ES2445709T3

ES2445709T3 - Método para la identificación por técnicas moleculares de variantes genéticas que no codifican antígeno D (D-) y codifican antígeno C alterado (C+W)

Info

Publication number: ES2445709T3
Application number: ES10197481.4T
Authority: ES
Inventors: Jorge Ochoa; Monica Lopez; Diego Tejedor; Antonio Martinez; Laureano Simon
Original assignee: Progenika Biopharma SA
Current assignee: Progenika Biopharma SA
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2014-03-04
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: US20160060696A1; US20120172239A1; EP2471949A1; EP2471949B1

Abstract

Un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes de gruposanguíneo de un sujeto, comprendiendo el método: determinar al menos 4 marcadores en una muestra que se ha obtenido del sujeto, en donde los marcadores comprenden: (i) la presencia o ausencia de un alelo de RHCE*C; (ii) la presencia o ausencia de un alelo del exón 3 híbrido de RHD/RHCE (RHD/CE Hex03); (iii) la ausencia de, o una variante de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) dentro de, uno cualquiera delexón 4 de RHD, el exón de RHD o el exón 6 de RHD; y (iv) la ausencia de, o variante de SNP dentro del, exón 7 de RHD, en el que: la ausencia de dicho alelo de RHCE*C; la presencia de dicho alelo del exón 3 híbrido de RHD/RHCE; laausencia del exón 4 de RHD, exón 5 de RHD o exón 6 de RHD; y la ausencia del exón 7 de RHD encombinación indican que la muestra contiene dicha variante de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D odicha variante de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D.

Description

Método para la identificación por técnicas moleculares de variantes genéticas que no codifican antígeno D (D-) y codifican antígeno C alterado (C+W) 5

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos para genotipación y determinación de antígenos de células sanguíneas, que en particular pueden diferenciar las variantes de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o RHD*DIIIa-CE(4-7)-D), que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes de grupo sanguíneo. La invención también se refiere a productos, en particular sondas, cebadores y kits para su uso en dichos métodos.

Antecedentes de la invención

15 El éxito de la transfusión sanguínea depende con frecuencia del grado de compatibilidad entre el donante y el receptor. El grado de compatibilidad, a su vez, está en función de la similitud en contenido de antígeno de glóbulos rojos (RBC) entre el donante y el receptor. La mayoría de los antígenos de RBC en un individuo pueden predecirse de una manera sencilla a partir del análisis de su ADN genómico. Por lo tanto, puede usarse análisis del ADN del donante y/o receptor para predecir el grado de compatibilidad y de este modo permitir la práctica de transfusión sanguínea apropiada.

Las reacciones hemolíticas son más habituales en individuos con múltiples transfusiones que con transfusiones individuales, no solamente por la mayor probabilidad de dicho acontecimiento a medida que aumenta el número de

25 unidades transfundidas, sino también debido a la naturaleza dirigida por memoria inmunológica acumulativa de la respuesta inmunitaria en el receptor. Un ejemplo de una afección cuyo tratamiento incluye transfusiones sanguíneas repetidas es la Anemia Falciforme (SCD). Se deduce por lo tanto que un alto grado de compatibilidad con la sangre del donante es con frecuencia crítico para el éxito de la transfusión en pacientes con SCD.

Aunque la SCD es más prevalente entre individuos de orígenes africanos, la población donante de sangre en los Estados Unidos y otros países occidentales es en su mayoría caucásica. Como consecuencia de esta disparidad, las diferencias de antígenos de RBC entre ambos grupos raciales con frecuencia son responsables de fracasos en transfusiones de sangre en pacientes con SCD.

35 La variante genética RHD*DIIIa-CE(4-7)-D (también conocida como RHD-CE-DS, RHD-CE(4-7)-D, (C)ceS, o r’S) puede encontrarse en aproximadamente el 5 % de la población afroamericana, pero no se ha indicado en caucásicos. Esta variante presenta un especial reto a la transfusión de sangre debido a que codifica un perfil antigénico bastante complejo, que incluye ausencia de antígeno D, formas alteradas de antígenos C (C+W) y e, expresión de antígeno VS de baja frecuencia, no expresión de antígeno V, y ausencia del antígeno hrB de alta frecuencia. Los perfiles antigénicos de D y C son los clínicamente más relevantes para determinar la compatibilidad entre donantes de sangre y pacientes de transfusión.

La complejidad antigénica de RHD*DIIIa-CE(4-7)-D se correlaciona con su complejidad genética, que incluye cambios en el gen RHD, con una sustitución de parte del exón 3 de RHD, exones 4-7 de RHD, y los intrones

45 intermedios por sus homólogos de RHCE, una sustitución G>T en la posición 186 (exón 2), una sustitución C>T en la posición 410 (exón 3 híbrido), una sustitución C>G en la posición 733 (exón 5), y una sustitución G>T en la posición 1006 (exón 7). Además de los cambios en el gen RHD, RHD*DIIIa-CE(4-7)-D aparece en cis con un gen RHCE que codifica sustituciones C>G en la posición 733 (exón 5) y G>T en la posición 1006 (exón 7). El fenotipo C+W se caracteriza por expresión débil del antígeno Rh C.

Para añadir a la complejidad antigénica y genética, el conocimiento de los inventores acerca de la base molecular de RHD*DIIIa-CE(4-7)-D está incompleto. Por ejemplo, los puntos precisos de recombinación RHCE/RHD en el intrón 3

o intrón 7 no se han presentado hasta la fecha. Además, se han descrito dos tipos de variantes RHD*DIIIa-CE(4-7)-D (Tipo 1 y Tipo 2), que difieren tanto en su composición genética como en sus perfiles antigénicos, aunque los

55 perfiles antigénicos de D y C clínicamente relevantes son iguales. Puede haber otros fenotipos de tipo RHD*DIIIaCE(4-7)-D, que también tienen un perfil antigénico D- y C+W. Clínicamente, es por lo tanto muy importante distinguir RHD*DIIIa-CE(4-7)-D y otros fenotipos de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D de fenotipos con diferentes perfiles antigénicos de C y D.

Varias publicaciones (Referencias 1-3) han examinado la similitud genética entre RHD*DIIIa-CE(4-7)-D y otras variantes de RHD, en particular RHD*DIIIa y RHD*DIVa-1/RHD*DIVa-2 (en lo sucesivo RHD*DIVa-2). Varios métodos moleculares para la detección específica de RHD*DIIIa-CE(4-7)-D se han basado en la detección de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) localizados en el exón 3 híbrido. Se sabe ahora que estos SNP están compartidos con las variantes RHD*DIIIa y RHD*DIVa-2. En consecuencia, la identificación de RHD*DIIIa-CE(4-7)-D 65 en una muestra por análisis de ADN requiere detección de los SNP del exón 3 híbrido y diferenciación de RHD*DIIIa y RHD*DIVa-2, que es difícil con los métodos actuales de genotipación. Esta diferenciación es clínicamente

relevante puesto que RHD*DIIIa y RHD*DIVa-2 codifican un perfil antigénico diferente, que incluye expresión de D parcial y ausencia de C+W (es decir D parcial, C-). También es importante distinguir entre otras variantes genéticas que también pueden compartir estos SNP de exón 3 híbrido pero codifican diferentes combinaciones de antígenos D y C, que también pueden ser clínicamente relevantes.

5 El documento WO 2006/075254 describe métodos y productos para genotipación in vitro.

Advent et al., 2009, Transfusion Medicine and Hemotherapy, Vol. 36, Nº 3, pp. 162-167, describe el proyecto bloodgen de la Unión Europea.

Westhoff et al., 2010, Transfusion, Vol. 50, Nº 6, pp. 1303-1311, presenta que DIIIa y DIII Tipo 5 están codificados por el mismo alelo y se asocian con alelos RHCE*ce alterados.

Pham et al., 2009, Transfusion, Vol. 49, Nº 3, pp. 495-504, describe el fondo molecular heterogéneo del fenotipo C 15 débil, VS+, hr(B)-, Hr(B)- en personas negras.

El documento WO 2006/032897 describe análisis génicos, particularmente de los genes ABO y RHD.

El documento DE 10049363 describe un kit de diagnóstico, una micromatriz y su uso para la determinación del factor Rh en un ser humano, por ejemplo en diagnóstico prenatal.

Faas et al., 1995, BLOOD, Vol. 85, Nº 3, pp. 829-832, describe genotipación de Rh E/e por amplificación de cebadores específicos de alelo.

25 Maaskant-van Wijk et al., 1998, Transfusion, Vol. 11, Nº 38, pp. 1015-1021, describe genotipación de RHD por análisis de reacción en cadena de la polimerasa múltiple de seis exones específicos de RHD.

El documento WO 2011/003921 describe métodos y productos para genotipación in vitro.

Algunas de estas otras variantes de RHD han identificado, por ejemplo RHD*DIVb-4, RHD*tipoDdébil4.0, RHD*tipoDdébil4.1, RHD*tipoDdébil14, RHD*tipoDdébil51, RHD*DAR, RHD*DAR-E, RHD*ex04-ex07del, RHD*ex03del y RHD*ex03-ex04del, que tienen expresión variada del antígeno D.

Los reactivos de anticuerpo habitualmente usados para detectar antígeno C no diferencian entre C+W y C+. Por lo

35 tanto, el fenotipo con frecuencia se indica como C+. En casos en los que el reactivo de anticuerpo no diferencia entre C+W y C+ pero la muestra contiene un alelo RHCE*C normal en trans para un alelo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, C+W está ocultado por C+, dando como resultado un fenotipo C+ para la muestra.

Esto hace difícil determinar el fenotipo correcto para perfiles antigénicos C+W/C-, C+W/C+W, C+W/C+ y C+/C+ usando análisis de serología solamente. Por lo tanto, es necesario ensayar con respecto a RHCE*C y mostrar que está ausente antes de la asignación de un fenotipo C+W a una muestra, y por lo tanto los métodos actuales de diagnóstico de un perfil antigénico RHD*DIIIa-CE(4-7)-D son difíciles incluso cuando se realiza tanto análisis de serología como análisis genético.

45 Sumario de la invención

Los inventores han descubierto un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D), que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa2 y otras variantes de grupo sanguíneo, determinando al menos cuatro marcadores genéticos. El método no requiere el uso de anticuerpos, y permite la predicción de los fenotipos de antígeno D y C de una gran mayoría de muestras que contienen el exón 3 híbrido de RHD/RHCE.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o de tipo RHD*DI-IIa-CE(4-7)-D, que expresan el antígeno C+W y carecen de un

55 antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes de grupo sanguíneo, de un sujeto, comprendiendo el método:

determinar al menos 4 marcadores en una muestra que se ha obtenido del sujeto, en el que los marcadores comprenden:

(i): la presencia o ausencia de un alelo RHCE*C;

(ii): la presencia o ausencia de un alelo de exón 3 híbrido de RHD/RHCE (RHD/CE Hex03);

65 (iii) la ausencia de, o una variante de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) dentro de uno cualquiera del exón 4 de RHD, exón 5 de RHD o exón 6 de RHD; y

(iv) la ausencia de, o variante de SNP dentro de, el exón 7 de RHD, en el que: 5 la ausencia de dicho alelo RHCE*C; presencia de dicho alelo de exón 3 híbrido de RHD/RHCE; ausencia del exón 4 de RHD, exón 5 de RHD o exón 6 de RHD; y ausencia del exón 7 de RHD en combinación indican que la muestra contiene dicha variante de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o dicha variante de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D. En algunos casos de acuerdo con la presente invención: a) la variante de SNP dentro del exón 4 de RHD está en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD (rs1053355),

15 b) la variante de SNP dentro del exón 5 de RHD está en la posición 667 de la secuencia codificante de RHD (rs1053356), c) la variante de SNP dentro del exón 6 de RHD está en la posición 819 de la secuencia codificante de RHD; y/o d) la variante de SNP dentro del exón 7 de RHD está en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD

(rs41307826), en la que la secuencia codificante de RHD es como se expone en SEC ID Nº: 1. 25 En algunos casos de acuerdo con la presente invención los marcadores comprenden además:

(v) la presencia o ausencia de un alelo del exón 3 de RHD,

en el que la ausencia de dicho exón 3 de RHD indica además que la muestra contiene dicha variante de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o dicha variante de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D.

En algunos casos de acuerdo con la presente invención:

a) el método comprende además determinar los fenotipos de antígenos RHD y RHC del sujeto de acuerdo con la 35 Tabla 1; y/o

b) el método comprende detectar la presencia o ausencia de una variante de grupo sanguíneo seleccionada de: RHD*DIIIa; RHD*DIVa-2; o variantes del grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D), por ejemplo en el que el método comprende detectar la presencia o ausencia de variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o variantes de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D); y/o

c) el marcador (iii) es el SNP dentro del exón 4 de RHD en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD (rs1053355); y/o

45 d) el alelo RHCE*C se determina determinando la presencia o ausencia del intrón 2 de RHCE*C, o una cualquiera de las siguientes posiciones en la secuencia codificante de RHCE: posición 307 (exón 2), posición 48 (exón 1), posición 150 (exón 2), posición 178 (exón 2), posición 201 (exón 2) y/o posición 203 (exón 2),

en el que la secuencia codificante de RHD es como se expone SEC ID Nº: 1 y en el que la secuencia codificante de RCHE es como se expone en SEC ID Nº: 2.

En algunos casos de acuerdo con la presente invención la muestra comprende ácido nucleico y el método comprende amplificar el ácido nucleico o una parte del mismo por PCR usando cebadores, por ejemplo en el que:

55 a) los cebadores de PCR para determinar el alelo RHCE*C son un cebador de PCR directo específico para RHCE*C, y un cebador de PCR inverso no específico, por ejemplo en el que

(i): el cebador inverso no específico se comparte con RHD, RHC*C y/o RHC*c; y/o

(ii): los cebadores de PCR comprenden: Directo: 5’-GGCCACCACCATTTGAA-3’ (SEC ID Nº: 3)

Inverso: 5’-CCATGAACATGCCACTTCAC-3’, (SEC ID Nº: 4); 65 y/o

b) los cebadores de PCR para determinar el alelo RHD/CE Hex03 son cebadores de PCR directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 2 y 3, o los intrones 3 y 2, respectivamente, por ejemplo en los que

5 (i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-TCCTGGCTCTCCCTCTCT-3’ (SEC ID Nº: 9)

Cebador inverso: 5’-TTTTCAAAACCCCGGAAG-3 (SEC ID Nº: 10); y/o

c) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 4 de RHD en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD (rs1053355) son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 3 y 4, o intrones 4 y 3, respectivamente, por ejemplo en los que

(i) los cebadores de PCR comprenden:

15 Cebador directo: 5’-GCTCTGAACTTTCTCCAAGGACT-3’ (SEC ID Nº: 17) Cebador inverso: 5’-ATTCTGCTCAGCCCAAGTAG-3’ (SEC ID Nº: 18); y/o

d) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 5 de RHD en la posición 667 de la secuencia codificante de RHD (rs1053356) son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 4 y 5, o intrones 5 y 4, respectivamente, por ejemplo en los que

(i) los cebadores de PCR comprenden:

25 Cebador directo: 5’-TTGAATTAAGCACTTCACAGAGCA-3’ (SEC ID Nº: 19) Cebador inverso: 5’-CACCTTGCTGATCTTCCC-3’ (SEC ID Nº: 20); y/o

e) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 6 de RHD en la posición 819 de la secuencia codificante de RHD son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 5 y 6, o intrones 6 y 5, respectivamente, por ejemplo en los que

(i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-AGTAGTGAGCTGGCCCATCA-3’ (SEC ID Nº: 21) 35 Cebador inverso: 5’-CTTCAGCCAAAGCAGAGGAG-3’ (SEC ID Nº: 22); y/o

f) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 7 de RHD en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD (rs41307826) son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 6 y 7, o intrones 7 y 6, respectivamente, por ejemplo en los que

(i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-ACAAACTCCCCGATGATGTGAGTG-3’ (SEC ID Nº: 35)

Cebador inverso: 5’-GAGGCTGAGAAAGGTTAAGCCA-3’ (SEC ID Nº: 36); y/o

45 g) como se indica en la reivindicación 3, los cebadores de PCR para determinar el alelo del exón 3 de RHD son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 2 y 3, o intrones 3 y 2, respectivamente, por ejemplo en los que

(i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-TCCTGGCTCTCCCTCTCT-3’ (SEC ID Nº: 15)

Cebador inverso: 5’-GTTGTCTTTATTTTTCAAAACCCT-3’ (SEC ID Nº: 16);

55 en el que la secuencia codificante de RHD es como se expone en SEC ID Nº: 1.

En algunos casos de acuerdo con la presente invención el ácido nucleico amplificado comprende un marcador, por ejemplo en el que

a) el marcador comprende un nucleótido biotinilado; y/o

b) el marcador comprende un resto fluorescente.

En algunos casos de acuerdo con la presente invención la muestra comprende ácido nucleico, y el método

65 comprende amplificar el ácido nucleico o una parte del mismo por PCR usando cebadores, fragmentando el ácido nucleico amplificado, y marcando el ácido nucleico fragmentado con ddNTPS biotinilado usando una enzima

desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). En algunos casos de acuerdo con la presente invención determinar la presencia, ausencia o variante de SNP de un marcador comprende poner en contacto ácidos nucleicos que contienen cada marcador con una o más sondas, por ejemplo en el que:

5 a) las sondas para determinar la presencia o ausencia de RHD/CE Hex03 o el exón 3 de RHD entra en contacto con un SNP localizado tanto en RHD/CE Hex03 como en el exón 3 de RHD, en el que una variante de SNP es específica de RHD/CE Hex03, y otra variante de SNP es específica para el exón 3 de RHD, por ejemplo en el que

(i): el SNP está en la posición 410 de la secuencia codificante, localizado tanto dentro de RHD/CE Hex03 como dentro del exón 3 de RHD; y/o

(ii): las sondas comprenden:

15 (1) 5’-TTTTACAGACGCCTGCTACCATG-3’, (SEC ID Nº: 5)

(2): 5’-CATGGTAGCAGGCGTCTGTAAAA-3’, (SEC ID Nº: 6)

(3): 5’-TTTTACAGACGTCTGCTACCATG-3’, (SEC ID Nº: 7) y

(4): 5’-CATGGTAGCAGACGTCTGTAAAA-3’, (SEC ID Nº: 8); y/o

b) las sondas para determinar la ausencia o variante de SNP del SNP en: la posición 602 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 4 (rs1053355), posición 667 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 5 (rs1053356), o posición 819 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 6 comprenden:

25 (i) exón 4 de RHD:

(1): 5’-ATAAAGATCAGACAGCAACGATACC-3’ (SEC ID Nº: 23)

(2): 5’-TAAAGATCAGACAGCAACGATAC-3’ (SEC ID Nº: 24)

(3): 5’-ATAAAGATCAGAGAGCAACGATACC-3’ (SEC ID Nº: 25)

(4): 5’-TAAAGATCAGAGAGCAACGATAC-3’ (SEC ID Nº: 26);

(ii) exón 5 de RHD:

(1) 5’-CTGGCCAAGTTTCAACTCTGC-3’ (SEC ID Nº: 27) 35 (2) 5’-TGGCCAAGTTTCAACTCTG-3’ (SEC ID Nº: 28)

(3): 5’-CTGGCCAAGTGTCAACTCTGC-3’ (SEC ID Nº: 29)

(4): 5’-TGGCCAAGTGTCAACTCTG-3’ (SEC ID Nº: 30);

(iii) exón 6 de RHD:

(1): 5’-GTGCACAGTGCGGTGTTGGCAGG-3’ (SEC ID Nº: 31)

(2): 5’- TGCACAGTGCGGTGTTGGCAG -3’ (SEC ID Nº: 32)

(3): 5’- GTGCACAGTGCAGTGTTGGCAGG -3’ (SEC ID Nº: 33)

(4): 5’-TGCACAGTGCAGTGTTGGCAG-3’ (SEC ID Nº: 34); y/o

45 c) las sondas para determinar la variante de SNP del SNP en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 7 (rs41307826) comprenden:

(1): 5’-TGCTGGTGCTTGATACCGTCGGA-3’ (SEC ID Nº: 37)

(2): 5’-GCTGGTGCTTGATACCGTCGG-3’ (SEC ID Nº: 38)

(3): 5’-TGCTGGTGCTTCATACCGTCGGA-3’ (SEC ID Nº: 39)

(4): 5’-GCTGGTGCTTCATACCGTCGG-3’ (SEC ID Nº: 40);

en las que la secuencia codificante de RHD es como se expone en SEC ID Nº:1. 55 En algunos casos de acuerdo con la presente invención

a) una o más de las sondas comprenden un marcador, por ejemplo en el que el marcador es un resto fluorescente; y/o b) una o más de las sondas está unida con un soporte sólido o conjugada con una o más partículas.

En un aspecto adicional la presente invención proporciona uso de un conjunto de cebadores en un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7-D), que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes de grupo sanguíneo, 65 amplificando ácido nucleico que comprende al menos los cuatro marcadores definidos en la reivindicación 1, en el que el conjunto de cebadores comprende al menos tres pares de cebadores seleccionados de los cebadores

expuestos en:

(i) reivindicación 5(a),

(ii) reivindicación 5(b), 5

(iii) una cualquiera de las reivindicaciones 5(c), 5(d) o 5(e)

(iv) reivindicación 5(f), y

(v) reivindicación 5(g). En algunos casos de acuerdo con la presente invención el conjunto de cebadores comprende al menos tres pares

de cebadores seleccionados de los cebadores expuestos en: 15 (i) reivindicación 5(a)(ii),

(ii) reivindicación 5(b)(i),

(iii) una cualquiera de las reivindicaciones 5(c)(i), 5(d)(i) o 5(e)(i),

(iv): reivindicación 5(f)(i), y

(v): reivindicación 5(g)(i).

25 En algunos casos de acuerdo con la presente invención al menos el 50 % de los cebadores en el conjunto son los pares de cebadores definidos en la reivindicación 10 u 11.

En un aspecto adicional más la presente invención proporciona uso de un conjunto de cebadores en un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7-D), que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes de grupo sanguíneo, determinando la presencia, ausencia o variante de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) de al menos los cuatro marcadores como se definen en la reivindicación 1, en el que el conjunto de cebadores comprende:

(i) las sondas de SEC ID Nº: 5, 6, 7 y 8; 35

(ii) las sondas de SEC ID Nº: 23, 24, 25 y 26;

(iii) las sondas de SEC ID Nº: 31, 32, 33 y 34

(iv): las sondas de SEC ID Nº: 27, 28, 29 y 30; y

(v): las sondas de SEC ID Nº: 37, 38, 39 y 40.

En algunos casos de acuerdo con la presente invención:

45 a) las sondas se inmovilizan en un soporte sólido o se conjugan con una o más partículas, por ejemplo en el que el soporte sólido comprende uno o más marcadores unidos, por ejemplo en el que el marcador es un fluorocromo; y/o

b) una o más sondas comprenden un marcador, por ejemplo en el que marcador es un resto fluorescente.

En un aspecto adicional más la presente invención proporciona uso de un kit para genotipar un sujeto, comprendiendo el kit un conjunto de cebadores de PCR como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, y un conjunto de cebadores como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14.

Descripción de las figuras

Figura 1: Secuencia codificante de RHD (SEC ID Nº: 1), que muestra las posiciones de cada exón. La secuencia de nucleótidos mostrada es una secuencia consenso.

Figura 2: Secuencia codificante de RHCE (SEC ID Nº: 2), que muestra las posiciones de cada exón. La secuencia de nucleótidos mostrada es una secuencia consenso.

Descripción detallada de la invención

65 El antígeno D del grupo sanguíneo Rh está codificado por el gen RHD, que comprende 10 exones. La secuencia del gen RHD completa está disponible en la Secuencia de Referencia de NCBI: NG_007494.1 Nº NG_007494.1, GI:171184448, (SEC ID Nº: 41). La secuencia codificante, anotada para mostrar la posición de partida de cada exón, se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1).

5 El antígeno C del grupo sanguíneo Rh está codificado por el gen RHCE, que comprende 10 exones. La secuencia del gen RHCE completa está disponible en la Secuencia de Referencia de NCBI: NG_009208.2, GI:301336136, (SEC ID Nº: 42). La secuencia codificante, anotada para mostrar la posición de partida de cada exón, se muestra en la Figura 2 (SEC ID Nº: 2).

La presente invención permite la determinación de los fenotipos de antígenos RHD y RHC clínicamente relevantes de una muestra sanguínea, basándose en al menos los siguientes cuatro marcadores: al menos un alelo RHCE*C; al menos un alelo del exón 3 híbrido de RHD/RHCE (RHD/CE Hex03); el SNP en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD, dentro del exón 4, o el SNP en la posición 667 de la secuencia codificante de RHD, dentro del exón 5, o el SNP en la posición 819 de la secuencia codificante de RHD, dentro del exón 6; y el SNP en la posición

15 1048 de la secuencia codificante de RHD, dentro del exón 7.

La determinación de los fenotipos de antígenos RHD y RHC clínicamente relevantes de una muestra sanguínea puede basarse adicionalmente en la determinación de un quinto marcador: concretamente, al menos un alelo de exón 3 de RHD.

La Tabla 1 demuestra como la combinación de estos cinco marcadores permite la predicción de la amplia mayoría de fenotipos de antígenos RHD y RHC. Las primeras tres columnas muestran si está presente al menos un alelo de RHCE*C, alelo del exón 3 híbrido de RHD/RHCE (RHD/CE Hex03) y exón 3 de RHD. Las columnas tituladas RHD 602 y RHD 1048 muestran las variantes de SNP en estas posiciones, es decir si están ausentes, son heterocigotas,

25 u homocigotas/está ausente un SNP. La presencia de al menos un alelo de RHCE*C determina si está presente un antígeno C+, y las siguientes cuatro columnas proporcionan información sobre el fenotipo de antígeno D, y el fenotipo de antígeno C en ausencia de RHCE*C. Juntos, estos datos permiten predecir los haplotipos genéticos de RHD y fenotipos antigénicos D y C, y pueden por lo tanto distinguirse basándose en esto diferentes grupos sanguíneos.

Aunque la combinación de los 4 o 5 marcadores descritos en la presente memoria puede distinguir variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D) de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes de grupo sanguíneo, no se pretende que predigan inequívocamente todas las posibles combinaciones antigénicas de C y D. Por lo tanto “Posiblemente RHD” en la columna de haplotipo es una expresión genética que se pretende

35 que incluya RHD así como variantes de RHD distintas de las buscadas por el presente método. De forma similar, “¿D?” en la columna de fenotipo se refiere a fenotipos D, D Parcial, D Débil, D-o Del codificados por variantes de RHD distintas de las buscadas por el presente método. Sin embargo, D+ es el fenotipo más probable en esta situación.

La interpretación de los datos de Fenotipo Predicho de la Tabla 1 se facilita por la Tabla 2, que proporciona una descripción exhaustiva de cómo los fenotipos codificados por haplotipo relevantes para la presente invención (el fenotipo de antígeno D y fenotipo de antígeno C) se combinan para producir el fenotipo de una muestra.

En algunas realizaciones, la presencia/ausencia del exón 3 de RHD puede determinarse determinando la secuencia

45 de nucleótidos de SNP en la posición 410 de la secuencia codificante de RHD, dentro del exón 3 (número rs no disponible).

En algunas realizaciones, la determinación de la secuencia de nucleótidos en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD, dentro del exón 4, podría sustituirse por la determinación de la secuencia de nucleótidos de SNP (nucleótido T frente a nucleótido G) en la posición 667 de la secuencia codificante de RHD, dentro del exón 5, o la secuencia de nucleótidos de SNP (nucleótido G frente a nucleótido A) en la posición 819 de la secuencia codificante de RHD, dentro del exón 6.

Otras combinaciones de marcadores que incluyen menos que los al menos 4 o 5 marcadores descritos en la 55 presente memoria darían como resultado una capacidad reducida para determinar fenotipos D- C+W.

Por ejemplo, sin la determinación de la presencia/ausencia de RHCE*C, no sería posible predecir un fenotipo C para muestras RHD*DIIIa y/o RHD*DIVa-2 o un fenotipo C+W para muestras RHD*DIIIa-CE(4-7)-D.

Sin la determinación de la presencia/ausencia del exón 3 híbrido de RHD/RHCE, no sería posible deducir un haplotipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D para ninguna muestra, y por tanto no sería posible predecir un fenotipo C+W para ninguna muestra.

Sin la determinación de la variante de SNP en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD, no sería posible

65 deducir un haplotipo de RHD*DIIIa para una muestra, y por lo tanto no sería posible predecir un fenotipo no D-para dicha muestra.

Sin la determinación del nucleótido en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD, no sería posible deducir un haplotipo RHD*DIVa-2 para una muestra, y por lo tanto no sería posible predecir un fenotipo no D-para dicha muestra.

5 Sin la determinación de la presencia/ausencia del exón 3 de RHD, no sería posible predecir un haplotipo RHD*DIIIaCE(4-7)-D para muestras con ciertas variantes de RHD nuevas, y por lo tanto no sería posible predecir un fenotipo C+W para esas muestras. Por ejemplo, cuando está ausente al menos un alelo RHCE*C, está presente al menos un alelo de exón 3 híbrido de RHD/RHCE (RHD/CE Hex03), está ausente el SNP en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD y está ausente en SNP en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD, la presencia o ausencia de al menos un alelo del exón 3 de RHD permitirá la predicción de un fenotipo C- o C+W, respectivamente (Tabla 1). De forma similar, cuando está ausente al menos un alelo de RHCE*C, está presente al menos un alelo de exón 3 híbrido de RHD/RHCE (RHD/CE Hex03), la secuencia de nucleótidos en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD es G, y la secuencia de nucleótidos en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD es

15 G, la ausencia o presencia de al menos un alelo de exón 3 de RHD permitirá la predicción de un fenotipo D Parcial o indeterminado (D Débil o D Parcial), receptivamente.

Podría usarse una diversidad de técnicas adecuadas para detectar estas secuencias genéticas. Lo siguiente se presenta como ejemplos no limitantes de dichas técnicas.

Una técnica adecuada para detectar las secuencias genéticas mencionadas en la presente memoria es análisis de mutación por digestión de restricción después de una reacción de PCR para amplificar la región de interés, si la variante genética o el polimorfismo dan como resultado la creación o eliminación de un sitio de restricción. También puede usarse análisis de secuencia, tal como secuenciación directa manual o fluorescente automática, directamente

25 o después de la selección de la región de interés por PCR, para detectar secuencias específicas. También pueden usarse oligonucleótidos específicos de alelo, por ejemplo, usados en una PCR competitiva, para detectar variantes genéticas.

Otra técnica para detectar secuencias específicas en una muestra es ensayar esa muestra con respecto a la presencia de una molécula de ácido nucleico que comprende toda o una parte de la región de interés, que comprende poner en contacto dicha muestra con una segunda molécula de ácido nucleico o sonda en condiciones para hibridación selectiva. Toda o una parte de la región de interés puede amplificarse antes de realizar la técnica específica usada para la detección de las variantes genéticas.

35 La muestra puede ser cualquier muestra biológica de un paciente, por ejemplo tejido, sangre, suero o saliva de un paciente. La muestra puede contener células, ser sin células o consistir solamente en células aisladas.

Los métodos de la invención hacen uso de la detección de la presencia o ausencia de una o más secuencias de nucleótidos específicas dentro de los segmentos funcionales.

En ciertos casos, el método de la invención puede denominarse hibridación específica de alelos, y puede hacer uso de sondas oligonucleotídicas sintéticas habitualmente de 10-50 nucleótidos de longitud, preferentemente de 19-27 nucleótidos de longitud, cuyas secuencias están diseñadas para ser complementarias de la secuencia buscada. La complementariedad de las secuencias permite emparejamiento de ADN genómico y moléculas sonda

45 oligonucleotídicas. Puede hacerse que el emparejamiento específico, es decir emparejamiento de sondas con su secuencia complementaria y con ninguna otra secuencia, suceda en condiciones apropiadas, que incluyen pero sin limitación el tiempo de incubación, temperatura de incubación, concentración de secuencias sonda y complementarias, rigurosidad de los tampones y mezcla. El emparejamiento específico con sondas permite la detección de secuencias en una mezcla de secuencias. La detección o falta de detección de secuencias específicas, a su vez, permite la determinación de presencia frente a ausencia de segmentos funcionales.

Pueden usarse sondas oligonucleotídicas sintéticas para la detección de regiones conservadas particulares, no variantes y/o variantes alélicas en el ADN genómico de un individuo. Con frecuencia, las variantes alélicas son polimorfismos de un único nucleótido (SNP), es decir posiciones de nucleótidos en las que la composición de ADN

55 puede variar entre individuos.

En algunos casos, las sondas oligonucleotídicas sintéticas descritas en la presente memoria se diseñan y se usan para detectar la presencia o ausencia de segmentos de ácido nucleico funcionales y también tanto para detectar variantes alélicas localizadas dentro de secuencias como para determinar la presencia o ausencia de segmentos funcionales.

Dado un nucleótido particular en una posición particular de un locus de ADN genómico, pueden diseñarse moléculas oligonucleotídicas sintéticas, o sondas, para detectar dicho nucleótido en una muestra de ensayo. Las sondas pueden diseñarse en pares de modo que un miembro del par de sonda sea complementario de una cadena de la 65 secuencia, mientras que el otro miembro del par de sonda es complementario de la otra cadena de la secuencia. Las sondas también pueden diseñarse en conjuntos de modo que tengan diferentes longitudes y sean complementarias

de una cadena o las dos cadenas de la secuencia de interés. De acuerdo con cualquiera aspecto de la presente invención, pueden unirse sondas con un soporte sólido funcionalizado químicamente. Un ejemplo de un soporte sólido es una superficie de vidrio plana, en la que se colocan moléculas sonda por deposición de contacto. Otro ejemplo de un soporte sólido es una partícula tal como

5 una perla polimérica de tamaño micrométrico, a la que se unen moléculas sonda por conjugación. Otro ejemplo de un soporte sólido es una partícula de tamaño nanométrico a la que se unen moléculas sonda.

Si las sondas están inmovilizadas en una superficie de vidrio plana, puede realizarse unión de una sonda con la superficie en múltiples localizaciones individuales, denominadas en lo sucesivo en la presente memoria elementos repetidos o “repeticiones”. El número de elementos repetidos para cada sonda es habitualmente diez, aunque puede variar. Si las sondas se inmovilizan en partículas, la unión puede ser con múltiples conjuntos de partículas.

De acuerdo con cualquier aspecto de la invención descrita en la presente memoria, pueden amplificarse segmentos funcionales o sus partes que contienen marcadores de la invención, por ejemplo por PCR, usando ADN genómico

15 como un molde. Pueden marcarse segmentos funcionales amplificados o sus partes que contienen marcadores (por ejemplo con un marcador de biotina y/o fluorescente) para permitir su detección, y opcionalmente fragmentarse para facilitar el emparejamiento con sondas oligonucleotídicas.

De acuerdo con cualquier aspecto de la invención descrita en la presente memoria, pueden incubarse segmentos funcionales marcados y fragmentados o sus partes que contienen marcadores de la invención en condiciones que maximizan la sensibilidad y especificidad del emparejamiento con sondas unidas con el soporte sólido. La presencia de segmentos funcionales emparejados con sonda o sus partes puede determinarse indirectamente a partir de la medición de un marcador, habitualmente un fluorocromo, unido con el soporte sólido. Esta medición se denomina en la presente memoria intensidad de señal. Como ejemplo, la fluorescencia emitida por el fluorocromo puede

25 recogerse por medio de un dispositivo de detección de fluorescencia, tal como un explorador confocal.

Determinación de la presencia o ausencia de RHCE*C

Amplificación del intrón 2 de RHCE*C por PCR.

El marcador RHCE*C puede detectarse amplificando el intrón 2 de RHCE*C usando cebadores oligonucleotídicos que se unen con secuencias del intrón 2. La secuencia diana del cebador directo (cadena arriba) puede ser específica de RHCE*C, y la secuencia diana del cebador inverso (cadena abajo) puede ser no específico, es decir compartido por RHD, RHC*C, RHC*c. Pueden usarse los siguientes cebadores, que producen un producto de PCR

35 con un tamaño de 357 pares de bases:

-: Cebador directo: 5’-GGCCACCACCATTTGAA-3’ (SEC ID Nº: 3)

-: Cebador inverso: 5’-CCATGAACATGCCACTTCAC-3’ (SEC ID Nº: 4)

En negrita, nucleótidos específicos de RHCE*C (cebador directo).

Como alternativa, puede amplificarse RHCE*C usando cualquier cebador oligonucleotídico que difiere de los cebadores previamente descritos en secuencia, longitud o cualquier otra característica, siempre que permitan la amplificación específica del inserto específico de RHCE*C localizado en el intrón 2. Por ejemplo, puede usarse un

45 cebador oligonucleotídico variante que difiere de un cebador descrito en la presente memoria en 1, 2, 3, 4 o 5 alteraciones de secuencia de nucleótidos.

Como alternativa, esta etapa puede hacer uso de cualquier cebador oligonucleotídico que permita la amplificación de cualquier otra secuencia específica de RHCE*C, distinta del inserto del intrón 2 previamente descrito, para el fin de establecer la presencia o ausencia de un alelo de RHCE*C en una muestra. Dichas secuencia habitualmente contienen posiciones polimórficas en las regiones codificantes o no codificantes del gen RHCE. Los casos incluyen pero sin limitación los siguientes: posición 48 (exón 1), posición 150 (exón 2), posición 178 (exón 2), posición 201 (exón 2), posición 203 (exón 2), y posición 307 (exón 2) de la secuencia codificante de RHCE.

55 La presencia o ausencia de RHCE*C puede después visualizarse directamente, por ejemplo mediante electroforesis en gel o indirectamente, por ejemplo mediante hibridación con una sonda como se analiza posteriormente. Como alternativa, la presencia o ausencia de RHCE*C puede determinarse por hibridación de sonda solamente sin amplificación por PCR previa.

Hibridación de RHCE*C con sondas oligonucleotídicas.

En algunas realizaciones, la hibridación del amplicón de intrón 2 de RHCE*C con sondas oligonucleotídicas puede hacer uso de 4 sondas oligonucleotídicas: 2 sondas serían complementarias de una parte del inserto específico de RHCE*C, cada una de una de las cadenas de ADN. Las otras 2 sondas serían idénticas a las anteriores excepto que 65 contienen un emparejamiento erróneo de un único nucleótido artificial en su posición central que evita en gran medida la hibridación, proporcionando de este modo una señal de fondo como un control negativo. Estas sondas

pueden detectar solamente presencia frente a ausencia de la secuencia variante, es decir no permiten la diferenciación entre muestras homocigotas/hemicigotas y heterocigotas. Las siguientes secuencias de sonda pueden usarse para este inserto:

5 Sonda exactamente coincidente específica de RHCE*C Nº 1: 5’-TTTTACAGACGCCTGCTACCATG-3’ (SEC ID Nº: 5)

-: Sonda exactamente coincidente específica de RHCE*C Nº 2: 5’-CATGGTAGCAGGCGTCTGTAAAA-3’ (SEC ID Nº: 6)

-: Sonda de emparejamiento erróneo Nº 1: 5’-TTTTACAGACGTCTGCTACCATG-3’ (SEC ID Nº: 7)

-: Sonda de emparejamiento erróneo Nº 2: 5’-CATGGTAGCAGACGTCTGTAAAA-3’ (SEC ID Nº: 8). En negrita, el emparejamiento erróneo en posición central.

Como alternativa, puede usarse cualquier método particular o conjunto de sondas que se dirigen a un amplicón específico de RHCE*C amplificado, o una secuencia específica de RHCE*C no amplificada directamente, para

15 determinar si RHCE*C está presente o ausente. Como alternativa, puede usarse una sonda oligonucleotídica variante que difiere de una sonda descrita en la presente memoria en 1, 2, 3, 4 o 5 alteraciones de secuencia de nucleótidos.

Determinación de la presencia o ausencia del exón 3 híbrido de RHD/RHCE

Amplificación del exón 3 híbrido de RHD/RHCE por PCR.

El exón 3 híbrido de RHD/RHCE marcador puede detectarse por amplificación por PCR usando cebadores oligonucleotídicos que se unen con secuencias intrónicas que flanquean el exón 3 híbrido de RHD/RHCE.

25 Específicamente las secuencias diana de los cebadores directo (cadena arriba) e inverso (cadena abajo) pueden localizarse en los intrones 2 y 3, respectivamente. Pueden usarse los siguientes cebadores, que producen un producto de PCR de 256 pares de bases:

-: Cebador directo: 5’-TCCTGGCTCTCCCTCTCT-3’ (SEC ID Nº: 9)

-: Cebador inverso: 5’-TTTTCAAAACCCCGGAAG-3’ (SEC ID Nº: 10)

En negrita, nucleótidos específicos de RHCE*C (cebador directo) y nucleótidos específicos de RHCE (cebador inverso).

35 El cebador directo también puede usarse para amplificación del exón 3 de RHD, analizado posteriormente.

Como alternativa, el exón 3 del híbrido RHD/RHCE puede amplificarse usando cualquier cebador oligonucleotídico que difiera de los cebadores previamente descritos en secuencia, longitud o cualquier otra característica, siempre que permitan amplificación específica del exón 3 híbrido de RHD/RHCE. Por ejemplo, puede usarse un cebador oligonucleotídico variante que difiere de un cebador descrito en la presente memoria en 1, 2, 3, 4 o 5 alteraciones de secuencia de nucleótidos.

Como alternativa, la amplificación por PCR puede hacer uso de cualquier cebador oligonucleotídico que permita la amplificación de cualquier secuencia asociada con exón 3 híbrido de RHD/RHCE conocido para el fin de establecer

45 la presencia o ausencia de un exón 3 híbrido de RHD/RHCE en una muestra. Dichas secuencias habitualmente contienen posiciones polimórficas en las regiones codificantes o no codificantes del gen RHD. Los casos incluyen pero sin limitación la posición 178 (exón 2) de la secuencia codificante de RHD.

La presencia o ausencia del exón 3 híbrido de RHD/RHCE puede después visualizarse directamente, por ejemplo, por electroforesis en gel, o indirectamente, por ejemplo por hibridación con una sonda como se analiza posteriormente. Como alternativa, la presencia o ausencia del exón 3 híbrido de RHD/RHCE puede determinarse por hibridación de sonda solamente sin amplificación por PCR previa.

Hibridación de amplicón del exón 3 híbrido de RHD/RHCE o exón 3 de RHD con sondas oligonucleotídicas.

55 En algunas realizaciones, la hibridación del amplicón de exón 3 híbrido de RHD/RHCE con sondas oligonucleotídicas puede hacer uso de 4 sondas oligonucleotídicas. Estas sondas pueden usarse también para detectar un SNP en el exón 3 de RHD, como se analiza posteriormente, debido a la alta similitud entre estas secuencias, ya que la especificidad de la señal de hibridación de cada marcador viene principalmente de la etapa de amplificación por PCR específica de alelo. Por ejemplo, pueden incorporarse diferentes nucleótidos modificados por fluorescencia durante la amplificación por PCR en los amplicones de exón 3 de híbrido de RHD/RHCE 2 y exón 3 de RHD, respectivamente. Como alternativa, los dos amplicones pueden marcarse de forma diferente después de la etapa de amplificación por PCR, por ejemplo mediante incubación con nucleótidos u oligonucleótidos marcados en presencia de una enzima polimerasa, ligasa o transferasa. Por ejemplo, el ácido nucleico puede incubarse con

65 ddNTP biotinilados en presencia de una enzima desoxinucleotidil transferasa terminal.

2 sondas pueden ser específicas de la secuencia de tipo silvestre de un SNP localizado dentro del amplicón, y las otras dos sondas pueden ser específicas de la secuencia variante de exón 3 híbrido del mismo SNP. Estas sondas solamente pueden detectar presencia frente a ausencia de la secuencia variante, es decir no permiten diferenciación entre muestras homocigotas y hemicigotas. Por ejemplo, puede usarse el SNP localizado en la posición 410 de la

5 secuencia codificante, con C y T como nucleótidos de tipo silvestre y variante, respectivamente. Pueden usarse las siguientes secuencias sonda para este SNP:

-: Sonda de tipo silvestre de RHD, RHCE Nº 1: 5’-GGTCAACTTGGCGCAGTTGGTGG-3’ (SEC ID Nº: 11)

-: Sonda de tipo silvestre de RHD, RHCE Nº 2: 5’-GTCAACTTGGCGCAGTTGGTG-3’ (SEC ID Nº: 12)

-: Sonda de variante del exón 3 híbrido Nº 1: 5’-GGTCAACTTGGTGCAGTTGGTGG-3’ (SEC ID Nº: 13)

-: Sonda de variante del exón 3 híbrido Nº 2: 5’-GTCAACTTGGTGCAGTTGGTG-3’ (SEC ID Nº: 14). En negrita está el SNP en la posición 410. El número de rs para el SNP en la posición 410 no está disponible.

Como alternativa, puede usarse cualquier método particular o conjunto de sondas que se dirigen a un amplicón

15 específico des exón 3 híbrido de RHD/RHCE amplificado, o una secuencia específica del exón 3 híbrido de RHD/RHCE no amplificada directamente, para determinar si el exón 3 híbrido de RHD/RHCE está presente o ausente. Como alternativa, puede usarse una sonda oligonucleotídica variante que difiere de una sonda descrita en la presente memoria en 1, 2, 3, 4 o 5 alteraciones de secuencia de nucleótidos. Determinación de la presencia o ausencia del exón 3 de RHD

Amplificación del exón 3 de RHD por PCR.

El exón 3 de RHD marcador puede detectarse por amplificación por PCR usando cebadores oligonucleotídicos que se unen con secuencias intrónicas que flanquean el exón 3 de RHD. Específicamente, las secuencias diana de los

25 cebadores directo e inverso pueden localizarse en los intrones 2 y 3, respectivamente. Pueden usarse los siguientes cebadores, que producen un producto de PCR de 268 pares de bases:

-: Cebador directo: 5’-TCCTGGCTCTCCCTCTCT-3’ (SEC ID Nº: 15)

-: Cebador inverso: 5’-GTTGTCTTTATTTTTCAAAACCCT-3’ (SEC ID Nº: 16)

En negrita están los nucleótidos específicos de RHD. El cebador directo es específico tanto para el exón 3 de RHD como para el exón 3 híbrido de RHD/RHCE, mientras que el cebador inverso es específico para el exón 3 de RHD solamente.

35 Como alternativa, el exón 3 de RHD puede amplificarse usando cualquier cebador oligonucleotídico que difiera de los cebadores previamente descritos en secuencia, longitud o cualquier otra característica, siempre que permitan la amplificación específica del exón 3 de RHD.

Como alternativa, la amplificación por PCR puede hacer uso de cualquier cebador oligonucleotídico que permita la amplificación de secuencias asociadas con exón 3 de RHD públicamente presentadas para el fin de establecer la presencia o ausencia de un exón 3 de RHD en una muestra. Dichas secuencias habitualmente contienen posiciones polimórficas en las regiones codificantes o no codificantes del gen RHD. Los casos incluyen pero sin limitación secuencias intrónicas que flanquean el exón 3 de RHD. Por ejemplo, puede usarse un cebador oligonucleotídico variante que difiere de un cebador descrito en la presente memoria en 1, 2, 3, 4 o 5 alteraciones de secuencia de

45 nucleótidos.

La presencia o ausencia del exón 3 de RHD puede después visualizarse directamente, por ejemplo mediante electroforesis en gel, o indirectamente, por ejemplo mediante hibridación con una sonda como se ha analizado con referencia al exón 3 híbrido de RHD/RHCE anteriormente. Como alternativa, la presencia o ausencia del exón 3 de RHD puede determinarse por hibridación de sonda solamente sin amplificación por PCR previa.

Determinación de los SNP en el exón 4 de RHD, el exón5 de RHD o el exón 6 de RHD

Amplificación del exón 4 de RHD, el exón 5 de RHD o el exón 6 de RHD por PCR.

55 En algunas realizaciones, el SNP en el exón 4 de RHD puede detectarse mediante amplificación por PCR usando cebadores oligonucleotídicos que se unen con secuencias intrónicas que flanquean el exón 4 de RHD. Específicamente, las secuencias diana de los cebadores directo e inverso pueden localizarse en los intrones 3 y 4, respectivamente. Pueden usarse los siguientes cebadores, que producen un producto de PCR de 281 pares de bases:

-: Cebador directo: 5’-GCTCTGAACTTTCTCCAAGGACT-3’ (SEC ID Nº: 17)

-: Cebador inverso: 5’-ATTCTGCTCAGCCCAAGTAG-3’ (SEC ID Nº: 18)

65 En negrita están los nucleótidos específicos de RHD.

En otra realización, el SNP en el exón 5 de RHD puede detectarse por amplificación por PCR usando cebadores oligonucleotídicos que se unen con secuencias intrónicas que flanquean el exón 5 de RHD. Específicamente, las secuencias diana de los cebadores directo e inverso pueden localizarse en los intrones 4 y 5, respectivamente. Pueden usarse los siguientes cebadores, que producen un producto de PCR de 432 pares de bases:

-: Cebador directo: 5’-TTGAATTAAGCACTTCACAGAGCA-3’ (SEC ID Nº: 19)

-: Cebador inverso: 5’-CACCTTGCTGATCTTCCC-3’ (SEC ID Nº: 20)

El subrayado indica la localización del inserto de 653 pares de bases específico de RHCE aprovechado para conferir especificidad de RHD a la amplificación. En negrita, nucleótidos específicos de RHD.

En otra realización más, el SNP en el exón 6 de RHD puede detectarse por amplificación por PCR usando cebadores oligonucleotídicos que se unen con secuencias intrónicas que flanquean el exón 6 de RHD. Específicamente, las secuencias diana de los cebadores directo e inverso pueden localizarse en los intrones 5 y 6,

15 respectivamente. Pueden usarse los siguientes cebadores, que producen un producto de PCR de 371 pares de bases:

-: Cebador directo: 5’-AGTAGTGAGCTGGCCCATCA-3’ (SEC ID Nº: 21)

-: Cebador inverso: 5’-CTTCAGCCAAAGCAGAGGAG-3’ (SEC ID Nº: 22)

En negrita, nucleótidos específicos de RHD.

La presencia o ausencia de estos SNP, y la variante de SNP específica, pueden después visualizarse directamente, por ejemplo mediante electroforesis en gel después de digestión de restricción como se ha descrito anteriormente, o

25 indirectamente, por ejemplo mediante hibridación con una sonda como se analiza posteriormente. Como alternativa, la variante de SNP puede determinarse por hibridación de sonda solamente sin amplificación por PCR previa.

Puede usarse un cebador oligonucleotídico variante que difiere de un cebador descrito en la presente memoria en 1, 2, 3, 4 o 5 alteraciones de secuencia de nucleótidos.

Hibridación del amplicón del exón 4 de RHD, amplicón del exón 5 de RHD o amplicón del exón 6 de RHD con sondas oligonucleotídicas

En algunas realizaciones, la hibridación del amplicón del exón 4 de RHD con sondas oligonucleotídicas puede hacer

35 uso de 4 sondas oligonucleotídicas: 2 sondas son específicas para la secuencia de tipo silvestre de un SNP ligado a variantes de RHD y localizado dentro del amplicón del exón 4 de RHD. Las otras 2 sondas permiten distinguir las variantes de RHD*DIIIa y RHD*DIIIa-CE(4-7)-D de la variante RHD*DIVa-2, ya que son específicas para las variantes RHD*DIIIa y RHD*DIIIa-CE(4-7)-D en relación con RHD*DIVa-2. Sin embargo, en algunas realizaciones las sondas pueden no distinguir entre otras variantes de RHD. En otras palabras, los SNP individuales por sí mismos pueden no identificar de forma exclusiva una variante de RHD particular (por ejemplo, debido a la existencia de otras variantes de RHD, además de DIIIa, DIVa y RHD*DIIIa-CE(4-7)-D), pero este SNP, y sus sondas, pueden distinguir una de las tres variantes Dllla, DIVa y RHD*DIIIa-CE(4-7)-D de las otras dos.

Estas sondas permiten la diferenciación entre muestras homocigotas/hemicigotas y heterocigotas. Por ejemplo,

45 puede usarse el SNP localizado en la posición 602 de la secuencia codificante, con C y G como nucleótidos de tipo silvestre y variante de RHD, respectivamente. Pueden usarse las siguientes secuencias de sonda para este SNP:

-: Sonda de tipo silvestre de RHD Nº 1: 5’-ATAAAGATCAGACAGCAACGATACC-3’ (SEC ID Nº: 23)

-: Sonda de tipo silvestre de RHD Nº 2: 5’-TAAAGATCAGACAGCAACGATAC-3’ (SEC ID Nº: 24)

-: Sonda de variante de RHD Nº 1: 5’-ATAAAGATCAGAGAGCAACGATACC-3’ (SEC ID Nº: 25)

-: Sonda de variante de RHD Nº 2: 5’-TAAAGATCAGAGAGCAACGATAC-3’ (SEC ID Nº: 26)

En negrita está el SNP.

55 En otra realización, la hibridación del amplicón del exón 5 de RHD con sondas oligonucleotídicas puede hacer uso de 4 sondas oligonucleotídicas: 2 sondas son específicas para la secuencia de tipo silvestre (es decir secuencia idéntica al alelo RHD*D convencional) de un SNP ligado a variantes de RHD y localizado dentro del amplicón del exón 5 de RHD. Las otras 2 sondas permiten distinguir las variantes de RHD*DIIIa y RHD*DIIIa-CE(4-7)-D de la variante RHD*DIVa-2, ya que son específicas para las variantes RHD*DIIIa y RHD*DIIIa-CE(4-7)-D en relación con RHD*DIVa-2. Sin embargo, en algunas realizaciones las sondas pueden no distinguir entre otras variantes de RHD. Estas sondas permiten la diferenciación entre muestras homocigotas/hemicigotas y heterocigotas. Por ejemplo, puede usarse el SNP localizado en la posición 667 de la secuencia codificante, con T y G como nucleótidos de tipo silvestre y variante de RHD, respectivamente. Pueden usarse las siguientes secuencias de sonda para este SNP:

65 -Sonda de tipo silvestre de RHD Nº 1: 5’-CTGGCCAAGTTTCAACTCTGC-3’ (SEC ID Nº: 27)

-: Sonda de tipo silvestre de RHD Nº 2: 5’-TGGCCAAGTTTCAACTCTG-3’ (SEC ID Nº: 28)

-: Sonda de variante de RHD Nº 1: 5’-CTGGCCAAGTGTCAACTCTGC-3’ (SEC ID Nº: 29)

-: Sonda de variante de RHD Nº 2: 5’-TGGCCAAGTGTCAACTCTG-3’ (SEC ID Nº: 30)

En negrita está el SNP.

5 En otra realización más, la hibridación del amplicón del exón 6 de RHD con sondas oligonucleotídicas puede hacer uso de 4 sondas oligonucleotídicas: 2 sondas serían específicas para la secuencia de tipo silvestre (es decir secuencia idéntica al alelo de RHD*D convencional) de un SNP localizado dentro del amplicón del exón 6 de RHD, y se uniría con la variante de RHD*DIIIa. Las otras 2 sondas permiten distinguir la variante RHD*DIIIa de RHD*DIIIaCE(4-7)-D y RHD*DIVa-2, ya que son completamente específicas de la variante RHD*DIIIa en relación con RHD*DIIIa-CE(4-7)-D y RHD*DIVa-2. Sin embargo, las sondas pueden ser solamente parcialmente específicas para la secuencia variante de RHD*DIIIa del mismo SNP frente a otras variantes de RHD (es decir variantes de RHD distintas de Dllla, DIVa y RHD*DIIIa-CE(4-7)-D). Estas sondas permiten la diferenciación entre muestras homocigotas/hemicigotas y heterocigotas. Por ejemplo, puede usarse el SNP localizado en la posición 819 de la

15 secuencia codificante, con G y A como nucleótidos de tipo silvestre y variante de RHD*DIIIa, respectivamente. Pueden usarse las siguientes secuencias de sonda para este SNP:

-: Sonda de tipo silvestre de RHD Nº 1: 5’-GTGCACAGTGCGGTGTTGGCAGG-3’ (SEC ID Nº: 31)

-: Sonda de tipo silvestre de RHD Nº 2: 5’-TGCACAGTGCGGTGTTGGCAG-3’ (SEC ID Nº: 32)

-: Sonda de variante RHD*DIIIa Nº 1: 5’-GTGCACAGTGCAGTGTTGGCAGG-3’ (SEC ID Nº: 33)

-: Sonda de variante RHD*DIIIa Nº 2: 5’-TGCACAGTGCAGTGTTGGCAG-3’ (SEC ID Nº: 34)

En negrita está el SNP. El número de rs del SNP en la posición 819 no está disponible.

25 Como alternativa, puede usarse una sonda oligonucleotídica variante que difiere de una sonda descrita en la presente memoria por 1, 2, 3, 4 o 5 alteraciones de secuencia de nucleótidos.

Determinación del SNP en el exón 7 de RHD

Amplificación del exón 7 de RHD por PCR

La variante de SNP en el exón 7 de RHD puede amplificarse usando cebadores oligonucleotídicos que se unen con secuencias intrónicas que flanquean el exón 7 de RHD. Específicamente, las secuencias diana de los cebadores directo e inverso pueden localizarse en los intrones 6 y 7, respectivamente. Pueden usarse los siguientes cebadores,

35 que producen un producto de PCR de 695 pares de bases:

-: Cebador directo: 5’-ACAAACTCCCCGATGATGTGAGTG-3’ (SEC ID Nº: 35)

-: Cebador inverso: 5’-GAGGCTGAGAAAGGTTAAGCCA-3’ (SEC ID Nº: 36)

En negrita están los nucleótidos específicos de RHD.

La presencia o ausencia de este SNP, y la variante de SNP específica, puede después visualizarse directamente, por ejemplo por electroforesis en gel después de digestión de restricción como se ha descrito anteriormente, o indirectamente, por ejemplo mediante hibridación con una sonda como se analiza posteriormente. Como alternativa,

45 la variante de SNP puede determinarse por hibridación de sonda solamente sin amplificación por PCR previa.

Puede usarse un cebador oligonucleotídico variante que difiera de un cebador descrito en la presente memoria en 1, 2, 3, 4 o 5 alteraciones de secuencia de nucleótidos.

Hibridación del amplicón del exón 7 de RHD con sondas oligonucleotídicas.

La hibridación del amplicón del exón 7 de RHD con sondas oligonucleotídicas puede hacer uso de 4 sondas oligonucleotídicas: 2 sondas serían específicas para la secuencia de tipo silvestre (es decir secuencia idéntica al alelo de RHD*D convencional) de un SNP localizado dentro del amplicón, y unido con variantes de RHD. Las otras 2

55 sondas permiten distinguir la variante RHD*DIVa-2IIIa de RHD*DIIIa-CE(4-7)-D y RHD*DIIIa, ya que la presencia del SNP es característica de la variante de RHD*DIVa-2. Sin embargo, en algunas realizaciones las sondas pueden no distinguir entre otras variantes de RHD (es decir variantes de RHD distintas de Dllla, DIVa y RHD*DIIIa-CE(4-7)-D). Estas sondas permiten la diferenciación entre muestras homocigotas/hemicigotas y heterocigotas. Por ejemplo, puede usarse el SNP localizado en la posición 1048 de la secuencia codificante, con G y C como nucleótidos de tipo silvestre y de variante RHD*DIVa-2, respectivamente. Pueden usarse las siguientes secuencias de sonda para este SNP:

-: Sonda de tipo silvestre de RHD Nº 1: 5’-TGCTGGTGCTTGATACCGTCGGA-3’ (SEC ID Nº: 37)

-: Sonda de tipo silvestre de RHD Nº 2: 5’-GCTGGTGCTTGATACCGTCGG-3’ (SEC ID Nº: 38) 65 -Sonda de variante RHD*DIVa-2 Nº 1: 5’-TGCTGGTGCTTCATACCGTCGGA-3’ (SEC ID Nº: 39)

-: Sonda de variante RHD*DIVa-2 Nº 2: 5’-GCTGGTGCTTCATACCGTCGG-3’ (SEC ID Nº: 40). En negrita está el SNP.

Como alternativa, puede usarse una sonda oligonucleotídica variante que difiera de una sonda descrita en la presente memoria en 1, 2, 3, 4 o 5 alteraciones de secuencia de nucleótidos.

5 La determinación de unión de secuencias amplificadas con sondas de tipo silvestre frente a variantes se realiza normalmente, pero no solamente, mediante cuantificación de fluorescencia unida a sonda. Los restos de fluorescencia y/o de captura de fluorescencia se introducen normalmente, pero no solamente, en el procedimiento en la etapa de amplificación en forma de nucleótidos modificados (véase sección de Materiales y Métodos).

10 Tabla 1

RHCE*C: RHD/CE Hex03 RHD ex 03 RHD 602 RHD 1048 RHD Haplotipo 1/RHD Haplotipo 2 Fenotipo de RHD, RHC

Ausente: Presente Presente C G RHD*DIIIa-CE(4-7)-D / Posiblemente RHD ¿D?, C+w

Ausente: Presente Presente c G/C RHD*DIVa-2 / Posiblemente RHD ¿D?, C-

Ausente: Presente Presente C C RHD*DIVa-2 / RHD*DIVb-4 D Parcial, C-

Ausente: Presente Presente C Ausente No Indicado

Ausente: Presente Presente C/G G RHD*DIIIa / Posiblemente RHD ¿D?, C-

Ausente: Presente Presente C/G G/C RHD*DIIIa / RHD*DIVb-4 D Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*DIVa-2: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DIVa-2: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil14/ RHD*DIVa-2: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil51 / RHD*DIVa-2: D Débil o Parcial, C-

RHD*DAR / RHD*DIVa-2: D Parcial, C-

RHD*DAR-E / RHD*DIVa-2: D Parcial, C-

Ausente: Presente Presente C/G C No Indicado

Ausente: Presente Presente C/G Ausente No Indicado

Ausente: Presente Presente G G RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*DIIIa D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DIIIa: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil14 / RHD*DIIIa: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil51 / RHD*DIIIa: D Débil o Parcial, C-

RHD*DAR / RHD*DIIIa: ¿D Parcial?, C

RHD*DAR-E / RHD*DIIIa: ¿D Parcial?, C

RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D): D Débil, C+W

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D): D Débil, C+W

RHD*tipoDdébil14 / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D): D Débil, C+W

RHD*tipoDdébil51 / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D): D Débil, C+W

RHD*DAR / RHD*DIIIaCE(4-7)-D): D Parcial, C+W

RHD*DAR-E / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D): D Parcial, C+W

Ausente: Presente Presente G G/C No Indicado

Ausente: Presente Presente G C No Indicado

Ausente: Presente Presente G Ausente No Indicado

Ausente: Presente Presente Ausente G No Indicado

Ausente: Presente Presente Ausente G/C No Indicado

Ausente: Presente Presente Ausente C No Indicado

Ausente: Presente Presente Ausente Ausente RHD*ex04-ex07del D-, C-

Ausente: Presente Ausente C G RHD*DIIIa-CE(4-7)-D / RHD*ex03del D-, C+W

Ausente: Presente Ausente C G/C RHD*DIVa-2 / RHD*ex03del D Parcial, C-

Ausente: Presente Ausente C C RHD*DIVa-2 / No RHD D Parcial, C

RHD*DIVa-2 / RHD*DIVa-2: D Parcial, C

RHD*DIVa-2 / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D: D Parcial, C+W

Ausente: Presente Ausente C Ausente No Indicado

Ausente: Presente Ausente C/G G RHD*DIIIa / RHD*ex03del D Parcial, C-

Ausente: Presente Ausente C/G G/C RHD*DIIIa / RHD*DIVa-2 D Parcial, C-

Ausente: Presente Ausente C/G C No Indicado

Ausente: Presente Ausente C/G Ausente No Indicado

Ausente: Presente Ausente G G RHD*DIIIa / No RHD D Parcial, C-

RHD*DIIIa / RHD*DIIIa: D Parcial, C-

RHD*DIIIa / RHD*DIIIaCE(4-7)-D: D Parcial, C+W

Ausente: Presente Ausente G G/C RHD*DIIIa / RHD*ex03ex04del D Parcial, C

Ausente: Presente Ausente G C No Indicado

Ausente: Presente Ausente G Ausente No Indicado

Ausente: Presente Ausente Ausente G RHD*DIIIa-CE(4-7)-D / RHD*ex03-ex04del D-, C+W

Ausente: Presente Ausente Ausente G/C No Indicado

Ausente: Presente Ausente Ausente C No Indicado

Ausente: Presente Ausente Ausente Ausente RHD*DIIIa-CE(4-7)-D / No RHD D-, C+W

RHD*DIIIa-CE(4-7)-D / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D: D-, C+W

Ausente
Ausente: Presente C G Posiblemente RHD ¿D?, C-

Ausente
Ausente: Presente C G/C RHD*DIVb-4 / Posiblemente RHD ¿D?, C-

Ausente
Ausente: Presente C C RHD*DIVb-4 / RHD*DIVb-4 D Parcial, C-

Ausente
Ausente: Presente C Ausente No Indicado

Ausente
Ausente: Presente C/G G RHD*tipoDdébil4.0 / Posiblemente RHD ¿D?, C

RHD*tipoDdébil4.1 / Posiblemente RHD: ¿D?, C

RHD*tipoDdébil14 / Posiblemente RHD: ¿D?, C

RHD*tipoDdébil51 / Posiblemente RHD: ¿D?, C-

RHD*DAR / Posiblemente RHD: ¿D?, C-

RHD*DAR-E / Posiblemente RHD: ¿D?, C-

Ausente
Ausente: Presente C/G G/C RHD*tipoDdébil4.0/ RHD*DIVb-4 D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.01 / RHD*DIVb-4: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DIVb-4: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil14 / RHD*DIVb-4: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil51 / RHD*DIVb-4: D Débil o Parcial, C-

RHD*DAR / RHD*DIVb-4: D Parcial, C-

RHD*DAR-E / RHD*DIVb-4: D Parcial, C-

Ausente
Ausente: Presente C/G C No Indicado

Ausente
Ausente: Presente C/G Ausente No Indicado

Ausente
Ausente: Presente G G RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*tipoDdébil4.0 D Débil, C

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*tipoDdébil4.0: D Débil, C

RHD*tipoDdébil14 / RHD*tipoDdébil4.0: D Débil, C

RHD*tipoDdébil51 / RHD*tipoDdébil4.0: D Débil, C-

RHD*DAR / RHD*tipoDdébil4.0: D Débil o Parcial, C-

RHD*DAR-E / RHD*tipoDdébil4.0: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil, C

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil, C

RHD*tipoDdébil14 / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil, C

RHD*tipoDdébil51 / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil, C-

RHD*DAR / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil o Parcial, C-

RHD*DAR-E / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.0/ / RHD*tipoDdébil14: D Débil, C

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*tipoDdébil14: D Débil, C

RHD*tipoDdébil14 / RHD*tipoDdébil14: D Débil, C

RHD*tipoDdébil51 / RHD*tipoDdébil14: D Débil, C-

RHD*DAR / RHD*tipoDdébil14: D Débil o Parcial, C-

RHD*DAR-E / RHD*tipoDdébil14: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*tipoDdébil51: D Débil, C

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*tipoDdébil51: D Débil, C

RHD*tipoDdébil14 / RHD*tipoDdébil51: D Débil, C

RHD*tipoDdébil51 / RHD*tipoDdébil51: D Débil, C-

RHD*DAR / RHD*tipoDdébil51: D Débil o Parcial, C

RHD*DAR-E RHD*tipoDdébil51: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*DAR: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DAR: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil14 / RHD*DAR: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil51 / RHD*DAR: D Débil o Parcial, C-

RHD*DAR / RHD*DAR: D Parcial, C-

RHD*DAR-E / RHD*DAR: D Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*DAR-E: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DAR-E: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil14 / RHD*DAR-E: D Débil o Parcial, C

RHD*tipoDdébil51 / RHD*DAR-E: D Débil o Parcial, C-

RHD*DAR / RHD*DAR-E: D Parcial, C-

RHD*DAR-E / RHD*DAR-E: D Parcial, C-

Ausente
Ausente: Presente G G/C No Indicado

Ausente
Ausente: Presente G C No Indicado

Ausente
Ausente: Presente G Ausente No Indicado

Ausente
Ausente: Presente Ausente G No Indicado

Ausente
Ausente: Presente Ausente G/C No Indicado

Ausente
Ausente: Presente Ausente C No Indicado

Ausente
Ausente: Presente Ausente Ausente RHD*ex04-ex07del / RHD*ex04-ex07del D-, C

RHD*ex04-ex07del / No RHD: D-, C-

Ausente
Ausente
Ausente: C G RHD*ex03del/ RHD*ex03del D-, C

RHD*ex03del / No RHD: D-, C-

Ausente
Ausente
Ausente: C G/C No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente: C C No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente: C Ausente No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente: C/G G No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente: C/G G/C No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente: C/G C No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente: C/G Ausente No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente: G G No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente: G G/C No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente: G C No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente: G Ausente No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente
Ausente: G RHD*ex03-ex04del / RHD*ex03-ex04del D-, C

RHD*ex03-ex04del / No RHD: D-, C-

Ausente
Ausente
Ausente
Ausente: G/C No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente
Ausente: C No Indicado

Ausente
Ausente
Ausente
Ausente
Ausente: No RHD / No RHD D-, C-

Presente
Presente
Presente: C G RHD*DIIIa-CE(4-7)-D / Posiblemente RHD ¿D?, C+

Presente
Presente
Presente: C G/C RHD*DIVa-2 / Posiblemente RHD ¿D?, C+

Presente
Presente
Presente: C C RHD*DIVa-2 / RHD*DIVb-4 D Parcial, C+

Presente
Presente
Presente: C Ausente No Indicado

Presente
Presente
Presente: C/G G RHD*DIIIa / Posiblemente RHD ¿D?, C+

Presente
Presente
Presente: C/G G/C RHD*DIIIa / RHD*DIVb-4 D Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*DIVa-2: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DIVa-2: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil14 / RHD*DIVa-2: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil51/ RHD*DIVa-2: D Débil o Parcial, C+

RHD*DAR / RHD*DIVa-2: D Parcial, C+

RHD*DAR-E / RHD*DIVa-2: D Parcial, C+

Presente
Presente
Presente: C/G C No Indicado

Presente
Presente
Presente: C/G Ausente No Indicado

Presente
Presente
Presente: G G RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*DIIIa D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DIIIa: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil14 / RHD*DIIIa: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil51 / RHD*DIIIa: D Débil o Parcial, C+

RHD*DAR / RHD*DIIIa: ¿D Parcial?, C+

RHD*DAR-E / RHD*DIIIa: ¿D Parcial?, C+

RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D): D Débil, C+

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D): D Débil, C+

RHD*tipoDdébil14 / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D): D Débil, C+

RHD*tipoDdébil51 / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D): D Débil, C+

RHD*DAR / RHD*DIIIaCE(4-7)-D): D Parcial, C+

RHD*DAR-E / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D): D Parcial, C+

Presente
Presente
Presente: G G/C No Indicado

Presente
Presente
Presente: G C No Indicado

Presente
Presente
Presente: G Ausente No Indicado

Presente
Presente
Presente: Ausente G No Indicado

Presente
Presente
Presente: Ausente G/C No Indicado

Presente
Presente
Presente: Ausente C No Indicado

Presente
Presente
Presente: Ausente Ausente RHD*ex04-ex07del D-, C+

Presente
Presente: Ausente C G RHD*DIIIa-CE(4-7)-D / RHD*ex03del D-, C+

Presente
Presente: Ausente C G/C RHD*DIVa-2 / RHD*ex03del D Parcial, C+

Presente
Presente: Ausente C C RHD*DIVa-2 / No RHD D Parcial, C+

RHD*DIVa-2/ RHD*DIVa-2: D Parcial, C+

RHD*DIVa-2 / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D: D Parcial, C+

Presente
Presente: Ausente C Ausente No Indicado

Presente
Presente: Ausente C/G G RHD*DIIIa / RHD*ex03del D Parcial, C+

Presente
Presente: Ausente C/G G/C RHD*DIIIa / RHD*DIVa-2 D Parcial, C+

Presente
Presente: Ausente C/G C No Indicado

Presente
Presente: Ausente C/G Ausente No Indicado

Presente
Presente: Ausente G G RHD*DIIIa / No RHD D Parcial, C+

RHD*DIIIa / RHD*DIIIa: D Parcial, C+

RHD*DIIIa / RHD*DIIIaCE(4-7)-D: D Parcial, C+

Presente
Presente: Ausente G G/C RHD*DIIIa / RHD*ex03ex04del D Parcial, C+

Presente
Presente: Ausente G C No Indicado

Presente
Presente: Ausente G Ausente No Indicado

Presente
Presente: Ausente Ausente G RHD*DIIIa-CE(4-7)-D / RHD*ex03-ex04del D-, C+

Presente
Presente: Ausente Ausente G/C No Indicado

Presente
Presente: Ausente Ausente C No Indicado

Presente
Presente: Ausente Ausente Ausente RHD*DIIIa-CE(4-7)-D / No RHD D-, C+

RHD*DIIIa-CE(4-7)-D / RHD*DIIIa-CE(4-7)-D: D-, C+

Presente: Ausente Presente C G Posiblemente RHD ¿D?, C+

Presente: Ausente Presente C G/C RHD*DIVb-4 / Posiblemente RHD ¿D?, C+

Presente: Ausente Presente C C RHD*DIVb-4 / RHD*DIVb-4 D Parcial, C+

Presente: Ausente Presente C Ausente No Indicado

Presente: Ausente Presente C/G G RHD*tipoDdébil4.0 / Posiblemente RHD ¿D?, C+

RHD*tipoDdébil4.1 / Posiblemente RHD: ¿D?, C+

RHD*tipoDdébil14 / Posiblemente RHD: ¿D?, C+

RHD*tipoDdébil51 / Posiblemente RHD: ¿D?, C+

RHD*DAR / Posiblemente RHD: ¿D?, C+

RHD*DAR-E / Posiblemente RHD: ¿D?, C+

Presente: Ausente Presente C/G G/C RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*DIVb-4 D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.01 / RHD*DIVb-4: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DIVb-4: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil14 / RHD*DIVb-4: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil51 / RHD*DIVb-4: D Débil o Parcial, C+

RHD*DAR / RHD*DIVb-4: D Parcial, C+

RHD*DAR-E / RHD*DIVb-4: D Parcial, C+

Presente: Ausente Presente C/G C No Indicado

Presente: Ausente Presente C/G Ausente No Indicado

Presente: Ausente Presente G G RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*tipoDdébil4.0 D Débil, C+

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*tipoDdébil4.0: D Débil, C+

RHD*tipoDdébil14 / RHD*tipoDdébil4.0: D Débil, C+

RHD*tipoDdébil51 / RHD*tipoDdébil4.0: D Débil, C+

RHD*DAR / RHD*tipoDdébil4.0: D Débil o Parcial, C+

RHD*DAR-E / RHD*tipoDdébil4.0: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil, C+

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil, C+

RHD*tipoDdébil14 / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil, C+

RHD*tipoDdébil51 / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil, C+

RHD*DAR / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil o Parcial, C+

RHD*DAR-E / RHD*tipoDdébil4.1: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.01 / RHD*tipoDdébil14: D Débil, C+

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*tipoDdébil14: D Débil, C+

RHD*tipoDdébil14 / RHD*tipoDdébil14: D Débil, C+

RHD*tipoDdébil51 / RHD*tipoDdébil14: D Débil, C+

RHD*DAR / RHD*tipoDdébil14: D Débil o Parcial, C+

RHD*DAR-E / RHD*tipoDdébil14: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.01 / RHD*tipoDdébil51: D Débil, C+

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*tipoDdébil51: D Débil, C+

RHD*tipoDdébil14 / RHD*tipoDdébil51: D Débil, C+

RHD*tipoDdébil51 / RHD*tipoDdébil51: D Débil, C+

RHD*DAR / RHD*tipoDdébil51: D Débil o Parcial, C+

RHD*DAR-E / RHD*tipoDdébil51: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*DAR: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DAR: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil14 / RHD*DAR: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil51 / RHD*DAR: D Débil o Parcial, C+

RHD*DAR / RHD*DAR: D Parcial, C+

RHD*DAR-E / RHD*DAR: D Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.0 / RHD*DAR-E: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil4.1 / RHD*DAR-E: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil14 / RHD*DAR-E: D Débil o Parcial, C+

RHD*tipoDdébil51 / RHD*DAR-E: D Débil o Parcial, C+

RHD*DAR / RHD*DAR-E: D Parcial, C+

RHD*DAR-E / RHD*DAR-E: D Parcial, C+

Presente: Ausente Presente G G/C No Indicado

Presente: Ausente Presente G C No Indicado

Presente: Ausente Presente G Ausente No Indicado

Presente: Ausente Presente Ausente G No Indicado

Presente: Ausente Presente Ausente G/C No Indicado

Presente: Ausente Presente Ausente C No Indicado

Presente: Ausente Presente Ausente Ausente RHD*ex04-ex07del / RHD*ex04-ex07del D-, C+

RHD*ex04-ex07del / No RHD: D-, C+

Presente: Ausente Ausente C G RHD*ex03del / RHD*ex03del D-, C+

RHD*ex03del / No RHD: D-, C+

Presente: Ausente Ausente C G/C No Indicado

Presente: Ausente Ausente C C No Indicado

Presente: Ausente Ausente C Ausente No Indicado

Presente: Ausente Ausente C/G G No Indicado

Presente: Ausente Ausente C/G G/C No Indicado

Presente: Ausente Ausente C/G C No Indicado

Presente: Ausente Ausente C/G Ausente No Indicado

Presente: Ausente Ausente G G No Indicado

Presente: Ausente Ausente G G/C No Indicado

Presente: Ausente Ausente G C No Indicado

Presente: Ausente Ausente G Ausente No Indicado

Presente: Ausente Ausente Ausente G RHD*ex03-ex04del / RHD*ex03-ex04del D-, C+

RHD*ex03-ex04del / No RHD: D-, C+

Presente: Ausente Ausente Ausente G/C No Indicado

Presente: Ausente Ausente Ausente C No Indicado

Presente: Ausente Ausente Ausente Ausente No RHD / No RHD D-, C+

Tabla 2

Antígeno: Fenotipo 1 Fenotipo 2 Fenotipo de muestra

RhD: D- D- D-

D-: D Débil D Débil

D-: D Parcial D Parcial

D-: D+ D+

D Débil
D Débil
D Débil

D Débil: D Parcial D Débil o Parcial

D Débil: D+ D+

D Parcial
D Parcial
D Parcial

D Parcial: D+ D+

D+
D+
D+

RhC: C- C- C-

C-: C+W C+W

C-: C+ C+

C+W
C+W
C+W

C+W: C+ C+

C+
C+
C+

Ejemplos

Identificación de variantes genéticas que no codifican antígenos D (D-) y codifican antígeno C alterado (C+W)

5 El siguiente ejemplo se refiere a un método para identificar variantes RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o de tipo RHD*DIIIaCE(4-7)-D). El método descrito en la presente memoria se ha aplicado a 58 muestras que se conocía previamente que contenían exón 3 híbrido de RHD/RHCE. El procedimiento descrito posteriormente parte de la genotipación de dichas muestras y el análisis posterior de dichas muestras agrupadas por genotipo y/o fenotipo predicho. El serotipo asignado a un grupo corresponde a análisis realizado solamente en un subconjunto de las muestras en dicho grupo.

10 Materiales y métodos

Se extrajo ADN genómico de células nucleadas en una muestra sanguínea por lisis celular. El ADN extraído se purificó en una columna de afinidad. Se realizaron tanto lisis celular como purificación de ADN con un kit de Sangre

15 QIAamp (Qiagen, Alemania) siguiendo los protocolos y recomendaciones del fabricante. La pureza del ADN se determinó por espectrofotometría en un instrumento Nanodrop (Nanodrop, DE). Solo las soluciones de ADN con una DO260/280 de 1,8 ± 0,2 continuaron al análisis posterior.

Se usó ADN purificado como un molde para amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) múltiple

20 de los segmentos génicos de interés en un termociclador GeneAmp 9700 (Perkin-Elmer, CA). Se enumeran secuencias de cebadores para los diferentes segmentos en la sección de Descripción Técnica posterior. Las condiciones de ciclación consistieron en una etapa de desnaturalización/activación de la polimerasa a 95 ºC durante 15 minutos, seguido de 38 ciclos de desnaturalización a 95 ºC durante 45 segundos, hibridación a 60 ºC durante 60 segundos, extensión a 72 ºC durante 90 segundos y una etapa final de extensión a 72 ºC durante 10 minutos.

25 El ADN amplificado se fragmentó enzimáticamente mediante incubación con DNasa I (Promega, WI) y fosfatasa alcalina (Roche, Alemania) a 37 ºC durante 30 minutos, seguido de inactivación enzimática a 95 ºC durante 10 minutos.

30 El ADN fragmentado se marcó por incubación con enzima TdT (Roche, Alemania) y biotina ddUTP (Perkin-Elmer, CA) o Cy5-dCTP (Perkin-Elmer, CA) a 37 ºC durante 60 minutos.

El ADN marcado se colocó en una micromatriz patentada de Progenika. La micromatriz comprendía una superficie de cristal modificada a la que se unieron covalentemente sondas oligonucleotídicas específicas de alelo. Las sondas 35 se diseñaron para explorar múltiples posiciones de variantes alélicas (es decir marcadores) en los segmentos genómicos amplificados. Cada variante alélicas se exploró mediante 2 sondas, para un total de 4 sondas por marcador. Cada sonda se imprimió 10 veces en la micromatriz, para un total de 40 elementos (puntos) por SNP. Las secuencias de sonda se enumeran en la sección de Descripción Técnica posterior. La interfaz de ADN marcado/micromatriz se colocó en una cámara de incubación de una estación HS 4800 Pro (Tecan, Suiza) y se 40 incubó a 47 ºC durante 30 minutos y a 45 ºC durante 60 minutos en tampón que contenía SSPE, dextrano y formamida desionizada para permitir que las sondas hibridaran (se unieran) con sus secuencias afines, cuando estuvieran presentes. El ADN no unido se retiró por lavado mediante incubación a 23 ºC durante diversos tiempos con tampón que contenía SSC con o sin SDS. Se añadió un conjugado de estreptavidina-Cy3 (Invitrogen, CA) diluido en tampón que contenía PBS y Tween-20 con la superficie de la micromatriz y se incubó adicionalmente a 37

45 ºC durante 10 minutos. El conjugado no unido se retiró por lavado como anteriormente. La micromatriz se secó por lavado abundante con nitrógeno líquido a alta presión a través de la cámara de incubación.

El ADN hibridado se marcó con fluorescencia, directamente con Cy5 (por la reacción de transferasa anterior) o mediante la interacción entre el conjugado de estreptavidina-Cy3 y biotina (últimas etapas de la hibridación), y se

50 inmovilizó en la micromatriz por formación de pares de bases específico de secuencia con su sonda respectiva. Se detectó fluorescencia de Cy3 y Cy5 unido a micromatriz en un explorador confocal InnoScan 710 (Innopsys, Francia). Este explorador usa dos haces de láser con longitudes de onda apropiadas para excitación de los fluoróforos Cy3 y Cy5 y sensores PMT para la detección de las señales de fluorescencia generadas. La señal de fluorescencia de cada elemento se cuantificó posteriormente por software específico.

55 Se usó software patentado de Progenika para transformar los valores de intensidad de fluorescencia para las variantes alélicas particulares detectadas, individualmente o en combinación, en genotipos de grupo sanguíneo, y de genotipos en fenotipos de grupo sanguíneo predichos.

60 Se puede realizar análisis de serología usando métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Pueden encontrarse protocolos adecuados, por ejemplo, en The Blood Group Antigen FactsBook, Segunda edición. 2004. M.

E. Reid y C. Lomas-Francis. Elsevier Ltd., y referencias citadas en el mismo de manuales técnicos de serología.

Descripción técnica

De acuerdo con el presente ejemplo, se realizaron amplificaciones e hibridaciones para determinación de las cinco secuencias genéticas como sigue:

5 Amplificación del intrón 2 de RHCE*C por PCR.

-: Se usaron los siguientes cebadores, que produjeron un producto de PCR con un tamaño de 357 pares de bases: Cebador directo: 5’-GGCCACCACCATTTGAA-3’ (SEC ID Nº: 3)

-: Cebador inverso: 5’-CCATGAACATGCCACTTCAC-3’ (SEC ID Nº: 4)

En negrita, los nucleótidos específicos de RHCE*C (cebador directo).

Amplificación del exón 3 híbrido de RHD/RHCE por PCR. 15 Se usaron los siguientes cebadores, que produjeron un producto de PCR con un tamaño de 256 pares de bases:

-: Cebador directo: 5’-TCCTGGCTCTCCCTCTCT-3’ (SEC ID Nº: 9)

-: Cebador inverso: 5’-TTTTCAAAACCCCGGAAG-3’ (SEC ID Nº: 10)

En negrita, los nucleótidos específicos de RHD (cebador directo) y nucleótidos específicos de RHCE (cebador inverso).

Amplificación del exón 3 de RHD por PCR. 25 Se usaron los siguientes cebadores, que produjeron un producto de PCR con un tamaño de 268 pares de bases:

-: Cebador directo: 5’-TCCTGGCTCTCCCTCTCT-3’ (SEC ID Nº: 15)

-: Cebador inverso: 5’-GTTGTCTTTATTTTTCAAAACCCT-3’ (SEC ID Nº: 16) En negrita, los nucleótidos específicos de RHD. Amplificación del exón 4 de RHD por PCR.

35 Se usaron los siguientes cebadores, que produjeron un producto de PCR con un tamaño de 281 pares de bases:

-: Cebador directo: 5’-GCTCTGAACTTTCTCCAAGGACT-3’ (SEC ID Nº: 17)

-: Cebador inverso: 5’-ATTCTGCTCAGCCCAAGTAG-3’ (SEC ID Nº: 18) En negrita, los nucleótidos específicos de RHD. Amplificación del exón 7 de RHD por PCR. Se usaron los siguientes cebadores, que produjeron un producto de PCR con un tamaño de 695 pares de bases:

-: Cebador directo: 5’-ACAAACTCCCCGATGATGTGAGTG-3’ (SEC ID Nº: 35)

-: Cebador inverso: 5’-GAGGCTGAGAAAGGTTAAGCCA-3’ (SEC ID Nº: 36) En negrita, los nucleótidos específicos de RHD. Hibridación del amplicón del intrón 2 de RHCE*C con sondas oligonucleotídicas. Se usaron las siguientes secuencias de sonda para determinar la presencia o ausencia de este amplicón:

55 -Sonda exactamente coincidente específica de RHCE*C Nº 1: 5’-TTTTACAGACGCCTGCTACCATG-3’ (SEC ID Nº: 5)

-: Sonda con emparejamiento erróneo Nº 1: 5’-TTTTACAGACGTCTGCTACCATG-3’ (SEC ID Nº: 7)

-: Sonda con emparejamiento erróneo Nº 2: 5’-CATGGTAGCAGACGTCTGTAAAA-3’ (SEC ID Nº: 8) En negrita, el emparejamiento erróneo en posición central. Hibridación del amplicón del exón 3 de RHD o el amplicón del exón 3 híbrido de RHD/RHCE con sondas

65 oligonucleotídicas.

Se usaron las siguientes secuencias de sonda para determinar la presencia o ausencia de ambos amplicones, usando el SNP localizado en la posición 410 del exón 3 tanto de RHD como de RHD/RHCE. Los dos amplicones se distinguieron usando moléculas marcadoras diferentes (Cy5-dCTP o biotina ddUTP) en la reacción transferasa terminal descrita anteriormente.

-: Sonda de variante del exón 3 híbrido Nº 2: 5’-GTCAACTTGGTGCAGTTGGTG-3’ (SEC ID Nº: 14)

10 En negrita, el SNP.

Hibridación del amplicón del exón 4 de RHD con sondas oligonucleotídicas

15 Se usaron las siguientes secuencias de sonda para determinar la presencia, ausencia y variante de SNP (bien C o G) para el SNP localizado en la posición 602 de la secuencia codificante:

-: Sonda de tipo silvestre de RHD Nº 2: 5’-TAAAGATCAGACAGCAACGATAC-3’ (SEC ID Nº: 24) 20 -Sonda de variante RHD*DIIIa Nº 1: 5’-ATAAAGATCAGAGAGCAACGATACC-3’ (SEC ID Nº: 25)

-: Sonda de variante RHD*DIIIa Nº 2: 5’-TAAAGATCAGAGAGCAACGATAC-3’ (SEC ID Nº: 26)

En negrita, el SNP.

25 Hibridación del amplicón del exón 7 de RHD con sondas oligonucleotídicas.

Se usaron las siguientes secuencias de sonda para determinar la presencia, ausencia y variante de SNP (bien G o C) para el SNP localizado en la posición 1048 de la secuencia codificante:

30 -Sonda de tipo silvestre de RHD Nº 1: 5’-TGCTGGTGCTTGATACCGTCGGA-3’ (SEC ID Nº: 37)

-: Sonda de tipo silvestre de RHD Nº 2: 5’-GCTGGTGCTTGATACCGTCGG-3’ (SEC ID Nº: 38)

-: Sonda variante RHD*DIVa-2 Nº 1: 5’-TGCTGGTGCTTCATACCGTCGGA-3’ (SEC ID Nº: 39)

-: Sonda variante RHD*DIVa-2 Nº 2: 5’-GCTGGTGCTTCATACCGTCGG-3’ (SEC ID Nº: 40) En negrita, el SNP.

35 Agrupamiento de muestras por combinación genotípica

El análisis por el método descrito anteriormente de 146 muestras que se sabía previamente que contenían el exón 3 híbrido de RHD/RHCE produjo los resultados mostrados posteriormente. Las muestras se agruparon por genotipo y/o fenotipo predicho. También se realizó análisis de serotipo en un subconjunto de las muestras en cada grupo. El

40 análisis de serotipo es incapaz de distinguir entre fenotipos de antígeno C+ y C+W, lo que demuestra los resultados imprecisos que pueden obtenerse usando este método. También hay algunos tipos de fenotipos de D-, parcial y débil que no pueden distinguirse por serología.

Grupo 1

45 Número de Muestras: 11

ID de las Muestras: 09-0084, 10-0210, 10-0380, 10-0635, 10-0972, 10-2366, 10-2367, 10-3113, 10-3649, 10-3664, 10-3809

50 Datos de genotipación: intrón 2 de RHCE*C presente, RHD/CE Hex03 presente, exón 3 de RHD presente, exón 4 de RHD 602C, exón 7 de RHD 1048G.

RHD haplotipo 1: RHD*DIIIa-CE(4-7)-D

55 RHD haplotipo 2: Posiblemente RHD*D Fenotipo de RHD predicho: ¿D? Serotipo: No disponible

RHCE haplotipo 1: RHCE*c RHCE haplotipo 2: RHCE*C

60 Fenotipo de RHCE C predicho: C+ Serotipo: C+

La determinación de los marcadores descritos en la presente memoria predijo correctamente que el fenotipo clínico no era RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, RHD*DIIIa o RHD*DIVa-2.

65 Grupo 2

Número de Muestras: 49

5 ID de las Muestras: 09-0216, 09-0294, 10-0056, 10-0097, 10-0118, 10-0280, 10-0367, 10-0371, 10-0373, 10-0376, 10-0389, 10-0396, 10-0428, 10-0461, 10-0476, 10-0575, 10-0598, 10-0654, 10-0752, 10-0773, 10-0790, 10-0849, 10-0867, 10-0933, 10-1391, 10-1423, 10-1500, 10-1591, 10-1599, 10-1643, 10-1653, 10-2038, 10-2153, 10-2155, 10-2212, 10-2321, 10-2347, 10-2758, 10-3387, 10-3400, 10-3417, 10-3426, 10-3486, 10-3528, 10-3545, 10-3625, 10-3635, 10-3684, 10-3694

Datos de genotipación: intrón 2 de RHCE*C ausente, RHD/CE Hex03 presente, exón 3 de RHD presente, exón 4 de RHD 602C, exón 7 de RHD 1048G.

RHD haplotipo 1: RHD*DIIIa-CE(4-7)-D

15 RHD haplotipo 2: Posiblemente RHD*D Fenotipo de RHD predicho: ¿D? Serotipo: D+

RHCE haplotipo 1: RHCE*c RHCE haplotipo 2: RHCE*c Fenotipo de RHCE C predicho: C+W Serotipo: C+

El método que determina los marcadores descritos en la presente memoria predijo que el fenotipo clínico podría ser RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, pero no podría ser RHD*DIIIa o RHD*DIVa-2. Para los pacientes de hecho ensayados, estaba

25 presente el antígeno D, y por lo tanto el fenotipo no era RHD*DIIIa-CE(4-7)-D. Estos datos también muestran que el análisis de serotipo indicó incorrectamente un fenotipo C+ en lugar de C+W; en ausencia del intrón 2 de RHCE*C, el fenotipo real no podría ser C+.

Grupo 3

Número de Muestras: 24

ID de las Muestras: 10-0085, 10-0177, 10-0443, 10-0656, 10-0715, 10-0847, 10-0853, 10-0900, 10-1374, 10-1455, 10-1532, 10-1577, 10-1588, 10-1649, 10-1661, 10-2220, 10-2238, 10-2335, 10-3392, 10-3427, 10-3461, 10-3561,

35 10-3718, 10-4060

Datos de genotipación: intrón 2 de RHCE*C ausente, RHD/CE Hex03 presente, exón 3 de RHD ausente, exón 5 de RHD 602 ausente, exón 7 de RHD 1048 ausente.

: RHD haplotipo 1: RHD*DIIIa-CE(4-7)-D RHD haplotipo 2: RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o RHD*Ø Fenotipo de RHD predicho: D- Serotipo: D

: RHCE haplotipo 1: RHCE*c

45 RHCE haplotipo 2: RHCE*c Fenotipo de RHCE C predicho: C+W Serotipo: C+

El método descrito en la presente memoria predijo un fenotipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D; sin embargo, el análisis de serotipo indicó incorrectamente un fenotipo de antígeno C+, debido a la incapacidad para distinguir C+ de C+W.

Grupo 4

Número de Muestras: 32

55 ID de las Muestras: 09-0275, 09-0300, 10-0041, 10-0074, 10-0107, 10-0425, 10-0481, 10-0523, 10-0579, 10-0590, 10-0628, 10-0642, 10-0669, 10-0717, 10-0770, 10-0842, 10-0942, 10-1233, 10-1413, 10-1458, 10-1468, 10-1574, 10-1658, 10-1683, 10-2215, 10-2391, 10-2433, 10-2435, 10-2456, 10-3546, 10-3574, 10-4080

Datos de genotipación: intrón 2 de RHCE*C ausente, RHD/CE Hex03 presente, exón 3 de RHD presente, exón 4 de RHD 602C/G (heterocigoto), exón 7 de RHD 1048G.

RHD haplotipo 1: RHD*DIIIa

RHD haplotipo 2: Posiblemente RHD*D 65 Fenotipo de RHD predicho: ¿D?

Serotipo: D+

RHCE haplotipo 1: RHCE*c RHCE haplotipo 2: RHCE*c Fenotipo de RHCE C predicho: C-

5 Serotipo: C-

El método predijo que el fenotipo no se debía a un haplotipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D. Los datos de serotipo coincidieron con estos resultados.

10 Grupo 5

Número de Muestras: 8

ID de las Muestras: 10-0420, 10-0512, 10-0543, 10-0735, 10-1634, 10-2379, 10-2470, 10-3409

15 Datos de genotipación: intrón 2 de RHCE*C presente, RHD/CE Hex03 presente, exón 3 de RHD presente, exón 4 de RHD 602C/G (heterocigoto), exón 7 de RHD 1048G.

RHD haplotipo 1: RHD*DIIIa

20 RHD haplotipo 2: Posiblemente RHD*D Fenotipo de RHD predicho: ¿D? Serotipo: D+

RHCE haplotipo 1: RHCE*c RHCE haplotipo 2: RHCE*C

25 Fenotipo de RHCE C predicho: C+ Serotipo: C+

El método predijo correctamente que el fenotipo clínico no era RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, RHD*DIIIa o RHD*DI-Va-2.

30 Grupo 6

Número de Muestras: 10

ID de la muestra: 09-0032, 10-0187, 10-0281, 10-1379, 10-1621, 10-1628, 10-2142, 10-2506, 10-3051, 10-3097

35 Datos de genotipación: intrón 2 de RHCE*C ausente, RHD/CE Hex03 presente, exón 3 de RHD ausente, exón 4 de RHD 602G, exón 7 de RHD 1048G.

RHD haplotipo 1: RHD*DIIIa

40 RHD haplotipo 2: RHD*DIIIa o RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o RHD*Ø (1) Fenotipo de RHD predicho: D Parcial

RHCE haplotipo 1: RHCE*c RHCE haplotipo 2: RHCE*c Fenotipo de RHCE C predicho: C-o C+W

45 Sin datos de serotipo disponibles para estas muestras.

Grupo 7

50 Número de Muestras: 4

ID de las Muestras: 09-0287, 09-0333, 10-0075, 10-0284

Datos de genotipación: intrón 2 de RHCE*C ausente, RHD/CE Hex03 presente, exón 3 de RHD presente, exón 4 de 55 RHD 602G, exón 7 de RHD 1048G.

RHD haplotipo 1: RHD*DIIIa o RHD*DIIIa-CE(4-7)-D RHD haplotipo 2: RHD*D débil Fenotipo de RHD predicho: D Débil o D Parcial

60 Serotipo: D+

RHCE haplotipo 1: RHCE*c RHCE haplotipo 2: RHCE*c Fenotipo de RHCE C predicho: C-o C+W Serotipo: Datos no disponibles

El método predijo correctamente que el fenotipo clínico no era RHD*DIIIa-CE(4-7)-D. Grupo 8

5 Número de Muestras: 5 ID de las Muestras: 10-0052, 10-0638, 10-0723, 10-0876, 10-2144 Datos de genotipación: intrón 2 de RHCE*C ausente, RHD/CE Hex03 presente, exón 3 de RHD presente, exón 4 de

10 RHD 602C, exón 7 de RHD 1048G/C (heterocigoto).

RHD haplotipo 1: RHD*DIVa-2 RHD haplotipo 2: Posiblemente RHD*D Fenotipo de RHD predicho: ¿D?

15 RHCE haplotipo 1: RHCE*c RHCE haplotipo 2: RHCE*c Fenotipo de RHCE C predicho: C-

Sin datos de serotipo disponibles para estas muestras. 20 Grupo 9

Número de Muestras: 3

25 ID de las Muestras: 10-0081, 10-0387, 10-0400

Datos de genotipación: intrón 2 de RHCE*C presente, RHD/CE Hex03 presente, exón 3 de RHD presente, exón 4 de RHD 602C, exón 7 de RHD 1048G/C.

30 RHD haplotipo 1: RHD*DIVa-2 RHD haplotipo 2: Posiblemente RHD*D Fenotipo de RHD predicho: ¿D? Serotipo: D+

RHCE haplotipo 1: RHCE*c

35 RHCE haplotipo 2: RHCE*C Fenotipo de RHCE C predicho: C+ Serotipo: C+

El método predijo correctamente que el fenotipo clínico no era RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, RHD*DIIIa o RHD*DI-Va-2. 40

(1)RHD*Ø: Sin gen de RHD.

Los resultados anteriores se resumen en la Tabla 3. 45 Tabla 3

Nº de Haplotipos: % de Haplotipos

Variante de Exón 3 Híbrido: RHD-DIIIa-CE(4-7)-D 84 28,8

RHD*DIIIa: 50 17,1

RHD*DIVa-2: 8 2,7

Incierto: 38 13,0

Otros: 112 38,4

Total: 292 100,0

Nº de Muestras: % de Muestras

Llamada RHD*DIIIa-CE(4-7)-D: Presente 84 57,5

Ausente: 48 32,9

Incierto: 14 9,6

Nº de Haplotipos: % de Haplotipos

Total: 146 100,0

Nº de Muestras: % de Muestras

Fenotipo de RhD Predicho: ¿D? 108 74,0

D Parcial: 10 6,9

D: 24 16,4

Incierto: 4 2,7

Total: 146 100,0

Nº de Muestras: % de Muestras

Fenotipo de RhC Predicho: C+ 22 15,1

C+W: 73 50,0

C: 37 25,3

Incierto: 14 9,6

Total: 146 100,0

Estos datos muestran que usando los marcadores descritos en la presente memoria, es posible distinguir RHD*DIIIa-CE(4-7)-D de RHD*DIIIa o RHD*DIVa-2. Además, estos datos muestran que basarse en el análisis de serotipo puede conducir erróneamente al diagnóstico incorrecto de un fenotipo de antígeno C+W como C+.

Referencias

1. DIIIa and DIII Type 5 are encoded by the same allele and are associated with altered RHCE*ce alleles: clinical

implications. Connie M. Westhoff, Sunitha Vege, Christine Halter-Hipsky, Trina Whorley, Kim Hue-Roye, Christine 10 Lomas-Francis, y Marion E. Reid. Transfusion (2010) 50, pp. 1303-1311.

2.: Heterogeneous molecular background of the weak C, VS+, hrB-, HrB- phenotype in black persons. Bach-Nga Pham, Thierry Peyrard, Genevieve Juszczak, Isabelle Dubeaux, Dominique Gien, Antoine Blancher, Jean-Pierre Cartron, Philippe Rouger, y Pierre-Yves Le Pennec. Transfusion (2009) 49, pp. 495-504.

3.: RHC and RHc genotyping in different ethnic Grupos. Martine G.H.M. Tax, C. Ellen van der Schoot, Rene’ van

15 Doorn, Lotte Douglas-Berger, Dick J. van Rhenen, y Petra A. Maaskant-van Wijk. Transfusion (2002) 42, pp. 6234-644.

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LISTADO DE SECUENCIAS 20

<110> Progenika Biopharma, S.A.

<120> Método para la identificación por técnicas moleculares de variantes genéticas que no codifican antígeno D

(D-) y codifican antígeno C alterado (C+W) 25

<130> CSC/FP6712525

<160> 42

30 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 1254

<212> ADN 35 <213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 1254

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 17 5 <212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 10 <222> 1..17

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

<400> 3

ggccaccacc atttgaa 17 15

<210> 4

<211> 20

<212> ADN

<213>Secuencia artificial 20

<220>

<221> fuente

<222> 1..20

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador" 25

<400> 4 ccatgaacat gccacttcac 20

<210> 5 30 <211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220> 5 <221> fuente

<222> 1..23

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 5 ttttacagac gcctgctacc atg 23

<210> 6

<211> 23

<212> ADN 15 <213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<222> 1..23

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 6 catggtagca ggcgtctgta aaa 23

25 <210> 7

<211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<222> 1..23

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

35 <400> 7 ttttacagac gtctgctacc atg 23

<210> 8

<211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 45 <222> 1..23

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 8 catggtagca gacgtctgta aaa 23

<210> 9

<211> 18

<212> ADN

<213>Secuencia artificial 55

<220>

<221> fuente

<222> 1..18

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

<400> 9 tcctggctct ccctctct 18

<210> 10 65 <211> 18

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 5 <222> 1..18

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

<400> 10 ttttcaaaac cccggaag 18

<210> 11

<211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial 15

<220>

<221> fuente

<222> 1..23

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 11 ggtcaacttg gcgcagttgg tgg 23

<210> 12 25 <211> 21

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<222> 1..21

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 12 35 gtcaacttgg cgcagttggt g 21

<210> 13

<211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<222> 1..23 45 <223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 13 ggtcaacttg gtgcagttgg tgg 23

<210> 14

<211> 21

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

55 <220>

<221> fuente

<222> 1..21

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 14 gtcaacttgg tgcagttggt g21

<210> 15

<211> 18 65 <212> ADN

<213>Secuencia artificial <220>

<221> fuente

<222> 1..18 5 <223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

<400> 15 tcctggctct ccctctct 18

<210> 16

<211> 24

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

15 <220>

<221> fuente

<222> 1..24

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

<400> 16 gttgtcttta tttttcaaaa ccct 24

<210> 17

<211> 23 25 <212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<222> 1..23

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

<400> 17

gctctgaact ttctccaagg act 23 35

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<222> 1..20 45 <223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

<400> 18 attctgctca gcccaagtag 20

<210> 19

<211> 24

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

55 <220>

<221> fuente

<222> 1..24

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

<400> 19 ttgaattaag cacttcacag agca 24

<210> 20

<211> 18 65 <212> ADN

<213>Secuencia artificial <220>

<221> fuente

<222> 1..18 5 <223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

<400> 20 caccttgctg atcttccc 18

10 <210> 21

<211> 20

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

15 <220>

<221> fuente

<222> 1..20

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

20 <400> 21 agtagtgagc tggcccatca 20

<210> 22

<211> 20 25 <212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 30 <222> 1..20

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

<400> 22

cttcagccaa agcagaggag 20 35

<210> 23

<211> 25

<212> ADN

<213>Secuencia artificial 40

<220>

<221> fuente

<222> 1..25

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda" 45

<400> 23 ataaagatca gacagcaacg atacc 25

<210> 24 50 <211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220> 55 <221> fuente

<222> 1..23

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 24 60 taaagatcag acagcaacga tac 23

<210> 25

<211> 25

<212> ADN 65 <213>Secuencia artificial <220>

<221> fuente

<222> 1..25

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda" 5

<400> 25 ataaagatca gagagcaacg atacc 25

<210> 26 10 <211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220> 15 <221> fuente

<222> 1..23

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 26 20 taaagatcag agagcaacga tac 23

<210> 27

<211> 21 25 <212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 30 <222> 1..21

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 27

ctggccaagt ttcaactctg c21 35

<210> 28

<211> 19

<212> ADN

<213>Secuencia artificial 40

<220>

<221> fuente

<222> 1..19

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda" 45

<400> 28 tggccaagtt tcaactctg 19

<210> 29 50 <211> 21

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220> 55 <221> fuente

<222> 1..21

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 29 60 ctggccaagt gtcaactctg c 21

<210> 30

<211> 19

<212> ADN 65 <213>Secuencia artificial <220>

<221> fuente

<222> 1..19

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda" 5

<400> 30 tggccaagtg tcaactctg 19

<210> 31

<211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220> 15 <221> fuente

<222> 1..23

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 31 gtgcacagtg cggtgttggc agg 23

<210> 32

<211> 21

<212> ADN 25 <213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<222> 1..21

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 32 tgcacagtgc ggtgttggca g 21

35 <210> 33

<211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<222> 1..23

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

45 <400> 33 gtgcacagtg cagtgttggc agg 23

<210> 34

<211> 21

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 55 <222> 1..21

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 34 tgcacagtgc agtgttggca g 21

<210> 35

<211> 24

<212> ADN

<213>Secuencia artificial 65

<220> <221> fuente

<222> 1..24

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

5 <400> 35 acaaactccc cgatgatgtg agtg 24

<210> 36

<211> 22

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 15 <222> 1..22

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: cebador"

<400> 36 gaggctgaga aaggttaagc ca 22

<210> 37

<211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial 25

<220>

<221> fuente

<222> 1..23

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 37 tgctggtgct tgataccgtc gga 23

<210> 38 35 <211> 21

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<222> 1..21

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 38 45 gctggtgctt gataccgtcg g 21

<210> 39

<211> 23

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<222> 1..23 55 <223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 39 tgctggtgct tcataccgtc gga 23

<210> 40

<211> 21

<212> ADN

<213>Secuencia artificial

65 <220>

<221> fuente

<222> 1..21

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: sonda"

<400> 40 5 gctggtgctt cataccgtcg g 21

<210> 41

<211> 64956

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 65624

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 42

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes de grupo sanguíneo de un sujeto, comprendiendo el método:

determinar al menos 4 marcadores en una muestra que se ha obtenido del sujeto, en donde los marcadores comprenden:

(i)

la presencia o ausencia de un alelo de RHCE*C;

(ii)

la presencia o ausencia de un alelo del exón 3 híbrido de RHD/RHCE (RHD/CE Hex03);

(iii) la ausencia de, o una variante de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) dentro de, uno cualquiera del exón 4 de RHD, el exón 5 de RHD o el exón 6 de RHD; y

(iv) la ausencia de, o variante de SNP dentro del, exón 7 de RHD,

en el que:

la ausencia de dicho alelo de RHCE*C; la presencia de dicho alelo del exón 3 híbrido de RHD/RHCE; la ausencia del exón 4 de RHD, exón 5 de RHD o exón 6 de RHD; y la ausencia del exón 7 de RHD en combinación indican que la muestra contiene dicha variante de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o dicha variante de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

a) la variante de SNP dentro del exón 4 de RHD está en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD (rs1053355), b) la variante de SNP dentro del exón 5 de RHD está en la posición 667 de la secuencia codificante de RHD (rs1053356), c) la variante de SNP dentro del exón 6 de RHD está en la posición 819 de la secuencia codificante de RHD; y/o d) la variante de SNP dentro del exón 7 de RHD está en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD (rs41307826),

en el que la secuencia codificante de RHD es como se expone en SEC ID Nº: 1.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que los marcadores comprenden además:

(v) la presencia o ausencia de un alelo del exón 3 de RHD,

en el que la ausencia de dicho exón 3 de RHD indica además que la muestra contiene dicha variante de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o dicha variante de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D.
4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:

a) el método comprende además determinar los fenotipos de antígenos RHD y RHC del sujeto de acuerdo con la Tabla 1; y/o b) el método comprende detectar la presencia o la ausencia de una variante de grupo sanguíneo seleccionada de: RHD*DIIIa; RHD*DIVa-2; o variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o variantes de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, por ejemplo en el que el método comprende detectar la presencia o la ausencia de variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o variantes de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D; y/o c) el marcador (iii) es el SNP dentro del exón 4 de RHD en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD (rs1053355); y/o d) el alelo de RHCE*C se determina determinando la presencia o la ausencia del intrón 2 de RHCE*C, o una cualquiera de las siguientes posiciones en la secuencia codificante de RHCE: posición 307 (exón 2), posición 48 (exón 1), posición 150 (exón 2), posición 178 (exón 2), posición 201 (exón 2) y/o posición 203 (exón 2),

en el que la secuencia codificante de RHD es como se expone en SEC ID Nº: 1 y en el que la secuencia codificante de RCHE es como se expone en SEC ID Nº: 2.
5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra comprende ácido nucleico y el método comprende amplificar el ácido nucleico o una parte del mismo por PCR usando cebadores, por ejemplo en el que:

a) los cebadores de PCR para determinar el alelo de RHCE*C son un cebador de PCR directo específico para RHCE*C y un cebador de PCR inverso no específico, por ejemplo en donde

(i)

el cebador inverso no específico está compartido con RHD, RHC*C y/o RHC*c; y/o

(ii)

los cebadores de PCR comprenden:

Directo: 5’-GGCCACCACCATTTGAA-3’ (SEC ID Nº: 3) Inverso: 5’-CCATGAACATGCCACTTCAC-3’, (SEC ID Nº: 4); y/o

b) los cebadores de PCR para determinar el alelo de RHD/CE Hex03 son cebadores de PCR directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 2 y 3, o intrones 3 y 2, respectivamente, por ejemplo en donde

(i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-TCCTGGCTCTCCCTCTCT-3’ (SEC ID Nº: 9) Cebador inverso: 5’-TTTTCAAAACCCCGGAAG-3 (SEC ID Nº: 10);

y/o

c) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 4 de RHD en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD (rs1053355) son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 3 y 4, o intrones 4 y 3, respectivamente, por ejemplo en donde

(i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-GCTCTGAACTTTCTCCAAGGACT-3’ (SEC ID Nº: 17) Cebador inverso: 5’-ATTCTGCTCAGCCCAAGTAG-3’ (SEC ID Nº: 18); y/o

d) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 5 de RHD en la posición 667 de la secuencia codificante de RHD (rs1053356) son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 4 y 5, o intrones 5 y 4, respectivamente, por ejemplo en donde

(i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-TTGAATTAAGCACTTCACAGAGCA-3’ (SEC ID Nº: 19) Cebador inverso: 5’-CACCTTGCTGATCTTCCC-3’ (SEC ID Nº: 20); y/o

e) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 6 de RHD en la posición 819 de la secuencia codificante de RHD son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 5 y 6, o intrones 6 y 5, respectivamente, por ejemplo en donde

(i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-AGTAGTGAGCTGGCCCATCA-3’ (SEC ID Nº: 21) Cebador inverso: 5’-CTTCAGCCAAAGCAGAGGAG-3’ (SEC ID Nº: 22); y/o

f) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 7 de RHD en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD (rs41307826) son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 6 y 7, o intrones 7 y 6, respectivamente, por ejemplo en los que

(i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-ACAAACTCCCCGATGATGTGAGTG-3’ (SEC ID Nº: 35) Cebador inverso: 5’-GAGGCTGAGAAAGGTTAAGCCA-3’ (SEC ID Nº: 36); y/o

g) dependiendo de la reivindicación 3, los cebadores de PCR para determinar el alelo del exón 3 de RHD son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 2 y 3, o intrones 3 y 2, respectivamente, por ejemplo en donde

(i) los cebadores de PCR comprenden: Cebador directo: 5’-TCCTGGCTCTCCCTCTCT-3’ (SEC ID Nº: 15)

Cebador inverso: 5’-GTTGTCTTTATTTTTCAAAACCCT-3’ (SEC ID Nº: 16); en el que la secuencia codificante de RHD es como se expone en SEC ID Nº: 1.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico amplificado comprende un marcador, por ejemplo en el que a) el marcador comprende un nucleótido biotinilado; y/o

b) el marcador comprende un resto fluorescente.
7.

Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra comprende ácido nucleico, y el método comprende amplificar el ácido nucleico o una parte del mismo por PCR usando cebadores, fragmentar el ácido nucleico amplificado y marcar el ácido nucleico fragmentado con ddNTP biotinilados usando una enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT).
8.

Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que determinar la presencia, la ausencia o la variante de SNP de un marcador comprende poner en contacto ácido nucleico que contenga cada marcador con una o más sondas, por ejemplo, en el que:

a) dependiendo de la reivindicación 3, las sondas para determinar la presencia o la ausencia de RHD/CE Hex03

o el exón 3 de RHD entran en contacto con un SNP localizado tanto en RHD/CE Hex03 como en el exón 3 de RHD, en el que una variante de SNP es específica para RHD/CE Hex03 y otra variante de SNP es específica para el exón 3 de RHD, por ejemplo en el que

(i)

el SNP está en la posición 410 de la secuencia codificante, localizada tanto dentro de RHD/CE Hex03 como del exón 3 de RHD; y/o

(ii)

las sondas comprenden:

(1)

5’-TTTTACAGACGCCTGCTACCATG-3’, (SEC ID Nº: 5)

(2)

5’-CATGGTAGCAGGCGTCTGTAAAA-3’, (SEC ID Nº: 6)

(3)

5’-TTTTACAGACGTCTGCTACCATG-3’, (SEC ID Nº: 7) y

(4)

5’-CATGGTAGCAGACGTCTGTAAAA-3’, (SEC ID Nº: 8); y/o

b) las sondas para determinar la ausencia o la variante de SNP del SNP en: posición 602 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 4 (rs1053355), posición 667 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 5 (rs1053356), o posición 819 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 6 comprenden:

(i)

exón 4 de RHD:

(1)

5’-ATAAAGATCAGACAGCAACGATACC-3’ (SEC ID Nº: 23)

(2)

5’-TAAAGATCAGACAGCAACGATAC-3’ (SEC ID Nº: 24)

(3)

5’-ATAAAGATCAGAGAGCAACGATACC-3’ (SEC ID Nº: 25)

(4)

5’-TAAAGATCAGAGAGCAACGATAC-3’ (SEC ID Nº: 26);

(ii)

exón 5 de RHD:

(1)

5’-CTGGCCAAGTTTCAACTCTGC-3’ (SEC ID Nº: 27)

(2)

5’-TGGCCAAGTTTCAACTCTG-3’ (SEC ID Nº: 28)

(3)

5’-CTGGCCAAGTGTCAACTCTGC-3’ (SEC ID Nº: 29)

(4)

5’-TGGCCAAGTGTCAACTCTG-3’ (SEC ID Nº: 30);

(iii) exón 6 de RHD:

(1)

5’-GTGCACAGTGCGGTGTTGGCAGG-3’ (SEC ID Nº: 31)

(2)

5’- TGCACAGTGCGGTGTTGGCAG-3’ (SEC ID Nº: 32)

(3)

5’- GTGCACAGTGCAGTGTTGGCAGG-3’ (SEC ID Nº: 33)

(4)

5’-TGCACAGTGCAGTGTTGGCAG-3’ (SEC ID Nº: 34); y/o

c) las sondas para determinar la variante de SNP del SNP en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 7 (rs41307826) comprenden:

(1)

5’-TGCTGGTGCTTGATACCGTCGGA-3’ (SEC ID Nº: 37)

(2)

5’-GCTGGTGCTTGATACCGTCGG-3’ (SEC ID Nº: 38)

(3)

5’-TGCTGGTGCTTCATACCGTCGGA-3’ (SEC ID Nº: 39)

(4)

5’-GCTGGTGCTTCATACCGTCGG-3’ (SEC ID Nº: 40);

en el que la secuencia codificante de RHD es como se expone en SEC ID Nº: 1.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que

a) una o más de las sondas comprenden un marcador, por ejemplo en el que el marcador es un resto

fluorescente; y/o b) una o más de las sondas están unidas con un soporte sólido o conjugadas con una o más partículas.
10. Uso de un conjunto de cebadores en un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIaCE(4-7-D) o de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes del grupo sanguíneo, amplificando ácido nucleico que comprende al menos los cuatro marcadores de la reivindicación 1, en el que el conjunto de cebadores comprende al menos tres pares de cebadores seleccionados de los cebadores expuestos en:

(i)

reivindicación 5(a),

(ii)

reivindicación 5(b),

(iii) una cualquiera de las reivindicaciones 5(c), 5(d) o 5(e)

(iv)

reivindicación 5(f), y

(v)

reivindicación 5(g).
11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el conjunto de cebadores comprende al menos tres pares de cebadores seleccionados de los cebadores expuestos en:

(i)

reivindicación 5(a)(ii),

(ii)

reivindicación 5(b)(i),

(iii) una cualquiera de las reivindicaciones 5(c)(i), 5(d)(i) o 5(e)(i),

(iv)

reivindicación 5(f)(i), y

(v)

reivindicación 5(g)(i).
12.

Uso de acuerdo con la reivindicación 10 o reivindicación 11, en el que al menos el 50 % de los cebadores en el conjunto son los pares de cebadores definidos en la reivindicación 10 u 11.
13.

Uso de un conjunto de sondas en un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7-D) o de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes del grupo sanguíneo, determinando la presencia, la ausencia o la variante de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) de al menos los cuatro marcadores de la reivindicación 1, en el que el conjunto de cebadores comprende:

(i)

las sondas de SEC ID Nº: 5, 6, 7 y 8;

(ii)

las sondas de SEC ID Nº: 23, 24, 25 y 26;

(iii) las sondas de SEC ID Nº: 31, 32, 33 y 34

(iv)

las sondas de SEC ID Nº: 27, 28, 29 y 30; y

(v)

las sondas de SEC ID Nº: 37, 38, 39 y 40.
14.

Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que:

a) las sondas se inmovilizan en un soporte sólido o se conjugan con una o más partículas, por ejemplo en el que el soporte sólido comprende uno o más marcadores unidos, por ejemplo en el que el marcador es un fluorocromo; y/o b) una o más sondas comprenden un marcador, por ejemplo en el que marcador es un resto fluorescente.
15.

Uso de un kit para genotipar un sujeto, comprendiendo el kit un conjunto de cebadores de PCR como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, y un conjunto de sondas como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14.