KR102063486B1 - Rnf213 단일염기다형성과 한국인 모야모야병 발병 위험도의 연관성 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 RNF213 단일염기다형성과 한국인 모야모야병 발병 위험도의 연관성에 관한 것으로, 구체적으로 한국인의 모야모야병 발생 위험 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검자의 DNA 시료로부터 rs371441113 단일염기다형성을 판별하는 방법 및 rs371441113 단일염기다형성을 검출하는 수단을 포함하는 한국인의 모야모야병 발생 위험 예측용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 상기 rs371441113 단일염기다형성, 또는 이와 함께 rs148731719 단일염기다형성, rs112735431 단일염기다형성 및 rs760732823 단일염기다형성을 판별함으로써 한국인의 모야모야병 발생 위험을 예측하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다. 특히, 본 발명의 키트를 사용할 경우 보다 용이하게 상기와 같은 정보를 제공할 수 있다.
본 발명에 따르면 상기 rs371441113 단일염기다형성, 또는 이와 함께 rs148731719 단일염기다형성, rs112735431 단일염기다형성 및 rs760732823 단일염기다형성을 판별함으로써 한국인의 모야모야병 발생 위험을 예측하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다. 특히, 본 발명의 키트를 사용할 경우 보다 용이하게 상기와 같은 정보를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 RNF213 단일염기다형성과 한국인 모야모야병 발병 위험도의 연관성에 관한 것으로, 구체적으로 한국인의 모야모야병 발생 위험 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검자의 DNA 시료로부터 rs371441113 단일염기다형성을 판별하는 방법 및 rs371441113 단일염기다형성을 검출하는 수단을 포함하는 한국인의 모야모야병 발생 위험 예측용 키트에 관한 것이다.
모야모야병(Moyamoya disease, MMD)은 일과성 허혈, 뇌경색 및 출혈성 뇌졸중을 초래하는 만성 뇌 혈관 폐쇄 장애이다. MMD는 전 세계적으로 발생하지만, 그 유병률은 동아시아 국가에서 가장 높다.
MMD는 최대 발생 빈도수에 대해 이분법의 연령 분포를 나타내며, 약 5세의 어린이와 40대 중반의 성인이 가장 높다. 대부분의 어린이 MMD 환자는 일과성 허혈 발작이나 뇌경색을 일으키는 반면, 성인 MMD 환자는 출혈성 뇌졸중을 일으킬 가능성이 더 크다. 이는 같은 MMD에서 유전자 서열의 변형 또는 손상의 가능성을 시사한다. 대부분의 MMD 사례는 가족성 MMD 사례가 전체 사례의 약 9.15%를 차지하지만 산발적이다. 염색체 3번, 6번, 8번, 10번 및 17번 상의 위치와 특이적 인간 백혈구 항원(HLA) 일배체형과의 유전적 연관성이 보고되었지만, 의문점은 여전히 남아있다.
MMD를 진단하는 방법으로 CT/MRI, SPECT 상에서나 뇌관류 CT 상에서 뇌혈류 감소를 확인하거나, PET나 뇌관류 MRI 상에서 뇌관류압 감소, 뇌혈류량의 증가, 뇌산소 추출분량의 증가 등을 확인하는 방법이 사용되고 있다. 또한 확진을 위해 뇌혈관조영술을 사용하며 이에 대한 뇌동맥 조영 상에서 양쪽 속목동맥의 원위부와 앞대뇌동맥 혹은 중대뇌동맥의 근위(부)가 좁아져 있거나 막혀있는 소견이 보이고, 이와 같은 동맥들이 막혀있거나 좁아져 있는 부위 근처에 비정상적인 혈관 그물(모야모야 혈관)이 나타날 때 MMD로 확진한다.
이러한 기존의 진단 방법들은 증상이 나타나거나 영상으로 소견이 보여야만 확진이 되고, 진행된 MMD를 치료하는 방법이 제한되어 있기 때문에 질환 발병 전에 MMD의 발병을 예측하여 혈관 위험 인자들의 관리 등의 예방적인 조치를 취하는 것이 매우 중요하다.
염색체 17q25에 위치한 RNF213은 동양인 뿐만 아니라 백인 및 동/남부 아시아인에서 MMD에 대한 주요 감수성 유전자로 인식되고 있다. 일본인과 한국인에서 p.R4810K 다형성과 두개 내 주요 동맥 협착증/동맥 폐쇄증의 연관성이 보고된 바 있으나, MMD와 관련된 이 유전적 변이는 비 MMD 뇌내 협착 환자에서도 관찰되었고, RNF213과 어린 아동 및 성인에서의 MMD의 임상 증상 사이의 연관성은 불확실하다.
대규모 연구를 통해 RNF213 변이체 p.R4810K(c.14429G> A, rs112735431)가 MMD와의 높은 관련성을 갖는 것으로 처음 보고되었다. RNF213 변이체 R4859K 및 R4810K는 rs112735431에 해당하지만, R4859K는 데이터베이스 상의 컴퓨터 예측 오픈리딩프레임을 기반으로 한다.
본 발명자는 MMD와 관련된 새로운 마커를 개발하여 MMD, 특히 한국인의 MMD 발생 위험 예측 정확도를 보다 높이고자 하였다.
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Genetic Analysis of Familial Moyamoya; Labor and Welfare: Tokyo, Japan, 2010; pp. 25-26.
따라서 본 발명의 주된 목적은 한국인의 모야모야병 발생 위험 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 한국인의 MMD 발생 위험도와 관련된 새로운 마커를 이용하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 이용하여 한국인의 MMD 발생 위험을 예측하는데 유용한 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 한국인의 모야모야병 발생 위험 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검자의 DNA 시료로부터 rs371441113 단일염기다형성을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, rs148731719 단일염기다형성, rs112735431 단일염기다형성 및 rs760732823 단일염기다형성 중에서 선택된 하나 이상의 단일염기다형성을 더 판별하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 rs371441113 단일염기다형성을 검출하는 수단을 포함하는 한국인의 모야모야병 발생 위험 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 rs371441113 단일염기다형성을 검출하는 수단은 인간의 유전체 DNA 상에서 rs371441113 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 rs371441113 단일염기다형성 부위의 염기가 구아닌 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트인 것이 바람직하다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 제한효소는 BssSI인 것이 바람직하다.
본 발명의 키트에 있어서, rs148731719 단일염기다형성, rs112735431 단일염기다형성 및 rs760732823 단일염기다형성 중에서 선택된 하나 이상의 단일염기다형성을 검출하는 수단을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 키트에 있어서, a) 상기 rs148731719 단일염기다형성을 검출하는 수단은 인간의 유전체 DNA 상에서 rs148731719 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 rs148731719 단일염기다형성 부위의 염기가 구아닌 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;이고, b) 상기 rs112735431 단일염기다형성을 검출하는 수단은 인간의 유전체 DNA 상에서 rs112735431 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 rs112735431 단일염기다형성 부위의 염기가 구아닌 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;이며, c) 상기 rs760732823 단일염기다형성을 검출하는 수단은 인간의 유전체 DNA 상에서 rs760732823 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 rs760732823 단일염기다형성 부위의 염기가 구아닌 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;인 것이 바람직하다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 a)의 프라이머는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 a)의 제한효소는 AluI이고, 상기 b)의 프라이머는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 b)의 제한효소는 Hpy188I이고, 상기 c)의 프라이머는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 c)의 제한효소는 Hpy188I인 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면 상기 rs371441113 단일염기다형성, 또는 이와 함께 rs148731719 단일염기다형성, rs112735431 단일염기다형성 및 rs760732823 단일염기다형성을 판별함으로써 한국인의 모야모야병 발생 위험을 예측하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다. 특히, 본 발명의 키트를 사용할 경우 보다 용이하게 상기와 같은 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 rs371441113(d), rs148731719(a), rs112735431(b) 및 rs760732823(c) 단일염기다형성의 유전형 분석결과를 나타낸 것이다. M: 분자량 마커, GG: GG 유전자형, GA: GA 유전자형, AA: AA 유전자형.
본 발명에서 이용하는 rs371441113, rs148731719, rs112735431 및 rs760732823 단일염기다형성(이하, 'SNP'로 약기)은 인간의 RNF213(ring finger protein 213) 유전자에서 나타날 수 있는 SNP로 미국 국립생물정보센터의 단일염기다형성 데이터베이스(NCBI dbSNP, http://http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)에 등록되어 있다.
rs371441113 SNP는 서열번호 1로 표시되는 인간의 DNA 부위에서 26번째 염기로 구분할 수 있는데, 이 염기가 아데닌(adenine), 시토신(cytosine) 또는 구아닌(guanine)일 수 있으나, 시토신인 경우는 매우 드물다.
rs148731719 SNP는 서열번호 2로 표시되는 인간의 DNA 부위에서 26번째 염기로 구분할 수 있는데, 이 염기가 아데닌(adenine) 또는 구아닌(guanine)일 수 있다.
rs112735431 SNP는 서열번호 3으로 표시되는 인간의 DNA 부위에서 26번째 염기로 구분할 수 있는데, 이 염기가 아데닌(adenine), 시토신(cytosine) 또는 구아닌(guanine)일 수 있으나, 시토신인 경우는 매우 드물다.
rs760732823 SNP는 서열번호 4로 표시되는 인간의 DNA 부위에서 26번째 염기로 구분할 수 있는데, 이 염기가 아데닌(adenine), 시토신(cytosine) 또는 구아닌(guanine)일 수 있으나, 시토신인 경우는 매우 드물다.
상기와 같은 SNP의 판별은 중합효소연쇄반응-제한효소단편길이다형성(polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP) 방법 또는 염기서열 분석방법을 수행하여 이루어질 수 있다.
중합효소연쇄반응-제한효소단편길이다형성 방법은 중합효소연쇄반응을 수행하여 대상 유전자 또는 DNA 부위를 증폭하고, 특정 제한효소로 처리하였을 때 제한효소가 인식하여 소화가 이루어지는지 또는 제한효소가 인식하지 못하여 소화가 이루어지지 않는지를 구분함으로써 염기의 다형성, 결실, 부가 또는 치환을 구분하는 방법이다. 이때 DNA의 증폭여부 및 제한효소에 의한 소화 여부는 아가로스겔을 사용한 전기영동을 통해 확인할 수 있다.
염기서열 분석방법으로는 공지의 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 또는 생어(Sanger)의 방법을 이용할 수 있다.
상기 PCR-RFLP 방법으로 다형성을 판별하는 경우에는 각 SNP 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 각 SNP 부위가 특정 염기인 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 이용할 수 있다.
보다 바람직하게는 다음의 증폭용 프라이머 및 제한효소를 사용할 수 있다.
rs371441113 SNP 판별 : 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머, BssSI 제한효소
rs148731719 SNP 판별 : 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머, AluI 제한효소
rs112735431 SNP 판별 : 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머, Hpy188I 제한효소
rs760732823 SNP 판별 : 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머, Hpy188I 제한효소
상기 rs371441113 SNP 판별 프라이머 및 제한효소를 사용할 경우, 중합효소연쇄반응을 통해 188bp의 DNA 단편이 증폭되며, 제한효소를 처리하면 GG 유전자형인 경우 162bp 및 26bp의 DNA 단편, GA 유전자형인 경우 188bp, 162bp 및 26bp의 DNA 단편, AA 유전자형인 경우 188bp의 DNA 단편이 생성된다.
상기 rs148731719 SNP 판별 프라이머 및 제한효소를 사용할 경우, 중합효소연쇄반응을 통해 230bp의 DNA 단편이 증폭되며, 제한효소를 처리하면 GG 유전자형인 경우 135bp 및 95bp의 DNA 단편, GA 유전자형인 경우 230bp, 135bp 및 95bp의 DNA 단편, AA 유전자형인 경우 230bp의 DNA 단편이 생성된다.
상기 rs112735431 SNP 판별 프라이머 및 제한효소를 사용할 경우, 중합효소연쇄반응을 통해 151bp의 DNA 단편이 증폭되며, 제한효소를 처리하면 GG 유전자형인 경우 104bp, 42bp 및 5bp의 DNA 단편, GA 유전자형인 경우 146bp, 104bp, 42bp 및 5bp의 DNA 단편, AA 유전자형인 경우 146bp 및 5bp의 DNA 단편이 생성된다.
상기 rs760732823 SNP 판별 프라이머 및 제한효소를 사용할 경우, 중합효소연쇄반응을 통해 867bp의 DNA 단편이 증폭되며, 제한효소를 처리하면 GG 유전자형인 경우 867bp의 DNA 단편, GA 유전자형인 경우 867bp, 719bp 및 148bp의 DNA 단편, AA 유전자형인 경우 719bp 및 148bp의 DNA 단편이 생성된다.
상기 각 SNP의 조합에 따른 일배체형은 조합된 각 다형성이 동형접합일 경우 별도의 분석방법을 수행하지 않아도 결정할 수 있으나, 그렇지 않을 경우 연속적인 염기서열 분석방법을 수행하여 결정할 수 있다.
본 발명에 의하면 상기와 같은 방법으로 RNF213 유전자의 각 SNP를 판별하고 이를 바탕으로 한국인의 모야모야병 발생 위험을 예측하기 위한 정보를 제공할 수 있다. 이는 모야모야병 환자 및 대조군 집단의 비교 분석을 통해 확인된 유의적인 차이(p<0.05)에 기인한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 RNF213 유전자의 각 SNP 판별 결과를 바탕으로 다음과 같이 모야모야병의 발생 위험을 예측할 수 있다.
1) 피검자가 rs371441113 GA 유전자형인 경우 다른 rs371441113 유전자형인 사람에 비해 모야모야병의 발생 위험이 높다.
2) 피검자가 rs148731719/rs112735431/rs760732823/rs371441113 G-A-G-G, G-A-G-A, G-A-A-G 또는 A-A-G-G 일배체형인 경우 다른 rs148731719/rs112735431/rs760732823/rs371441113 일배체형인 사람에 비해 모야모야병의 발생 위험이 높다.
3) 피검자가 rs148731719/rs112735431/rs371441113 G-G-A, G-A-G 또는 A-A-G 일배체형인 경우 다른 rs148731719/rs112735431/rs371441113 일배체형인 사람에 비해 모야모야병의 발생 위험이 높다.
4) 피검자가 rs112735431/rs760732823/rs371441113 A-G-G, A-G-A 또는 A-A-G 일배체형인 경우 다른 rs112735431/rs760732823/rs371441113 일배체형인 사람에 비해 모야모야병의 발생 위험이 높다.
5) 피검자가 rs148731719/rs371441113 G-A 일배체형인 경우 다른 rs148731719/rs371441113 일배체형인 사람에 비해 모야모야병의 발생 위험이 높다.
6) 피검자가 rs112735431/rs371441113 G-A 또는 A-G 일배체형인 경우 다른 rs112735431/rs371441113 일배체형인 사람에 비해 모야모야병의 발생 위험이 높다.
7) 피검자가 rs760732823/rs371441113 G-A 일배체형인 경우 다른 rs760732823/rs371441113 일배체형인 사람에 비해 모야모야병의 발생 위험이 높다.
8) 피검자가 rs148731719/rs371441113 GG/GA 조합형인 경우 다른 rs760732823/rs371441113 조합형인 사람에 비해 모야모야병의 발생 위험이 높다.
9) 피검자가 rs112735431/rs371441113 GA/GG 또는 GA/GA 조합형인 경우 다른 rs112735431/rs371441113 조합형인 사람에 비해 모야모야병의 발생 위험이 높다.
10) 피검자가 rs760732823/rs371441113 GG/GA 조합형인 경우 다른 rs760732823/rs371441113 조합형인 사람에 비해 모야모야병의 발생 위험이 높다.
특히, 본 발명에 따르면 rs371441113의 GA 유전자형은 허혈성 모야모야병의 환자군에서 유의성이 있는 것으로 나타났다. 따라서 rs371441113 유전자형을 판별하는 방법은 허혈성 모야모야병의 발생 위험을 예측하는데 보다 효율적이다.
또한, 본 발명에 따르면 rs371441113의 GA 유전자형은 성인 MMD 환자군에서 더 유의성이 있는 것으로 나타났다. 따라서 피검자가 rs371441113 GA 유전자형인 경우 다른 rs371441113 유전자형인 사람에 비해 18세 이상의 성인이 되었을 때 모야모야병이 발생할 위험이 높다고 예측할 수 있다.
본 발명의 한국인의 모야모야병 발생 위험 예측용 키트는 상기와 같은 SNP 판별을 용이하게 수행할 수 있도록 하여 이를 바탕으로 한국인의 모야모야병 발생 위험을 예측할 수 있도록 하는 것으로, SNP를 검출하는 수단으로는 SNP의 검출을 위해 통상적으로 사용되는 물질, 예를 들어 PCR용 프라이머, PCR-RFLP용 프라이머 및 제한효소, DNA-DNA hybridization용 프로브 등이 사용될 수 있다. 본 발명에서는 이중에서도 PCR-RFLP용 프라이머 및 제한효소를 검출 수단으로 하는 것이 바람직하며, 특히 위에서 언급한 SNP 판별용 프라이머 및 제한효소가 바람직하다.
본 발명의 키트에는 상기와 같은 검출 수단 이외에도 SNP 검출에 사용되는 시약, 기구 등이 더 포함될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
본 실시예에서는 rs371441113을 'RNF213 4950G>A'로, rs148731719를 'RNF213 4448G>A'로, rs112735431를 'RNF213 4810G>A'로, rs760732823를 'RNF213 4863G>A'로 표현하였다.
1. 방법
1-1. 연구 집단 선정
모야모야병(이하, 'MMD'로 약기)을 앓고 있는 한국인 환자 117명(평균 나이, 23.20ㅁ17.75세; 여성 77명(65.8%); 남성 40명(34.2%))이 본 연구를 위해 모집되었다. MMD 환자는 자기공명영상(MRI) 또는 자기공명혈관조영술(MRA)에서 혈관 병변을 통한 임상 허혈성 또는 출혈성 증상의 존재를 바탕으로 진단 및 등록되었다.
대조군은 MMD 환자와 동일한 지역 배경의 253명(평균 나이 25.60ㅁ16.98세; 여성 145명(57.3%); 남성 108명(42.7%))으로 구성되었다. 세브란스 병원, 분당차병원, 충북대학교 병원에서 외래 환자를 대상으로 연령 및 성별에 따른 대상자를 모집했다. 표 1은 환자군과 대조군의 인구 통계적 특성을 보여준다. MMD 환자를 소아(18세 미만) 및 성인(18세 이상) 그룹으로 나누었고, 추가로 MMD 환자를 임상 및 MRI 소견에 따라 허혈성 또는 출혈성 그룹으로 나누었다.
모든 참가자는 연구에 등록하기 전에 서면 동의서를 제공했다. 세브란스 병원(4-2008-0308), 분당차병원(PBC09-103), 충북대학교 병원(2014-08-010-005)의 기관 검토위원회가 본 연구를 승인했다.
1-2. RNF213 유전형 분석
제조사의 지시에 따라 G-DEX II Genomic DNA Extraction kit(Intron Biotechnology, 성남)를 이용하여 백혈구에서 DNA를 추출하였다. RNF213 유전형을 분석하기 위해 PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)를 선택했다.
RNF213 4448G>A 다형성은 정방향 프라이머(5'-TTG CCA ACT AAG CCC TCG AAA CAA-3')와 역방향 프라이머(5'-CAA CAA TGG CAC AGA ATT GTC-3')를 사용하여 PCR하고, PCR 생성물(230bp)을 5U AluI로 처리하여 검출하였다. PCR 생성물을 AluI로 처리하였을 때 230bp의 단편만 생성되면 AA 유전자형, 230bp, 135bp 및 95bp의 단편이 생성되면 GA 유전자형, 135bp 및 95bp의 단편이 생성되면 GG 유전자형을 나타낸다(도 1의 a 참조).
RNF213 4810G>A 다형성은 정방향 프라이머(5'-AGC AGA GCT GAG GCT GGT AA-3') 및 역방향 프라이머(5'-CTG TCA GAG CAG AGC CAC AC-3')를 사용하여 PCR하고, PCR 생성물(151bp)을 3U Hpy188I로 처리하여 검출하였다. PCR 생성물을 Hpy188I로 처리하였을 때 146bp 및 5bp의 단편이 생성되면 AA 유전자형, 146bp, 104bp, 42bp 및 5bp의 단편이 생성되면 GA 유전자형, 104bp, 42bp 및 5bp의 단편이 생성되면 GG 유전자형을 나타낸다(도 1의 b 참조).
RNF213 4863G>A 다형성은 정방향 프라이머(5'-TGT GTG TGG AGC TGA TGG CT-3') 및 역방향 프라이머(5'-AGG GAG GAG ATA CAG ACC AGA CT-3')를 사용하여 PCR하고, PCR 생성물(867bp)을 5U Hpy188I로 처리하여 검출하였다. PCR 생성물을 Hpy188I로 처리하였을 때 867bp 단편만 생성되면 GG 유전자형, 867bp, 719bp 및 148bp의 단편이 생성되면 GA 유전자형, 719bp 및 148bp의 단편이 생성되면 AA 유전자형을 나타낸다(도 1의 c 참조).
RNF213 4950G>A 다형성은 정방향 프라이머(5'-GGT GGA GGA GGG CAG AGA GAC CGT GCA CGA-3') 및 역방향 프라이머(5'-CTT CCC TCT CTC GAG AAA CAC ACC AA-3')를 사용하여 PCR하고, PCR 생성물(188bp)을 3U BssSI로 처리하여 검출하였다. PCR 생성물을 BssSI로 처리하였을 때 162bp 및 26bp의 단편이 생성되면 GG 유전자형, 188bp, 162bp 및 26bp의 단편이 생성되면 GA 유전자형, 188bp의 단편만 생성되면 AA 유전자형을 나타낸다(도 1의 d 참조).
각 제한효소는 37℃에서 16시간 동안 처리하였고(New England BioLabs, Beverly, MA, USA), PCR은 표 1의 조건에 따라 수행하였다. 반응생성물(12㎕)은 3.0% EtBr 염색된 아가로스겔을 사용한 전기영동을 통해 확인하였다.
다형성 각각에 대해 PCR 분석의 약 10%를 무작위로 반복하고 자동 시퀀서(ABI3730x1 DNA 분석기, Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 DNA 시퀀싱으로 일치결과를 확인했다. 일치도는 100%였다.
1-3. 통계 분석
RNF213 다형성에 대한 유전자형 빈도는 Hardy-Weinberg 평형(HWE) 테스트를 통해 비교하였다. MMD의 인구학적 특성을 분석하기 위해 Mann-Whitney 및 카이-제곱 검정을 연속적 및 범주적 데이터에 각각 사용했다. RNF213과 MMD 환자(소아 또는 성인) 사이의 관계는 Fisher's exact test를 사용하여 odds ratio(OR)와 95% confidence intervals(CI)에 따라 계산되었다. RNF213 유전자의 4가지 다형성에 대한 보정된 odds ratio(AOR)는 성별과 나이를 가진 다중 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 계산되었다. 유전자형 분포에서 Hardy-Weinberg 평형을 고려했다. 통계 분석을 수행하기 위해 GraphPad Prism 4.0(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)과 StatsDirect 소프트웨어(버전 2.4.4, StatsDirect Ltd., 영국 Altrincham)를 사용하였다. 일배체형(haplotype) 분석을 수행하기 위해 HAPSTAT(3.0 버전; 미국 노스캐롤라이나 채플힐 대학)와 Haploview 4.2(Broad Institute, Cambridge, MA, USA)를 사용하였다. 조정된 OR 및 95% CI는 통계 소프트웨어(버전 2.4.4, StatsDirect Ltd., Altrincham, UK)에 의해 계산되었다.
2. 결과
2-1. 유전자형 분석
표 2는 본 연구에서 MMD 환자의 인구학적 특성을 나타낸다. RNF213 4448G>A, RNF213 4810G>A, RNF213 4863G>A 및 RNF213 4950G>A 다형성의 MMD 환자와 대조군 사이의 유전자형 빈도를 비교하여 표 3에 나타내었다. RNF213 4810G>A 및 RNF213 4950G>A 다형성에서 MMD 환자와 대조군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있었다.
RNF213 4810G>A의 GA 유전자형이 MMD 환자군에서 더 빈번하게 나타났으며(p<0.001, GG vs. GA), GA + AA 유전자형과 GG 유전자형의 비교 또한 MMD 환자에서 유의적인 차이가 있었다. RNF213 4950G>A의 GA 유전자형 또한 MMD 환자군에서 더 빈번하게 나타났다(p=0.008, GG vs. GA).
RNF213 다형성의 연관성을 MMD 질환의 허혈성과 출혈성으로 구분하여 분석한 결과, RNF213 4950G>A의 GA 유전자형은 허혈성(ischemic) 유형에서 유의적으로 더 빈번하게 나타났으며, RNF213 4810G>A의 GA 유전자형은 허혈성 및 출혈성 유형의 MMD 모두에서 빈번하게 나타났다(표 4 참조).
소아(18세 미만) MMD group 에서는 RNF213 4810G>A의 GA 유전자형이 대조군보다 빈번하게 나타났고(p<0.001), 성인(18세 이상) MMD group 에서는 RNF213 4810G>A의 GA 유전자형(p=0.004)과 RNF213 4950G>A의 GA 유전자형이 유의적으로 더 빈번하게 나타났다(p=0.006)(표 5 참조).
2-2. 일배체형 분석
일배체형 분석결과를 표 6 내지 12에 나타내었다.
RNF213 4448/4810/4863/4950 일배체형의 경우 G-A-G-G(p<0.001), G-A-G-A(p<0.001), G-A-A-G(p=0.001) 및 A-A-G-G(p=0.036) 일배체형은 대조군에 비교하여 MMD 환자군에서 유의적으로 높았으며, G-G-A-G 일배체형은 MMD 환자군에서 나타나지 않았다. RNF213 4448/4810/4950 일배체형의 경우 G-G-A 및 G-A-G 일배체형이 MMD 환자군에서 유의적으로 높았으며, RNF213 4810/4863/4950 일배체형의 경우 A-G-G 일배체형이 MMD 환자군에서 더 자주 나타났다(표 6 및 7 참조).
또한 MMD 환자를 소아군(18세 미만)과 성인군(18세 이상)으로 나누어 일배 체형 분석을 수행했다(표 9 내지 12 참조). 흥미롭게도 RNF213 4448/4810/4863/4950 일배체형에서 G-G-A-G(p=0.005), G-A-G-G(p<0.0001) 및 G-A-A-G(p=0.033) 일배체형은 소아군에서 MMD 위험성과 관련이 있는 반면, G-A-G-A(p<0.0001) 일배체형은 성인군에서 MMD의 위험을 높였다.
MMD 환자군과 대조군에서 RNF213의 유전자형 조합 빈도 분석결과를 표 13 및 14에 나타내었다. RNF213 4448G>A / 4810G>A 조합 유전자형의 경우 GG/GA 조합 유전자형이 MMD 환자군에서 더 자주 나타났고, RNF213 4810G>A / 4863G>A 조합 유전자형의 경우 GA/GG와 GA/GA 조합 유전자형, RNF213 4810G>A / 4950G>A 조합 유전자형의 경우 GA/GG와 GA/GA 조합 유전자형이 MMD 환자군에서 더 자주 나타났다.
2-3. 세계 인구에 대한 RNF213 다형성 스크리닝
표 15는 1000 게놈 프로젝트 데이터베이스(http://www.internationalgenome.org/)에 따른 다른 세계 인구에서 RNF213 다형성의 주요 및 작은 대립유전자 빈도, 그리고 본 발명에서 조사된 대조군과 MMD 환자군의 RNF213 4448G>A, 4810G>A, 4863G>A 및 4950G>A 대립유전자 빈도를 나타낸다.
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<160> 12
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<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aggagggcag agagaccgtg caggagttcg atctggagaa gattcagcgg c 51
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gtttttttcc tgtcagcaat gtgaagctgt gagcaaattc attggcgaat g 51
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cagcaagttg aatacagctc catcagaggc ttcctcagca agcacagctc a 51
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ctactgcagc actgacttgg atctggacac tgagtttgag atcctcttgc c 51
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for rs371441113
<400> 5
ggtggaggag ggcagagaga ccgtgcacga 30
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for rs371441113
<400> 6
cttccctctc tcgagaaaca caccaa 26
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for rs148731719
<400> 7
caaatggtgg tgatttctcc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for rs148731719
<400> 8
caacaatggc acagaattgt c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for rs112735431
<400> 9
agcagagctg aggctggtaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for rs112735431
<400> 10
ctgtcagagc agagccacac 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 11
tgtgtgtgga gctgatggct 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for rs760732823
<400> 12
agggaggaga tacagaccag act 23
Claims (8)
- 한국인의 모야모야병 발생 위험 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검자의 DNA 시료로부터 rs371441113 단일염기다형성을 판별하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
rs148731719 단일염기다형성, rs112735431 단일염기다형성 및 rs760732823 단일염기다형성 중에서 선택된 하나 이상의 단일염기다형성을 더 판별하는 것을 특징으로 하는 방법. - rs371441113 단일염기다형성을 검출하는 수단을 포함하는 한국인의 모야모야병 발생 위험 예측용 키트.
- 제 3항에 있어서,
상기 rs371441113 단일염기다형성을 검출하는 수단은 인간의 유전체 DNA 상에서 rs371441113 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 rs371441113 단일염기다형성 부위의 염기가 구아닌 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트인 것을 특징으로 하는 키트. - 제 4항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 제한효소는 BssSI인 것을 특징으로 하는 키트. - 제 3항에 있어서,
rs148731719 단일염기다형성, rs112735431 단일염기다형성 및 rs760732823 단일염기다형성 중에서 선택된 하나 이상의 단일염기다형성을 검출하는 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트. - 제 6항에 있어서,
a) 상기 rs148731719 단일염기다형성을 검출하는 수단은 인간의 유전체 DNA 상에서 rs148731719 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 rs148731719 단일염기다형성 부위의 염기가 구아닌 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;이고,
b) 상기 rs112735431 단일염기다형성을 검출하는 수단은 인간의 유전체 DNA 상에서 rs112735431 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 rs112735431 단일염기다형성 부위의 염기가 구아닌 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;이며,
c) 상기 rs760732823 단일염기다형성을 검출하는 수단은 인간의 유전체 DNA 상에서 rs760732823 단일염기다형성 부위를 포함하는 연속된 50 내지 10,000bp 부위를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 rs760732823 단일염기다형성 부위의 염기가 구아닌 또는 아데닌인 경우 중 어느 한 경우의 DNA를 절단할 수 있는 제한효소를 포함하여 이루어지는 프라이머-제한효소 세트;인 것을 특징으로 하는 키트. - 제 7항에 있어서,
상기 a)의 프라이머는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 a)의 제한효소는 AluI이고,
상기 b)의 프라이머는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 b)의 제한효소는 Hpy188I이고,
상기 c)의 프라이머는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이루어지며, 상기 c)의 제한효소는 Hpy188I인 것을 특징으로 하는 키트.
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