)은 10-5로 설정하여 분석하였다. 맨하탄 플롯(Manhattan plot)은 R 프로그램의 "qqman" 패키지를 통하여 분석하였으며, 지역 연관 플롯(regional association plot)은 LocusZoom을 통하여 분석하였다. 하플로뷰(Haploview) 4.2 프로그램을 통하여 LD(linkage disequilibrium) 값을 계산하고, LD 플롯을 그렸다.
수집된 자료는 소프트웨어 프로그램(Windows용 SPSS statics version 20.0)을 사용하여 분석하였다. 출혈 환자군 및 대조군의 통계분석을 위해 연속형 변수는 짝을 이루지 않은 t-검정(unpaired t-test), 범주형 변수는 카이 제곱 테스트(chi-squared test)를 이용하였다. 그리고 백워즈 제거(backward elimination)를 통한 로지스틱 회귀 분석(logistic regression analysis)을 통해 다변량 분석을 실시하였다. 본 실시예에서의 분석은 유의 확률이 0.05 미만일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
실시예 3. 주요 출혈에 대한 전장유전체연관분석
주요 출혈에 대한 전장유전체연관분석 결과, 19q13.41에 위치한 SIGLEC(Sialic acid-binding Ig-like lectin)의 유전 변이(rs62116178, rs12463300, rs2034891, rs8110247, rs9676254, rs9676256 및 rs7246846)는 주요 출혈의 암시 신호(suggestive signal)로 발견되었으며(표 2, 도 1), 이들은 비슷한 효과 크기 및 높은 LD를 보이기 때문에 미스센스 돌연변이(missense mutation)인 rs2034981을 대표적 변이로 하여 분석하였다(도 2, 도 3).
단변량 분석에서 출혈에 영향을 미치는 유의미한 인자들을 통제한 후 분석한 결과, rs2034891의 대립 유전자 조정 배당률(per-allele adjusted odds ratio)은 3.6(95% CI: 1.6-8.5, p-value=0.003)으로 나타나 T 대립 유전자가 하나 증가할 때마다 출혈 위험이 3.6배 증가하는 것으로 확인되었다(표 3).
한편, rs62116178, rs12463300, rs8110247, rs9676254, rs9676256 및 rs7246846에 대해서도 다변량 분석에서 출혈에 영향을 미치는 유의미한 인자들을 통제한 후 분석한 결과(표 3), rs62116178의 대립 유전자 조정 배당률은 4.8 (95% CI: 1.9-11.8, p-value<0.001)으로 나타나 A 대립 유전자가 하나 증가할 때마다 출혈 위험이 4.8배 증가하는 것으로 확인되었으며, rs12463300의 대립 유전자 조정 배당률은 3.9 (95% CI: 1.7-9.2, p-value=0.002)으로 나타나 G 대립 유전자가 하나 증가할 때마다 출혈 위험이 3.9배 증가하는 것으로 확인되었다. 또한, rs8110247, rs9676254, rs9676256 및 rs7246846의 대립 유전자 조정 배당률은 3.6(95% CI: 1.6-8.5, p-value=0.003)으로 나타나 각각 G, T, G 및 G 대립 유전자가 하나 증가할 때마다 출혈 위험이 3.6배 증가하는 것으로 확인되었다.
dbSNP rsID Chr 위치 Minor allele 출혈군 MAF 대조군 MAF 오즈비 P 값 해당(또는 가깝게 위치한) 유전자
rs62116178 19 52009544 A 0.31 0.07 5.85 1.45 Х 10-6 4.5kb 5' of SIGLEC12
rs12463300 19 52016530 G 0.33 0.09 5.22 3.19 Х 10-6 6.3kb 3' of SIGLEC6
rs6551599 4 59995208 T 0.33 0.09 4.97 5.37 Х 10-6 1.9Mb 3' of LOC255130
rs2034891 19 52004747 T 0.31 0.08 5.16 5.59 Х 10-6 SIGLEC12
rs8110247 19 52010404 G 0.31 0.08 5.16 5.59 Х 10-6 5.4kb 5' of SIGLEC12
rs9676254 19 52011044 T 0.31 0.08 5.16 5.59 Х 10-6 6kb 5' of SIGLEC12
rs9676256 19 52011164 G 0.31 0.08 5.16 5.59 Х 10-6 6.1kb 5' of SIGLEC12
rs7246846 19 52013359 G 0.31 0.08 5.16 5.59 Х 10-6 8.3kb 5' of SIGLEC12
rs4710994 6 21895824 C 0.17 0.02 10.20 8.77 Х 10-6 FLJ22536
rs78419688 7 48172504 G 0.17 0.02 10.20 8.77 Х 10-6 24kb 3' of UPP1
Unadjusted 오즈비 (95% CI) Adjusted 오즈비 (95% CI)
여성 1.19 (0.50-2.84)
나이 (≥65 세) 10.05 (1.30-77.53) 19.12 (1.89-193.77)*
CrCl (< 50 mL/min) 3.52 (1.10-11.28) 4.22 (1.02-17.46)*
Apixaban 1 (ref) 1 (ref)
Edoxaban 5.17 (1.76-15.17) 6.37 (1.84-22.03)**
Rivaroxaban 1.62 (0.41-6.33) 0.87 (0.17-4.45)
Dabigatran 2.83 (0.60-13.44) 3.02 (0.57-16.12)
이뇨제 3.10 (1.28-7.48)
Rs2034891 (per T allele) 4.72 (2.13-10.45) 3.64 (1.56-8.50)**
*p값 < 0.05, **p값 < 0.01
상기 실시예의 결과는 SIGLEC, 특히 SIGLEC6 또는 SIGLEC12의 유전 변이가 직접경구용 항응고제의 효과 및 안전성에 영향을 준다는 근거를 제공하며, 실시예와 같이 직접경구용 항응고제 투여 예정이거나 투여 중인 환자들의 유전 변이 확인을 통해 효과적인 직접경구용 항응고제 사용을 기대할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (21)

  1. 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 조성물로서,
    상기 마커는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에서,
    서열번호 1의 염기서열에서 144번째 염기가 A 또는 G이고;
    서열번호 2의 염기서열에서 130번째 염기가 A 또는 G이고;
    서열번호 3의 염기서열에서 147번째 염기가 G 또는 T이고;
    서열번호 4의 염기서열에서 104번째 염기가 A 또는 G이고;
    서열번호 5의 염기서열에서 44번째 염기가 C 또는 T이고;
    서열번호 6의 염기서열에서 164번째 염기가 A 또는 G이고;
    서열번호 7의 염기서열에서 59번째 염기가 A 또는 G이고,
    상기 서열번호 1의 염기서열에서 144번째, 서열번호 2의 염기서열에서 130번째 염기, 서열번호 3의 염기서열에서 147번째 염기, 서열번호 4의 염기서열에서 104번째 염기, 서열번호 5의 염기서열에서 44번째 염기, 서열번호 6의 염기서열에서 164번째 염기, 서열번호 7의 염기서열에서 59번째 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 직접경구용 항응고제는 아픽사반, 에독사반, 리바록사반 또는 다비가트란인 것인, 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 마커의 서열번호 1의 144번째 염기가 대립 유전자에서 AG 또는 AA인 경우, GG인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 마커의 서열번호 2의 130번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG인 경우, AA인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 마커의 서열번호 3의 147번째 염기가 대립 유전자에서 TT 또는 TG인 경우, GG인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 마커의 서열번호 4의 104번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG인 경우, AA인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 마커의 서열번호 5의 44번째 염기가 대립 유전자에서 TC 또는 TT인 경우, CC인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 마커의 서열번호 6의 164번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG인 경우, AA인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 마커의 서열번호 7의 59번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG인 경우, AA인 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 7 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있는 프로브 또는 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는, 조성물.
  11. 제1항의 조성물을 포함하는 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인, 키트.
  13. 제1항의 조성물을 포함하는 직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측용 마이크로 어레이.
  14. (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 혼성화하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 증폭되거나 혼성화된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는,
    직접경구용 항응고제 투여에 따른 출혈 부작용 예측을 위한 정보제공방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중,
    서열번호 1의 144번째 염기가 대립 유전자에서 AG 또는 AA를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 1의 144번째 염기가 대립 유전자에서 GG를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중,
    서열번호 2의 130번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 2의 130번째 염기가 대립 유전자에서 AA를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중,
    서열번호 3의 147번째 염기가 대립 유전자에서 TT 또는 TG를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 3의 147번째 염기가 대립 유전자에서 GG를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중,
    서열번호 4의 104번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 4의 104번째 염기가 대립 유전자에서 AA를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중,
    서열번호 5의 44번째 염기가 대립 유전자에서 TC 또는 TT를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 5의 44번째 염기가 대립 유전자에서 CC를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중,
    서열번호 6의 164번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 6의 164번째 염기가 대립 유전자에서 AA를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 방법은 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중,
    서열번호 7의 59번째 염기가 대립 유전자에서 GA 또는 GG를 포함하는 경우, (a) 단계의 개체에 직접경구용 항응고제를 투여하였을 때 서열번호 7의 59번째 염기가 대립 유전자에서 AA를 포함하는 경우에 비하여 출혈 부작용이 발생할 가능성이 높을 것으로 예측하는 것인, 방법.
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