WO2006098401A1 - 関節リウマチ罹患リスクの測定方法 - Google Patents

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WO2006098401A1
WO2006098401A1 PCT/JP2006/305240 JP2006305240W WO2006098401A1 WO 2006098401 A1 WO2006098401 A1 WO 2006098401A1 JP 2006305240 W JP2006305240 W JP 2006305240W WO 2006098401 A1 WO2006098401 A1 WO 2006098401A1
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sec8l1
polynucleotide
human
oligo
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PCT/JP2006/305240
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Mitsuo Itakura
Daisuke Hamada
Natsuo Yasui
Katsutoshi Miyatake
Hiroshi Takaku
Kahoko Hashimoto
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The University Of Tokushima
Chiba Institute Of Technology
Haplopharma Inc.
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring and determining the risk of developing rheumatoid arthritis.
  • the method detects SNPs (single nucleotide polymorphisms) associated with rheumatoid arthritis, particularly haplotypes, from a sample containing human genomic DNA, so that the sample provider (subject) has rheumatoid arthritis. This is a method of detecting and judging whether or not there is a potential risk.
  • the present invention relates to a diagnostic marker for rheumatoid arthritis, a probe, a primer, and a reagent kit that can be effectively used for carrying out a powerful detection method.
  • Rheumatoid arthritis (hereinafter simply referred to as "RA"! /) Is one of the most frequent! Autoimmune diseases, and the prevalence is almost uniform throughout the world. % To 1% (Non-patent Document 1). Chronic inflammation of the synovium and subsequent joint destruction are the main features. Although the detailed pathophysiology of rheumatoid arthritis has not been elucidated, it is suggested that genetic and environmental factors (infection, hormones, pregnancy, etc.) are both involved in family studies and twin studies (Non-patent Document 2 and 3).
  • HLA human immunoglobulin-associated RA
  • RA disease risk and severity
  • HLA alone can explain only about 1/3 of the genetic factors of RA (Non-patent Document 5), and multiple genes other than HLA are expected to be involved in the development of RA.
  • candidate genes such as TNF o ;, CTLA-4, and cytoforce-in-related genes has been investigated, but the results are not consistent (Non-patent Document 6).
  • Genome-wide linkage analysis using RA families has been reported by at least four groups (Non-Patent Documents 7 to 12), and several non-HLA regions have been identified in multiple studies. A common region has not been identified.
  • Non-Patent Documents 13 to 15 genes related to multifactorial diseases such as type 2 diabetes and Crohn's disease have begun to be identified by this method.
  • Non-Patent Document 16 an association between a haplotype in the PADI4 gene and Japanese RA has been reported (Non-Patent Document 16).
  • PADI4 is located on chromosome 1 q36 and has been reported as a candidate region in two studies so far (Non-patent Documents 7 and 8).
  • Non-patent Document 17 Recently, the same group has identified an association between SNP and RA in the RANX1-binding region within the SLC22A4 gene.
  • RA is a multifactorial disease that involves genetic factors and environmental factors together, so it is possible to determine the risk of morbidity only by mutations and abnormalities in one gene. It is difficult to do and further study is required.
  • Non-patent literature 1 Felson D: Epidemiology of the rheumatic diseases.In: Koopman WJ, ed) Arthritis and allied conditions: a textbook of rheumatology, 13th ed.Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, pp3- 34, 1996.
  • Non-Patent Document 2 Lawrence JS. Heberden Oration, 1969. Rheumatoid arthritis-nature or nurture? Ann Rheum Dis 1970; 29: 357-79.
  • Non-Patent Document 3 del Junco D, Luthra HS, Annegers JF, Worthington JW, Kurland LT. The familial aggregation of rheumatoid arthritis and its relationship to the HLA— DR4 association. Am J Epidemiol 1984; 119: 813-29.
  • Non-Patent Document 4 Wordsworth BP, Lanchbury JS, Sakkas LI, Welsh KI, Panayi GS, Bell JI.HLA-DR4 subtype frequencies in rheumatoid arthritis indicate that DRBl is the major susceptibility locus within the HLA class II region.Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 10049-53.
  • Non-Patent Document 5 Deighton CM, Walker DJ, Griffiths ID, Roberts DF.The contribution of HLA to rheumatoid arthritis.Clin Genet 1989; 36: 178-82.
  • Non-Patent Document 6 Barton A, Oilier W. Genetic approaches to the investigation of rheum atoid arthritis. Curr Opin Rheumatol 2002; 14: 260-9.
  • Non-Patent Document 7 Cornelis F, Faure S, Martinez M, Prud'ans JF, Fritz P, Dib C, et al. New susceptibility locus for rheumatoid arthritis suggested by a genome-wide lin kage study.Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 95: 10746-50.
  • Non-Patent Document 8 hiozawa S, Hayashi S, Tsukamoto Y, Goko H, Kawasaki H, Wada T, et al. Identification of the gene loci that predispose to rheumatoid arthritis.Int Imm unol 1998; 10: 1891-5.
  • Non-Patent Document 9 Jawaheer D, Seldin MF, Amos CI, Chen WV, Shigeta R, Monteiro J, et al. A genomewide screen in multiplex rheumatoid artnntis families suggests genetic overlap with other autoimmune diseases.Am J Hum Genet 2001; 68: 927—36.
  • Non-Patent Document 10 MacKay K, Eyre S, Myerscough A, Milicic A, Barton A, Laval S, et al. Whole-genome linkage analysis of rheumatoid arthritis susceptibility loci in 252 a ffected sibling pairs in the United Kingdom. Arthritis Rheum 2002 ; 46: 632-9.
  • Non-Patent Document 11 Jawaheer D, Seldin MF, Amos CI, Chen WV, Shigeta R, Etzel C, et al. Screening the genome for rheumatoid artnntis susceptibility genes: a replication study and combined analysis of 512 multicase families. Arthritis Rheum 2003; 48: 906 -16.
  • Non-Patent Document 12 Eyre S, Barton A, Shephard N, Hinks A, Brintnell W, MacKay K, et al. Investigation of susceptibility loci identified in the UK rheumatoid arthritis whole -genome scan in a lurther series of 217 UK affected sibling pairs Arthritis Rheum 2 004; 50: 729-35.
  • Non-Patent Document 13 Horikawa Y, Oda N, Cox NJ, Li X, Orho- Melander M, Hara M, et al. Genetic variation in the gene encoding calpain— 10 is associated with type 2 diabete s mellitus. Nat Genet 2000; 26: 163-75.
  • Non-Patent Document 14 Hugot JP, Chamaillard M, Zouali H, Lesage S, Cezard JP, Belaiche J, et al. Association of NOD2 leucine— rich repeat variants with susceptibility to Croh n's disease. Nature 2001; 411: 599— 603.
  • Non-Patent Document 15 Ogura Y, Bonen DK, Inohara N, Wu D, Chen FF, Ramos R, et al. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease.Nature 2001; 411: 603— 6.
  • Non-patent literature lb Suzuki A, Yamada R, Chang X, Tokuhiro S, Sawada T, Suzuki M, et al. Functional haplotypes of PAD 14, encoding citrullinating enzyme peptidylarginine de Genesin 4, are associated with rheumatoid arthritis. Nat Genet 2003; 34: 395— 402.
  • Non-specialized literature 17 Tokuhiro S, Yamada R, Chang X, Suzuki A, Kochi Y, Sawada T, et a 1.
  • An intronic SNP in a RUNX1 binding site of SLC22A4, encoding an organic cation transporter is associated with rheumatoid arthritis. Nat Genet 2003; 35: 341-8. Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a method for determining the risk of developing rheumatoid arthritis for an individual subject. Furthermore, an object of the present invention is to provide a reagent and a reagent kit useful for carrying out the method easily.
  • SNP441 specific genetic polymorphism that showed a significant difference in allelic frequency between scontrols, and the SNP441 and haplotypes containing it were found to be important in defining susceptibility to rheumatoid arthritis .
  • the present invention provides the following inventions: (1) Rheumatoid arthritis disease diagnosis marker
  • Item 1 The following (1)-) group force that also has power
  • a marker for diagnosing rheumatoid arthritis comprising at least one selected oligo or polynucleotide:
  • an oligo or polynucleotide having a base sequence with a maximum length of 300 bases on each of the 5 'and 3' sides across A or T located at position 411544 (SNP443),
  • an oligo or polynucleotide having a base sequence with a maximum length of 300 bases on each of the 5 'side and 3' side across A or G located at position 476136 (SNP445),
  • an oligo or polynucleotide having a base sequence with a maximum length of 300 bases on each of the 5 'side and 3' side across A or G located at position 569133 (SNP447),
  • an oligonucleotide or polynucleotide having a nucleotide sequence with a maximum length of 300 nucleotides on each of the 5 'and 3' sides of T or C located at position 628601 (SNP449).
  • Item 2 Targeting genomic DNA that can also be used as a human test subject, at least one base selected from the bases described in (2) below and the bases described in (1) and (5)-) Detecting the risk of developing rheumatoid arthritis for the subject, including the step of detecting and identifying Method:
  • the base (SNP441) detected and identified in step (A) above is cytosine, and the bases described in (1) and (5) to (SNP440, SNP445, SNP447, At least one base selected from SNP449) has the following conditions:
  • Oligo or polynucleotide of the following (2) (However, when the oligo or polynucleotide is RNA, the base symbol “t” in the sequence listing shall be read as “u”. The same shall apply hereinafter.) 15 to 30 bases-long oligonucleotide or a labeled product thereof, and (1) and (5) to 15) bases or 15 to 30 bases that hybridize to at least one selected oligo group or polynucleotide Primer set used to detect the risk of developing rheumatoid arthritis, which can also be combined with nucleotides or their labels:
  • Nucleotide located at position 476136 (SN445) in the nucleotide sequence of the human SEC8L1 gene A continuous oligo or polynucleotide of 16 bases or more in length
  • a continuous oligo or polynucleotide having a length of 16 bases or more containing a nucleotide located at position 628601 (SN449).
  • Oligo or polynucleotide of the following (2) (However, when the oligo or polynucleotide is RNA, the base symbol “t” in the sequence listing shall be read as “u”. 16) to 500 bases in length, or a labeled product thereof, and (1) and (5) to) Powerful group power to hybridize to at least one selected oligo or polynucleotide 16 to 500 bases in length
  • a probe set used to detect the risk of developing rheumatoid arthritis which can also be combined with oligonucleotides or their labels:
  • a continuous oligo or polynucleotide having a length of 16 to 500 bases comprising a nucleotide located at position 628601 (SN449) in the base sequence of the human SEC8L1 gene.
  • Item 6 The probe set according to Item 5, which is a solid-phase probe in which each oligonucleotide or a labeled product thereof is immobilized on an arbitrary solid phase.
  • the detection method of the present invention is a method that can be easily performed in vitro and without requiring specialized knowledge such as a doctor. For subjects whose potential risk of developing RA has been found to be relatively high by the detection method of the present invention, this fact is notified in order to prevent the onset of RA or delay it even a little. It is possible to take appropriate measures. Therefore, the present invention is extremely useful as a test method for preventing the onset of RA or for delaying the onset of RA. Furthermore, the present invention provides a reagent used in the above detection method, which makes it possible to easily carry out the above method.
  • nucleotide sequences nucleotide sequences
  • nucleic acids in the present specification are defined by I UPAC—IUB regulations [IUPAc-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)], “ It shall follow the “Guidelines for the preparation of specifications including base sequences or amino acid sequences” (edited by the Patent Office) and conventional symbols in the field.
  • gene has double-stranded DNA including human genomic DNA, single-stranded DNA (sense strand), and a sequence complementary to the sense strand. Both single-stranded DNA (antisense strand) and fragments thereof are included. In this specification, “gene” distinguishes between regulatory region, coding region, exon and intron unless otherwise specified. It shall be shown without doing.
  • nucleotide refers to nucleic acid and include both DNA and RNA.
  • nucleotide or “oligonucleotide”, “polynucleotide”
  • nucleotide having a sequence that may be double-stranded or single-stranded
  • Nucleotide or “oligonucleotide” and “polynucleotide” having a complementary sequence is also meant to be comprehensive.
  • nucleotide refers to alleles when there are two or more genetically determined alleles. Specifically, in a human population, one or more nucleotide substitutions, deletions, insertions, translocations, reverses at specific sites in one or more other individual genomes based on the genome sequence of one individual.
  • the term “gene polymorphism” refers to a polymorphism caused by a single nucleotide change! /, Linked to a so-called single nucleotide polymorphism (SNP (or SNPs)). Both polymorphisms that span multiple nucleotides that follow are included.
  • a “single nucleotide polymorphism” is a polymorphism caused by a single nucleic acid change. Polymorphisms are present at a frequency greater than 1%, preferably greater than 10% of the selected population.
  • no-protype refers to a combination of genetic mutations existing in one allele (no-proid).
  • rheumatoid arthritis susceptibility gene refers to a gene that is likely to develop rheumatoid arthritis (RA), a polygenic disease, and determines the constitution!
  • allele frequency refers to the locus of one gene! The proportion of alleles in the total number of genes present in the population! Little.
  • linkage disequilibrium refers to a relationship in which the frequency of any allele combination in a population appears more frequently with a specific allele in the vicinity than expected by chance.
  • locus X has alleles a and b (these are equal V, present at a frequency)
  • neighboring locus Y has alleles c and d (these are present at an equal frequency). If so, haplotype ac, another genetic polymorphism combination, is expected to be present in the population at a frequency of 0.25.
  • the haplotype ac is greater than this expected value, that is, if a specific genotype ac appears frequently, the allele ac is said to be in linkage disequilibrium.
  • Linkage disequilibrium is caused by the natural selection of a particular combination of alleles or the fact that they have been introduced into a population in an evolutionary manner, and are due to the fact that linked alleles have not reached equilibrium. You can get it. Therefore, the linkage disequilibrium is different in another group, such as ethnicity and race, and even if ac is in linkage disequilibrium in one group, ad is in linkage disequilibrium in another group. In some cases.
  • Detection of genetic polymorphism in linkage disequilibrium is effective in detecting susceptibility to a disease even though the polymorphism itself does not directly cause the disease.
  • an allele a at locus X may not be the causative element of the disease, but may be disease susceptibility due to linkage disequilibrium with allele c at locus Y.
  • linkage disequilibrium analysis refers to analyzing the degree of linkage disequilibrium in a genomic region. For example, linkage disequilibrium analysis can be performed by calculating the linkage disequilibrium coefficient
  • minor allele refers to an allele (allele) having a low gene frequency when there are two opposing genes at one gene locus. ! Uh.
  • Each base number described in this specification is based on positional information of The National Center for Biotechnology Information data base. Also, in this specification, “xxxx position” in the case of “xxxx position in the base sequence of human SEC8L1 gene” means the position information when the first base at position 132395078 of the human SEC8L1 gene is 1. means.
  • RA rheumatoid arthritis
  • the present inventors selected the region of chromosome 31 q31-34 (7q31-34) as an RA susceptibility candidate region in order to search for RA susceptibility genes in Japanese, and gene-centri c Evenly-spaced common SNP “Frequently placed single nucleotide polymorphisms (SNPs) that are evenly distributed in the gene region” and region-wide case control-related analysis and linkage complaints
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the human SEC8L 1 gene is an 812691 bp gene located at nucleotide numbers 132395078 to 133207769 in the genome sequence of human chromosome 7 (Genbank Sequence Accession IDs: NC 000 007) (ene Name: Homo sapiens gene exocyst) complex component 4).
  • the identification of the RA susceptibility gene of the present invention was specifically performed by the method described below, as described in Examples.
  • q31-34 (7q31-34) of chromosome 7 was selected as a candidate susceptibility region for RA, and 728 SNPs with a minor allele frequency of 15% or more arranged at equal intervals in the region were used.
  • a two-stage case-control-related analysis was performed (380 patients with rheumatoid arthritis x 2, healthy controls 380 patients x 2).
  • 48 SNPs were significantly associated with RA
  • four SNPs within the SEC8L1 gene SNP441 , SNP442, SNP443, SNP445
  • SNP441 showed significant differences with reproducibility (P ⁇ 0.05).
  • SNP441-461 SNP441-461 located in the block were found to correlate with RA. This revealed that the RA-sensitive locus is present in linkage disequilibrium block 4 in a 300 kb region spanning introns 10 to 13 of the SEC8L1 gene.
  • linkage disequilibrium block 4 corresponds to nucleotide numbers 132 747619 to 133035115 in the genome sequence of human chromosome 7 (corresponding to positions 393668 to 681164 in the nucleotide sequence of the SEC8L1 gene). This is the area that is located.
  • LD block 4 has 21 SNPs as shown in Figure 1B. The observed correlation with RA, in which there were no genes other than the SEC8L1 gene in the block, was thought to originate from the SEC8L1 gene itself.
  • SNP440, SNP441, SNP445, SNP447, SNP449 was selected, and the distribution of genotype combinations between SNPs was compared between the case controls.
  • the human SEC8L1 gene is ubiquitously expressed in human tissues including synovial fibroblasts, and all cells of the lymphocyte system that are immunocompetent cells ( T cells, rod cells, macrophages, B cells, NK cells, etc.) expressed SEC8L1.
  • SEC8L1 gene is a potent rheumatoid arthritis (RA) disease susceptibility gene.
  • the present invention is an oligonucleotide or polynucleotide comprising a rheumatoid arthritis susceptibility SNP (RA susceptibility SNP) present in the linkage disequilibrium block 4 (LD block 4) of the human SEC8L1 gene, which is the RA susceptibility gene.
  • RA susceptibility SNP rheumatoid arthritis susceptibility SNP
  • An oligo or polynucleotide that is specifically recognized on the human genome is provided as a diagnostic marker for rheumatoid arthritis (RA diagnostic marker).
  • RA-sensitive SNPs include the following seven SNPs present in LD block 4.
  • SNP440 SNP located at position 379258 in the nucleotide sequence of the human SEC8L1 gene
  • SNP445 SNP located at position 476136 in the nucleotide sequence of the human SEC8L1 gene
  • SNP447 SNP located at position 569133 in the nucleotide sequence of the human SEC8L1 gene
  • SNP449 SNP located at position 628601 in the nucleotide sequence of the human SEC8L1 gene.
  • the length (base length) of the oligo or polynucleotide containing each of these SNPs is not particularly limited as long as it is a length specifically recognized on the human genome.
  • the length is usually 10 bases or more, preferably 20 bases or more. Therefore, the RA diagnosis diagnosis of the present invention is based on 51 nucleotides (each of the above SNPs) centered on each RA sensitive SNP ((1) to)) present in the LD block in the base sequence of the human SEC8L1 gene.
  • diagnostic marker for RA disease of the present invention include oligos or polynucleotides containing the following base sequences:
  • An oligo or polynucleotide tide having a base length in the range of 51 to 601 and containing at least the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 across SNP440 (base G or C) ,
  • An oligo or polynucleotide tide having a base length of 51 to 601 containing at least the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 across SNP441 (base C or T) ,
  • An oligo or polynucleotide tide having a base length in the range of 51 to 601, comprising at least the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6 across SNP442 (base C or T) ,
  • An oligo or polynucleotide tide having a base length of 51 to 601 containing at least the base sequence of SEQ ID NO: 7 and the base sequence of SEQ ID NO: 8 across SNP443 (base A or T) ,
  • An oligo or polynuclear tide containing a base length of 51 to 601 containing at least the base sequence of SEQ ID NO: 9 and the base sequence of SEQ ID NO: 10 across SNP445 (base A or G) ,
  • Oligos or polynucleotides (DNA fragments) specified by these base sequences are genetic predisposition markers that define susceptibility (susceptibility, resistance) to rheumatoid arthritis. Therefore, by detecting a gene containing the marker, a genetic predisposition for rheumatoid arthritis in a subject can be examined and diagnosed. In this sense, the oligo or polynucleotide can be defined and used as a diagnostic marker for RA disease.
  • the present invention also provides a method for detecting a risk of developing rheumatoid arthritis (RA) in a subject (whether it is easy to develop or difficult to develop rheumatoid arthritis).
  • the method for detecting a risk of RA according to the present invention is selected from the bases described in the following (2) and the bases described in (1) and (5) to (5) for genomic DNA from which subject power is also obtained. It has a step of detecting and identifying at least one base.
  • RA disease-susceptible SNPs present in LD block 4 (positions 393668 to 681164 in the base sequence of the human SEC8L1 gene).
  • the combination of the base (SNP) to be detected and identified here is the base (SNP441) of (2) and any one base selected from (1) and (5) to (SNP440, Combinations with SNP445, SNP447, SNP44 9) are sufficient, for example, combination of base (2) (SNP441) and base (1) (SNP440), base (2) (SNP441) and (5) Combination of base (SNP445), (2) base (SNP441) and (6) base (SNP447), (2) base (SNP441) and (7) base (SNP449) Can be mentioned. It is not necessary to have one SNP to be combined with the base of (2) (SNP441) (1) and (5)-) force, but any two or three selected Or all four of (1) and (5) ⁇ )! / ⁇ .
  • the detection method of the present invention is directed to genomic DNA from which human subject force is also obtained, and (2) base (SNP441) and (1) and (5) to at least one force selected.
  • This method comprises a step of detecting and identifying a base (SNP440, SNP445, SNP447, SNP449) [step (A)].
  • the method further comprises the step (A) detected and identified in step (A) (SNP441), and (1) and (5)-) at least one selected base satisfies the following conditions:
  • Base (2) (SNP441): cytosine
  • the method of the present invention is a method for detecting the risk of rheumatoid arthritis.
  • the specimen from which genomic DNA is extracted includes all cells (including cultured cells, excluding germ cells), tissues (including cultured tissues), organs, and animals isolated from subjects and clinical specimens.
  • body fluids eg saliva, lymph, airway mucosa, semen, sweat, urine, etc.
  • leukocytes or mononuclear cells separated from peripheral blood are preferred, and leukocytes are most preferred. These materials are usually used in clinical tests Can be isolated according to
  • leukocytes when leukocytes are used as a material, leukocytes are first separated according to a normal method of peripheral blood force isolated from a subject. Next, proteinase K and sodium dodecyl sulfate (SDS) are added to the obtained white blood cells to degrade and denature the protein, and then the genomic DNA (including RNA) is extracted by phenol phenol extraction. obtain. RNA can be removed with RNase if necessary. Incidentally, extraction of the genomic DNA is not limited to the above method, methods well known in the art (e.g., Sambrook J. et al,.. "Molecular Cloning:. A Laboratry Manual (2 nd Ed)" Cold Spring Harbor Laboratory, NY) or a DNA extraction kit sold by the company.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • DNA containing the SE C8L1 gene on human chromosome 7 or its LD block 4 can be isolated by PCR or the like using genomic DNA as a trapezoid using a primer that hybridizes to the SEV8L1 gene or its LD block 4.
  • an RA-sensitive SNP that is highly related to rheumatoid arthritis is detected from the extract containing human genomic DNA obtained as described above.
  • the base is detected by directly determining the nucleotide sequence in the SEC8L1 gene, preferably LD block 4, on the human seventh chromosome further isolated from a sample containing human genomic DNA, and located in each block.
  • a method for examining mutations in the bases of various SNPs may be used.
  • a restriction enzyme cleavage pattern is used as a method for detecting the target base.
  • the method of genotype determination (hereinafter referred to as “RFLP”) using the difference between the above and the method based on hybridization using polymorphism-specific probes (for example, on a glass slide or nylon membrane) Determine the type of polymorphism by attaching a specific probe to the probe and detecting the difference in hybridization intensity for those probes, or the hybridization efficiency of a specific probe.
  • a method to identify the genotype by detecting the amount of probe that degrades polymerase during vertical double-strand amplification, and the temperature of fluorescence emitted by certain double-strand-specific fluorescent dyes. By detecting the temperature difference in double-strand melting by tracking changes, this method identifies the polymorphism, and complementary sequences are attached to both ends of the polymorphic site-specific oligoprobe. The method of identifying the genotype by using the difference between the secondary structure and the hybridizing to the target region.
  • a type-specific primer is also subjected to a base extension reaction with a polymer, and the bases incorporated into the polymorphic site at that time are identified (using dideoxynucleotides, each of which is fluorescently labeled).
  • a method for detecting each fluorescence a method for detecting incorporated dioxynucleotide by mass spectrometry, and a base pair or non-pair complementary to the mutation site following the type-specific primer.
  • a method for detecting incorporated dioxynucleotide by mass spectrometry and a base pair or non-pair complementary to the mutation site following the type-specific primer.
  • the above are representative gene polymorphism detection methods.
  • the determination of RA risk of the present invention is not limited to these, and other known or future developed gene polymorphism detection methods are widely used. be able to.
  • these gene polymorphism detection methods may be used alone or in combination of two or more.
  • the present invention is extremely useful as a test method for preventing the onset of RA, and further as a test method for preventing the occurrence of other diseases and symptoms associated with RA.
  • oligo- or polynucleotide containing RA-sensitive SNP on the SEC8L1 gene of human chromosome 7 specifically hybridize to the oligo- or polynucleotide containing RA-sensitive SNP on the SEC8L1 gene of human chromosome 7 and detect the SNP.
  • Oligonucleotides that can be used are used. Strong oligonucleotides are 16 to 500 bases long, preferably 20 to 200 bases long, more preferably 20 to 50 bases long, each containing individual SNPs (SNP440, SNP441, SNP445, SNP447, SNP449) on the SEC8L1 gene. It is usually designed as an oligo or polynucleotide having a length of 16 to 500 bases so as to specifically hybridize with a continuous gene region.
  • oligo or polynucleotide preferably has a base sequence complementary to the base sequence of the gene region containing the SNP to be detected, but there is a strong specific hybridization. If possible, they need not be completely complementary.
  • the powerful oligo or polynucleotide the following (1), (2), and (5)-) at least one oligo or polynucleotide selected as a powerful group force (provided that the oligo or polynucleotide is selected)
  • the base symbol “t” in the sequence listing shall be read as “u”), and a continuous oligo- or polynucleotide having a length of 16 to 500 bases may be mentioned [hereinafter these The oligos or polynucleotides correspond to the oligos or polynucleotides to be hybridized ((1), (2) and (5) to)), (), (2 ') and (5') to ' ) May be indicated).
  • the oligo or polynucleotide is an RA-receptive SNP (S NP440, SNP441, SNP445, SNP447, SNP449) located on the SEC8L1 gene on human chromosome 7 to determine the susceptibility to rheumatoid arthritis in a subject.
  • S NP440, SNP441, SNP445, SNP447, SNP449 located on the SEC8L1 gene on human chromosome 7 to determine the susceptibility to rheumatoid arthritis in a subject.
  • oligo or polynucleotide “probes” that specifically hybridize to oligos or polynucleotides containing.
  • These oligos or polynucleotides are based on the nucleotide sequence of the SEC8L1 gene. For example, it can be prepared by a conventional method using a commercially available nucleotide synthesizer.
  • a probe suitable for use in the detection of the risk of developing rheumatoid arthritis is selected from the probe consisting of the above-mentioned (2) oligo or polynucleotide, and (5) and (5) to ') above.
  • the combination of probes is selected from (2 ') and () and (5' to ')! Any combination of probes may be used, for example (2, ) Probe and (1) probe, (2) probe and (5) probe combination, (2) probe and (6) probe combination, A combination of the probe (2) and the probe (7) can be mentioned.
  • the probe to be combined with the probe (2 ') need not be one (1') and any two or three selected from (5'to (') Moyo! /, Or, or all four of (1,) and (5, ⁇ ,)! / ⁇ .
  • the probe is a radioactive substance, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or an enzyme so that an oligo or a polynucleotide containing each of the SNPs (SNP440, SNP441, SNP445, SNP447, SNP449) can be detected. Etc. (described later).
  • the probe can be used by being immobilized on an arbitrary solid phase.
  • the present invention also provides the probe (oligo or polynucleotide) as an immobilized probe (for example, a gene chip on which the probe is immobilized, a cDNA microarray, an oligo DNA array, a membrane filter, etc.).
  • the probe can be preferably used as a DNA chip for detecting an RA-sensitive gene.
  • the solid phase used for immobilization is not particularly limited as long as it can immobilize oligos or polynucleotides.
  • glass plate, nylon membrane, microbead, silicon chip, capillary or Other substrates can be mentioned.
  • Immobilization of an oligo or polynucleotide to a solid phase is a method of placing a pre-synthesized oligo or polynucleotide on the solid phase, or a method of synthesizing the target oligo or polynucleotide on the solid phase. Also good.
  • the immobilization method is well known in the art depending on the type of immobilization probe, for example, using a commercially available spotter (such as Amersham) in the case of a DNA microarray [for example, photolithographic technology (Aifymetrix) In situ synthesis of oligonucleotides using inkjet technology (Rosetta Inpharmatics)) [0062]
  • a commercially available spotter such as Amersham
  • a DNA microarray for example, photolithographic technology (Aifymetrix) In situ synthesis of oligonucleotides using inkjet technology (Rosetta Inpharmatics)
  • a DNA microarray for example, photolithographic technology (Aifymetrix) In situ synthesis of oligonucleotides using inkjet technology (Rosetta Inpharmatics)
  • a DNA microarray for example, photolithographic technology (Aifymetrix) In situ synthesis of oligonucleotides using inkjet technology (Rosetta Inpharmatics)
  • This probe is labeled with a fluorescent dye at the 5 'end and a quenching substance at the 3' end, and does not emit light as it is, but it is an extension reaction of the upstream force of a separately added PCR primer. As a result, the 5 'fluorescent dye bond is cleaved and detected by the released fluorescent dye.
  • the present invention also provides an oligonucleotide used as a primer for specifically amplifying a sequence region containing an RA-sensitive SNP on the SEC8L1 gene of human chromosome 7.
  • oligonucleotide As a powerful oligonucleotide, the following (1), (2) and (5)-) powerful group force selected at least one oligo or polynucleotide (provided that the oligo or polynucleotide is RNA)
  • the base symbol “t” in the sequence listing shall be read as “u”)
  • oligonucleotides having a length of 15 to 30 bases may be mentioned (hereinafter, these oligonucleotides are to be hybridized.
  • Corresponding to oligo or polynucleotides ((1), (2) and (5) to)) may also be indicated as (1 "), (2") and (5 ") to”)].
  • nucleotide sequence of the human SEC8L1 gene the nucleotide located at position 476136 (SNP445)
  • SNP445 A continuous oligo or polynucleotide of 16 bases or more in length, including
  • such an oligonucleotide specifically hybridizes to a part of a continuous oligo or polynucleotide containing RA-sensitive SNP bases (nucleotides) and specifically identifies the oligo or polynucleotide. It is designed as an oligonucleotide having a length of 15 to 30 bases, preferably about 18 to 25 bases for amplification.
  • the length of the oligonucleotide or polynucleotide to be amplified is appropriately set depending on the detection method used, but is generally 15 to 1000 bases, preferably 20 to 500 bases, more preferably 20 to 200 salts. It is the director.
  • a suitable primer for use in the detection of the risk of developing rheumatoid arthritis is selected from the primer having the oligonucleotide power of (2 ") and the above ( ⁇ ) and (5") to “).
  • a combination of a primer of (2 ") and a primer of ( ⁇ ) a primer of ( ⁇ )
  • a combination of a primer of (2") and a primer of (5 "). (2 ") primer and (6") primer combination, (2 ") primer and (7") primer combination. It is not necessary to combine one primer with the other primer ( ⁇ ) Beauty (5 ") ⁇ ") forces also may be among any two or three selected, or (gamma) and (5 ") ⁇ ") may be all four
  • the above has a base sequence that specifically hybridizes to a base sequence of 15 or more bases in the vicinity of various RA-sensitive SNPs (SNP440, SNP441, SNP445, SNP447, SNP449) on the SEC8L1 gene of human chromosome 7.
  • SNP440, SNP441, SNP445, SNP447, SNP449 various RA-sensitive SNPs
  • SNP441, SNP445, SNP447, SNP449 on the SEC8L1 gene of human chromosome 7.
  • These various oligonucleotides can be used as a primer in the present invention.
  • These oligonucleotides are based on the base sequence of the SEC8L1 gene, for example, using a commercially available nucleotide synthesizer according to a conventional method. Can be created.
  • a method applying MALDI-TOFZMS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of- Flight Mass Spectrometry) to the Mass Array method [Haff LA et al. Genome Res 7, 378 (1997), Little DP et al. , Nature Medicine vol.3, No.12, 1413-1416, (1997)], a specific method for using primers will be described.
  • the primer is hybridized to the sample DNA fixed on the silicon chip, and ddNTP is added to extend only one base. The single base extension product is then separated and the polymorphism is detected by mass spectrometry.
  • primers should be designed to be as short as possible, usually 15 bases or longer.
  • the probe or primer of the present invention includes a suitable label for detecting a gene polymorphism, for example, a fluorescent dye, an enzyme, a protein, a radioisotope, a chemiluminescent substance, a pyotine and the like added thereto.
  • a suitable label for detecting a gene polymorphism for example, a fluorescent dye, an enzyme, a protein, a radioisotope, a chemiluminescent substance, a pyotine and the like added thereto.
  • the fluorescent dye used in the present invention those generally labeled with nucleotides and used for detection and quantification of nucleic acids can be suitably used.
  • HEX 4,7,2 ', 4, 5, 7-hexachloro-6-carboxyfluorescein, green light, fluorescein, NED (trade name, Applied Fluorescent Systems, yellow fluorescent dye), or 6-FAM (trade name, Applied Biosystems)
  • TMR tetramethylrhodamine
  • any suitable labeling method can be used [see Nature Biotechnology, 14, 303-3 08 (1996)], and commercially available fluorescent labeling kits can also be used (for example, Amashi Cham Fanolemasia, Oligonucleotide ECL 3, one oligo labeling system, etc.).
  • the primer of the present invention includes a primer having a linker sequence for detecting a polymorphism at its end.
  • a linker sequence for detecting a polymorphism at its end.
  • a linker sequence include a flap (a sequence completely unrelated to the sequence near the polymorphism) added to the 5 ′ end of the oligonucleotide used in the above-described invader method. .
  • the above-mentioned probe or primer (labeled or may be) is used to detect the risk of developing RA. It can be used as a reagent for delivery.
  • the present invention also provides the reagent for detecting the risk of RA disease as a kit.
  • the kit contains at least one oligo or polynucleotide used as the probe or primer (which may be labeled or immobilized on a solid phase).
  • the kit of the present invention may contain other reagents necessary for carrying out the method of the present invention, such as hybridization reagents, probe labels, label detection agents, buffer solutions, etc. It may contain reagents and instruments as appropriate.
  • RA patients rheumatoid arthritis patients
  • 806 were non-rheumatoid arthritis patients (healthy controls) (189 men and 617 people) Women).
  • All RA patients have ACR diagnostic criteria (Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, et al.
  • the American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; J 1: 315-24), who has passed at least 3 years since onset.
  • RA type is classified by Ochi et al. (Ochi T, Iwase R, Yonemasu K, Matsukawa M, Yoneda M, Yukiok a M, et al. Natural course of joint destruction and fluctuation of serum Clq levels in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31: 37—43)
  • Age at sample collection SD was 61.9 ⁇ 12.2 years for RA patients and 38.8 ⁇ 1 5.4 years for healthy controls.
  • association test for SNP allele frequency was performed by creating a 2X2 contingency table and performing a chi-square test.
  • the chi-square test for the frequency of the norotype using the permutation method was performed using SNPAlyze ver.3.2 Pro (DYNACOM, Japan).
  • the degree of pairwise linkage disequilibrium was evaluated by calculating the linkage disequilibrium coefficient (
  • SNPs that exist in the gene region from 10 kb upstream from the transcription start point to 10 kb downstream of the stop codon, and are arranged at evenly spaced intervals (10 to 20 kb) as much as possible.
  • TaqMan system was created for the extracted 728SNP.
  • TaqMan probes and primer sets were created using Primer Express from Applied Biosystems. Genotyping was performed in a reaction system (4 ⁇ l) using TaqMan Universal Master Mix or QuantiTect Prove PCR Kit, 5 ng DNA, 450 nM primer, and 100 nM probe. PCR is carried out using a thermal cycler (ABI GeneAmp PCR System 9700) for 40 cycles of enzyme activation at 95 ° C for 10 minutes, then at 92 ° C or 94 ° C for 15 seconds and at 60 ° C for 1 minute. I went. I don't know the genotype on a 384-well plate!
  • Hardy ⁇ Weinberg equilibrium at each SNP was also examined by% square test (Nielsen DM, Ehm MG, Weir BS. Detecting marker-disease association by testing for Hardy— Weinberg disequilibrium at a marker locus. Am J Hum Genet 1998; 63: 1531-40). The SNP was excluded from the analysis because the minor allele frequency was less than 15%, the typing success rate was less than 97%, and the Hardy–Weinberg equilibrium was not established in the control sample. Linkage disequilibrium and phase estimation in the candidate region used the genotype of 380 healthy control samples from the first stage. Pair-wise linkage disequilibrium is determined by haplotype frequency AB as XA and B allele frequency as p and q, respectively.
  • the power using the Genetic Power Calculator was 380 RA patients and healthy controls, with genotype relative risks of f / f and f / f of 1.2 and 1.5, respectively.
  • the population risk of SNP441 is 40% when the allele frequency is 0.57, and the geno type risk ratio is 1.075 for C / T and r for C / C. 1.708 and
  • the SNP441 was located at a position of 3.9 Mb from the marker D7S2560 that peaked in the affected sibling pair analysis. This means that there was no contradiction between the results of the linkage disequilibrium analysis using the sporadic sample and the results of the affected sibling pair analysis using the family sample. To do.
  • Table 2 shows the results of association analysis for SNPs present in the SEC8L1 gene.
  • ⁇ SNPs are indicated by dbSNP CekraCVID
  • ⁇ Ncleid Chid fiR is based on UCSC Genome Bioinfomatics Site ⁇ hdp; /genome.ucsc.edu
  • SNP441, 442, 443, and 445 which showed significant differences in RA patients above, are introns of SEC8L1 gene, V, which is also a component of the exocyst complex. In the 82 kb region. SNP449 to SNP455 and SNP in SEC8L1 gene The 12SNPs from 457 to SNP461 showed a significant difference in the analysis that integrated the results of the first and second stages, which were not significantly different in the second stage analysis. SNP444, 446 and 456 showed a significant difference in the first stage, so the second stage analysis was performed, but since the Hardy-Weinberg equilibrium in the integrated results was not established, only the results of the first stage were described. Excluded from linkage disequilibrium analysis.
  • the SEC8L1 gene is an 800 kb gene composed of 18 exons. Previous studies have shown that polymorphisms that occur frequently have linkage disequilibrium between SNPs ranging from 10 to 60 kb and possibly several hundred kb. In order to prove that this correlation is due to the SEC8L1 gene itself, the linkage disequilibrium pattern of the region including the two genes before and after the SEC8L1 gene (CHCHD3 gene, FLJ32786 gene) was evaluated. As a result, six linkage disequilibrium blocks were identified based on
  • haplotypes were analyzed.
  • Block 4 had 22 SNPs in force 3 SNP (SNP44 4, 446, 456) were excluded from the analysis for the above reasons.
  • SNP44 4, 446, 456 were excluded from the analysis for the above reasons.
  • 19SNPs present in the remaining block 4 those with linkage disequilibrium of r 2 > 0.9 were classified into 5 groups.
  • a haplotype was constructed by selecting 1 SNP from each group (SNP440, 441, 445, 447, 449).
  • SNP440 and 447 were subjected to the second stage typing! /, And the second stage analysis was performed for the force haplotype analysis that did not exist.
  • Table 4 four frequent haplotypes (haplotypes 1 to 4) were identified.
  • RNA from synovial fibroblasts FLS
  • RNA from other tissues was prepared using the Human Total TNA Master Panel II Kit.
  • the prepared RNA was reverse-transcribed using oligo dT primer and Superscript II, and quantified by real-time PCR using SEC8L1 gene and 13-actin TaqMan Assays on Demand as a control.
  • SEC8L1 synovial fibroblasts
  • SEC8L1 was expressed ubiquitously in normal tissues of healthy controls, particularly high in skeletal muscle. In RA patients, S EC8L1 was moderately expressed in cultured synovial fibroblasts. Synovial fibroblasts are known to release MMPs (enzymes that break down articular cartilage) by inflammatory site forces such as TNF-a, which are also released by macrophages, and are deeply involved in the pathogenesis. It is a cell that is considered.
  • MMPs enzyme that break down articular cartilage
  • lymphocytes were separated using the autoMACS TM (automatic magnetic separation) system. T cells were isolated using a pan T cell isolation kit (a kit that excludes cells other than Tcell, manufactured by Miltenyi). The purity of each obtained lymphocyte population was evaluated by FACS analysis. As a result, all of the cell populations were 80% or higher in purity.
  • the rod-shaped cells were cultured for 7 days in a GM-CSF (20 ng / ml) environment using a bone marrow cell population derived from the limb of the mouse (line; BALB / c) as the starting material. After culturing, the cells were similarly separated by autoMACS TM using a magnetic bead-bound antibody against CD 11c, a specific marker molecule for rod cells.
  • RNeasy micro kit manufactured by Qiagen
  • RT-PCR "superscript first-strand synthesis for RT-PCR” (Miltenyi) and the following primers were used for the preparation of cDNA by RT-PCR.
  • primer-2 (designed to detect intron 14 of mouse SEC8L1 gene) (i) Forward primer: 5,-CTTCATAAGGGCAGCCTTTG-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • any lymphoid cells (B cells, macrophages, T cells, NK cells and rod cells (DC)) were confirmed to express SEC8L1.
  • the detection results by Primer-l showed that T cells were highly expressed compared to other lymphoid cells, followed by high expression in rod cells (DC), macrophages, and B cells.
  • the expression of SEC8L 1 was also observed in T cells, although it was high in some cases.
  • T cells are CD4 positive cells and are often differentiated into Th 1 cells that induce cellular immunity.
  • IFN- ⁇ and IL-17 The cytodynamic ins released by these are IFN- ⁇ and IL-17, which are suggested to act on macrophages and synovial fibroblasts. It has also been reported to release cartilage destruction and synovial inflammation by releasing inflammatory site forces such as TNF- «and IL-1 (Lubberts, E. et al. IL-17 promotes bone erosion in murine colia gen-induced arthritis through loss of the receptor activator of NF—kB ligand / osteoprotegerin balance. J. Immunol. 170: 2655—2662 (2003)).
  • T cells and macrophages produce and secrete RANKL (Recptor Activator of NF-kB Ligand), an osteoclast activator, and induce bone destruction
  • RANKL Recptor Activator of NF-kB Ligand
  • osteoclast activator an osteoclast activator
  • SEC8 LI is a subunit of the Exocyst Complex, and is mainly involved in vesicle transport. It is anchored when the vesicle and the cell membrane are bound (the vesicle is temporarily connected to the cell membrane).
  • FIG. A is a diagram showing a pairwise linkage disequilibrium among SNPs of 380 healthy Japanese controls using
  • Figure B shows -log (P value) and physical position of case control related analysis
  • FIG. 1 A comparison of the positions is shown.
  • the arrow indicates the physical position of SNP441, which showed the strongest significant difference.
  • Figure C shows the genomic structure around the SEC8L1 gene and the positional relationship between the six linkage disequilibrium blocks.
  • the vertical line shows the exon of the SEC8L1 gene.
  • FIG. 2 shows the expression pattern of the SEC8L1 gene in human tissues with respect to the expression in the bone marrow. This is the result of standardizing the expression level of SEC8L1 with the expression level of
  • FLSJ means synovial fibroblasts.
  • FIG. 3 shows the expression of SEC8L1 in lymphocytes derived from living cells collected from mouse spleen and bone marrow (Bsa3 ⁇ 4ou, macrophage, T cell, NK cell, rod-shaped cell (DC)). Expression was confirmed in all cells.
  • the detection results with Primer-1 showed that T cells were highly expressed compared to other lymphocytes, followed by high expression in rod cells, macrophages, and B cells.
  • Primer-2 also showed high SEC8L1 expression in T cells, albeit slightly.

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Abstract

　本発明は日本人における関節リウマチ感受性遺伝子を提供し、かつ関節リウマチの発症リスクを検出し判定する方法を提供する。また本発明はこの検出方法の実施にあたり有効に使用することができる関節リウマチ易罹患性診断マーカー、プローブ、プライマー並びに試薬キットを提供する。本発明は、関節リウマチ感受性遺伝子としてSEC8L1遺伝子を、また関節リウマチ感受性ＳＮＰとして、SNP440、SNP441、SNP442、SNP443、SNP445、SNP447およびSNP449（LDブロック4に存在）を提供する。さらに、関節リウマチの罹患リスクを検出する方法として、ヒト被験者から得られるゲノムDNAを対象として、上記各ブロックから選択されるSNP441と他のSNP（SNP440、SNP445、SNP447およびSNP449）から選ばれる少なくとも１つのSNPを検出し同定する工程を含む方法を提供する。

Description

明 細 書
関節リウマチ罹患リスクの測定方法
技術分野
[0001] 本発明は、関節リウマチ罹患の危険度を測定し判定する方法に関する。より詳細に は、当該方法は、ヒトゲノム DNAを含む試料から関節リウマチ罹患に関連した SNPs (単一塩基多型)、特にハプロタイプを検出することにより、該試料提供者 (被験者)が 関節リウマチに罹患する潜在的な危険度を有するか否かを検出し、判定する方法で ある。
[0002] さらに本発明は、力かる検出方法の実施にあたり有効に使用することができる関節 リウマチ罹患診断マーカー、プローブ、プライマー並びに試薬キットに関する。
背景技術
[0003] 関節リウマチ（rheumatoid arthritis：以下、単に「RA」とも!/、う）は、最も頻度の高!ヽ自 己免疫疾患のひとつであり、その有病率は世界中でほぼ均一で 0.3%〜1%であるとい われている (非特許文献 1)。滑膜の慢性炎症とそれに引き続く関節破壊が主徴であ る。関節リウマチの詳細な病態は解明されていないが、家系研究、双生児研究より遺 伝的要因と環境要因 (感染、ホルモン、妊娠等)がともに関与することが示唆されてい る (非特許文献 2および 3)。 HLA領域と RAの相関は以前より知られており、特にシェア 一ドエピトープをコードする複数の HLA-DRB1のアレルは疾患のリスクや重症度に関 与することが知られて 、た (非特許文献 4)。し力し HLAだけでは RAの遺伝的要因の 1 /3程度しか説明がつかず (非特許文献 5)、 HLA以外の複数の遺伝子が RAの発症に 関与していることが予想される。 TNF o;、 CTLA-4、サイト力イン関連遺伝子等の候補 遺伝子の関与が調査されてきたが、その結果は一貫していない (非特許文献 6)。 RA 家系を用いたゲノムワイドの連鎖解析が少なくとも 4つのグループより報告されており（ 非特許文献 7〜12)、いくつかの HLA以外の領域が複数の研究で同定されているが 、 HLA以外で共通した領域は同定されていない。
[0004] 一般に関節リウマチのような多因子疾患では、連鎖解析だけでは感受性遺伝子を 同定するのに十分な結果は得られず、 SNPを用い連鎖不平衡解析による当該領域 の詳細な解析が必要である。実際このような方法で 2型糖尿病、クローン病などと言つ た多因子疾患の関連遺伝子が同定され始めている (非特許文献 13〜15)。関節リウ マチでは PADI4遺伝子内のハプロタイプと日本人 RAの関連が報告されている (非特 許文献 16)。 PADI4は 1番染色体 q36に位置しこれまで 2つの研究で候補領域であると 報告されている (非特許文献 7および 8)。また最近、同じグループが SLC22A4遺伝子 内の RANX1結合領域にある SNPと RAの関連を同定している (非特許文献 17)。
し力しながら、前述するように、 RAは遺伝的要因と環境的要因とが共に関与して発 症に 、たる多因子疾患であるため、一遺伝子の変異や異常だけ力 その罹患リスク を判断することは困難であり、さらなる検討が求められている。
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非特許文献 lb : Suzuki A, Yamada R, Chang X, Tokuhiro S, Sawada T, Suzuki M, et al. Functional haplotypes of PAD 14, encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4, are associated with rheumatoid arthritis. Nat Genet 2003 ;34: 395— 402. 非特言午文献 17 : Tokuhiro S, Yamada R, Chang X, Suzuki A, Kochi Y， Sawada T, et a 1. An intronic SNP in a RUNX1 binding site of SLC22A4, encoding an organic cation transporter, is associated with rheumatoid arthritis. Nat Genet 2003;35:341-8. 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、個々の被験者について関節リウマチの罹患リスクを判定するため の方法を提供することである。さらに本発明の目的は、当該方法を簡便に実施するた めに有用な試薬および試薬キットを提供することである。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、 日本人集団を対象として、関節リウマチ (RA)の発症に関与する R A感受性遺伝子および遺伝子多型を見いだすことを目的として、かねてより複数の人 種間で繰り返して連鎖が報告されてきた領域 (第 7染色体長腕 31-34 : 7q31-34) (Tak euchi F, Moritani M, Nabeta H, Mori M, Goto M, Hanyu T, et al. Nine Japanese RA susceptibility genes areas, TIRA1— 9, by preliminaly genome-wide screening.: 10th Asia PasificLeague of Associations for Rheumatology Congress. Bangkok, Thailand, 2002 Dec 1-6)を候補領域として選択し、関節リウマチ患者と対照者 (健常者)との間 (ケースコントロール間）で大規模な関連解析および連鎖不平衡解析を行ったところ、 当該ヒト第 7染色体 (7q31-34)に存在する SEC8L1遺伝子が RAの疾患感受性候補遺 伝子であることを見出し、さらに、当該遺伝子のイントロン 10の中にケースコントロール 間でアレル頻度に有意差を認める特定の遺伝子多型 (SNP441)が存在しており、当 該 SNP441およびこれを含むハプロタイプが関節リウマチの感受性を規定するうえで 重要であることを見出した。
[0008] そして、個々の被験者について当該 SEC8L1遺伝子の遺伝子多型（SNP441)およ びこれを含むハプロタイプを検出することにより、当該被験者について関節リウマチを 発症する潜在的な危険度が、高い確率で検出できることを見いだし、本発明を完成 するにいたつた。
[0009] すなわち、本発明は下記の発明を提供するものである： ( 1)関節リウマチの罹患診断マーカー
項 1.下記の (1)〜 )力もなる群力 選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌク レオチドからなる、関節リウマチの罹患診断マーカー：
(1)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 379258位（SNP440)に位置する Gまた は Cを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(2)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 393668位（SNP441)に位置する Cまた は Tを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(3)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 405691位（SNP442)に位置する Cまた は Tを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(4)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 411544位（SNP443)に位置する Aまた は Tを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(5)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 476136位（SNP445)に位置する Aまた は Gを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(6)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 569133位（SNP447)に位置する Aまた は Gを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(7)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 628601位（SNP449)に位置する Tまた は Cを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド。
(2)関節リウマチの罹患リスクを検出する方法
項 2. (A)ヒト被験者力も得られるゲノム DNAを対象として、下記 (2)に記載する塩基 と、（1)及び (5)〜 )に記載する塩基の中から選択される少なくとも 1つの塩基とを検出 し同定する工程を含む、当該被験者について関節リウマチの罹患リスクを検出する 方法：
(1)ヒト SEC8L1遺伝子の 379258位（SNP440)の塩基
(2)ヒト SEC8L1遺伝子の 393668位（SNP441)の塩基
(5)ヒト SEC8L1遺伝子の 476136位（SNP445)の塩基
(6)ヒト SEC8L1遺伝子の 569133位（SNP447)の塩基
(7)ヒト SEC8L1遺伝子の 628601位（SNP449)の塩基
項 3. (B)上記工程 (A)で検出し同定した (2)の塩基 (SNP441)がシトシンであり、かつ (1)及び (5)〜 )に記載する塩基（SNP440、 SNP445、 SNP447, SNP449)から選択され る少なくとも 1つの塩基が、下記の条件：
(1)の塩基（SNP440)：グァニン
(5)の塩基（SNP445)：グァニン
(6)の塩基（SNP447)：グァニン
(7)の塩基（SNP449)：シトシン
を満たしている場合に、当該被験者が関節リウマチ易罹患性であると判定する工程 を有する、項 2に記載する関節リウマチの罹患リスクを検出する方法。
(3)関節リウマチの罹患リスク検出用試薬または試薬キット
項 4.下記の (2)のオリゴまたはポリヌクレオチド (但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオ チドが RNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする。以 下同じ）にハイブリダィズする 15〜30塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物と 、（1)および (5)〜 )力 なる群力も選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレ ォチドにハイブリダィズする 15〜30塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物との 組み合わせ力もなる、関節リウマチ罹患リスクを検出するために用いられるプライマー セット：
(1)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 379258位（SN440)に位置するヌクレオ チドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 393668位（SN441)に位置するヌクレオ チドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 476136位（SN445)に位置するヌクレオ チドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 569133位（SN447)に位置するヌクレオ チドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 628601位（SN449)に位置するヌクレオ チドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
項 5.下記の (2)のオリゴまたはポリヌクレオチド (但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオ チドが RNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする。以 下、同じ）にハイブリダィズする 16〜500塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識 物と、（1)および (5)〜 )力 なる群力 選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌ クレオチドにハイブリダィズする 16〜500塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識 物との組み合わせ力もなる、関節リウマチ罹患リスクを検出するために用いられるプロ ーブセット：
(1)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 379258位（SN440)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 393668位（SN441)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 476136位（SN445)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 569133位（SN447)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 628601位（SN449)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
項 6. 各オリゴヌクレオチドまたはその標識物が任意の固相に固定してなる固相化プ ローブである項 5に記載するプローブセット。
項 7.項 4に記載するプライマーセット、または Z及び、項 5若しくは 6に記載するプロ ーブセットを含む、関節リウマチ罹患リスク検出用試薬、または当該試薬を含むキット 発明の効果 [0012] 本発明によれば、関節リウマチ (RA)を発症する相対的な危険度を簡便に検出す ることができる。本発明の検出方法は、 in vitroでし力も医師等の専門的な知識を要 することなく簡単に実施することができる方法である。本発明の検出方法によって RA を発症する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その 旨を告知し、予め RAの発症を防ぐ力、または少しでも遅延させるための的確な対策 を講じることができる。従って、本発明は、 RAの発症を予防するための、または RA発 症を遅延させるための検査方法として極めて有用である。さらに本発明は上記検出 法において使用される試薬を提供するものであり、これにより上記方法を簡便に実施 することが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 1.本発明で使用する用語の定義
本明細書における塩基配列 (ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、 I UPAC— IUBの規定〔IUPAc- IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製の ためのガイドライン」（特許庁編)及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
[0014] 本明細書中において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノム DNAを含む 2本 鎖 DNA、及び 1本鎖 DNA (センス鎖）、並びに当該センス鎖と相補的な配列を有す る 1本鎖 DNA (アンチセンス鎖）、及びそれらの断片のいずれもが含まれる、また、本 明細書で「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、ェクソン、及び イントロンを区別することなく示すものとする。
[0015] また、本明細書中において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオ チド」は、核酸と同義であって、 DNAおよび RNAの両方を含むものとする。また、こ れらは 2本鎖であっても 1本鎖であってもよぐある配列を有する「ヌクレオチド」（また は「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これ に相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレ ォチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌタレ ォチド」及び「ポリヌクレオチド」）が RNAである場合、配列表に示される塩基記号「T」 は「U」と読み替えられるものとする。 [0016] 本明細書において「遺伝子多型」とは、 2つ以上の遺伝的に決定された対立遺伝 子がある場合にそれらの対立遺伝子を指す。具体的には、ヒトの集団において、ある 一個体のゲノム配列を基準として、他の 1または複数の個体ゲノム中の特定部位に、 1又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転移、逆位などの変異が存在すると き、その変異が当該 1または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計学的に 確実か、または当該個体内特異変異でなぐ 1 %以上の頻度で集団内に存在するこ とが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。本明細書で用いる「 遺伝子多型」の意味には、単一のヌクレオチドの変化によって引き起こされる多型で ある!/、わゆる 1塩基多型 [Single Nucleotide Polymorphism： SNP (又は SNPs)〕と連 続した複数ヌクレオチドにわたる多型の両方が含まれる。「一塩基多型」とは、単一の 核酸の変化によって引き起こされる多型である。多型は選択された集団の 1%より大 きな頻度、好ましくは 10%以上の頻度で存在する。また「ノヽプロタイプ」とは、一つの アレル (ノ、プロイド）に存在する遺伝子変異の組み合わせを 、う。
[0017] 本明細書において「関節リウマチ感受性遺伝子」（RA感受性遺伝子）とは、多遺伝 子性疾患である関節リウマチ (RA)を発症しやす 、体質を決める遺伝子のことを!、う
[0018] また、本明細書にぉ 、て「アレル頻度」とは、一つの遺伝子の座位につ!、て、集団 中に存在する全遺伝子数のうち、その対立遺伝子が占める割合を!、う。
[0019] 本明細書において「連鎖不平衡」とは、集団における任意の対立遺伝子の組み合 わせの頻度について、偶然によって期待されるよりも、より頻繁に近傍の特定対立と 出現する関係のことをいう。例えば、遺伝子座 Xが対立遺伝子 a及び b (これらは等し V、頻度で存在する）を有し、近傍の遺伝子座 Yが対立遺伝子 c及び d (これらは等し い頻度で存在する）を有する場合、別の遺伝子多型の組み合わせであるハプロタイ プ acは、集団において 0.25の頻度で存在することが期待される。ハプロタイプ acがこ うした期待値よりも大きい場合、つまり acという特定の遺伝子型が頻繁に出現する場 合、対立遺伝子 acは連鎖不平衡にあるという。連鎖不平衡は、対立遺伝子の特定の 組み合わせの自然選択または集団に導入された時期が進化的にみて最近であるこ とによって生じたもので、連鎖する対立遺伝子同士が平衡に達していないことから生 じ得る。従って、民族や人種などのように、別の集団においては連鎖不平衡の様式 は異なり、ある集団において acが連鎖不平衡である場合でも、別の集団で adが連鎖 不平衡の関係である場合もある。連鎖不平衡における遺伝子多型の検出は、当該多 型そのものが直接疾患を引き起こさないにも拘わらず、疾患に対する感受性を検出 するのに有効である。例えば、ある遺伝子座 Xの対立遺伝子 aについて、それが疾患 の原因遺伝子要素ではないが、遺伝子座 Yの対立遺伝子 cとの連鎖不平衡により、 疾患感受性を示し得ることがある。
[0020] 本明細書にぉ 、て「連鎖不平衡解析」とは、ゲノム領域における連鎖不平衡の強さ の度合いを解析することをいう。例えば、連鎖不平衡解析は 2つのマーカー間での連 鎖不平衡の強さを示す連鎖不平衡係数 | D， |を健常者 (対照者)のタイピングデー タカも算出することで行うことができる。
[0021] 本明細書にぉ 、て「マイナーアレル」とは、一つの遺伝子の座位につ 、て 2つの対 立遺伝子が存在する場合にぉ ヽて、遺伝子頻度の低 ヽ対立遺伝子 (アレル)を！、う。
[0022] なお、本明細書に記載する各塩基番号は、 The National Center for Biotechnology Information data baseの位置情報に基づくものである。また、本明細書において「ヒト S EC8L1遺伝子の塩基配列中、 xxxx位」という場合の「xxxx位」というのは、ヒト SEC8L1 遺伝子の 132395078位の 1番目の塩基を 1としたときの位置情報を意味する。
[0023] 2. 閗節リウマチ感 件遣伝子
多因子疾患である関節リウマチ (RA)の遺伝的要因や環境因子を同定することは、 個々の因子が病因や病態に関与する度合いが少ないがゆえに困難である。均一に 配置された頻度の高い SNPを使用して、広範囲領域にわたってケースコントロール 関連解析を行うアプローチ (領域ワイドのケースコントロール関連解析）は、多因子疾 患である RAの疾患感受性遺伝子を同定するための効果的かつ強力なアプローチで ある。
[0024] そこで本発明者らは、日本人における RA感受性遺伝子を探索するために、第 7番 染色体の q31-34 (7q31-34)の領域を RAの感受性候補領域として選び、 gene-centri c evenly-spaced common SNP「遺伝子領域に均一に配置された頻度の高い一塩基 多型（SNP)」を用いて、領域ワイドのケースコントロール関連解析ならびに連鎖不平 衡（LD)マッピングを行うことにより、エクソシストコンプレックスの構成成分である SEC8 (蛋白質)をコードするヒト SEC8L1遺伝子が RAの感受性を規定する遺伝子であること を見出した。酵母では、この Sec8複合体は、ェクソサイト一シスに必要であり、ゴルジ 体からの分泌小胞の分泌への道標となる（35)。哺乳類のエクソシストも酵母のように ゴルジ体力も細胞膜への小胞の輸送に関わると考えられている（36)。当該ヒト SEC8L 1遺伝子は、ヒト第 7染色体のゲノム配列（Genbank Sequence Accession IDs: NC 000 007)中、塩基番号 132395078番〜 133207769番に位置する 812691 bpの遺伝子で ある ( ene Name: Homo sapiens gene exocyst complex component 4)。
[0025] なお本発明の RA感受性遺伝子の同定は、実施例に記載するように、具体的には 下記に説明する方法によって行われた。
[0026] RAの感受性候補領域として第 7番染色体の q31-34 (7q31-34)を選択し、その領域 内に等間隔に配置されたマイナーアレル頻度 15%以上の 728の SNPを用いて、 2段 階のケースコントロール関連解析を行った（関節リウマチ患者 380名 X 2、健常対照者 380名 X 2)。第 1段階の関連解析では 728の SNPのうち、 48の SNPが RAと有意な関連 を示し、続いて行った第 2段階めのケースコントロール関連解析では、 SEC8L1遺伝 子内の 4つの SNP(SNP441、 SNP442、 SNP443、 SNP445)が再現性をもって有意差を 示した（P〈0.05)。なかでも、 SNP441が P=0.000059と最も関節リウマチと強い相関を示 した。
[0027] これらの SEC8L1遺伝子内の SNPは、いずれも SEC8L1遺伝子内のイントロン 10に位 置し、保存された連鎖不平衡ブロック 4 (LDブロック 4)に存在していた。また、当該ブ ロック内に位置するほぼすベての SNP(SNP441-461)は、 RAと相関することが認めら れた。このことから、 RA感受性座位は SEC8L1遺伝子のイントロン 10〜13にわたる 300 kbの領域にある連鎖不平衡ブロック 4に存在することが明らかになった。なお、ここで 連鎖不平衡ブロック 4 (LDブロック 4)はヒト第 7染色体のゲノム配列中、塩基番号 132 747619番〜 133035115番（SEC8L1遺伝子の塩基配列中、 393668〜681164位に相 当する）に位置する領域である。 LDブロック 4には、図 1Bに示すように 21つの SNPが 存在している。当該ブロック内には SEC8L1遺伝子以外の遺伝子はなぐ観察された RAとの相関は、 SEC8L1遺伝子そのものに由来すると思われた。 [0028] 次 、で、連鎖不平衡ブロック 4 (LDブロック 4)に存在する SNPの相互関係を明らか にするために、当該ブロックから有意差を示した SNP (SNP440, SNP441, SNP445, S NP447, SNP449)を選択し、それぞれ SNP同士の遺伝子型の組み合わせの分布をケ ースコントロール間で比較した。その結果、 RA感受性ハプロタイプ（P=0.0015)と RA 抵抗性ハプロタイプ (P=0.0000062)が同定された。
[0029] 以上説明するように、上記ヒト第 7染色体 (7q31)に位置するヒト SEC8L1遺伝子の塩 基配列上の連鎖不平衡ブロック 4に存在する SNP441とそれを含むハプロタイプが RA と強い相関を示したことから、このヒト SEC8L1遺伝子が RAの感受性に寄与していると 考えられた (RA感受性遺伝子)。
[0030] また実験例 2および 3に示すように、ヒト SEC8L1遺伝子は滑膜線維芽細胞を含むヒ ト組織でュビキタスに発現しており、さらに免疫担当細胞であるリンパ球系の全ての 細胞 (T細胞、榭状細胞、、マクロファージ、 B細胞、 NK細胞など）で SEC8L1が発現 していた。これらのことは、 SEC8L1遺伝子が、有力な関節リウマチ (RA)の疾患感受 性遺伝子であるという本発明の知見を裏付けるものである。
[0031] 3. 閗節リウマチ罹唐、診断マーカー
本発明は、上記 RA感受性遺伝子であるヒト SEC8L1遺伝子の上記連鎖不平衡ブロ ック 4 (LDブロック 4)内に存在する関節リウマチ感受性 SNP(RA感受性 SNP)を含むォ リゴまたはポリヌクレオチドであって、ヒトゲノム上で特異的に認識されるオリゴまたは ポリヌクレオチドを、関節リウマチ罹患診断マーカー（RA罹患診断マーカー）として提 供する。
[0032] ここで RA感受性 SNPとしては、 LDブロック 4に存在する下記の 7つの SNPを挙げるこ とがでさる。
[0033] (1) SNP440 ;ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列中、 379258位に位置する SNP
(2) SNP441 ;ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列中、 393668位に位置する SNP
(3) SNP442 ;ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列中、 405691位に位置する SNP
(4) SNP443 ;ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列中、 411544位に位置する SNP
(5) SNP445 ;ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列中、 476136位に位置する SNP
(6) SNP447 ;ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列中、 569133位に位置する SNP (7) SNP449 ;ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列中、 628601位に位置する SNP。
[0034] これらの各 SNPを含むオリゴまたはポリヌクレオチドの長さ（塩基長）は、ヒトゲノム上 で特異的に認識される長さであればよぐその限りにおいて特に制限されない。通常 10塩基長以上、好ましくは 20塩基長以上である。従って、本発明の RA罹患診断マ 一力一は、ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、上記 LDブロック内に存在する 各 RA感受性 SNP ((1)〜 )）を中心として、 51塩基 (上記各 SNPの 5'側及び 3'側各 2 5塩基ずつ）、 201塩基（上記各 SNPの 5'側及び 3'側各 100塩基ずつ）、 601塩基（上 記各 SNPの 5 '側及び 3 '側各 300塩基ずつ）などを有するオリゴまたはポリヌクレオチド であることができる。
[0035] 本発明の RA罹患診断マーカーとして、具体的には下記の塩基配列を含有するォ リゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる：
(1) SNP440 (塩基 Gまたは C)を挟んで、少なくとも配列番号 1記載の塩基配列と配列 番号 2記載の塩基配列を含有する、塩基長が 51〜601の範囲にあるオリゴまたはポリ ヌクレ才チド、
(2) SNP441 (塩基 Cまたは T)を挟んで、少なくとも配列番号 3記載の塩基配列と配列 番号 4記載の塩基配列を含有する、塩基長が 51〜601の範囲にあるオリゴまたはポリ ヌクレ才チド、
(3) SNP442 (塩基 Cまたは T)を挟んで、少なくとも配列番号 5記載の塩基配列と配列 番号 6記載の塩基配列を含有する、塩基長が 51〜601の範囲にあるオリゴまたはポリ ヌクレ才チド、
(4) SNP443 (塩基 Aまたは T)を挟んで、少なくとも配列番号 7記載の塩基配列と配列 番号 8記載の塩基配列を含有する、塩基長が 51〜601の範囲にあるオリゴまたはポリ ヌクレ才チド、
(5) SNP445 (塩基 Aまたは G)を挟んで、少なくとも配列番号 9記載の塩基配列と配列 番号 10記載の塩基配列を含有する、塩基長が 51〜601の範囲にあるオリゴまたはポ リヌクレ才チド、
(6) SNP447 (塩基 Aまたは G)を挟んで、少なくとも配列番号 11記載の塩基配列と配 列番号 12記載の塩基配列を含有する、塩基長が 51〜601の範囲にあるオリゴまたは ポリヌクレオチド、
(7) SNP449 (塩基 Tまたは C)を挟んで、少なくとも配列番号 13記載の塩基配列と配 列番号 14記載の塩基配列を含有する、塩基長が 51〜601の範囲にあるオリゴまたは ポリヌクレオチド。
[0036] これらの塩基配列で特定されるオリゴまたはポリヌクレオチド (DNA断片）は、関節リ ゥマチに対する罹患性 (易罹患性、抵抗性)を規定する遺伝的素因マーカーである。 ゆえに、当該マーカーを含む遺伝子を検出することにより、被験者における関節リウ マチ罹患の遺伝的素因を検査 ·診断することができる。この意味で、上記オリゴまた はポリヌクレオチドは、 RA罹患診断マーカーとして規定することができ、かつ使用す ることがでさる。
[0037] 4.閗節リウマチの罹唐、リスク 檢出する方法
本発明は、また被験者について関節リウマチ (RA)の罹患リスク（関節リウマチを発 症し易いか、発症し難いかの別）を検出する方法を提供する。本発明の RA罹患リス クの検出方法は、被験者力も得られるゲノム DNAを対象として、下記 (2)に示す塩基 と、（1)及び (5)〜 )に記載する塩基の中から選択される少なくとも 1つの塩基とを検出 し同定する工程を有するものである。
[0038] (1)ヒト SEC8L1遺伝子の 379258位（SNP440)の塩基
(2)ヒト SEC8L1遺伝子の 393668位（SNP441)の塩基
(5)ヒト SEC8L1遺伝子の 476136位（SNP445)の塩基
(6)ヒト SEC8L1遺伝子の 569133位（SNP447)の塩基
(7)ヒト SEC8L1遺伝子の 628601位（SNP449)の塩基。
[0039] なお、これらは LDブロック 4 (ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列中、 393668〜681164位 )内に存在する RA疾患感受性 SNPの集合である。
[0040] ここで検出し同定する塩基 (SNP)の組合せとしては、（2)の塩基 (SNP441)と、 （1)お よび (5)〜 )から選択されるいずれ力 1つの塩基（SNP440、 SNP445、 SNP447, SNP44 9)との組合せであればよぐ例えば (2)の塩基（SNP441)と (1)の塩基（SNP440)との組 合せ、（2)の塩基（SNP441)と (5)の塩基（SNP445)との組合せ、（2)の塩基（SNP441)と ( 6)の塩基（SNP447)との組合せ、（2)の塩基（SNP441)と (7)の塩基（SNP449)との組合 せを挙げることができる。し力し (2)の塩基 (SNP441)と組み合わせる対象の SNPは 1つ である必要はなぐ（1)および (5)〜 )力 選択される任意の 2つまたは 3つであっても ょ 、し、または (1)および (5)〜 )の 4つすべてであってもよ!/ヽ。
[0041] 本発明の検出方法として好ましくは、ヒト被験者力も得られるゲノム DNAを対象とし て、（2)の塩基 (SNP441)と、（1)および (5)〜 )力 選択される少なくとも 1つの塩基 (SN P440、 SNP445、 SNP447、 SNP449)とを検出し同定する工程〔工程 (A)〕を有する方法 である。当該方法は、さらに、工程 (A)で検出し同定した (2)の塩基 (SNP441)と、 (1) および (5)〜 )力 選択される少なくとも 1つの塩基が、下記の条件を満たしている場 合に当該被験者が関節リウマチに罹りやすい (RA易罹患性)と判定する工程〔工程（ B)〕を有することができる。
[0042] (2)の塩基（SNP441)：シトシン
(1)の塩基（SNP440)：グァニン
(5)の塩基（SNP445)：グァニン
(6)の塩基（SNP447)：グァニン
(7)の塩基（SNP449)：シトシン。
[0043] 当該方法によれば、 RA易罹患性及び RA難罹患性の別、すなわち RA罹患リスク を判定し診断することができる。当該 RA罹患リスクの判定 (診断)は、上記塩基の別 を判断基準 (判断指標）として医師等の専門知識を有する者の判断を要することなく 、機械的に行なうことができる。このため、本発明の方法は、関節リウマチの罹患リスク の検出方法と言うことができる。
[0044] なお、上記ゲノム DNAの抽出および目的塩基の検出は、公知の方法〔例えば、 Br uce, et al., ueneme Analysis/A laboratory Manual (vol.4), Cold pring Harbor Labo ratory, NY., (1999)〕を用いて行うことができる。
[0045] ゲノム DNAの抽出を行う検体は、被験者および臨床検体等から単離されたあらゆ る細胞 (培養細胞を含む。但し生殖細胞は除く）、組織 (培養組織を含む）、臓器、ま たは体液 (例えば、唾液、リンパ液、気道粘膜、精液、汗、尿等)などを材料とすること ができる。該材料としては末梢血力 分離した白血球または単核球が好ましぐ特に 白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法 に従って単離することができる。
[0046] 例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血力 常法に従って 白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロティナーゼ Kとドデシル硫酸ナトリ ゥム（SDS)をカ卩えてタンパク質を分解、変性させた後、フエノール Zクロ口ホルム抽 出を行うことによりゲノム DNA(RNAを含む）を得る。 RNAは、必要に応じて RNase により除去することができる。なお、ゲノム DNAの抽出は、上記の方法に限定されず 、当該技術分野で周知の方法（例えば、 Sambrook J. et. al.， "Molecular Cloning: A Laboratry Manual (2nd Ed.)"Cold Spring Harbor Laboratory, NY)や、巿販の DNA抽 出キット等を利用して行なうことができる。さらに必要に応じて、ヒト第 7染色体上の SE C8L1遺伝子またはその LDブロック 4を含む DNAを単離してもよ!、。当該 DNAの単 離は、 SEV8L1遺伝子またはその LDブロック 4にハイブリダィズするプライマーを用い て、ゲノム DNAを铸型とした PCR等によって行うことができる。
[0047] 目的塩基を検出する工程にぉ 、て、上記のようにして得られたヒトゲノム DNAを含 む抽出物から、関節リウマチに極めて関連性の深い RA感受性 SNPを検出する。な お、当該塩基の検出は、ヒトゲノム DNAを含む試料からさらに単離したヒト第 7染色 体上の SEC8L1遺伝子、好ましくはその LDブロック 4中の塩基配列を直接決定し、各 ブロック内に位置する各種 SNPの塩基の変異を調べる方法によってもよい。
[0048] 例えば目的の塩基を検出する方法としては、上記のように該当領域の遺伝子配列 を直接決定する方法の他に、多型配列が制限酵素認識部位である場合は、制限酵 素切断パターンの相違を利用して、遺伝子型を決定する方法 (以下、 RFLPという）、 多型特異的なプローブを用いハイブリダィゼーシヨンを基本とする方法 (例えば、チッ プゃガラススライド、ナイロン膜上に特定なプローブを張り付け、それらのプローブに 対するハイブリダィゼーシヨン強度の差を検出することによって、多型の種類を決定 する、または、特異的なプローブのハイブリダィゼーシヨンの効率を、铸型 2本鎖増幅 時にポリメレースが分解するプローブの量を検出することにより遺伝子型を特定する 方法、ある種の 2本鎖特異的な蛍光色素が発する蛍光を温度変化を追うことにより 2 本鎖融解の温度差を検出し、これにより多型を特定する方法、多型部位特異的なォ リゴプローブの両端に相補的な配列を付け、温度によって該当プローブが自己分子 内で 2次構造をつくるか、ターゲット領域にハイブリダィズするかの差を利用して遺伝 子型を特定する方法など）がある。また、さらに铸型特異的なプライマーカもポリメレ ースによって塩基伸長反応を行わせ、その際に多型部位に取り込まれる塩基を特定 する方法 (ダイデォキシヌクレオタイドを用い、それぞれを蛍光標識し、それぞれの蛍 光を検出する方法、取り込まれたダイデォキシヌクレオタイドをマススぺタトロメトリー により検出する方法)、さらに铸型特異的なプライマーに続いて変異部位に相補的な 塩基対または非相補的な塩基対の有無を酵素によって認識させる方法などがある。
[0049] 以下、従来公知の代表的な遺伝子多型の検出方法を列記するが、本発明はこれら に何ら限定されるものではな 、。
[0050] (a)RFLP (制限酵素切断断片長多型)法、（b) PCR— SSCP法 (一本鎖 DNA高次 構造多型解析） [Biotechniques, 16, 296-297 (1994)、及び Biotechniques, 21, 510-5 14 (1996)〕、 (c) ASO (Allele Specific Oligonucleotide)ハイブリダィゼーシヨン法〔Clin . Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕、（d)ダイレクトシークェンス法 [Biotechniques, 1 1, 246-249 (1991)〕、 (e) ARMS (Amplification Refracting Mutation System)法〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991) ;Nuc. Acids. Res., 20, 4831—4837 (1992)〕、 (f) 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis； DGGE) 法 [Biotechniques, 27, 1016-1018 (1999)〕、（g) RNaseA切断法〔DNA Cell. Biol, 14 , 87-94 (1995)〕、（h)化学切断法 [Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕、（i) DOL (D ye- labeled Oligonucleotide Ligation)法 LGenome Res., 8, 549-556 (1998)〕、 ( j) Taq Man— PCR法〔Genet. Anal, 14, 143-149 (1999) ; J. Clin. Microbiol, 34, 2933-293 6 (1996)〕、（k)インベーダー法 [Science, 5109, 778-783 (1993) ;J.Biol.Chem., 30,21 387-21394 (1999) ; Nat. BiotechnoL, 17, 292-296 (1999)〕、 (1) MALDI-TOF/M S法 (Matrix Assisted Laser Desorption— time of Flight/Mass Spectrometry)法 LGeno me Res., 7, 378-388 (1997) ; Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 35, 545-548 (1997)〕、 (m) TDI (Template-directed Dye-terminator Incorporation)法 [Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕、（n)モレキュラ^ ~ ·ビーコン（Molecular Beacons) 法〔Nat. BiotechnoL, 1, p49- 53 (1998) ;遺伝子医学、 4, p46- 48 (2000)〕、（o)ダイナ ミック ·アレル一スぺシフィック ·ハイブリダィゼーシヨン (Dynamic Allele- Specific Hybri dization;DASH)法〔Nat.Biotechnol.,l.p.87- 88 (1999) ;遺伝子医学, 4, 47-48 (2000 )〕、（p)パドロック'プローブ（Padlock Probe)法〔Nat. Genet., 3,p225-232 (1998)；遺 伝子医学, 4, p50-51 (2000)〕、（q) UCAN法〔タカラ酒造株式会社ホームページ（htt p：〃 www.takara.co.jp)参照〕、（r) DNAチップまたは DNAマイクロアレイ（「SNP遺 伝子多型の戦略」松原謙一 ·榊佳之、中山書店、 pl28-135)、（s) ECA法〔Anal. Che m" 72, 1334-1341, (2000)〕。
[0051] 以上は代表的な遺伝子多型検出方法である力 本発明の RA罹患リスクの判定に は、これらに限定されず、他の公知または将来開発される遺伝子多型検出方法を広 く用いることができる。また、本発明の遺伝子多型検出に際して、これらの遺伝子多 型検出方法を単独で使用してもよいし、また 2以上を組み合わせて使用することもで きる。
[0052] 以上の方法によって、関節リウマチ (RA)を発症する潜在的な危険度が相対的に 高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予め RAの発症を防ぐため の的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、 RAの発症を予防するための 検査方法として、さらには RAに伴って生じる他の疾患や症状発生の予防のための検 查方法として極めて有用である。
[0053] 5. 閗節リウマチ罹唐、リスクの檢出用試靠、これ 含すキット
(1)プローブ
目的とする塩基 (RA感受性 SNP)並びに当該塩基を含むヌクレオチドの検出には、 ヒト第 7染色体の SEC8L1遺伝子上の RA感受性 SNPを含むオリゴまたはポリヌクレオ チドに特異的にハイブリダィズし、当該 SNPを検出することができるオリゴヌクレオチ ドが用いられる。力かるオリゴヌクレオチドは、上記 SEC8L1遺伝子上において個々の SNP (SNP440、 SNP441、 SNP445、 SNP447, SNP449)を各々含む 16〜500塩基長、 好ましくは 20〜200塩基長、より好ましくは 20〜50塩基長の連続した遺伝子領域と特 異的にハイブリダィズするように、通常 16〜500塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレ ォチドとして設計される。
[0054] ここで「特異的にノ、イブリダィズする」とは、通常のハイブリダィゼーシヨン条件下、 好ましくはストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件下（例えば、サムブルックら、 Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA,第 2版 、 1989に記載の条件）において、他の DNAとクロスハイブリダィゼーシヨンを有意に 生じないことを意味する。好適には当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、上記検出す る SNPを含む遺伝子領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望 ましいが、力かる特異的なハイブリダィゼーシヨンが可能であれば、完全に相補的で ある必要はない。
[0055] 力かるオリゴまたはポリヌクレオチドとしては、下記 (1)、（2)および (5)〜 )力もなる群 力も選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチド (但し、当該オリゴ若しく はポリヌクレオチドが RNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替える ものとする）にハイブリダィズする 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオ チドを挙げることができる〔以下、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドを、ハイブリダ ィズする対象のオリゴまたはポリヌクレオチド ((1)、（2)および (5)〜 )）に対応して、（ ) 、（2 ')および (5' )〜 ')として示す場合もある〕。
[0056] (1)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 379258位（SNP440)に位置するヌクレ ォチドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 393668位（SNP441)に位置するヌクレ ォチドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 476136位（SNP445)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 569133位（SNP447)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 628601位（SNP449)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
[0057] 当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、被験者について関節リウマチに対する罹患性 を判定するために、ヒト第 7染色体上の SEC8L1遺伝子上に位置する RA受性 SNP (S NP440、 SNP441、 SNP445、 SNP447, SNP449)を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに 特異的にハイブリダィズするオリゴまたはポリヌクレオチド「プローブ」として設計される 。なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、 SEC8L1遺伝子の塩基配列に基づ いて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。
[0058] 本発明において関節リウマチ罹患リスクの検出に使用するための好適なプローブ は、上記 (2，)のオリゴまたはポリヌクレオチドからなるプローブと、上記 ( )および (5，） 〜 ')から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチドからなるプローブ との組み合わせである。ここでプローブの組合せとしては、（2 ')のプローブと、 （ )お よび (5 'ト ' )から選択される!ヽずれか 1つのプローブとの組合せであればよく、例え ば (2，）のプローブと (1，）のプローブとの糸且合せ、 (2，）のプローブと (5，）のプローブとの 組合せ、（2，）のプローブと (6，）のプローブとの組合せ、（2，）のプローブと (7，）のプロ一 ブとの組合せを挙げることができる。し力し (2' )のプローブと組み合わせる対象のプロ ーブは 1つである必要はなぐ (1 ' )および (5 'ト ( ' )から選択される任意の 2つまたは 3つであってもよ!/、し、または (1，）および (5，、〜 ，）の 4つすべてであってもよ!/ヽ。
[0059] さらに好ましくは、当該プローブは、上記各 SNP (SNP440、 SNP441、 SNP445、 SNP4 47、 SNP449)を含むオリゴまたはポリヌクレオチドが検出できるように、放射性物質、 蛍光物質、化学発光物質、または酵素等で標識される (後述)。
[0060] 上記プローブ (オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定ィ匕して用いること もできる。このため本発明はまた、上記プローブ (オリゴまたはポリヌクレオチド)を固 定化プローブ（例えばプローブを固定化した遺伝子チップ、 cDNAマイクロアレイ、ォ リゴ DNAアレイ、メンブレンフィルタ一等）として提供するものである。当該プローブは 、好適には RA感受性遺伝子検出用の DNAチップとして利用することができる。
[0061] 固定ィ匕に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定ィ匕できるものであ れば特に制限されることなぐ例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、 シリコンチップ、キヤビラリ一またはその他の基板等を挙げることができる。固相への オリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを 固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相 上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えば DNAマイクロアレイであれ ば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類 に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、 photolithographic技術 (Aifymetrix社)、 インクジェット技術 (Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドの in situ合成等〕 [0062] 例えば、 ASO法の一例である TaqMan PCR法〔Livak KJ. Gene Anal 14, 143 (19 99), Morris T et al.， J Clin Microbiol 34, 2933 (1996)〕の場合、各種の RA感受性 S NPを含む領域に相補的な 20塩基長程度のオリゴヌクレオチドがプローブとして設計 される。当該プローブは、 5'末端を蛍光色素、 3'末端を消光物質により標識され、検 体 DNAと特異的にハイブリダィズする力 そのままでは発光せず、別に加えられた P CRプライマーの上流力 の伸長反応により 5'側の蛍光色素結合が切断され、遊離 した蛍光色素により検出される。
[0063] ASO法の別の 1例である Invade法〔Lyamichev V. et al.， Nat Biotechnol 17, 292 ( 1999)〕では、多型部位に隣接する配列（3 '側と 5 '側の 2種）に相補的なオリゴヌタレ ォチドがプローブとして設計される。検出は、これら 2種のプローブと検体とは無関係 な第 3のプローブによって達成される。
[0064] (2)プライマー
本発明は、またヒト第 7染色体の SEC8L1遺伝子上の RA感受性 SNPを含む配列領 域を特異的に増幅するためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドを提供す る。
[0065] 力かるオリゴヌクレオチドとしては、下記 (1)、（2)および (5)〜 )力 なる群力 選択さ れる少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチド (但し、当該オリゴ若しくはポリヌク レオチドが RNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする )にハイブリダィズする 15〜30塩基長のオリゴヌクレオチドを挙げることができる〔以下 、これらのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダィズする対象のオリゴまたはポリヌクレオチ ド ((1)、（2)および (5)〜 )）に対応して、（1")、（2")および (5")〜 ")として示す場合もあ る〕。
[0066] (1)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 379258位（SNP440)に位置するヌクレ ォチドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 393668位（SNP441)に位置するヌクレ ォチドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 476136位（SNP445)に位置するヌクレ ォチドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 569133位（SNP447)に位置するヌクレ ォチドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 628601位（SNP449)に位置するヌクレ ォチドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
[0067] このようなオリゴヌクレオチドは、 SEC8L1遺伝子において、 RA感受性 SNPの塩基（ ヌクレオチド)を含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの 1部に特異的にノ、イブリ ダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための 15〜30塩基 長、好ましくは 18〜25塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。増幅するォ リゴまたはポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが 、一般的には 15〜1000塩基長、好ましくは 20〜500塩基長、より好ましくは 20〜200塩 基長である。
[0068] 本発明において関節リウマチ罹患リスクの検出に使用するための好適なプライマー は、上記 (2")のオリゴヌクレオチド力 なるプライマーと、上記 (Γ)および (5")〜 ")か ら選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチド力 なるプライマーとの組み合わせ である。ここでプライマーの組合せとしては、（2")のプライマーと、 （Γ)および (5")〜 ")から選択される 、ずれ力 1つのプライマーとの組合せであればよぐ例えば (2")のプ ライマーと (Γ)のプライマーとの糸且合せ、（2")のプライマーと (5")のプライマーとの糸且合 せ、（2")のプライマーと (6")のプライマーとの糸且合せ、（2")のプライマーと (7")のプライ マーとの組合せを挙げることができる。し力し (2")のプライマーと組み合わせる対象の プライマーは 1つである必要はなぐ（Γ)および (5")〜 ")力も選択される任意の 2つ または 3つであってもよいし、または (Γ)および (5")〜 ")の 4つすべてであってもよい
[0069] ヒト第 7染色体の SEC8L1遺伝子上の、各種 RA感受性 SNP (SNP440, SNP441, SN P445、 SNP447, SNP449)近傍の 15塩基以上連続した塩基配列に特異的にハイブリ ダイズする塩基配列を有する上記の各種オリゴヌクレオチドは、本発明にお ヽてブラ イマ一として利用することができる。なお、これらのオリゴヌクレオチドは、 SEC8L1遺伝 子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って 作成することができる。
[0070] Mass Array法に MALDI—TOFZMS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionizat ion Time- Of- Flight Mass Spectrometry)を応用した方法〔Haff LA et al. Genome Res 7, 378 (1997), Little DP et al., Nature Medicine vol.3, No.12, 1413—1416, (1997)] を例にとって、プライマーの具体的な利用方法を説明する。この場合、シリコンチップ 上に固定した検体 DNAに前記プライマーをハイブリダィズさせ、 ddNTPを添カ卩して 一塩基だけを伸長させる。次いで、一塩基伸長産物を分離し、質量分析法により多 型を検出する。この方法では、プライマーは通常 15塩基長以上で可能な限り短く設 計することが望ましい。
[0071] (3)標識物
上記本発明のプローブまたはプライマーには、遺伝子多型検出のための適当な標 識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ピオチン 等が付加されたものが含まれる。
[0072] なお、本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識し て、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、 HEX(4,7,2 ' ,4 ,5 ,7 - hexachloro- 6- carboxylfluorescein、緑色 光色 リ、フルォレセイン (fluores cein)、 NED (商品名、アプライドバイォシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、 6— FAM (商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン ( rhodamin)またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン (TMR)〕を挙げることが できるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知 の標識法のうち適当なものを使用することができる [Nature Biotechnology, 14, 303-3 08 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシ ャム ·ファノレマシア社製、オリゴヌクレオチド ECL 3，一オリゴラベリングシステム等）。
[0073] また、本発明のプライマーには、その末端に多型検出のためのリンカ一配列が付カロ されたものも含まれる。このようなリンカ一配列としては、例えば、前述したインべーダ 一法で用いられるオリゴヌクレオチド 5 '末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列 とは全く無関係な配列)等が挙げられる。
[0074] 以上の、プローブまたはプライマー（標識されて 、てもよ 、）は、 RA発症リスクの検 出用試薬として利用することができる。
[0075] (4)関節リウマチ罹患リスク検出用試薬キット
本発明はまた、上記 RA罹患リスク検出用試薬をキットとして提供するものである。当 該キットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴまたはポリヌクレオ チド (なお、これらは標識されていても、また固相に固定ィ匕されていてもよい）を少なく とも 1つ含むものである。本発明のキットは上記プローブまたはプライマーの他、必要 に応じてハイブリダィゼーシヨン用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩 衝液など、本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよ い。
実施例
[0076] 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施 例によって何ら限定されるものではない。
[0077] 解析対象
下記の実施例で示す解析は、合計 1566人の日本人の被験者を対象として行った。 1566人のうち、 760人は関節リウマチ患者 (RA患者）（156人の男性と 603人の女性） であり、 806人は非関節リウマチ患者 (健常対照者）（189人の男性と 617人の女性)で ある。すべての RA患者は ACRの診断基準 (Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, M cShane DJ, Fries JF, Cooper NS, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988;J 1:315-24)を満たし、発症から最低 3年以上経過した症例者である。本研究は、徳島 大学倫理委員会の承認を得ており、全ての参加者から、書面でのインフォームドコン セントが得られたのちに採血を行い、標準のプロトコルを用いて、末梢血リンパ球また は EBウィルスを用いた不死化リンパ芽球よりゲノム DNAを抽出し、被験サンプルとし て使用した。また、滑膜組織は、人工関節手術を受けた 3名の RA患者カゝら採取し、 文献 (Mishiro T, Nakano S, Takahara b, Miki M, Nakamura Y, Yasuoka S, et al. Rela tionship between cathepsin B and thrombin in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 200 4;31:1265-73)に記載する方法に従って滑膜線維芽細胞を培養した。なお、 RAの病 型は越智らの分類 (Ochi T, Iwase R, Yonemasu K, Matsukawa M, Yoneda M, Yukiok a M, et al. Natural course of joint destruction and fluctuation of serum Clq levels in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988;31:37— 43)【こ従って、 3群【こ 分類した。
[0078] RA患者および健常対照者の臨床像を表 1にまとめた。
[0079] [表 1]
RA患者 健常対照者
m 760 806 イニシャルスクリーニング - 46 第 1鹏 380 380 女性 OS洽 (%) 78.9 78.9
第 2鹏 380 380 女性 (D 洽 (%) 79.7 77.6 人種， 日本人 洽 (%) 100 100
^ ^土 S.D. 61.9 土 12.2 38.8 土 15.4 く 30 62 - '
30-39 115 -
40-49 38 -
50-59 196 一
60-69 114 -
>70 35 - m ^ (%) 16.8 -
SJ^ (MLD： Muti lating disease) 58 - 中等度 (ES： More erosive subset) 279 -
(LES： Less erosive subset) 423 -
[0080] サンプル採取時年齢士 SDは、 RA患者では 61.9±12.2歳、健常対照者では 38.8±1 5.4歳であった。
[0081] 下記の実施例において、 SNPのアレル頻度に関する関連検定は、 2X2の分割表 を作成し、カイ 2乗検定を行った。 permutation法を利用したノヽプロタイプ頻度のカイ 2乗検定は、 SNPAlyze ver.3.2プロ（DYNACOM、 日本）を用いて行った。ペアワイズ の連鎖不平衡の程度は、連鎖不平衡係数 (|D'|)と相関係数 (r2)を算出することによ つて評価した。
[0082] ¾細 (1)RA感受性領域の SNP探索とタイピング
53家系を用 、たゲノムワイド罹患同胞対解析で、 7q31-34領域のマーカー D7S2560 で LODスコア一 1.41という結果が得られている (Nyholt DR. All LODs are not created equal. Am J Hum Genet 2000;67:282-8) 0そこで、 D7S2560からの 1- LODインターバ ルである D7S486から D7S2513の領域（25.3Mb)に RAの感受性や重症度に関わる遺 伝子が存在するのではないかと考えた。この領域には NCBIの Map View Build 34 Ve rsion2で 179の遺伝子が存在している。そこで、これらの候補遺伝子に対し有用なマ 一力一セットを作成するために、公共のデータベース (dbSNP, TSC)やセレラ社のデ ータベースから SNPの探索を行った。膨大な数の SNPの中で、下記の 3つの基準を満 たす 728の SNPを抽出した。
[0083] (0転写開始点から 10kb上流からストップコドンの 10kb下流までの遺伝子領域に存 在し、かつ可能な限り等間隔（10〜20kb)に一つの割合で配置された SNPであること。
(ii) TaqManアツセィで用いるプローブの設計に適した配列を持つこと。
(iii) 46人の健常対照者サンプルを用いた頻度解析で、マイナーアレル頻度が 15%以 上の頻度の高 、SNPであること。
[0084] 次いで、この抽出した 728SNPに対し TaqManアツセィ系を作成した。 TaqManプロ一 ブとプライマーのセットはアプライドバイオシステムズ社の Primer Expressを用いて作 成した。遺伝子型のタイピングは TaqMan Universal Master Mixまたは QuantiTect Pr ove PCR Kit, 5ngの DNA、 450nMのプライマー、および 100nMのプローブを用いた反 応系（4 μ 1)で行った。 PCRは、サーマルサイクラ一（ABI GeneAmp PCR System 9700 )を用いて、酵素の活性化 95°C10分、その後 92°Cまたは 94°Cで 15秒、 60°Cで 1分の 反応を 40サイクル繰り返して行った。 384ゥエルのプレートに遺伝子型のわからな!/、38 0サンプルを注入し、残る 4ゥエルはコントロールとした。 PCR反応後、 PCR増幅産物の VICおよび FAMに基づく蛍光シグナルを、 ABI Prism 7900HT Sequence Detector Sy stemと SDS Softwareを用いて検出した。
[0085] (2)ケースコントロール関連解析
鍾
タイピングにかかる時間と費用を削減するために、 1520症例を 2つのグループ（1グ ループ: RA患者 380人、健常対照者 380人）に分け、 2段階の解析を行った。なお、性 差、発症年齢、 RAのサブタイプは各段階で均一になるよう調整した。第 1段階の解析 ではすベての SNPをタイピングし、 RAと関連（P〈0.05)を示した SNPを異なるサンプル セットで再現性の確認を行った。各段階で患者、健常対照者のアレル頻度を 2 X 2の 分割表を用いた％ 2乗検定にかけた。有意差を示した SNPについては、さらに遺伝子 型頻度、ドミナントモデル、リセッシブモデルでの検討を行った。各 SNPでのハーディ ~ ·ワインバーグ平衡も、 ％ 2乗検定で検討を行った (Nielsen DM, Ehm MG, Weir BS. Detecting marker-disease association by testing for Hardy— Weinberg disequilibrium at a marker locus. Am J Hum Genet 1998;63:1531- 40)。なお、マイナーアレル頻度 が 15%未満、タイピング成功率が 97%未満、コントロールサンプルでハーディ一'ワイン バーグ平衡が成立しな 、SNPは解析から除外した。候補領域での連鎖不平衡および 相の推定は第 1段階の 380人の健常対照者サンプルの遺伝子型を用いた。ペアワイ ズの連鎖不平衡はハプロタイプ頻度 A Bを X A、 Bのアレル頻度をそれぞれ p、 qと
1 1 11、 1 1 したとき、 D = X -P qで推定した。また rは A、 Bの他方のアレル頻度をそれぞれ p、 q
11 1 1 2 2 としたとき r = D/(p p q q ) 1/2で推定した (Hill WG RA. Linkage disequilibrium in finite
1 2 1 2
populations. Theor Appl Genet 1968;38:226— 31)。 D，は D〈 0のとき D = minimum(p max
q ,p q )、 D〉 0のとき D = minimum(p q ,p q )とし D， = D/D で表した (Lewontin R
1 2 2 1 max 1 1 2 2 max
C. The interaction of selection and linkage. I. eneral considerations: heterotic mod els. Genetics 1964;49:49- 67)。多点でのハプロタイプ頻度の推定は最尤推定法で行 つた o
パーミューテーシヨンテストを含む統計は、 SNP Alyze Proまたは Fujitsu Disease Sus ceptibility Gene Discovery Systemを用いた。連鎖不平衡の構成は GOLD(Abecasis GR, Cookson WO. GOLD—― graphical overview of linkage disequilibrium. Bioinforma tics 2000;16:182-3)を用いて図示した。ポピュレーションアトリビユータブルリスクは、 R Aの有病率を 0.01とし、 ¾リスクアレルの頻度、 r、 rを遺伝子型のリスクレイシォと推
1 2
定したとき、 X = (1- + 2 1- l)r + frを用い (X- 1)/Xで表される (Esterbauer H, Schn
1 2
eitlerし, Oberkofler H, Ebenbichlerし, Paulweber B, Sandhofer F, et al. A common polymorphism in the promoter of UCP2 is associated with decreased risk of obesity i n middle-aged humans. Nat Genet 2001;28:178— 83)。
[0087] S
Genetic Power Calculatorを用いた検出力は、 380人ずつの RA患者および健常対 照者を用いて、遺伝子型相対危険度 f /f、 f /fをそれぞれ 1.2、 1.5、マーカーアレル
1 0 2 0
の頻度を 0.45、 αを 0.05とした場合、 0.5125であった (Purcell S, Cherny SS, Sham PC. Genetic Power Calculator: design of linkage and association genetic mapping studie s of complex traits. Bioinformatics 2003; 19: 149-50)。
[0088] 第 1段階でタイピングをした 728SNPのうち 69SNPはマイナーアレル頻度が 15%未満 またはコントロールサンプルでハーディ一'ワインバーグ平衡が不成立であったため、 解析から除外した。解析を行った 695SNPのうち 13遺伝子領域に存在する 48SNPが、 RAと有意な相関 (P < 0.05)を示した。そこで、これらの 48SNPについて、第 2グループ (380人の RA患者、 380人の健常対照者)を対象として第 2段階の解析を行った。
[0089] 48SNP中、 3SNPは同様に規定を満たさな力 たため解析より除外した。残る 45SNP 中 5SNP(SNP411, 441, 442, 443および 445 :当初の 0.69%)が再現性を持って有意差を 示した。各段階の結果を統合したところ、 SNP441, 442, 443, 445ではさらに小さな P 値を示した力 一方で SNP411の有意差は消失した。この SNP411は、各解析段階で は有意差が確認されていたが、第 1段階と第 2段階でアレル頻度が逆転していたた め、統合された結果では有意差が消失したと考えられる。
[0090] これらの SNPのうち、 SNP441が最も強い有意差（RAとの相関）を示した（P = 0.00005 9、ォッズ比 1.34、 95%信頼区間 1.16-1.55) (表 2参照）。本実験のように多数の SNPを 用いた関連解析では多重検定に伴う偽陽性の出現を排除することが重要である。 SN P441は、多重検定による偽陽性を補正するボンフェロー-の補正を行っても有意性 は保たれていた (P = 0.039)。
[0091] SNP441の population attributable riskはアレル頻度を 0.57としたとき 40%であり、 geno type risk ratioは、 T/T〖こ対する C/Tを r、 C/Cを rとすると、それぞれ 1.075と 1.708と
1 2
なった。当該 SNP441は、罹患同胞対解析でピークとなったマーカー D7S2560からわ ずカゝ 3.9Mbの位置にあった。このことは、孤発例サンプルを用いた連鎖不平衡解析の 結果と家系例サンプルを用いた罹患同胞対解析の結果に矛盾がな力つたことを意味 する。
[0092] 表 2に SEC8L1遺伝子に存在する SNPsについて、関連解析の結果を示す。
[0093] [表 2] ^SS1^
。
：
：
； r
、
、 (SNPS)を列記
†
Figure imgf000030_0001
SNPsが dbSNP CekraCVIDで示している
ίヌクレ才チド fiRは UCSC Genome Bioinfomatics Site {hdp;/genome.ucsc.eduに基づく
§odds ratioが 1編の齢微のスコアを 95%CI= 95% confidence intavaL
[0094] これ力もわ力るように、上記で RA患者で有意差が認められた SNP441, 442, 443およ び 445は、 V、ずれもエクソシストコンプレックスの構成成分である SEC8L1遺伝子のイン トロン 10の 82kb領域内に存在していた。 SEC8L1遺伝子内の SNP449〜SNP455と SNP 457〜SNP461の 12SNPは、第 2段階の解析では有意差は認められなかった力 第 1 段階、第 2段階の結果を統合した解析では有意差を示した。 SNP444, 446および 456 は第 1段階では有意差を示したため、第 2段階の解析を行ったが、統合した結果での ハーディー ·ワインバーグ平衡が不成立であったため第 1段階の結果のみ記載し、連 鎖不平衡解析からは除外した。
[0095] 統合した結果では、これ以外にも 4遺伝子内の 6SNPが少なくとも 1つの形質で RAと 強い相関 (Pく 0.01)を示した (表 3)。
[0096] [表 3]
Iffi 链
*P働 01 *iiの正 ©ffl関にある一:^^ (SNPs)を? I
†odds ratioが 1 ©¾&ί;¾©スコアを鶴己 95%CI = 5% confidence interval.
[0097] (3)連鎖不平衡解析、ハプロタイプ解析
SEC8L1遺伝子は、 18のェキソン力 構成される 800kbからなる遺伝子である。これ までの研究で頻度の高い多型では SNP間での連鎖不平衡は 10から 60kbにわたり、ま た数百 kbに及ぶこともあるといわれている。この相関が SEC8L1遺伝子そのものによる ことを証明するため、 SEC8L1遺伝子の前後 2遺伝子（CHCHD3遺伝子， FLJ32786遺 伝子)を含めた領域の連鎖不平衡のパターンを評価した。その結果、 |D' |> 0.9を基 準として 6つの連鎖不平衡ブロックを同定した（図 1)。
[0098] そのうち、ブロック 4内に存在するほぼすベての SNP(SNP441-461)に、 RAとの相関 性が認められた。このブロックは、 SEC8L1遺伝子内のイントロン 10〜13にわたる約 30 Okbの領域である（図 1Bおよび C)。この連鎖不平衡ブロック内には他の遺伝子はなく 、このことから、上記で観察された RAとの相関は、 SEC8L1遺伝子そのものに由来す ることが判明した。
[0099] これらのブロック 4内の SNPが組み合わせとなって RAのリスクに寄与する可能性を考 え、ハプロタイプの解析を行った。ブロック 4には 22の SNPが存在した力 3SNP(SNP44 4, 446, 456)は上記理由により解析から除外した。残るブロック 4に存在する 19SNPの うち、 r 2> 0.9以上の連鎖不平衡にあるものを、 5つのグループに分類した。各グルー プから 1SNPずつ選択 (SNP440,441, 445,447,449)し、ハプロタイプを構築した。なお、 S NP440と 447は第 2段階のタイピングを行って!/、なかった力 ハプロタイプ解析のため 第 2段階の解析を行った。その結果、表 4に示すように、 4つの頻度の高いハプロタイ プ (ハプロタイプ 1〜4)が同定された。
[0100] [表 4]
S PK)
ΛΤ Ρ？ィプ ID SNP440 SNP441 SNP445 SNP4 7 SNP449 P Permutation
Hap l 0.47 0.52 G C G G C 0.0015 0.001
H¾)2 0.16 0.11 G T A A T 0.0000062 < 0.0001
H¾)3 0.16 0.15 C T A A T 033 033
Hap4 0.09 0.09 G T G A T 0.94 0.94
* ¾^s'0.05より大き w" Πタイプを RA患者と ItfiSM^とで Μ*¾
ナ ΙΟ,ΟΟΟρεηηιΜίαιした Ρ値を 3¾
[0101] ハプロタイプ 1 (G,C,G,G,C)は最も頻度が高ぐ RAと正の相関 (P =0.0015)を示し、 R A感受性ノヽプロタイプであると認められた。一方、ハプロタイプ 2は RAと負の相関 (P = 0.0000062)を示し、 RA抵抗性ノヽプロタイプであると認められた。 P値は、多重検定の 補正のためパーミューテーシヨンテストにより求めた（ノヽプロタイプ 1 : P = 0.001、ハプ 口タイプ 2 : P < 0.0001)。このことから、単点 SNP441、および SNP441を含むハプロタイ プはどちらも RAに対して強い有意性を示した力 同様に RAの感受性を規定するう えで重要であると考えられる。
[0102] 実験例 2 ヒト組織での SEC8L1の発現
なお、リアルタイム PCRにあたり、滑膜線維芽細胞（FLS)力ものトータル RNAの抽出 は RNeasy KITを用いて行った。またその他の組織 (脳、骨髄、肺、心臓、胸腺、脾臓 、腎臓、骨格筋）からの RNAは、 Human Total TNA Master Panel II Kitを用いて調製 した。調製した RNAは、オリゴ dTプライマーおよび Superscript IIを用いて逆転写し、 S EC8L1遺伝子およびコントロールとした 13ァクチン TaqMan Assays on Demandを用い たリアルタイム PCRで定量した。骨髄での SEC8L1の発現量を基準（1とする）にスタン ダードカーブ法により他の糸且織の発現量を算出した。 結果を図 2に示す。図 2に示すように、健常対照者の正常組織では SEC8L1はュビキ タスに発現しており、特に骨格筋に高い発現が認められた。また RA患者において、 S EC8L1は培養滑膜線維芽細胞で中等度の発現が確認された。滑膜線維芽細胞は、 マクロファージカも放出される TNF- aなどの炎症性サイト力インによって MMP (関節 軟骨を分解する酵素)を放出することが知られており、病因に深く関わっていると考え られている細胞である。
[0103] 実験例 3 マウス免疫細胞内での SEC8遺伝子の発現
Sec8Llの発現は、脳と脾臓に特異的に認められたことから、さらに限定した生体内 での局在を解明するべぐどの組織あるいは細胞に発現が高いかを検討した。関節リ ゥマチにおける炎症病理に SEC8L1の関与が考えられることから、免疫担当細胞に着 目した。
[0104] マウス (系統; BALB/c)の脾臓を摘出後、各リンパ球に特異的な分子マーカー (B cell ： B220、 NK cell:DX5 a、 Macrophage:Macl)に対する抗体に磁気ビーズを結合させ た抗体を反応させた後， autoMACS™ (自動磁気分離)システムにてリンパ球を分離し た。 T cellは pan T cell isolation kit (Tcell以外を排除するキット、 Miltenyi製）を用いて 分離を行った。得られたリンパ球集団は FACS解析によって、各々の純度を評価した 。その結果、すべて 80%以上の純度の高い細胞集団であった。榭状細胞はマウス（ 系統; BALB/c)の四肢の長官骨由来の骨髄細胞集団を出発材料とし、 GM-CSF(20n g/ml)環境下で 7日間培養した。培養後、榭状細胞の特異的マーカー分子である CD 11cに対する磁気ビーズ結合抗体を使って同様に autoMACS™で分離した。
[0105] 上記の方法により分離'精製した各種リンパ球から、 RNeasy micro kit (Qiagen製）を 用いて RNAを抽出し、マウス SEC8L1遺伝子の発現を RT-PCRで解析した。なお、 RT -PCRによる cDNAの作成には「superscript first-strand synthesis for RT— PCR」（Mil tenyi製）、および下記に示すプライマーを使用した。
[0106] (l)primer- 1(マウス SEC8L1遺伝子のイントロン 3,4,5を検出するように設計）
(i)Forward primer： 5， - CGACATGCTGGTGTCAGCAGT- 3，（配列番号 15) (ii)Reverse primer ： 5， - TCATCTCCCTCACACTTGAGCCTC- 3 ' (配列番号 16)。
[0107] (2) primer-2(マウス SEC8L1遺伝子のイントロン 14を検出するように設計） (i) Forward primer : 5， - CTTCATAAGGGCAGCCTTTG- 3 ' (配列番号 17)
(ii) Reverse primer : 5， - GGGGAAAGCATCTGGGATGT- 3 ' (配列番号 18)。
上記 primer- 1セットおよび primer- 2セットを用いて RT-PCRを行った結果、図 3に示 すように、免疫担当細胞に相当するいずれのリンパ球系細胞 (B細胞、マクロファージ 、 T細胞、 NK細胞、榭状細胞（DC) )で SEC8L1の発現が確認された。また Primer-l による検出結果では、特に T細胞が他のリンパ球系細胞と比べて発現が高ぐ次いで 榭状細胞（DC)、マクロファージ、 B細胞で高い発現を示した。 Primer-2の場合も、わ ずかではあるが T細胞において高!、SEC8L 1の発現が認められた。（図 3)
以上示すように、すべてのリンパ球で SEC8L1遺伝子の発現が認められ、特に T細 胞で高い発現が認められた。関節リウマチ患者滑膜内には多数の T細胞の浸潤が確 認されており、関節リウマチにおいて T細胞は非常に重要な役割をするといわれてい る (¾meets, 1 . J. et al. Poor expression of cell-derived cyto ines and activation a nd proliferation markers in early rheumatoid synovial tissue. Clin. Immunol. Immuno pathol. 88:84-90 (1998))。 T細胞は CD4陽性細胞であり、細胞性免疫を誘導する Th 1細胞へ分化したものが多い。これらが放出するサイト力インは IFN- γや IL- 17であり 、マクロファージゃ滑膜線維芽細胞などに作用することが示唆されている。また TNF- «、 IL-1などの炎症性サイト力インを放出して軟骨破壊、滑膜の炎症を引き起こすこ と力報告されている (Lubberts, E. et al. IL-17 promotes bone erosion in murine colia gen-induced arthritis through loss of the receptor activator of NF— kB ligand/ osteop rotegerin balance. J. Immunol. 170:2655—2662 (2003) )。さらに T細胞やマクロファー ジは破骨細胞活性化因子である RANKL (Recptor Activator of NF-kB Ligand)を産 生'分泌し、骨破壊を誘導するとの報告もある（Nakae, S. et al. IL-17 production fro m activated T cell is required for the spontaneous development of destructive artnn tis in mice deficient IL- 1 receptor antagonist. PNAS.100:5986- 5990 (2003) )。 SEC8 LIは Exocyst Complexのサブユニットであり、主に小胞輸送に関与しており、小胞と細 胞膜が結合する際に繋留 (小胞を細胞膜に一時的につなぎとめておく）させて膜へ の結合能を高める作用を示す（Grindstaff,K.K. et al. Sec6/8 complex is recruited to cell-cell contacts and specifies transport vesicle delivery to the basal-lateral memb rane in epithelial cell. Cell. 93:731-740 (1998) ) 0関節リウマチ患者ではかかる Exocy st Complexの機能不全があり、ある特定のサイト力イン発現やその SEC8L1の膜への 輸送障害が生じ、その結果、関節リウマチを誘発、助長させている可能性が示唆され る。
図面の簡単な説明
[図 1]図 Aは、 |D Ίを用いた日本人健常対照者 380人の SNP間でのペアワイズの連鎖 不平衡を示す図である。図 Bは、ケースコントロール関連解析の- log (P値)と物理位
10
置の対比を示す。横にひいた線は P = 0.05を示す。 1520人（2グループ：各グループ 患者 380人および健常対照者 380人)力もタイピングされた 21SNPのみを記載する。矢 印は最も強い有意差を示した SNP441の物理位置を示す。図 Cは、 SEC8L1遺伝子周 辺のゲノム構造と 6つの連鎖不平衡ブロックの位置関係を示す。縦線は SEC8L1遺伝 子のェキソンを示す。
[図 2]ヒト組織での SEC8L1遺伝子の骨髄での発現に対する発現パターンを示す図で ある。 SEC8L1の発現量を |8ァクチンの発現量で標準化した結果である。なお、図中「 FLSJは滑膜線維芽細胞を意味する。
[図 3]マウス脾臓、骨髄より採取した生体細胞由来のリンパ球 (Bsa¾ou、マクロファー ジ、 T細胞、 NK細胞、榭状細胞（DC) )での SEC8L1の発現を示す。いずれの細胞で も発現が確認された。 Primer-1による検出結果では特に T細胞が他のリンパ球と比べ て発現が高ぐ次いで榭状細胞、マクロファージ、 B細胞でも高い発現を示した。 Prim er-2でもわずかではあるが T細胞において高い SEC8L1発現が認められた。

Claims

請求の範囲 [1] 下記の (1)〜 )力もなる群力 選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオ チドからなる、関節リウマチの罹患診断マーカー：
(1)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 379258位（SNP440)に位置する Gまた は Cを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(2)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 393668位（SNP441)に位置する Cまた は Tを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(3)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 405691位（SNP442)に位置する Cまた は Tを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(4)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 411544位（SNP443)に位置する Aまた は Tを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(5)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 476136位（SNP445)に位置する Aまた は Gを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(6)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 569133位（SNP447)に位置する Aまた は Gを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド、
(7)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 628601位（SNP449)に位置する Tまた は Cを挟んで 5 '側および 3 '側に各々最長 300塩基長の塩基配列を有するオリゴまた はポリヌクレオチド。
[2] (A)ヒト被験者力も得られるゲノム DNAを対象として、下記 (2)に記載する塩基と、 (1
)及び (5)〜 )に記載する塩基の中から選択される少なくとも 1つの塩基とを検出し同 定する工程を含む、当該被験者について関節リウマチの罹患リスクを検出する方法： (1)ヒト SEC8L1遺伝子の 379258位（SNP440)の塩基 (2)ヒト SEC8L1遺伝子の 393668位（SNP441)の塩基
(5)ヒト SEC8L1遺伝子の 476136位（SNP445)の塩基
(6)ヒト SEC8L1遺伝子の 569133位（SNP447)の塩基
(7)ヒト SEC8L1遺伝子の 628601位（SNP449)の塩基
[3] (B)上記工程 (A)で検出し同定した (2)の塩基 (SNP441)がシトシンであり、かつ (1) 及び (5)〜 )に記載する塩基（SNP440、 SNP445、 SNP447, SNP449)から選択される 少なくとも 1つの塩基力 下記の条件：
(1)の塩基（SNP440)：グァニン
(5)の塩基（SNP445)：グァニン
(6)の塩基（SNP447)：グァニン
(7)の塩基（SNP449)：シトシン
を満たしている場合に、当該被験者が関節リウマチ易罹患性であると判定する工程 を有する、請求項 2に記載する関節リウマチの罹患リスクを検出する方法。
[4] 下記の (2)のオリゴまたはポリヌクレオチド (但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチド が RNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする。以下 同じ）にハイブリダィズする 15〜30塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物と、 ( 1)および (5)〜 )力もなる群力も選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオ チドにハイブリダィズする 15〜30塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物との組 み合わせ力もなる、関節リウマチ罹患リスクを検出するために用いられるプライマーセ ッ卜：
(1)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 379258位（SN440)に位置するヌクレオ チドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 393668位（SN441)に位置するヌクレオ チドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 476136位（SN445)に位置するヌクレオ チドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 569133位（SN447)に位置するヌクレオ チドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、 (7)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 628601位（SN449)に位置するヌクレオ チドを含む 16塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
[5] 下記の (2)のオリゴまたはポリヌクレオチド (但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチド が RNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする。以下、 同じ）にハイブリダィズする 16〜500塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物と、 (1)および (5)〜 )力もなる群力 選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオ チドにハイブリダィズする 16〜500塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物との 組み合わせ力もなる、関節リウマチ罹患リスクを検出するために用いられるプローブ セット：
(1)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 379258位（SN440)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 393668位（SN441)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 476136位（SN445)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 569133位（SN447)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7)ヒト SEC8L1遺伝子の塩基配列において、 628601位（SN449)に位置するヌクレオ チドを含む 16〜500塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
[6] 各オリゴヌクレオチドまたはその標識物が任意の固相に固定してなる固相化プロ一 ブである請求項 5に記載するプローブセット。
[7] 請求項 4に記載するプライマーセット、または Z及び、請求項 5に記載するプローブ セットを含む、関節リウマチ罹患リスク検出用試薬、または当該試薬を含むキット。
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