KR20180023087A - Col6a6 유전자 단일염기다형성을 이용한 아토피 피부염 진단용 조성물과 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 COL6A6 유전자 단일염기다형성을 이용한 아토피 피부염 진단용 마커 조성물과 검출 방법에 대한 것으로, 보다 상세하게는 COL6A6 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위인 rs16830494, rs200963433, rs59021909의 26번째 염기의 변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물과 상기 COL6A6 유전자의 SNP를 마커로 검출하는 방법에 대한 것이다.
본 발명을 이용하여 아토피성 피부염을 조기에 발견하고 초기에 적절하게 대응하여 효과적으로 치료할 수 있게 하기 위한 아토피 피부염의 유전자 진단 시약 및 진단용 칩을 개발할 수 있다.

Description

COL6A6 유전자 단일염기다형성을 이용한 아토피 피부염 진단용 조성물과 검출 방법{Composition and method for diagnosing atopic dermatitis using COL6A6 SNP}

본 발명은 COL6A6 유전자 단일염기다형성을 이용한 아토피 피부염 진단용 마커 조성물과 검출 방법에 대한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 A이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물과 COL6A6 유전자의 다형성을 마커로 검출하는 방법에 대한 것이다.

아토피 피부염(atopic dermatitis, AD)은 습진성 손상과 건조하고 가려운 피부가 주요 증상이며, 쉽게 재발되는 만성 피부 염증 질환이다. AD는 유전적 소인과 환경적 요인의 조합에 의하여 발생하는 것으로 생각되고 있다. AD는 다수의 유전자에 의하여 발생하고, 집안 내력으로 세대 간에 유전되며, 어린 시절에 발병한다는 특징이 있다. AD 가족력이 있는 집단의 연구(cohort study)를 통하여 상염색체 우성의 방식으로 유전되는 것으로 밝혀졌다. AD는 약 20%의 어린이에서 발생하며(Nutten S, Annals of nutrition & metabolism 2015, 66 Suppl 1:8-16), 따라서 AD에 대한 유전적 배경을 이해하고 조기 진단과 치료법을 개발하는 것이 중요하다. 또한 AD를 조기 진단하기 위해서는 AD 같은 복잡다단한 현상을 일으키는 원인이 되는 변이를 규명하는 것이 필요하다.

전체 엑솜 시퀀싱(whole-exome sequencing, WES)은 유전체에서 엑솜(exome)으로 알려진 모든 단백질을 코딩하는 약 3×10⁷bp의 염기서열을 분석하는 기술이다. 엑솜이 인간 유전체에서 차지하는 비율은 2% 보다 낮지만, 이 부위의 변이는 나머지 98%에서 발생하는 변이보다 훨씬 심각한 결과를 초래할 수 있다. WES의 목적은 모든 단백질 코딩 부위를 포함하는 빅 데이터(big data)에서 선별 과정(filtering process)을 통하여 멘델리안 방식으로 유전되는 질병 유발 돌연변이나 흔하고도 복잡한 질환의 발병 위험도를 높이는 단일염기 다형성(single-nucleotide polymorphisms, SNP) 등의 유전적 변이를 찾아내는 것이다.

흔한 질환은 흔한 변이로부터 발생된다는 가설(the common disease-common variant hypothesis, CD-CV)은 유전체 연관 연구(genome-wide association studies, GWASs)를 통해 가장 효과적으로 검증해 볼 수 있다. 한편, CD-CV에서 유전성(heritability)이 상실되는 문제로부터 개개인에서 발생한 희귀한 유전적 변이가 더 중요한 작용을 한다는 가설이 생겨나기도 하였다. 최근 흔한 질환의 흔한 유전적 변이는 다른 인종 간에서도 공통적으로 나타나는 것으로 보고된 바 있다(Marigorta UM et al., PLoS genetics 2013, 9(6):e1003566). 유전적 변이의 희귀성 또는 공통성의 중요성은 아직 정확하게 알려지지 않았으므로, 희귀한 변이 뿐만 아니라, 흔하고 보편적인 변이도 확인할 필요가 있다.

본 발명자들은 조기에 발병하는 아토피 피부염(AD)을 일으키는 유전적 변이를 동정하기 위하여 중증의 증상을 보이는 AD 가족력이 있는 한국인의 세 가계의 가족 구성원에 대하여 WES를 실시하고, 대립유전자(allele)를 비교하였다. 분석 결과, 세 가계에서 공통적으로 희귀하거나 흔하게 발견되는 다수의 유전적 변이가 관찰되었으며, 이 중 특히 COL6A6 유전자의 변이가 유전성 AD와 밀접하게 연관되어 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은

서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 A이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은

아토피 피부염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여

(1) 피검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및

(2) 상기 핵산 시료의 염기서열을 분석하여 COL6A6 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계

를 포함하는 COL6A6 유전자의 다형성을 마커로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 A이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

아토피 피부염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여

(1) 피검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및

(2) 상기 핵산 시료의 염기서열을 분석하여 COL6A6 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계

를 포함하는 COL6A6 유전자의 다형성을 마커로 검출하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 A이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리 뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 ‘상보적(complementary)'이라고 한다. 또한 본 명세서에서 ‘유전체 DNA(genomic DNA, gDNA)’는 한 개체의 유전자의 총 염기서열로서, 거의 완전한 유전정보를 포함하고 있는 DNA를 의미한다.

한편 본 명세서에서 유전자의 변이를 표기할 때 ’c.'은 단백질 코딩 부위의 변이를 의미하며, ‘(염기 위치)(염기일문자)(기호 >)(염기일문자)’는 해당 염기 위치에서 선행 표기된 염기가 후행 표기된 염기로 치환된다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르지닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 쓰레오닌; U(Sec):셀레노시스테인; V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신.

본 명세서에 표기되는 ‘(아미노산 일문자)(아미노산 위치)(아미노산 일문자)’는 천연형 단백질(wild-type protein)의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산이 후행 표기된 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다.

‘아토피(atopy)’는 아토피 소인을 가지고 있는 개인에서 피부, 호흡기 점막, 안점막, 장점막 등에 나타나는 일련의 알레르기 증상을 말하며, 이러한 아토피 소인(알레르기 체질)은 유전되어 가계의 다음 세대로 전달된다. 아토피 소인에 의한 알레르기 질환으로 알레르기 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 결막염, 아토피성 두드러기 등이 있으며, 이들 질환은 단독 또는 여러 질환이 동시에 나타날 수 있다.

‘아토피성 피부염’ 또는 ‘아토피 피부염(atopic dermatitis)’은 아토피 알레르기를 가진 사람에서 나타나는 대표적인 피부 질환으로, 흔히 태열이라고 불리는 만성 피부질환이다. 피부의 붉은 반점, 부종, 피부 건조증 및 가려움증이 주요 증상이며, 면역학적 특성을 보여 다른 알레르기 질환인 두드러기, 금속 알레르기, 천식이나 알레르기성 비염 등을 동반하는 경우가 있다.

본 명세서에서 ‘진단’은 질병 발생의 예측 및 발병 위험도(risk) 또는 발병 감수성(susceptibility)를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다.

본 발명의 목적상, 상기 진단은 아토피 피부염의 진단을 의미한다. 본 발명에서의 아토피 피부염은 바람직하게는 유전적 소인(genetic factor)에 의하여 유발되는 유전성(hereditary) 아토피 피부염일 수 있으며, 유전적 소인에 환경적인 영향이 더해져서 증상이 심화된 것일 수 있다. 또한 본 발명에서의 아토피 피부염은 조기에 발병하는 것일 수 있다. 상기 ‘조기 발병(early-onset)'이란 성인이 되기 전에 발병하는 것을 의미하며, 가장 바람직하게는 생후 2년 이내에 발병하는 것을 의미한다.

본 발명에서는 피검체에서 아토피 피부염의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 COL6A6 유전자의 다형성(polymorphism)을 진단 마커로 검출한다. ‘COL6A6'는 collagen type VI의 alpha 6 chain으로, 3q21 위치에 존재하며, 약 43개의 엑손(exon)으로 이루어져 있다. 인간에서 다양한 조직과 세포에서 발현되며, 특히 골격근과 피부의 기능에 중요하다. 본 발명에서의 COL6A6는 가장 바람직하게는 인간에서 유래한 것으로서, 인간 COL6A6 유전자의 mRNA와 단백질의 서열정보는 GenBank database에 각각 NM_001102608.1와 NP_001096078.1의 accession number로 공지되어 있다.

본 명세서에서 상기‘다형성(polymorphism)’이란 유전적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대립형질(또는 대립유전자)의 발생을 의미하며, ‘단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)'은 하나의 염기의 다형성을 의미한다. 구체적으로 유전체에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예를 들어 AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립유전자(A 또는 G)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNP는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 또한 SNP가 특정 질환과 유전적으로 밀접하게 연관되어 있는 경우에는, SNP는 확인된 정상인(normal) 또는 야생형(wild-type, WT) 개체 또는 대립유전자와 비교하여 특정 위치의 하나의 염기에 변이가 발생한 것을 의미하기도 한다.

본 발명에 따른 아토피 피부염 진단용 마커인 COL6A6의 SNP 부위는 COL6A6의 단백질 코딩 부위(coding region)에 위치하며, 아토피 피부염과 관련된 SNP 대립형질은 COL6A6 단백질 기능의 손상을 야기하는 것일 수 있다. 구체적인 COL6A6 SNP와 아토피 피부염과의 연관성은 다음과 같다:

1) 서열번호 1의 염기서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기:

서열번호 1은 SNP rs16830494의 염기서열이며, 26번째 염기에서 대립형질을 나타낸다. 상기 서열번호 1의 26번째 염기는 3번 염색체 상에서는 130,361,856번째 염기에 해당한다(표 2 참고). 아토피 피부염 가계의 아토피 피부염 환자는 상기 SNP 대립형질로서 '아데닌(adenine, A)' 염기를 갖는 것으로 확인되었다. 상기 아토피 피부염과 관련된 변이는 COL6A6 유전자의 단백질 코딩 부위(coding region)에서 5216번째 염기가 정상인의 G에서 A로 치환된 것(c.5216G>A)으로, COL6A6 단백질에서는 1739번째 아미노산 아르기닌이 글루타민으로 치환된 것(Arg1739Gln 또는 R1739Q)이다. COL6A6 유전자의 mRNA 염기서열(개시 코돈부터 종결 코돈까지의 서열)과 단백질의 아미노산 서열은 각각 본 명세서에 서열번호 10과 서열번호 11로 기재되어 있다.

2) 서열번호 2의 염기서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기:

서열번호 2는 SNP rs200963433의 염기서열이며, 26번째 염기에서 대립형질을 나타낸다. 상기 서열번호 2의 26번째 염기는 3번 염색체 상에서는 130,289,976번째 염기에 해당한다(표 4 참고). 아토피 피부염 가계의 아토피 피부염 환자는 상기 SNP 대립형질로서 '티민(thymine, T)' 염기를 갖는 것으로 확인되었다. 상기 아토피 피부염과 관련된 변이는 COL6A6 유전자의 단백질 코딩 부위(coding region)에서 2716번째 염기가 정상인의 C에서 T로 치환된 것(c.2716C>T)으로, COL6A6 단백질에서는 906번째 아미노산 아르기닌이 시스테인으로 치환된 것(Arg906Cys 또는 R906C)이다.

3) 서열번호 3의 염기서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기:

서열번호 3은 SNP rs59021909의 염기서열이며, 26번째 염기에서 대립형질을 나타낸다. 상기 서열번호 3의 26번째 염기는 3번 염색체의 130,285929번째 염기에 해당한다(표 3 참고). 아토피 피부염 가계의 아토피 피부염 환자는 상기 SNP 대립형질로서 '티민(thymine, T)' 염기를 갖는 것으로 확인되었다. 상기 아토피 피부염과 관련된 변이는 COL6A6 유전자의 단백질 코딩 부위(coding region)에서 1666번째 염기가 정상인의 C에서 T로 치환된 것(c.1666C>T)으로, COL6A6 단백질에서는 556번째 아미노산 프롤린이 시스테인으로 치환된 것(Pro556Ser 또는 P556S)이다.

이에 따라, 본 발명에 따른 아토피 피부염의 진단용 조성물은 상기 COL6A6 SNP를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 것이다. 보다 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 A이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 것이다.

상기 검출 제제는 구체적으로는 상기 COL6A6 SNP를 포함하는 부위의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하여 SNP 염기를 확인할 수 있는 프로브일 수 있다. 즉, 서열번호 1의 26번째 염기, 상기 서열번호 2의 26번째 염기 및 상기 서열번호 3의 26번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기를 검출할 수 있는 프로브인 것이다.

'프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA), DNA 등에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질(또는 대립유전자, allele)을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출 방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화(hybridization)란, 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 통상적으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 5×SSPE(750mM NaCl, 50mM sodium phosphate, 5mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30℃의 조건이 대립형질 특이적(allele-specific) 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

또한 상기 검출 제제는 COL6A6 SNP를 포함하는 부위의 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수도 있다. 즉, 서열번호 1의 26번째 염기, 상기 서열번호 2의 26번째 염기 및 상기 서열번호 3의 26번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기를 증폭할 수 있는 프라이머쌍인 것이다.

프라이머(primer)는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소(DNA polymerase)가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, T_m)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 상기 증폭 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 폴리뉴클레오티드의 특정 구간의 양쪽 끝부분(5‘말단 또는 3’말단)의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 쌍(세트)로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 앞서 서술한 COL6A6의 SNP 부위의 cDNA 또는 genomic DNA의 염기서열을 참조하여 본 발명에 따른 아토피 피부염의 진단을 위한 프라이머쌍을 용이하게 디자인할 수 있다. 본 발명에 따른 COL6A6의 SNP를 검출하기 위한 PCR cycle 조건은 실시예의 실험 방법에 구체적으로 기재되어 있다.

보다 구체적으로, 상기 프라이머쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 쌍, 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열의 쌍, 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머쌍일 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지 된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출하고자 하는 표적이 되는 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.

또한 본 발명에 따른 진단용 조성물은 COL6A6 SNP를 검출할 수 있는 진단용 키트 또는 진단용 마이크로어레이(microarray)로 제작될 수 있다.

프로브를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 프로브는 COL6A6 SNP의 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질 간에 명확한 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 혼성화 조건은 전술한 바와 같다.

상기 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하는 과정은 종래 기술을 사용하여 용이하게 실시할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또한 본 발명은

아토피 피부염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여

(1) 피검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및

(2) 상기 핵산 시료의 염기서열을 분석하여 COL6A6 유전자의 단일염기다형성( SNP ) 부위의 염기를 결정하는 단계

를 포함하는 COL6A6 유전자의 다형성을 마커로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 피검체의 시료는 피검체에서 분리된 혈액, 전혈, 혈장, 가래, 타액, 안구액, 정액, 세포와 조직(예를 들어 피부 등) 등 핵산 시료를 분리할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 혈액을 사용할 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 적절히 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등의 전처리를 할 수 있다. 핵산 시료를 분리하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

본 명세서에서 ‘검출’은 본 발명에 따른 진단 마커, 구체적으로는 COL6A6 SNP의 특정 염기의 존재 또는 부존재를 분석, 영상화, 확인 또는 확립하는 것을 의미한다.

상기 COL6A6의 단일염기다형성(SNP) 부위는 전술한 바와 같다. 구체적으로는 서열번호 1의 26번째 염기, 서열번호 2의 26번째 염기 및 서열번호 3의 26번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 단일염기다형성 부위가 서열번호 1의 26번째 염기가 A, 상기 서열번호 2의 26번째 염기가 T 및 상기 서열번호 3의 26번째 염기가 T로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기인 경우에 아토피 피부염으로 진단하거나, 아토피 피부염 발병 위험 또는 감수성이 높은 것으로 판단하게 된다.

상기 염기를 결정하는 단계는 당업계에 염기서열을 분석하고 결정하기 위하여 통상적으로 사용되는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 시퀀싱(sequencing), 엑솜 시퀀싱(exome sequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화(microarray hybridization), 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization), PCR 연장 분석 및 Taqman 기법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 방법으로 수행할 수 있다.

따라서 본 발명은 COL6A6 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위인 rs16830494, rs200963433, rs59021909의 26번째 염기의 변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물 상기 변이를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 중증의 증상을 동반하는 아토피 피부염의 가족력을 갖는 가계 구성원의 유전체 DNA의 단백질 코딩 부위를 분석한 결과, COL6A6 유전자의 상기 SNP의 특정 염기 변이가 아토피 피부염에 밀접하게 연관되어 있는 것으로 규명하였으며, 이를 이용하여 아토피 피부염을 진단하기 위한 유전자 진단 시약을 개발하는데 이용할 수 있다.

도 1은 아토피 피부염(AD) 가족력이 있는 한국인 가족의 가계도를 나타낸다. 기호 표시 사각형은 남성, 원형은 여성을 나타내며, 검정색 기호는 AD 환자를, 흰색 기호는 정상인을 나타낸다.
도 2는 AD 가계의 가족 구성원에서 발견된 보편적이거나 희귀한 유전자 변이에 대한 유전자형(genotype)을 나타낸다. 희귀한 변이(rare variant)는 대각선 표시로, 보편적인 변이(common variant)는 회색 표시로 나타냈다. 한 가계의 한 유전자 변이가 희귀하면서도 보편적인 변이인 것으로 확인되었다(rare and common variant).
도 3은 AD 가계에서 변이 선별을 위한 필터링 과정의 모식도이다
도 4는 세 가계에 공통적인 보편적인 변이와 희귀한 변이의 수를 나타내는 벤 다이어그램이다.
도 5는 AD 가계에서 생어 방법으로 확인된 COL6A6의 단백질 코딩 부위의 단일염기다형성(SNP) 변이를 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험 방법>

환자

본 연구는 중앙대학교병원 윤리위원회의 승인을 받아 이루어졌다. AD 가족력이 있는 한국인의 세 가계의 가족 구성원에서 말초혈액 샘플을 수득하였다. 각각의 가족은 AD 증상을 나타내는 2인과 정상인 2인으로 이루어져 있었다. 각각의 가족 구성원은 피부과 전문의의 진단을 받았다. 대상이 된 환자와 어린이들은 모두 생후 2년 이전에 AD가 발생하였다.

Whole-exome sequencing

유전체 DNA(genomic DNA)는 AD 가족력이 있는 가족 구성원에서 수득한 말초혈액으로부터 QIAamp DNA mini kit(Qiagen Inc, Valencia, CA, USA)를 이용하여 분리하였다. DNA의 양과 질은 Nanodrop spectrometer(Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA)와 Qubit Fluorometer(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)로 확인하였다. WES는 제조자의 표준 프로토콜에 따라 SureSelect Human All Exon V4+UTR 71 Mb(Agilent, CA, USA)을 이용하여 실시하였다. Genomic DNA는 Covaris(Covaris, Woburn, MA, USA)을 이용하여 절단하였다(shearing). Paired-end DNA sequencing library는 shearing, end-repair, A-tailing, peak detection, PE adaptor ligation, 그리고 amplification 과정을 통하여 제작하였다. 상기 제작한 라이브러리(Library)는 bait sequence와 24시간 동안 혼성화하고, 분리한 뒤, index index barcode tag을 이용하여 증폭하고 양과 질을 결정하였다. 엑솜 라이브러리(exome library)는 HiSeq SBS kit의 100-bp paired-end mode로 시퀀싱하였다.

Whole - Exome Sequencing 과정과 염기서열 배열( alignment )

FASTQ format의 sequence reads는 Burrows-Wheeler Aligner(BWA, v0.7.7) 프로그램을 이용하여 정확한 mate pair 정보를 갖는 SAM 파일을 생성되도록 ‘mem’ 그리고 seed value parameter ‘-k 45’로 human assembly UCSC hg19에 맵핑(mapping)하였다(Li H et al., Bioinformatics 2009, 25(14):1754-1760). Read group tag은 샘플명을 포함하였다. Picard(v1.92)를 이용하여 SAM 파일을 압축된 BAM 파일로 변환하고 BAM 파일을 염색체 좌표 위치(coordinate)에 따라 정렬하였다. The Genome Analysis Toolkit(v2.3.9Lite)을 이용하여 삽입/결손(insertion/deletion, indel)의 배열 오차를 포함할 수 있는 간격으로 BAM 파일을 국지적으로 재정렬하였다(DePristo MA et al., Nature genetics 2011, 43(5):491-498). 삽입과 결손은 각각 Mutect(Cingolani P et al., Fly 2012, 6(2):80-92)과 GATK Somatic Indel Detector를 이용하여 확인하였다. 단일 염기 변이와 indel은 snpEff(v3.6c)(Cibulskis K et al., Nature biotechnology 2013, 31(3):213-219)를 이용하여 ‘유사함(synonymous)', ’유사하지 않음(non-synonymous)', '미스센스(missense)', '프레임시프트 점돌연변이(frameshift point mutation)', '프레임쉬프트 삽입/결손(frameshift indel)' 등으로 분류하기 위한 주를 달았다(annotation).

Annotation

필터 1( Filter 1): SnpEff(http://snpeff.sourceforge.net/index.html)는 다양한 유전자의 아미노산 치환과 같은 변이의 주석을 달고, 변이의 효과를 예측하는 프로그램이다. 유전자 변이는 다양한 방식의 효과(예를 들어 ‘비유사 코딩(Non_Synonymous_coding)’, ‘종결 획득(Stop gained)’, ‘삽입(Insertion)’, ‘결손(Deletion)’ 등)를 유발한다.

필터 2( Filter 2): SnpEff에 의한 영향력 예측 분석은 유전자 변이의 잠정적인 영향력을 분석하는 것이 변이를 빠르게 분류하고 우선 순위를 쉽게 부여할 수 있게 함을 보여주었다(‘높음(High)’: ‘스플라이스 사이트 수여자(Splice_Site_Acceptor)’, ‘스플라이스 사이트 공여자(Splice_Site_Donor)’, ‘개시 손실(Start_Lost)’, ‘프레임쉬프트(Frame_Shift)’, ‘종결 획득(Stop_Gained)’; ‘중간(Moderate)’: ‘비유사 코딩(Non_Synonymous_ coding)’, ‘코돈 변경(Codon_Change)’, ‘코돈 삽입과 결손(Codon_Insertion and Deletion)’ 등)

필터 3( Filter 3): dbNSFP의 SIFT와 Polyphen2.

SIFT score는 아미노산 치환이 단백질 기능에 미치는 영향을 예측한다. SIFT의 예측은 PSI-BLAST를 통해 수집한 밀접하게 연관된 서열과의 배열에서 파악되는 아미노산의 보존 정도에 기반하고 있다. 범위는 0부터 1까지로, 0.05 보다 작은 score를 갖는 치환은 기능에 손상적인 것으로(수치가 낮을수록 손상 정도가 커지는 것으로), score가 높을수록 치환은 용인될 가능성이 높을 것으로 예측된다. Polyphen2 HDIV score는 HumDiv(hdiv_prob)에 기반하고 있다. score는 0부터 1 사이의 범위에 있으며, score가 0.957과 1 사이이면 ‘손상 개연성(probably damaging)’으로, 0.453부터 0.956 사이는 ‘손상 가능성(possibly damaging)', 0부터 0.452 사이는 '양호함(benign)'에 해당된다(score 수치가 높을수록 손상이 높음을 제시함).

필터 4( Filter 4): dbNSFP의 PhyloP은 계통수(phylogenetic tree)의 분지 이상의 진화 속도의 차이는 허용하면서, 양성 또는 음성 선택(positive or negative selection)이 진행 중인 위치를 찾는다. PhyloP score가 높을수록 보존된 위치임을 나타낸다(http://varianttools. sourceforge.net/Annotation/DbNSFP).

필터 5( Filter 5): PhastCons는 DNA 서열에 작용하는 정제 선택(purifying selecton)의 강도를 측정한다. 높은 PhastCons score(0.2)는 해당 유전체 부위가 기능적으로 중요하다는 중요한 근거가 된다.

필터 6( Filter 6): dbNSFP의 1000 유전체 대립유전자 빈도(the 1000 Genome allele frequency)는 빈도가 0.01보다 낮거나 알려지지 않은 유전자 변이를 선택한다. Filter 6는 전 세계 인종에서 관찰되는 소수 대립유전자 빈도(minor allele frequency, MAF)가 0.01이상 나오는 보편적인 변이를 제거하는 것이다.

필터 7( Filter 7): 한국 개인 유전체 프로젝트(The Korean Personal Genome Project, KPGP)는 국제적인 개인 유전체 프로젝트의 일환이다. KPGP는 KPGP dataset(http://kpgp.kr/)로부터 MAF 빈도 0.002 미만 또는 알려지지 않은 변이를 선택한다. 즉, Filter 7에서는 한국인의 MAF 0.002 이상의 보편적인 변이를 제거하는 것이다.

Sanger sequencing

WES로 선별된 단일염기다형성(SNP)을 Sanger 방법으로 검증하기 위한 PCR 조건은 다음과 같다: 95℃, 10min(1cycle); 95℃, 30s; 55-58℃, 30s; 72℃, 40s(35 cycles); 72℃, 1min 30s(1cycle). PCR 반응액(total volume 50μL)은 25μL의 2×EF-Taq premix(SolGent, Seoul, South Korea), 2.5μL의 oligonucleotide primer(10pmol/μL), 18μL의 증류수, 그리고 20ng의 genomic DNA를 포함하는 2μL의 template을 포함하였다. PCR 생성물은 PCR purification kit(Favorgen, Pingtung, Taiwan)를 이용하여 분리 정제하고, 제조사 매뉴얼에 따라 Applied Biosystems 3500 DNA sequencer(Foster City, CA, USA)를 이용하여 시퀀싱하였다.

통계 분석

로지스틱 회귀 분석을 이용하여 분석 대상인 SNP와 AD의 연관성에 대한 천연 오차 비율(crude odds ratio, ORs)과 95% 신뢰 구간(confidence intervals, CI)을 계산하였다. COL6A6 다형성과 AD와의 연관성은 Fisher's exact test를 이용하여 검정하였다.

< 실시예 1>

Whole exome sequencing 분석

AD 가족력이 있는 한국인의 세 가계의 가족 구성원의 말초혈액 샘플에서 분리한 유전체 DNA에 대하여 whole-exome sequencing(WES)를 실시하였다.

유전적인 요인만 분석하기 위하여 중증의 증상을 나타내는 AD 가족력이 있는 세 가계를 모집하고, 환경적인 영향을 최대한 제거하기 위하여 AD가 조기 발현하는 경우로 제한하였다. 부모 한 쪽과 자녀 한 쪽이 2살 이전에 AD가 발병한 경우, 정상인 가족 구성원과 함께 분석 대상으로 하였다. 분석 결과, 모든 AD 환자는 이형접합(heterozygote)의 유전형을 가지고 있었으며, 정상인 가족 구성원은 모든 확인된 변이에 대하여 동형접합(homozygote)의 야생형(wild-type, WT) 유전형을 가지고 있었다(도 1, 도 2).

각 개인으로부터 얻어진 WES 데이터는 AD와 관련된 변이 후보를 선별해내기 위하여 도 3에 도시된 바와 같이 단계적으로 필터링하였다. AD 가계 당 평균 필터 4를 통과한 176가지 보편적인 변이(common variant)와 필터 5의 1000 Genome을 통과한 48가지 희귀한 변이(rare variant)가 확인되었다. KPGP에서는 평균 44개의 희귀한 변이가 감지되었다(표 1).

아미노산 치환과 변이 종류(‘비유사 SNP(non-synonymous SNP)’, ‘종결 획득(stop gained)’, ‘삽입(insertion)’, ‘결손(deletion)’ 등)은 1단계 필터(필터 1)로 결정되었다. ‘비유사 SNP’는 다른 아미노산의 코돈으로 전환시키는 단일염기의 변화를 의미한다. 세 가계에서 모두 상당 수의 ‘비유사 SNP’가 관찰되었다. 필터 5에서 발견된 변이들은 보편적인 변이(1% 보다 높은 MAF)라는 점 외에도, 척추동물 100여 종 간에 잘 보존된 염기서열을 가지고 있으며, 변이로 단백질 기능이 손상되었을 것으로 예측되는 기능성 유전자임을 보여주었다.

< 실시예 2>

AD 가계에 공통적인 유전자 변이의 특징

선별된 유전자 변이 중 특히 중요한 변이를 찾기 위하여 세 가계에서 필터 5를 통해 확인된 보편적인 변이에 공통적인 유전자를 확인하였다(도 2, 도 4).

필터 5에서는 14종류의 중복된 유전자가 있었는데, 그 중 4종류는 필터 7까지 이르러 희귀한 변이로 분류될 수 있는 것들이었다(도 2). AD 환자에서의 위험 대립유전자(risk allele)는 건강한 대조군과 비교하여 동정하였다(도 2). 상기 유전자 중 UNC93A 유전자는 종결 코돈을 획득하였으며, 다른 유전자들은 ‘비유사 SNP’ 변이를 보였다. 특히 COL6A6 유전자의 변이는 세 가계에서 모두 확인되었으며(표 2~표 4), 가계 A에는 두 가지 COL6A6 SNP가 존재하는 것으로 나타났다(표 2). 14가지 유전자의 유전자형은 exome 분석으로 조사하였다. AD가 있는 아버지와 어린이들은 이형접합형이었으며, 정상인 어머니와 어린이들은 14개 유전자 모두에 대하여 동형접합형의 야생형(wild-type, WT) 유전자를 가지고 있었다(도 2).

세 가계에 공통적으로 변이가 발견된 14개 유전자의 염색체 위치, 아미노산 변화 그리고 기능성 예측의 지수를 확인하였다. 상기 14개 유전자는 기능적으로 중요하면서, SIFT(변이가 기능을 손상시키거나 유해한 것일 가능성)과 PhyloP (척추동물 100여 종간에 잘 보존되어 있음) 분석 결과로도 뒷받침되는 것으로 나타났다. 특히 세 가계에서 모두 COL6A6 유전자의 SIFT 지수가 낮고, PhyloP과 Phastcon 지수가 높게 나온 것은 유전자 변이가 COL6A6의 기능을 손상시키는 것으로 판단되었다. 또한 세 가계의 COL6A6의 KPGP 지수는 MAF가 한국인 1,000명당 5~21%의 범위에 있을 것임을 보여주었다.

< 실시예 3>

AD 와 COL6A6 SNP 변이 연관성

앞선 실시예에서 확인한 바와 같이, 아토피 피부염과 관련하여 의미있는 기능성 예측 점수(functional prediction score)를 가지면서 유전체 상 아토피 피부염 발병 민감성 부위로 알려진 3q21에 위치하고, 세 가계에 공통적인 변이가 발견된 COL6A6 유전자에 대하여 WES로 확인된 변이와 아토피 피부염의 상관관계를 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)으로 검증하였다. Sanger seqeuncing에 사용된 프라이머는 표 5에 기재한 바와 같다.

그 결과, WES 결과와 동일한 위치에서 변이를 확인하였다. 가계 A에서는 AD 환자에서는 missense 돌연변이인 c.5216G>A, p.Arg1739Gln(보편적인 변이; SNP rs16830494에 해당)와 c.2716C>T, p.Arg906Cys(희귀한 변이; SNP rs200963433에 해당)가 발견되었으며, 건강한 가족 구성원들은 이들 변이를 가지고 있지 않았다(도 5). 가계 B에서는 missense 돌연변이인 c.1666C>T, p.Pro556Ser(보편적인 변이; SNP rs59021909에 해당)가 존재하였고, 가계 C에서는 역시 missense 변이인 c.2716C>T, p.Arg906Cys(희귀한 변이)가 관찰되었다. 이상의 결과는 각 가계의 AD 환자에서 발견된 COL6A6 SNP 변이가 AD 발병과 밀접하게 연관되어 있으며, AD 발병 위험 인자일 가능성이 매우 높음을 시사하고 있다.

또한 본 연구에서 변이가 확인된 CDX1, ANKRD35 그리고 TUFT1 등의 유전자는 AD와 연관성이 있는 것으로 알려진 5q31-33 또는 1q21 등에 위치하였으며, 세 가계에서 공통적으로 변이가 발견된 COL6A6 유전자 또한 AD에 밀접하게 연관된 것으로 알려진 3q21 위치에 존재하는 것으로 확인되었다(표 6). 이는 COL6A6 유전자의 변이 및 단백질의 기능 손상이 AD 발병에 관여할 가능성을 뒷받침하는 것이다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 아토피성 피부염을 조기에 발견하여 초기에 적절하게 대응하여 효과적으로 치료할 수 있게 하기 위한 아토피 피부염의 유전자 진단 시약과 진단용 칩을 개발하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Composition and method for diagnosing atopic dermatitis using COL6A6 SNP <130> NP16-0067 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens rs16830494 <400> 1 acatgtgagc tcattcagta tgtgcgagac cgcagtcgta agtaccctgc t 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens rs200963433 <400> 2 catgttcact gaagcccggg gcagccgcct gaacaagggg gtcccccaag t 51 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens rs59021909 <400> 3 catgtccaag gatagcatct tggagcctgc aaacagactg agagaagagc a 51 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs16830494 forward primer <400> 4 tagggtgtga aaggagcc 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs16830494 reverse primer <400> 5 agcaaccaga gagggagtta 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs200963433 forward 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acattggaca aaccaccctg 2100 actggtagtg ccctgagctt tgtgtctcag tacttcagcc ccaccaaggg cgcccggccc 2160 aacatcagaa agtttctcat cctcatcacg gatggtgaag ctcaggacat agtaaaggaa 2220 ccagcagtag tgcttcggca agaaggtgta atcatctatt ctgtgggagt gtttggctcc 2280 aatgtcaccc agcttgagga gatcagtggg aggcccgaga tggtttttta tgttgagaat 2340 tttgacattc tgcagcgcat tgaagatgat cttgtttttg gaatatgcag cccccgtgaa 2400 gaatgcaagc ggattgaagt tttagacgtt gtgtttgtca ttgatagctc tggcagtatt 2460 gactatgatg agtataatat catgaaggat tttatgattg gcttagtgaa aaaagctgat 2520 gtgggcaaga atcaggtccg gtttggggct ctgaagtatg ctgatgaccc agaggtgctg 2580 ttttatctgg atgactttgg cacaaaactg gaggtaattt cagtgctcca gaatgaccaa 2640 gccatgggtg gcagtactta tactgctgag gcactgggct tctcagacca catgttcact 2700 gaagcccggg gcagccgcct gaacaagggg gtcccccaag tcctcattgt gatcaccgat 2760 ggggaatccc atgatgctga taaactcaat gccacggcaa aggccttgcg ggacaaaggc 2820 attcttgtcc tggctgtggg gattgatggt gccaatcccg tggagctgtt agccatggca 2880 ggatcaagcg acaagtactt cttcgtggag acttttggag gtctgaaggg aatattttca 2940 gatgtgacag ccagtgtctg caactcttca aaagtagatt gtgaaattga caaagtagat 3000 cttgttttcc ttatggatgg ttcaactagc attcagccaa atgacttcaa gaaaatgaag 3060 gaatttctgg catctgttgt tcaagacttt gatgtcagcc tcaacagagt gcgaatagga 3120 gcggcccagt ttagcgatac ctatcacccg gagtttccac tgggaacttt cataggtgaa 3180 aaagagatat catttcagat tgaaaacatc aagcagatct ttggaaacac acacatcggt 3240 gctgcactca gggaggtgga acattacttc aggccagaca tgggcagcag gataaataca 3300 ggtaccccac aggtgctgct ggtccttaca gatggccagt cccaagacga ggtggcccag 3360 gccgcggaag ccctgagaca cagaggtatc gacatctact ccgtgggcat tggggatgtg 3420 gatgaccagc agctcattca gatcaccggg actgcagaga aaaaactgac agtgcacaac 3480 ttcgatgaac tgaagaaggt caataaaagg atcgttcgca acatctgtac cacagcgggt 3540 gaaagcaact gtttcgtgga tgttgtggtg ggatttgatg tctcaactca ggagaaaggg 3600 cagactttgc ttgaaggtca gccttggatg gaaacctacc ttcaagacat cttacgtgcc 3660 atcagctccc tcaatggagt aagctgtgag gtgggcacag agactcaggt cagtgtggct 3720 tttcaagtga ccaatgccat ggaaaaatat tctcccaagt ttgagatcta cagtgaaaac 3780 atactgaata gcttgaagga tataacagtt aaaggaccat ctcttctcaa tgcaaacctc 3840 ttggattctc tatgggatac atttcagaat aaatcagctg ctcgaggaaa ggtggtcctt 3900 ttattttcag atggattgga tgatgatgtt gagaaacttg aacaaaaatc tgatgaactt 3960 agaaaagaag gcctgaatgc cctcataact gttgctctgg atggacctgc tgattcaagt 4020 gacttggctg atcttcccta tattgaattt gggaaaggat ttgagtacag gacacagctc 4080 tctattggca tgagagaact tggaagccgg ctgtcaaagc agctggtcaa tgttgctgaa 4140 aggacatgct gctgtttgtt ctgcaagtgc attggaggag atggcacaat gggagatcct 4200 ggaccaccag ggaaaagggg acctccaggt tttaaaggca gtgaaggcta cctgggagag 4260 gagggaatcg ctggagaaag aggagcccct ggaccagtgg gagagcaagg tactaaggga 4320 tgctatggca ccaaaggtcc taagggaaac agaggactaa atggacagga gggagaagtt 4380 ggggaaaatg gaattgacgg attaaacgga gaacagggtg ataatggtct tcctggaaga 4440 aaaggagaaa agggagatga gggatctcag ggaagcccag ggaagagagg gactcctggt 4500 gaccgtggag caaagggcct gcgaggggat cccggagctc ctggagttga cagtagcata 4560 gaaggaccca caggcttgaa aggagaacgt ggaagacaag gcagaagagg ctggccaggc 4620 ccccccggga caccaggctc cagaagaaag acagcagctc atggcagaag gggacataca 4680 ggcccacagg gaacagcagg catcccagga ccagatggac ttgaaggctc cctgggactt 4740 aagggccctc agggcccaag aggagaggct ggtgtgaaag gagaaaaagg aggtgtggga 4800 agtaaaggtc cccaggggcc tccaggaccc ggaggagagg cagggaatca aggccgtttg 4860 ggaagccaag gaaataaagg agaacctgga gatctgggag aaaaaggagc tgttggcttt 4920 cctggtcctc gtggcttgca gggcaatgat ggcagtccag gttatggtag tgtcggacgc 4980 aagggagcaa agggacaaga aggattccct ggagaaagtg gacctaaggg tgagattggg 5040 gaccctggtg gtccaggaga gactgggctg aagggagcta gaggcaaaat gatatctgct 5100 gggcttccag gagagatggg atcccctggg gaaccaggac ctcctggacg taagggtgtg 5160 aaaggagcca aaggcttggc ttcattttct acatgtgagc tcattcagta tgtgcgagac 5220 cgcagtcctg gcaggcatgg aaaaccggaa tgcccagtgc acccaaccga gttggtgttt 5280 gccctggacc actcccggga tgtcactgag caggaatttg agcggatgaa ggagatgatg 5340 gctttcctgg tgagagacat taaggtccgg gagaacagct gccccgtggg agcgcacatc 5400 gccatcctct cctataactc ccacgccagg caccttgtgc gcttctcaga cgcctacaag 5460 aagagtcaac ttctcagaga aattgaaact attccttatg agagatcctc tgccagcagg 5520 gagattggca gagcaatgcg gtttatttcc aggaatgtct tcaagcggac gcttccgggg 5580 gcacacacga gaaaaatcgc cacatttttc agcagcggtc agtccgcgga tgcccactcc 5640 atcaccacgg ctgccatgga gttcggcgcg cttgaaatca ttcccgtggt gatcactttc 5700 agcaacgtgc cctcggtcag gcgcgcattt gcgattgacg acactggcac atttcaagta 5760 atagtggttc cctccggggc cgactacata ccagcattag agagactcca gcggtgcact 5820 ttctgctatg atgtgtgcaa gccagatgct tcttgtgacc aagccagacc accccctgtg 5880 cagtcttaca tggatgctgc tttccttctg gatgcctccc ggaacatggg aagtgctgaa 5940 tttgaagaca taagagcctt ccttggagca ctattagatc actttgaaat caccccagag 6000 ccggagactt ctgtcactgg agaccgggtg gccctattga gccatgctcc ccccgacttc 6060 ctacccaaca ctcagaagag tccagttaga gctgagttca atcttaccac ctacagaagt 6120 aagcgcctca tgaagaggca tgtgcacgag tcagttaaac aactaaatgg agatgctttt 6180 attggtcatg ccttacagtg gactctggac aatgtatttt taagtacacc caatctgaga 6240 agaaacaaag tcatatttgt gatatctgct ggggaaacca gccacttaga tggggaaatc 6300 ttaaagaagg aatccttgcg agccaaatgt cagggatatg ccttatttgt gttttccctt 6360 ggccctattt gggatgacaa ggaactggag gatctcgcca gccacccttt ggatcaccac 6420 ctggtccagc ttggccgaat tcataaacct gaccacagtt atggtgtgaa gtttgtgaag 6480 tcctttataa actcaatcag gcgtgcaatc aacaaatatc caccaataaa cttaaaaata 6540 aagtgcaaca gacttaactc tatagatcca aagcagcccc cacgaccatt ccgaagcttt 6600 gttcctggac cacttaaagc taccctcaaa gaagatgtat tacagaaggc aaaattcttt 6660 caagataaaa aatatctttc aagagtagca agaagtggca gagatgatgc tattcaaaat 6720 tttatgagaa gcacctccca tacctttaag aatggaagga tgatagaaag tgctcccaaa 6780 caacatgatt aa 6792 <210> 11 <211> 2263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens COL6A6 protein (NP_001096078.1) <400> 11 Met Met Leu Leu Ile Leu Phe Leu Val Ile Ile Cys Ser His Ile Ser 1 5 10 15 Val Asn Gln Asp Ser Gly Pro Glu Tyr Ala Asp Val Val Phe Leu Val 20 25 30 Asp Ser Ser Asp Arg Leu Gly Ser Lys Ser Phe Pro Phe Val Lys Met 35 40 45 Phe Ile Thr Lys Met Ile Ser Ser Leu Pro Ile Glu Ala Asp Lys Tyr 50 55 60 Arg Val Ala Leu Ala Gln Tyr Ser Asp Lys Leu His Ser Glu Phe His 65 70 75 80 Leu Ser Thr Phe Lys Gly Arg Ser Pro Met Leu Asn His Leu Arg Lys 85 90 95 Asn Phe Gly Phe Ile Gly Gly Ser Leu Gln Ile Gly Lys Ala Leu Gln 100 105 110 Glu Ala His Arg Thr Tyr Phe Ser Ala Pro Ala Asn Gly Arg Asp Lys 115 120 125 Lys Gln Phe Pro Pro Ile Leu Val Val Leu Ala Ser Ser Glu Ser Glu 130 135 140 Asp Asn Val Glu Glu Ala Ser Lys Ala Leu Arg Lys Asp Gly Val Lys 145 150 155 160 Ile Ile Ser Val Gly Val Gln Lys Ala Ser Glu Glu Asn Leu Lys Ala 165 170 175 Met Ala Thr Ser Gln Phe His Phe Asn Leu Arg Thr Val Arg Asp Leu 180 185 190 Ser Met Phe Ser Gln Asn Met Thr His Ile Ile Lys Asp Val Ile Lys 195 200 205 Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Asp Ile Phe Val Glu Ala Cys Gln Gly 210 215 220 Pro Ser Met Ala Asp Val Val Phe Leu Leu Asp Met Ser Ile Asn Gly 225 230 235 240 Ser Glu Glu Asn Phe Asp Tyr Leu Lys Gly Phe Leu Glu Glu Ser Val 245 250 255 Ser Ala Leu Asp Ile Lys Glu Asn Cys Met Arg Val Gly Leu Val Ala 260 265 270 Tyr Ser Asn Glu Thr Lys Val Ile Asn Ser Leu Ser Met Gly Ile Asn 275 280 285 Lys Ser Glu Val Leu Gln His Ile Gln Asn Leu Ser Pro Arg Thr Gly 290 295 300 Lys Ala Tyr Thr Gly Ala Ala Ile Lys Lys Leu Arg Lys Glu Val Phe 305 310 315 320 Ser Ala Arg Asn Gly Ser Arg Lys Asn Gln Gly Val Pro Gln Ile Ala 325 330 335 Val Leu Val Thr His Arg Asp Ser Glu Asp Asn Val Thr Lys Ala Ala 340 345 350 Val Asn Leu Arg Arg Glu Gly Val Thr Ile Phe Thr Leu Gly Ile Glu 355 360 365 Gly Ala Ser Asp Thr Gln Leu Glu Lys Ile Ala Ser His Pro Ala Glu 370 375 380 Gln Tyr Val Ser Lys Leu Lys Thr Phe Ala Asp Leu Ala Ala His Asn 385 390 395 400 Gln Thr Phe Leu Lys Lys Leu Arg Asn Gln Ile Thr His Thr Val Ser 405 410 415 Val Phe Ser Glu Arg Thr Glu Thr Leu Lys Ser Gly Cys Val Asp Thr 420 425 430 Glu Glu Ala Asp Ile Tyr Leu Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Thr Gln 435 440 445 Ala Thr Asp Phe His Glu Met Lys Thr Phe Leu Ser Glu Val Val Gly 450 455 460 Met Phe Asn Ile Ala Pro His Lys Val Arg Val Gly Ala Val Gln Tyr 465 470 475 480 Ala Asp Ser Trp Asp Leu Glu Phe Glu Ile Asn Lys Tyr Ser Asn Lys 485 490 495 Gln Asp Leu Gly Lys Ala Ile Glu Asn Ile Arg Gln Met Gly Gly Asn 500 505 510 Thr Asn Thr Gly Ala Ala Leu Asn Phe Thr Leu Ser Leu Leu Gln Lys 515 520 525 Ala Lys Lys Gln Arg Gly Asn Lys Val Pro Cys His Leu Val Val Leu 530 535 540 Thr Asn Gly Met Ser Lys Asp Ser Ile Leu Glu Pro Ala Asn Arg Leu 545 550 555 560 Arg Glu Glu His Ile Arg Val Tyr Ala Ile Gly Ile Lys Glu Ala Asn 565 570 575 Gln Thr Gln Leu Arg Glu Ile Ala Gly Glu Glu Lys Arg Val Tyr Tyr 580 585 590 Val His Asp Phe Asp Ala Leu Lys Asp Ile Arg Asn Gln Val Val Gln 595 600 605 Glu Ile Cys Thr Glu Glu Ala Cys Lys Glu Met Lys Ala Asp Ile Met 610 615 620 Phe Leu Val Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Pro Glu Asn Phe Ser Lys 625 630 635 640 Met Lys Thr Phe Met Lys Asn Leu Val Ser Lys Ser Gln Ile Gly Pro 645 650 655 Asp Arg Val Gln Ile Gly Val Val Gln Phe Ser Asp Ile Asn Lys Glu 660 665 670 Glu Phe Gln Leu Asn Arg Phe Met Ser Gln Ser Asp Ile Ser Asn Ala 675 680 685 Ile Asp Gln Met Ala His Ile Gly Gln Thr Thr Leu Thr Gly Ser Ala 690 695 700 Leu Ser Phe Val Ser Gln Tyr Phe Ser Pro Thr Lys Gly Ala Arg Pro 705 710 715 720 Asn Ile Arg Lys Phe Leu Ile Leu Ile Thr Asp Gly Glu Ala Gln Asp 725 730 735 Ile Val Lys Glu Pro Ala Val Val Leu Arg Gln Glu Gly Val Ile Ile 740 745 750 Tyr Ser Val Gly Val Phe Gly Ser Asn Val Thr Gln Leu Glu Glu Ile 755 760 765 Ser Gly Arg Pro Glu Met Val Phe Tyr Val Glu Asn Phe Asp Ile Leu 770 775 780 Gln Arg Ile Glu Asp Asp Leu Val Phe Gly Ile Cys Ser Pro Arg Glu 785 790 795 800 Glu Cys Lys Arg Ile Glu Val Leu Asp Val Val Phe Val Ile Asp Ser 805 810 815 Ser Gly Ser Ile Asp Tyr Asp Glu Tyr Asn Ile Met Lys Asp Phe Met 820 825 830 Ile Gly Leu Val Lys Lys Ala Asp Val Gly Lys Asn Gln Val Arg Phe 835 840 845 Gly Ala Leu Lys Tyr Ala Asp Asp Pro Glu Val Leu Phe Tyr Leu Asp 850 855 860 Asp Phe Gly Thr Lys Leu Glu Val Ile Ser Val Leu Gln Asn Asp Gln 865 870 875 880 Ala Met Gly Gly Ser Thr Tyr Thr Ala Glu Ala Leu Gly Phe Ser Asp 885 890 895 His Met Phe Thr Glu Ala Arg Gly Ser Arg Leu Asn Lys Gly Val Pro 900 905 910 Gln Val Leu Ile Val Ile Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Ala Asp Lys 915 920 925 Leu Asn Ala Thr Ala Lys Ala Leu Arg Asp Lys Gly Ile Leu Val Leu 930 935 940 Ala Val Gly Ile Asp Gly Ala Asn Pro Val Glu Leu Leu Ala Met Ala 945 950 955 960 Gly Ser Ser Asp Lys Tyr Phe Phe Val Glu Thr Phe Gly Gly Leu Lys 965 970 975 Gly Ile Phe Ser Asp Val Thr Ala Ser Val Cys Asn Ser Ser Lys Val 980 985 990 Asp Cys Glu Ile Asp Lys Val Asp Leu Val Phe Leu Met Asp Gly Ser 995 1000 1005 Thr Ser Ile Gln Pro Asn Asp Phe Lys Lys Met Lys Glu Phe Leu Ala 1010 1015 1020 Ser Val Val Gln Asp Phe Asp Val Ser Leu Asn Arg Val Arg Ile Gly 1025 1030 1035 1040 Ala Ala Gln Phe Ser Asp Thr Tyr His Pro Glu Phe Pro Leu Gly Thr 1045 1050 1055 Phe Ile Gly Glu Lys Glu Ile Ser Phe Gln Ile Glu Asn Ile Lys Gln 1060 1065 1070 Ile Phe Gly Asn Thr His Ile Gly Ala Ala Leu Arg Glu Val Glu His 1075 1080 1085 Tyr Phe Arg Pro Asp Met Gly Ser Arg Ile Asn Thr Gly Thr Pro Gln 1090 1095 1100 Val Leu Leu Val Leu Thr Asp Gly Gln Ser Gln Asp Glu Val Ala Gln 1105 1110 1115 1120 Ala Ala Glu Ala Leu Arg His Arg Gly Ile Asp Ile Tyr Ser Val Gly 1125 1130 1135 Ile Gly Asp Val Asp Asp Gln Gln Leu Ile Gln Ile Thr Gly Thr Ala 1140 1145 1150 Glu Lys Lys Leu Thr Val His Asn Phe Asp Glu Leu Lys Lys Val Asn 1155 1160 1165 Lys Arg Ile Val Arg Asn Ile Cys Thr Thr Ala Gly Glu Ser Asn Cys 1170 1175 1180 Phe Val Asp Val Val Val Gly Phe Asp Val Ser Thr Gln Glu Lys Gly 1185 1190 1195 1200 Gln Thr Leu Leu Glu Gly Gln Pro Trp Met Glu Thr Tyr Leu Gln Asp 1205 1210 1215 Ile Leu Arg Ala Ile Ser Ser Leu Asn Gly Val Ser Cys Glu Val Gly 1220 1225 1230 Thr Glu Thr Gln Val Ser Val Ala Phe Gln Val Thr Asn Ala Met Glu 1235 1240 1245 Lys Tyr Ser Pro Lys Phe Glu Ile Tyr Ser Glu Asn Ile Leu Asn Ser 1250 1255 1260 Leu Lys Asp Ile Thr Val Lys Gly Pro Ser Leu Leu Asn Ala Asn Leu 1265 1270 1275 1280 Leu Asp Ser Leu Trp Asp Thr Phe Gln Asn Lys Ser Ala Ala Arg Gly 1285 1290 1295 Lys Val Val Leu Leu Phe Ser Asp Gly Leu Asp Asp Asp Val Glu Lys 1300 1305 1310 Leu Glu Gln Lys Ser Asp Glu Leu Arg Lys Glu Gly Leu Asn Ala Leu 1315 1320 1325 Ile Thr Val Ala Leu Asp Gly Pro Ala Asp Ser Ser Asp Leu Ala Asp 1330 1335 1340 Leu Pro Tyr Ile Glu Phe Gly Lys Gly Phe Glu Tyr Arg Thr Gln Leu 1345 1350 1355 1360 Ser Ile Gly Met Arg Glu Leu Gly Ser Arg Leu Ser Lys Gln Leu Val 1365 1370 1375 Asn Val Ala Glu Arg Thr Cys Cys Cys Leu Phe Cys Lys Cys Ile Gly 1380 1385 1390 Gly Asp Gly Thr Met Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Lys Arg Gly Pro 1395 1400 1405 Pro Gly Phe Lys Gly Ser Glu Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Ile Ala 1410 1415 1420 Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Glu Gln Gly Thr Lys Gly 1425 1430 1435 1440 Cys Tyr Gly Thr Lys Gly Pro Lys Gly Asn Arg Gly Leu Asn Gly Gln 1445 1450 1455 Glu Gly Glu Val Gly Glu Asn Gly Ile Asp Gly Leu Asn Gly Glu Gln 1460 1465 1470 Gly Asp Asn Gly Leu Pro Gly Arg Lys Gly Glu Lys Gly Asp Glu Gly 1475 1480 1485 Ser Gln Gly Ser Pro Gly Lys Arg Gly Thr Pro Gly Asp Arg Gly Ala 1490 1495 1500 Lys Gly Leu Arg Gly Asp Pro Gly Ala Pro Gly Val Asp Ser Ser Ile 1505 1510 1515 1520 Glu Gly Pro Thr Gly Leu Lys Gly Glu Arg Gly Arg Gln Gly Arg Arg 1525 1530 1535 Gly Trp Pro Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Arg Lys Thr Ala 1540 1545 1550 Ala His Gly Arg Arg Gly His Thr Gly Pro Gln Gly Thr Ala Gly Ile 1555 1560 1565 Pro Gly Pro Asp Gly Leu Glu Gly Ser Leu Gly Leu Lys Gly Pro Gln 1570 1575 1580 Gly Pro Arg Gly Glu Ala Gly Val Lys Gly Glu Lys Gly Gly Val Gly 1585 1590 1595 1600 Ser Lys Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gly Gly Glu Ala Gly Asn 1605 1610 1615 Gln Gly Arg Leu Gly Ser Gln Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Asp Leu 1620 1625 1630 Gly Glu Lys Gly Ala Val Gly Phe Pro Gly Pro Arg Gly Leu Gln Gly 1635 1640 1645 Asn Asp Gly Ser Pro Gly Tyr Gly Ser Val Gly Arg Lys Gly Ala Lys 1650 1655 1660 Gly Gln Glu Gly Phe Pro Gly Glu Ser Gly Pro Lys Gly Glu Ile Gly 1665 1670 1675 1680 Asp Pro Gly Gly Pro Gly Glu Thr Gly Leu Lys Gly Ala Arg Gly Lys 1685 1690 1695 Met Ile Ser Ala Gly Leu Pro Gly Glu Met Gly Ser Pro Gly Glu Pro 1700 1705 1710 Gly Pro Pro Gly Arg Lys Gly Val Lys Gly Ala Lys Gly Leu Ala Ser 1715 1720 1725 Phe Ser Thr Cys Glu Leu Ile Gln Tyr Val Arg Asp Arg Ser Pro Gly 1730 1735 1740 Arg His Gly Lys Pro Glu Cys Pro Val His Pro Thr Glu Leu Val Phe 1745 1750 1755 1760 Ala Leu Asp His Ser Arg Asp Val Thr Glu Gln Glu Phe Glu Arg Met 1765 1770 1775 Lys Glu Met Met Ala Phe Leu Val Arg Asp Ile Lys Val Arg Glu Asn 1780 1785 1790 Ser Cys Pro Val Gly Ala His Ile Ala Ile Leu Ser Tyr Asn Ser His 1795 1800 1805 Ala Arg His Leu Val Arg Phe Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ser Gln Leu 1810 1815 1820 Leu Arg Glu Ile Glu Thr Ile Pro Tyr Glu Arg Ser Ser Ala Ser Arg 1825 1830 1835 1840 Glu Ile Gly Arg Ala Met Arg Phe Ile Ser Arg Asn Val Phe Lys Arg 1845 1850 1855 Thr Leu Pro Gly Ala His Thr Arg Lys Ile Ala Thr Phe Phe Ser Ser 1860 1865 1870 Gly Gln Ser Ala Asp Ala His Ser Ile Thr Thr Ala Ala Met Glu Phe 1875 1880 1885 Gly Ala Leu Glu Ile Ile Pro Val Val Ile Thr Phe Ser Asn Val Pro 1890 1895 1900 Ser Val Arg Arg Ala Phe Ala Ile Asp Asp Thr Gly Thr Phe Gln Val 1905 1910 1915 1920 Ile Val Val Pro Ser Gly Ala Asp Tyr Ile Pro Ala Leu Glu Arg Leu 1925 1930 1935 Gln Arg Cys Thr Phe Cys Tyr Asp Val Cys Lys Pro Asp Ala Ser Cys 1940 1945 1950 Asp Gln Ala Arg Pro Pro Pro Val Gln Ser Tyr Met Asp Ala Ala Phe 1955 1960 1965 Leu Leu Asp Ala Ser Arg Asn Met Gly Ser Ala Glu Phe Glu Asp Ile 1970 1975 1980 Arg Ala Phe Leu Gly Ala Leu Leu Asp His Phe Glu Ile Thr Pro Glu 1985 1990 1995 2000 Pro Glu Thr Ser Val Thr Gly Asp Arg Val Ala Leu Leu Ser His Ala 2005 2010 2015 Pro Pro Asp Phe Leu Pro Asn Thr Gln Lys Ser Pro Val Arg Ala Glu 2020 2025 2030 Phe Asn Leu Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Arg Leu Met Lys Arg His Val 2035 2040 2045 His Glu Ser Val Lys Gln Leu Asn Gly Asp Ala Phe Ile Gly His Ala 2050 2055 2060 Leu Gln Trp Thr Leu Asp Asn Val Phe Leu Ser Thr Pro Asn Leu Arg 2065 2070 2075 2080 Arg Asn Lys Val Ile Phe Val Ile Ser Ala Gly Glu Thr Ser His Leu 2085 2090 2095 Asp Gly Glu Ile Leu Lys Lys Glu Ser Leu Arg Ala Lys Cys Gln Gly 2100 2105 2110 Tyr Ala Leu Phe Val Phe Ser Leu Gly Pro Ile Trp Asp Asp Lys Glu 2115 2120 2125 Leu Glu Asp Leu Ala Ser His Pro Leu Asp His His Leu Val Gln Leu 2130 2135 2140 Gly Arg Ile His Lys Pro Asp His Ser Tyr Gly Val Lys Phe Val Lys 2145 2150 2155 2160 Ser Phe Ile Asn Ser Ile Arg Arg Ala Ile Asn Lys Tyr Pro Pro Ile 2165 2170 2175 Asn Leu Lys Ile Lys Cys Asn Arg Leu Asn Ser Ile Asp Pro Lys Gln 2180 2185 2190 Pro Pro Arg Pro Phe Arg Ser Phe Val Pro Gly Pro Leu Lys Ala Thr 2195 2200 2205 Leu Lys Glu Asp Val Leu Gln Lys Ala Lys Phe Phe Gln Asp Lys Lys 2210 2215 2220 Tyr Leu Ser Arg Val Ala Arg Ser Gly Arg Asp Asp Ala Ile Gln Asn 2225 2230 2235 2240 Phe Met Arg Ser Thr Ser His Thr Phe Lys Asn Gly Arg Met Ile Glu 2245 2250 2255 Ser Ala Pro Lys Gln His Asp 2260

Claims (10)

1. 서열번호 1의 염기서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 A이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 T이고, 상기 26번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 검출 제제는 서열번호 1의 26번째 염기, 상기 서열번호 2의 26번째 염기 및 상기 서열번호 3의 26번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기를 검출할 수 있는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 검출 제제는 서열번호 1의 26번째 염기, 상기 서열번호 2의 26번째 염기 및 상기 서열번호 3의 26번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기를 증폭할 수 있는 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 쌍, 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열의 쌍, 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 아토피 피부염은 유전성(hereditary) 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 아토피 피부염은 조기발병(early-onset) 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 아토피 피부염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여
   (1) 피검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및
   (2) 상기 핵산 시료의 염기서열을 분석하여 COL6A6 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계
   를 포함하는 COL6A6 유전자의 다형성을 검출하는 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 COL6A6의 단일염기다형성(SNP) 부위는 서열번호 1의 26번째 염기, 서열번호 2의 26번째 염기 및 서열번호 3의 26번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 단일염기다형성 부위가 서열번호 1의 26번째 염기가 A, 상기 서열번호 2의 26번째 염기가 T 및 상기 서열번호 3의 26번째 염기가 T로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기인 경우 아토피 피부염으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제7항에 있어서, 상기 염기를 결정하는 단계는 시퀀싱(sequencing), 엑솜 시퀀싱(exome sequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화(microarray hybridization), 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization), PCR 연장 분석 및 Taqman 기법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
    

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