KR102009838B1 - 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은, 대상으로부터 얻은 유전자 시료에 대하여, LOX 유전자 중의 서열번호 1의 서열의 205번째 염기, 서열번호 2의 서열의 488번째 염기, 서열번호 2의 서열의 678번째 염기 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 다형성을 확인하는 단계를 포함한다.

Description

뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법{INFORMATION PROVIDING METHOD FOR PREDICTING RISK OF DEVELOPMENT OF CEREBRAL ANEURYSM OR DIAGNOSING SAME}

본 발명은 LOX(Lysyl oxidase) 유전자 상에 위치한 염기의 단일염기다형성을 이용한, 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

염기서열 다형성(Polymorphism)은 1% 초과하는 빈도로 나타나는 염기서열의 변이를 일컫는 것으로, 이 중 90%는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이다. 인간 유전적 서열은 99.9% 동일하고, SNP는 약 250~1000bp 마다 하나씩 나타나며, 인간 유전체의 경우 약 2백만개의 SNP가 존재하고 이중 유전자에는 약 21,000개가 존재한다. 또한 1% 이하의 빈도로 나타나는 다른 단일염기의 변이는 통상 돌연변이(mutation)로 칭한다.

염기서열 돌연변이 분석 또는 SNP는 DNA 서열분석은 분석은 물론, 질환 예를 들어 암, 천식, 당뇨와 같은 질환을 야기하는 유전자 발굴 또는 특정 질환과의 연관성을 판단할 수 있는 마커로서 중요한 역할을 한다. 따라서 단일염기 다형성을 분석함으로써 사람의 경우 특정 질환에 대한 개인의 감수성을 파악하여 염기서열의 차이로 인해 발생하는 선천성 질병에 대한 예방 또는 발병한 질환의 치료에 도움이 될 수 있다.

뇌동맥류, 구체적으로 두개내 동맥류는 모든 지주막하 출혈(지주막하 출혈)의 약 85%를 차지하며, 이는 50%까지의 높은 사망률을 가진다. 세포외기질(ECM)은 동맥 벽에 구조적 완전성을 제공하며, 세포외기질의 파괴는 뇌동맥류 형성과 관련이 있을 수 있다. 리실 옥시다제(lysyl oxidase, LOX)는 콜라겐과 엘라스틴의 교차 결합과 성숙을 조절하는 구리-함유 아민 산화효소로서, LOX 유전자의 변이는 ECM의 불안정성 및 동맥류 형성을 유도할 수 있다.

그러나, LOX 유전자의 다형성이 한국인 집단에서의 뇌동맥류의 발달에 미치는 유전적 연관성에 대하여 연구된 바 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명 의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

1) Ma L, Song H, Zhang M, Zhang D. Lysyl oxidase G473A polymor-phism is associated with increased risk of coronary artery diseas-es. DNA Cell Biol 2011;30:1033-7; 2) Zhang HF, Zhao KJ, Xu Y, Hong B, Zhao WY, Liu JM, et al. Lysyl ox-idase polymorphisms and ischemic stroke--a case control study. Mol Biol Rep 2012;39:9391-7.

본 발명은 LOX 유전자 상에 위치한 염기의 단일염기 다형성을 이용하여 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단을 위한 마커로 제공함으로써, 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 LOX 유전자 상에 위치한 10개의 SNP 중 3개의 SNP가 한국인의 뇌동맥류 발병에 유의한 연관성이 있어, 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단에 이용할 수 있는 마커로 이용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 양태는, 대상으로부터 얻은 유전자 시료에 대하여, LOX 유전자 중의 서열번호 1의 서열의 205번째 염기, 서열번호 2의 서열의 488번째 염기, 서열번호 2의 서열의 678번째 염기 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1의 205번째 염기의 대립형질이 T이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 A인 경우가 상기 서열번호 1의 205번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 낮다고 예측할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 2의 488번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우가 상기 서열번호 2의 488번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 높다고 예측하거나 뇌동맥류의 발병을 진단할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 2의 678번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우가 상기 서열번호 2의 678번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 높다고 예측하거나 뇌동맥류의 발병을 진단할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 2의 488번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C이고, 상기 서열번호 2의 678번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우가 상기 서열번호 2의 488번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T이고, 상기 서열번호 2의 678번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 높다고 예측하거나 뇌동맥류의 발병을 진단할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 염기의 다형성을 확인하는 단계는 대상으로부터 얻은 유전자 시료의 염기서열을 시퀀싱하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 대상으로부터 얻은 유전자 시료에 대하여 마이크로어레이를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 대상은 한국인일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 대상의 위험 예측 또는 진단을 수행하기 위해, 비유전적(non-genetic) 정보를 분석하는 단계를 더 포함하고, 상기 비유전적 정보는 성별, 연령, 고혈압, 당뇨, 고지혈증, 흡연, 동맥류의 가족력, 생화학적 척도 및 임상적 척도로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, LOX 유전자 중의 서열번호 1의 서열의 205번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 서열의 488번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 서열의 678번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는, 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 마이크로어레이를 수행하기 위한 프로브일 수 있다.

본 발명의 또다른 일 양태는 상기 조성물을 포함하는 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명에 따른 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 따르면, LOX 유전자 상의 단일염기 다형성(SNP)을 한국인에서 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단을 위한 마커로서 이용할 수 있다.

도 1은 실시예 4에서의 뇌동맥류와 10개의 SNP와의 연관성 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 4에서의 뇌동맥류와 10개의 SNP의 일배체형 연관성 분석 결과를 나타낸다.

이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시 양태에 대하여 상세하게 설명한다. 이하 설명은 본 발명에 실시 양태들을 용이하게 이해하기 위한 것일 뿐이며, 보호범위를 제한하기 위한 것은 아니다.

본 발명자들은 뇌동맥류 환자 80명과 정상인 대조군 80명을 대상으로 LOX 유전자 상에 위치하는 SNP들(rs2303656, rs3900446 및 rs763497)과 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단의 연관성을 규명하였다. 그 결과, rs2303656, rs3900446 및 rs763497은 단일　SNP로서 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단에 사용할 수 있음을　확인하였다.

이에, 본 발명은 대상으로부터 얻은 유전자 시료에 대하여, LOX 유전자 중의 서열번호 1의 서열의 205번째 염기(rs2303656), 서열번호 2의 서열의 488번째 염기(rs3900446), 서열번호 2의 서열의 678번째 염기(rs763497) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 "뇌동맥류(cerebral aneurysm 또는 brain aneurysm)"는 두개내 동맥류(Intracranial aneurysm.　IA)로도 지칭되며, 뇌동맥 또는 뇌정맥의 벽의 약화가 혈관의 국소적 확장 또는 풍선확장(ballooning)을 유발하는 뇌혈관 질환이다. 뇌동맥류의 일반적인 위치는 윌리스환(Circle of Willis)이라고 알려진, 뇌의 기부에 있는 동맥이다. 뇌동맥류의 약 85%가 윌리스환의 앞부분에서 발생하고, 뇌의 앞부분과 중간부분에 혈액을 공급하는 내부 경동맥 및 그들의 주요 분지를 포함한다.

뇌동맥류는 크기와 형태에 의해 분류된다. 소　동맥류(small aneurysm)는 15 mm 미만의 직경을 갖는다. 더 큰　동맥류(larger aneurysm)는 대형(large)(15 내지 25mm), 특대형(giant)(25 내지 50mm), 및 초특대형(super giant)(50mm 초과)으로 분류되는　동맥류를 포함한다. 낭형　동맥류(saccular aneurysm)는 낭형 돌출(saccular outpouching)을 갖는　동맥류이고, 뇌동맥류의 가장 흔한 형태이다. 딸기형 동맥류는 딸기를 닮은 목 또는 줄기를 갖는 낭형 동맥류이다. 방추형　동맥류(fusiform aneurysm)는 줄기가 없는　동맥류이다.

하기 표 1은 본 발명에서 이용된 SNP　마커에 대한 뉴클레오티드 서열로서, 해당　SNP의 서열 및 그 위치를 나타낸다. 당 업계의 통상의 기술자라면 기재된 NCBI의 refSNP　ID를 이용하여 각 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다. NCBI에 등록되어 있는　SNP의 refSNP　ID에 해당하는 구체적인 서열은 계속되는 유전자에 대한 연구 결과에 따라 약간씩 변경될 수 있으며, 이러한 변경된 서열 또한 본 발명의 범위 내에 포함됨은 당 업계의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

SNP	서열	서열번호
rs2303656	5'-TACGCATGATGTCCTGTGTAGCGAATGTCACAGCGCACAACATTGTTGGTATAGTCAGATTCAGGAACCAGGTAGCTGGGGTTTACACTGACCTGGGCAACACAAAGAGTTCCTCAGTATTTCTTTTTCCATAGGGCTACAATAAGGAAATTGTTAATGAGGACTTAGCTAAATCAAGCAGGGAAGGGATTTTAACTTAAGTAA [G/T] TGGTTAAACTCTGGAGACGTTATGGAAAGAGACTGCATATTTTCCCCTGAAGTTCTTTAAAATAAGACAGATTAGATTAGATTAGATTGTTTATAAATAGTTTGAGGATGTATAATTGCTTCCAATACCATGATTATTTAACATTTGAATCCAGAGAAGAGGGCCTATTGATCTGCAATATCAATATATGATATATTTTCAAAGGTCTTTACCTTTAGGATATAGTTTCCAGGTTTTACATCTGTAATATCAATCCACTGGCAGTCTATGTCTGCACCATAGGTATCATAACAGCCAGG-3'	1
rs3900446a 및 rs763497b	5'-GAGCATGCAACCTAAATCCCTCATATGCACAGTTCACAATGGGGTTCACGCTCATATGAGAATCTAATGCCATGATTGATCTGACAGGAAGCAAAGCTCAGGTGGTAATGTGAGGAAAGAGGATCTTGGTAAACATGCTATTGTAAGTTTAATGTCTCTACTCCCCTTCCGAGAACCCCATGTCTCCTTACTGGGAAACTTCAAGTCAAATGGTTTTAGGATTTACTGACAGAGGTTACTTGCTAGTATGAATTTGAGAAATTCATGGGAGGTACCTCACCAGGAACCCAAAAAATGGAATTTTTGACGTGGGGAGTGTCTGTAAATACAGATGAAGCTTCACTTGCTGGCCCACTGCTCACCTCCTGCTGTGCAGCCCAGTTCCTAACAGGGATGGTACTGGTCCGTGTCCTGGGGTTTGGGAACCACTGGTTTATTGAAAAGACATTCTGCTGGGTTGGTATGGAGCCCAAGTTATATTTGGGTT [A/G] aCACATTAGGGACTACTTCTTGTGATTTTGAGCCTAAATTATAATAAACTCTAGATATACACACCCTATGCCTATCAGAATAGTAATGAAGGGGTAAATGGCCCCCAACACAAGTGGCAATGGTTTTTGGAATAATACCAAAAGCCAACGAAATGTGATGGAGATTTACTGAAGCTAAGC [A/G] bTTAATTTTGGGGATAGGATGTTCTCGATGTAGGCCTAGATGTATGCAGCATCGTGTAAGGCTATCTATTAAAGAAGTCTAAAAAATTCACTTGTGATATTGAGTCATAAAGTTGGTTTTTAATCCATTCTCAACAGACTCTCAATTT-3'	2

**[M/m] : SNP 부위

본 발명에서 LOX 유전자 중의 서열번호 1의 서열의 205번째 염기(rs2303656)의 대립형질이 T이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 A인 경우가 상기 서열번호 1의 205번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 낮다고 예측할 수 있다. rs2303656의 T 대립유전자는 뇌동맥류 형성에 대하여 보호 효과를 나타낸다. 따라서, rs2303656의 T 대립유전자는 뇌동맥류 환자에게서 빈번하게 관찰되지 않는다(p = 8.2 Х 10^-4).

본 발명에서 LOX 유전자 중의 서열번호 2의 488번째 염기(rs3900446)의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우가 상기 서열번호 2의 488번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 높다고 예측하거나 뇌동맥류의 발병을 진단할 수 있다. rs3900446의 G 대립유전자는 뇌동맥류의 위험이 증가하면서 가장 유의미하고 강한 연관성을 나타낸다(OR = 20.15, p = 4.8 Х 10^-5).

본 발명에서 LOX 유전자 중의 서열번호 2의 678번째 염기(rs763497)의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우가 상기 서열번호 2의 678번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 높다고 예측하거나 뇌동맥류의 발병을 진단할 수 있다. rs763497의 G 대립유전자는 증가된 뇌동맥류 발병 위험과의 연관성을 보여준다(OR = 2.26, p = 0.009).

나아가, 본 발명에서 LOX 유전자 중의 서열번호 2의 488번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 동시에, 상기 서열번호 2의 678번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우가 상기 서열번호 2의 488번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T이고, 상기 서열번호 2의 678번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 높다고 예측하거나 뇌동맥류의 발병을 진단할 수 있다. 이와 같은 rs3900446과 rs763497의 CG 조합은 증가된 뇌동맥류 발병 위험과의 높은 연관성을 보여준다(MHF = 0.113, 점근선 p = 1.3 Х 10^-5).

본 발명의 방법은 환경적인 요인과 유전적인 요인에 기인하는 뇌동맥류에 대하여, 임의의 개인을 대상으로 유전적인 요인에 의해 뇌동맥류의 발병 위험이 높은 개인으로　예측하고 이들에 대하여 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는 데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 뇌동맥류를 조기에 진단하여 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 "대상"은 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 발병 여부의 판단이 수행되는 객체를 의미한다. 대상은 포유류일 수 있으며, 예를 들어, 인간일 수 있다. 예를 들어, 대상은 한국인일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 대상으로부터 얻은 "시료"는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변 등을 포함한다. 이들 시료로부터 유전자 시료를 얻을 수 있으며, 유전자 시료는 핵산, 예를 들어, DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함한다.

본 발명에서, 대상으로부터 얻은 시료로부터 핵산을 분리하는 방법은 당 업계에 공지된 방법을 통하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 조직 또는 세포로부터 DNA 등을 직접적으로 정제하거나, 중합효소연쇄반응(PCR)과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 수행될 수 있다. 본 발명에서, 시료로부터 핵산을 분리하는 단계에는, 예를 들어, PCR 증폭법, 리가아제(ligase) 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA) 등이 사용될 수 있다.

본 명세서에서 "예측"은 특정 개인에 대하여 뇌동맥류가 발병할 가능성이 있는지, 발병할 가능성이 있다면 뇌동맥류가 발병할 가능성이 불특정 다수인에 비하여 상대적으로 높은지 여부를 판별하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "진단"은 특정 개인에 대하여 뇌동맥류가 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "대립형질" 또는 "대립유전자"는 상동염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 유형을 의미한다. 대립유전자는　다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대,　SNP는 두 종류 이상, 예를 들어 두 종류의 대립형질을 갖는다.

본 명세서에서 "유전자의 다형성을 확인하는 단계"는 SNP의 유전자형을 확인하는 단계를 의미한다. SNP의 유전자형을 확인하는 단계는, 시퀀싱 분석, 예를 들어, 자동염기서열분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP(restriction fragment length polymorphism)법, PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)법, PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide)법, PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA(rolling circle amplification)법, HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

본 명세서에서 유전자의 다형성을 확인하는 단계는, 예를 들어, 대상으로부터 얻은 시료로부터 분리한 핵산으로부터 SNP 부위를 포함하는 염기서열을 시퀀싱(sequencing)하고, SNP의 대립형질을 직접적으로 확인함으로써 수행될 수 있다. 염기서열의 시퀀싱은 당 업계에 공지된 방법을 통하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 염기서열의 시퀀싱은 대상으로부터 얻은 시료로부터 분리한 핵산을 주형으로 하고, 각 SNP 부위를 포함하는 유전자 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계, 및 상기 PCR 반응물을 제한효소 절단방법으로 그 서열을 확인하는 단계를 순차적으로 수행함으로써 이뤄질 수 있다.

본 명세서에서 "프라이머(primer)"는 복제 대상인 주형에 상보적으로 결합하여 복제 합성의 개시점으로 작용하는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 합성효소(폴리머라제)를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3' 말단에 뉴클레오티드가 공유 결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 지칭한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 프라이머를 구성하는 올리고뉴클레오티드의 각 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드일 수 있으나, 디옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.

프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머는 길이가 짧을수록, 낮은 어닐링(annealing) 온도에서 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성할 수 있다. 프라이머는 사용목적에 따라 제작될 수 있으며, 제한효소를 이용하여 유전형을 확인하는 경우에는 프라이머를 이용한 PCR 산물 내에 포함되는 제한효소 부위의 수 및 제한효소에 의해 절단되는 단편의 크기 등을 고려하여야 한다.

프라이머는 SNP 부위를 포함하는 표적 핵산에 혼성화하고, 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립유전자 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 세트, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

또는, 본 명세서에서 유전자의 다형성을 확인하는 단계는, 예를 들어, 대상으로부터 얻은 시료로부터 분리한 핵산을 마이크로어레이에 의해 혼성화시키고, 형광 안료 등을 통해 표적 핵산의 존재를 검출함으로써 수행될 수 있다. 핵산의 마이크로어레이에 의한 혼성화는 당 업계에 공지된 방법을 통하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 핵산의 마이크로어레이는 대상으로부터 얻은 시료로부터 분리한 핵산을 주형으로 하고, 각 SNP 부위를 포함하는 유전자 부위에 혼성화할 수 있는 프로브를 사용하여 주형에 프로브를 혼성화시키는 단계, 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 순차적으로 수행함으로써 이뤄질 수 있다.

상기 프로브의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 프로브 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 프라이머는 표적 핵산 중 SNP 부위를 포함하는 서열 부위에 혼성화한다. 이 프로브는 반대편에 혼성화하는 제2 프로브와 쌍을 이루어 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 1의 서열의 205번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 서열의 488번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 서열의 678번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 대상으로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 대상의 위험 예측 또는 진단을 수행하기 위해, 비유전적 정보를 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 비유전적 정보는 성별, 연령, 고혈압, 당뇨, 고지혈증, 흡연, 동맥류의 가족력, 생화학적 척도 및 임상적 척도(예를 들어, 비파열 뇌동맥류 또는 지주막하 출혈)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 뇌동맥류의 발병 위험을 예측하거나 뇌동맥류의 발병을 진단하기 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 LOX 유전자 중의 서열번호 1의 서열의 205번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 서열의 488번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 서열의 678번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 10개 이상, 예를 들어 10개 내지 100개, 예를 들어 10개 내지 60개, 예를 들어 20개 내지 40개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.

조성물은 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드이다. 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열 중의 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화되는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화란 일반적으로 엄격한 조건, 예를 들어 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 수행될 수 있다.

대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 대립형질 특이적 프로브일 수 있다. 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 대립형질 특이적 프로브는 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성　부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 유전자 단편에는 혼성화 하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 프로브의 중앙 부위는 다형성　서열의　다형성　염기와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 뇌동맥류 위험도를　진단하거나　예측하기 위한 진단　키트나　예측　방법 등에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 대립형질 특이적 프라이머일 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 뇌동맥류 위험도를 예측하기 위한 진단 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단용 키트의 제조를 위한 용도로서 제공된다. 키트는 당 업계의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제작될 수 있다.

본 발명의 키트는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, cDNA 등뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양할 수 있음), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 뇌동맥류 위험도　예측용 키트일 수 있으며, DNA 칩 키트는 상기　SNP　에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

SNP　다형성의 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리 할 수 있으며, 예를 들어, 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-스퀘어 검정(Chi-square test), 선형 회귀선 분석(linear regression line analysis), 다변량 로지스틱 회귀분석(multiple logistic regression analysis), 메타 분석(meta-analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수(continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비(odds ratio, OR) 및 95% 신뢰구간(confidence interval, CI) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.

이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.

실시예

실시예 1. 연구 대상

단일 기관에서 방사선학적으로 낭형(saccular shape)을 갖는 것으로 확인된 뇌동맥류 환자군 80명과, 환자군의 환자의 나이 및 성별과 매칭된 대조군 80명을 모집하였다. 상기 뇌동맥류에서, 방추형 또는 해부학 비낭성 동맥류 및 외상성 또는 전염성 동맥류는 제외하였다. 대조군은, 동정맥 기형, 두개내 출혈 또는 경색 등과 같은 다른 신경계 질환을 제외한, 두통 진단 또는 건강 검진을 위해 전산화 단층 촬영 또는 자기 공명 혈관 조영술을 받은, 매칭된 환자들로 구성하였다. 성별, 연령, 비파열 뇌동맥류 또는 지주막하 출혈과 같은 임상 증상, 고혈압, 당뇨, 고지혈증, 흡연, 동맥류의 가족력 등 여러 변수를 고려하여 의료 기록을 검토하였다. 동맥류의 크기, 위치(전방 순환 또는 후방 순환), 및 수(단수 또는 복수)에 대한 혈관조영 변수를 검토하였다. 본 연구는 춘천 성심 병원의 임상 시험 위원회에 의해 승인되었다(No. 2016-31).

검토 결과, 뇌동맥류 환자군에서, 여성의 수는 43명(53.8%)이었고, 평균 연령은 57.1 ± 12.9세였다. 지주막하 출혈 증상은 41명(51.3%)의 환자에게서 나타났다. 동맥류 위치와 관련하여, 전방순환동맥류(n = 73, 91.3%)가 다음과 같이 기록되었다: 내경동맥, n = 15; 전교통동맥 또는 전대뇌동맥, n = 21; 중간대뇌동맥, n = 25; 및 후교통동맥, n = 12. 단일 동맥류가 있는 환자는 75명(93.8%)이었으며, 지주막하 출혈의 가족력이 없는 환자는 없었다. 두 군간에 고혈압, 당뇨, 고지혈증 및 흡연의 발생률은 유의하게 다르지 않았다.

실시예 2. 단일염기 다형성 선택 및 검사

LOX 유전자 상의 단일염기 다형성과 뇌동맥류 발병 가능성의 연관성을 조사하기 위하여, 대립형질에 대한 SNPinfo(https://snpinfo.niehs.nih.gov/)의 LD TAG SNP 셀렉션(TagSNP)로부터의 일본 및 중국(JPT+CHB) HapMap 데이터베이스(Phase II)에서 연관불균형(linkage disequilibrium, LD; r² < 0.8)을 적용한 후, LOX 유전자의 5'-상류와 3'-하류 사이에 위치한 10개의 태그(tag) SNP를 선택하였다(서열번호 1, 서열번호 2 및 하기 표 2의 서열번호 3 내지 서열번호 8 참조).

SNP	서열	서열번호
rs10040971	5'-TCTAGCTCAGGGCATCAACAAACAGTACAAAAATGAGAGTGCAAATGAATAAATAAATGGAGAATGGATGAATAAATTAAGGAATTATAAAAATTAAGAAAAAACTAATCTGTTTATTTAAGTGCAAATTATTTTAGCTTAAATTATAATGGTGTTCTGGCGGTGGGGGTCGGGGGTTGGTTCTACTATAACCAACTCCACACAATATGGGCCATAAAACCTGCCAGGTTTTCTGTGCTGTGGGCATGTTCAGAAGAATGTATGTGACTCTGTTTTTTCAGTGCTATCCTTTTGCTATCACAGGCTTCATCTATCTCTAA [T] GTTGTGACAACACTTGTAAAGCACAGTCTCTGCTTCTTTATGTAGAAAGTCCTGGGTTTTTGTATCAGGCAGAAATTTCTATTAATTATGAGATTCTAGTATAGCTCTGCTATACCTGTCTGTATGATCCAGTGGCACTGGTGGTTCTCCAGTGACAAAGCAAAGCTGATGAGTGTTGAGTATCATTCCAATGGAAATAGTATTCTCATTGTTGGGAAGGCATAACTCAAGTGGCATATGTAATTATAATCTAGCACCCAGCAACACTTGGGGAGGTAGTGC -3'	3
rs17148773a 및 rs3792801b	5'-AATAGGCAGAAACTGGACCAAAGCTAATCAATCAAATATTACTGTCTTTAAATGTGACCATAGATCTTCATGTAAGGAAGTGAAAATTCACTTATTCAAATCATAAACTACCAATTTCCAAACAGTAAATTCTGTGAGGAGAAAAAAAAAAACTTACATAGTATCTTATAACTGAAAGAAGCCTCAGAGTCACCTGGTC [C] aGTACATTTTGTTTCAGTGAGGAAAATGAAGGAGAGAGGGTACATTAACAGCACATACCTATTCAACTATTTACTGGGTGGCTTTTACACATCAACAGAATGCTCTTAAATATCTGGCAGGAAAAGCAATCAGTGAACTGATACATGATATGTCTTCAGAGTCACACTCACTGCTGCTTACACAGCCACCAGACTGACCTGATGGCCTTAGGCAAGTTACACTTCCTGCTCAAAAAGCTTCAGCCTCCCACTGCCTCCAGAATAAATTTTAGCCTGCTCTTCAGGGCTGTCTTCCATCTGGCTCAACTTACTTTTCCATCCTTTTTGTCCAACTCGTAACTCCACAAAATT [C] bATGCTTTAGCCAAACTAGAAGACTTGTTTTTCCAAACATGCCCTGCAGTTTCCTCCTGCCATGCAAGTTGCCTGTGACGTTGACTTGCCCTGGGCTTCCTTTCCTTAATGCTCCCCGGTGCATTCCCCAGACTTCAAGGCTCAA-3'	4
rs10519694	5'-CTACATGAGGGGCTATTATCTCCATTTTATAGATGAGAAAACTAAGGCACACTAAGATCAAATAACTTACCCAAGGGTATCCAGCCTAGTAAGTGGCTAAGCTGGTTTTGAGTTTAGGTAATCAAGGTCCAGAGTCCCTGTTCTTAACTACCCCACTATACTCTCTCTCATACAGTCACTGAAATATGACATATTTTGTTGAAGGGGTAAATGCATGACTAAATTGATGAATGCCACATCACTCCACTTGCTAAAATATTCACATCAATAAGTAAATGAATG [C] CTTCTACAGGCTGGGAGGAGAAAAATATAACAAATACAATCCTTGCTTTTAAGAATGTTATAGTCTAGAGAAGTTTCCTCAGATTGGAGTCTGTAGGTATATTCTTGATTCCATTAGTTCTTCACAAAAAGTTTTAACTTGTATTTTTATTCTAATAGTAATTTAAATTCAAAGTACATGCTAGATTCATTTTAACTCAATACTGCCATTCAATTCTAGCAACCAATATTGCTTTGCTGTTTAAGATCACTTTGGTCACCCAAGAG-3'	5
rs1800449	5'- CCGGGACTGCAAAGCAATGTGAAAAGGAAGCAGGAGGGGCCAGACGCGCGGTTTGCACTGGATTCCAGGGCTGCCACTGCAGGCGCGTGGGGGAGGGATCGGATCTGCGAGGACCGGGGCCCGCCGCGCCCAGGCAGCCACGTCGAGAAGCCACATAGCTGGGGACCAGGTGCACGGGTGCTTCCAGCGGACTTGGGGGTACTTACCGTACTGGAAGTAGCCAGTGCCGTATCCGGGCCGGTACCTGCCCCCAGGTCTGGGCCTTTCATAAGTATCGTAGTAGTTGTAATAAGGGTTGTCGTCAGAGTACTTGTAGGGGTTGTAAGGGTCGTCGCCCACCATGCCGTCCACGCGGCTGGGCGGC [C] GCAGGTTACTGAGCGCAGGAACTTCTCCCGGCGCTGTCTGGTTCTCCGCGCGCGAGGCGCCAGCTTCGCGGGCTCTAGATGTCGAGTAGCCAGCTTGGAACCAGTGACGGGCGGTGGGCCTGGGGCGGCCAGCGGTGACTCCAGATGAGCCGGCCGTCCGCGTTCGCGCCGCGGCGGTGCGGTTGTCGCGGATCAGCAGGATCGGAGTGCGGGGCTGCTGGGCGGAGGCGTTGGCTGCACCAGGGACGGCGGCGCCCGGGTCCCGGCGGCGCTGAGGCTGGTACTGTGAGCCCAGGCTCAGCAAGCTGAACACCTGCCCGTTGTTCTCCCATTGGATCTGC-3'	6
rs2956540	5'- GATCTGGGCGGGAGTCAAATTATAATGTCCTTTTACAAATTAGGGTTTCATATGGAAATACTGACATAGATTTTAACTGACACGCATTTTCCAATGATAAAACATGCAAACTGCTTAGTTCAGCACTACTTTAAAAAAATCCATCCAAACAACATCTGACATCAATTATACTGTAGATTTAAATATATATGTGTGGAGAAAGAAATGGTGTCCTTCTGCTCTTATTTGCATTATTAAAAGAGGCAACTTTTTAAAGTGCTTTTAAAGAAACTTATTTTTCCTCCATTTGCTAACC [G] CAACCACTATTCTATTTTCAGCATAAAACAGAAGGAAGGAATGGTTTCACAGGTGAAAAAACAGAGATATCTTTTTTTACAGTTATTTACTAAGCCGGTTAAGGAATACAGAATGGGTGCATATGTTGTCAACCATTCAGACTTTTTCAGAGAGTAAATTTTTGTTCTTCATTGTGGACTGTAACAAGGACCCACACTGACCTGTGATC-3'	7
rs3853401	5'- CTACCCTTTGTCACACATGCTAATGAAAAGCTTAGTTGATTTTCACTCTCCTTCATTTCCTCTAAAATCTCTCTGGCTTAGGACTCTGTCAGCTGAAAAACAAACATGTGGCTACCACATTTGGGGACAATACAGTGTTTGCAAGCCCTGCGGGAGATAATCTAGCCACACATTGTGTTCCCTGTTCAATAACAAAACTATTATTCACAAAATTGGAGAAACCATAGTTCCTTTCCACTCAAATCTGAGATGATAATGATGATGACAATAATAATAATAAGCCACGGCTACATCAAGATACAAACAGCTTTTTTTGCTTTGATAAGATCCACAGCTGATTTCACTTTTGACCATGAGATTTTCTTCTC [G] TGAACAATTCTGCAGTATGTGCCATAAGAGAAGGGAAGGAATGTTGCTAATTCTTTTTTTGAGTTTCTAGCCCATCAATATCAAATCTTTAAATGGCAATGTCTGGCCCATTGGCCAAGAAATGAAAGTTGTTGTAATGCTATGTTCCTGGTATTTGTTAAATACATTTATTTTTGTAGGACATTTCACATAAATGGAAAACAGAAAGCCGAAACCATAAAGCAGGGCCTCTGAATTGCAGAAGCCAGAACAGTAATGCCACATTCAAAGCAATCAGGTTCAAGTGTAAATTCTTTTGTTTGAGGCTCAAGAAGCTCATACAAAGCTTG-3'	8

**[M/m] : SNP 부위

10개의 태그 SNP의 유전자형 분석(genotyping)을 위해, HiGene^TM Genomic DNA 프렙 키트(BIOFACT, 대전, 한국)를 이용하여, 피험자 160명의 말초 혈액으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 10개의 SNP 프라이머는 프라이머-3 v.0.4.0 프로그램(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을 사용하여 설계되었으며, 설계된 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다.

SNP	프라이머	서열	서열번호
rs2303656	정방향 역방향	5'-CGCATGATGTCCTGTGTAGC-3' 5'-TGGCTGTTATGATACCTATGGTG-3'	9 10
rs3900446, rs763497	정방향 역방향	5'-CATGCAACCTAAATCCCTCAT-3' 5'-TTGAGAGTCTGTTGAGAATGGA-3'	11 12
rs10040971	정방향 역방향	5'-AGCTCAGGGCATCAACAAAC-3' 5'-CTACCTCCCCAAGTGTTGCT-3'	13 14
rs17148773, rs3792801	정방향 역방향	5'-AGGCAGAAACTGGACCAAAG-3' 5'-AGCCTTGAAGTCTGGGGAAT-3'	15 16
rs10519694	정방향 역방향	5'-CATGAGGGGCTATTATCTCCA-3' 5'-TTGGGTGACCAAAGTGATCTT-3'	17 18
rs1800449	정방향 역방향	5'-GGACTGCAAAGCAATGTGAA-3' 5'-GATCCAATGGGAGAACAACG-3'	19 20
rs2956540	정방향 역방향	5'-CTGGGCGGGAGTCAAATTAT-3' 5'-CACAGGTCAGTGTGGGTCCT-3'	21 22
rs3853401	정방향 역방향	5'-CCCTTTGTCACACATGCTAATG-3' 5'-GCTTTGTATGAGCTTCTTGAGC-3'	23 24

상기 표 3의 프라이머와 Solg^TM 2X Taq PCR Pre-Mix(Solgent, 대전, 한국)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 예비 변성은 95℃?에서 5분간 수행되었고, 95℃?에서 30초간 변성, 63℃?에서 30초간 어닐링, 72℃?에서 1분간 연장, 및 72°C에서 5분간 최종연장이 34사이클 수행되었다. 1.5% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭된 단편을 확인하고, Solg^TM PCR 정제 키트(SolGent, 대전, 한국)로 정제한 후, ABI PRISM 3730XL 분석기(Applied Biosystems, 캘리포니아, USA)에 의해 각 서열을 분석하였다.

실시예 3. 통계 분석

크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정을 수행하여, 뇌동맥류 환자 80명 및 대조군 80명 사이의 비유전적 인자에 대한 차이를 평가했다. 피셔 정확검정은, 교차비(OR)를 추정하기 위해, 뇌동맥류와 LOX 유전자 근처 또는 LOX 유전자 상에 위치하는 10개의 SNP 사이의 대립 관계를 평가하기 위해 수행되었다.

후속 분석에서, 동맥류 파열에 따른 뇌동맥류 형성에의 LOX 유전자의 유전적 영향을 분석했다. 또한, h-1의 자유도(h는 SNP의 수에 따라 슬라이딩 윈도우에서 모든 가능한 일배체형의 수)를 포함하는, 점근선 카이-제곱 통계를 통해 일배체형-특이적 연관 분석을 사용한 옴니버스 검정을 수행하어 뇌동맥류와의 유의한 일배체형 연관성을 검정하였다. 상기 검정에서 10개의 SNP를 사용하여 가능한 조합의 0.01 미만의 마이너 일배체형 빈도(MHF)를 갖는 일배체형 구조를 제외하였다.

단일 SNP 및 일배체형 연관에서 각각 0.01 및 0.001의 다중 비교 보정 및 암시적 유효 p값을 시험한 후, 본페로니(Bonferroni)-보정된 유의한 p값을 0.005 미만 및 2.0 x 10^-4 미만으로 적용하였다. 기술 및 단변수 분석은 STATA 소프트웨어 v.11.2(Stata Corp., College Station, 텍사스, 미국)에 의해 수행되었다. 유전자형 분류율(genotyping call rate, GCR), 마이너 대립유전자 빈도(MAF), 하디-바인버그 평형(Hardy Weinberg equilibrium, HWE) p값 및 쌍별 LD(pairwise LD)를 평가하기 위해, Haploview v.4.2(https://www.broadinstitute.org/haploview/haploview)를 사용하여 10개의 SNP에 대한 품질 관리 검정을 수행하였다. 유전자형 및 일배체형 연관성을 PLINK 프로그램 v.1.07(http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/)을 사용하여 분석하였다.

실시예 4. 단일염기 다형성과 뇌동맥류와의 유전적 연관성의 검토

상기 실시예 2에서 선택된 10개의 모든 SNP는, 품질 관리 검정 후, 완전한 유전자형 분류율(GCR), 마이너 대립유전자 빈도(MAF)는 0.01 초과, 하디-바인버그 평형(HWE) p값은 0.05 초과, 쌍별 연관불균형(LD)은 0.8 초과였다.

10개의 SNP 중 3개의 SNP(rs2303656, rs3900446 및 rs763497)는 뇌동맥류와 통계적으로 유의한 연관성을 보였다(p < 0.05)(도 1). 2개의 SNP(rs2303656 및 rs3900446)는 본페로니-보정된 유의 수준(p < 0.005)에 도달했다. rs3900446의 C 대립 유전자는 뇌동맥류의 위험이 증가하면서 가장 유의미하고 강한 연관성을 보였다(OR = 20.15, p = 4.8 Х 10^-5). 반대로, rs2303656의 A 대립 유전자는 뇌동맥류에서 보호 효과가 있었고, 환자군에서는 빈번하게 관찰되지 않았다(p = 8.2 Х 10^-4). rs763497의 G 대립 유전자는 증가된 뇌동맥류 위험과의 연관성을 보여 주었다(OR = 2.26, p = 0.009). 그러나, 이후의 분석에서 뇌동맥류를 가진 80명의 환자 중 뇌동맥류 파열과 연관된 SNP는 없었다(p > 0.05).

일배체형 연관성에 대한 옴니버스 검정에서, 45개의 슬라이딩 윈도우(SNP 세트)에서 전체 247개 일배체형 구조 중 136개는 0.05 미만의 점근선 p값을 보였으며, 17개의 일배체형은 뇌동맥류와 암시적 연관성을 보였다(점근선 p < 0.001, 도 2). 10개의 SNP 일배체형 조합 중 rs3900446과 rs763497의 CG 조합은 단일 SNP 분석(MHF = 0.113, 점근선 p = 1.3 Х 10^-5)에서 유의한 연관성을 보였다.

단일 SNP 분석에서 6개의 SNP(rs10040971, rs17148773, rs3792801, rs10519694, rs2956540 및 rs1800449)가 독립적으로 연관되어 있지는 않았지만, 이들 SNP를 rs2303656, rs3900446 또는 rs763497과 조합한 일배체형 구조는 일배체형 분석에서 유의했다(6.5Х10^-4<p<7.5Х10^-4).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Hallym University Industry Academic Cooperation Foundation <120> INFORMATION PROVIDING METHOD FOR PREDICTING RISK OF DEVELOPMENT OF CEREBRAL ANEURYSM OR DIAGNOSING SAME <130> P-LOX <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 504 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tacgcatgat gtcctgtgta gcgaatgtca cagcgcacaa cattgttggt atagtcagat 60 tcaggaacca ggtagctggg gtttacactg acctgggcaa cacaaagagt tcctcagtat 120 ttctttttcc atagggctac aataaggaaa ttgttaatga ggacttagct aaatcaagca 180 gggaagggat tttaacttaa gtaagtggtt aaactctgga gacgttatgg aaagagactg 240 catattttcc cctgaagttc tttaaaataa gacagattag attagattag attgtttata 300 aatagtttga ggatgtataa ttgcttccaa taccatgatt atttaacatt tgaatccaga 360 gaagagggcc tattgatctg caatatcaat atatgatata ttttcaaagg tctttacctt 420 taggatatag tttccaggtt ttacatctgt aatatcaatc cactggcagt ctatgtctgc 480 accataggta tcataacagc cagg 504 <210> 2 <211> 815 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gagcatgcaa cctaaatccc tcatatgcac agttcacaat ggggttcacg ctcatatgag 60 aatctaatgc 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ttcaactatt tactgggtgg cttttacaca tcaacagaat 300 gctcttaaat atctggcagg aaaagcaatc agtgaactga tacatgatat gtcttcagag 360 tcacactcac tgctgcttac acagccacca gactgacctg atggccttag gcaagttaca 420 cttcctgctc aaaaagcttc agcctcccac tgcctccaga ataaatttta gcctgctctt 480 cagggctgtc ttccatctgg ctcaacttac ttttccatcc tttttgtcca actcgtaact 540 ccacaaaatt cbatgcttta gccaaactag aagacttgtt tttccaaaca tgccctgcag 600 tttcctcctg ccatgcaagt tgcctgtgac gttgacttgc cctgggcttc ctttccttaa 660 tgctccccgg tgcattcccc agacttcaag gctcaa 696 <210> 5 <211> 549 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ctacatgagg ggctattatc tccattttat agatgagaaa actaaggcac actaagatca 60 aataacttac ccaagggtat ccagcctagt aagtggctaa gctggttttg agtttaggta 120 atcaaggtcc agagtccctg ttcttaacta ccccactata ctctctctca tacagtcact 180 gaaatatgac atattttgtt gaaggggtaa atgcatgact aaattgatga atgccacatc 240 actccacttg ctaaaatatt cacatcaata agtaaatgaa tgccttctac aggctgggag 300 gagaaaaata taacaaatac aatccttgct tttaagaatg ttatagtcta gagaagtttc 360 ctcagattgg agtctgtagg tatattcttg attccattag ttcttcacaa aaagttttaa 420 cttgtatttt tattctaata gtaatttaaa ttcaaagtac atgctagatt cattttaact 480 caatactgcc attcaattct agcaaccaat attgctttgc tgtttaagat cactttggtc 540 acccaagag 549 <210> 6 <211> 706 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ccgggactgc aaagcaatgt gaaaaggaag caggaggggc cagacgcgcg gtttgcactg 60 gattccaggg ctgccactgc aggcgcgtgg gggagggatc ggatctgcga ggaccggggc 120 ccgccgcgcc caggcagcca cgtcgagaag ccacatagct ggggaccagg tgcacgggtg 180 cttccagcgg acttgggggt acttaccgta ctggaagtag ccagtgccgt atccgggccg 240 gtacctgccc ccaggtctgg gcctttcata agtatcgtag tagttgtaat aagggttgtc 300 gtcagagtac ttgtaggggt tgtaagggtc gtcgcccacc atgccgtcca cgcggctggg 360 cggccgcagg ttactgagcg caggaacttc tcccggcgct gtctggttct ccgcgcgcga 420 ggcgccagct tcgcgggctc tagatgtcga gtagccagct tggaaccagt gacgggcggt 480 gggcctgggg cggccagcgg tgactccaga tgagccggcc gtccgcgttc gcgccgcggc 540 ggtgcggttg tcgcggatca gcaggatcgg agtgcggggc tgctgggcgg aggcgttggc 600 tgcaccaggg acggcggcgc ccgggtcccg 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Sequence <220> <223> primer (Rev) <400> 12 ttgagagtct gttgagaatg ga 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Fwd) <400> 13 agctcagggc atcaacaaac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Rev) <400> 14 ctacctcccc aagtgttgct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Fwd) <400> 15 aggcagaaac tggaccaaag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Rev) <400> 16 agccttgaag tctggggaat 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Fwd) <400> 17 catgaggggc tattatctcc a 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Rev) <400> 18 ttgggtgacc aaagtgatct t 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Fwd) <400> 19 ggactgcaaa gcaatgtgaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (Rev) <400> 20 gatccaatgg gagaacaacg 20 <210> 21 <211> 20 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Claims (13)

1. 대상으로부터 얻은 유전자 시료에 대하여, LOX 유전자 중의 서열번호 1의 서열의 205번째 염기, 서열번호 2의 서열의 488번째 염기, 서열번호 2의 서열의 678번째 염기 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 서열번호 1의 205번째 염기의 대립형질이 T이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 A인 경우가 상기 서열번호 1의 205번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 낮다고 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 서열번호 2의 488번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우가 상기 서열번호 2의 488번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 높다고 예측하거나 뇌동맥류의 발병을 진단하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 서열번호 2의 678번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우가 상기 서열번호 2의 678번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 높다고 예측하거나 뇌동맥류의 발병을 진단하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 서열번호 2의 488번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C이고, 상기 서열번호 2의 678번째 염기의 대립형질이 G이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 C인 경우가 상기 서열번호 2의 488번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T이고, 상기 서열번호 2의 678번째 염기의 대립형질이 A이거나 그의 상보적인 염기의 대립형질이 T인 경우보다 뇌동맥류의 발병 위험이 높다고 예측하거나 뇌동맥류의 발병을 진단하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 염기의 다형성을 확인하는 단계는 대상으로부터 얻은 유전자 시료의 염기서열을 시퀀싱하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 염기의 다형성을 확인하는 단계는 대상으로부터 얻은 유전자 시료에 대하여 마이크로어레이를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 대상은 한국인인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 대상의 위험 예측 또는 진단을 수행하기 위해, 비유전적(non-genetic) 정보를 분석하는 단계를 더 포함하고,
   상기 비유전적 정보는 성별, 연령, 고혈압, 당뇨, 고지혈증, 흡연, 동맥류의 가족력, 생화학적 척도 및 임상적 척도로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
10. LOX 유전자 중의 서열번호 1의 서열의 205번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 서열의 488번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 서열의 678번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는, 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단용 조성물.
11. 제 10 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 마이크로어레이를 수행하기 위한 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 10 항의 조성물을 포함하는, 뇌동맥류의 발병 위험 예측 또는 진단용 키트.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것을 특징으로 하는 키트.

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