KR101423745B1

KR101423745B1 - 류마티스 관절염 감수성 진단 방법

Info

Publication number: KR101423745B1
Application number: KR1020120082003A
Authority: KR
Inventors: 강창원; 배상철; 강창수; 이혜순
Original assignee: 한국과학기술원; 한양대학교 산학협력단; 성신여자대학교 산학협력단
Priority date: 2012-07-26
Filing date: 2012-07-26
Publication date: 2014-08-04
Also published as: KR20140014861A

Abstract

본 발명은 신규한 류마티스 관절염 감수성 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HSPA1A에 위치한 rs1043618 SNP의 다형성을 분석하는 류마티스 관절염 감수성 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 류마티스 관절염 감수성 진단을 위한 SNP, 마커, 키트, 마이크로어레이 및 류마티스 관절염 감수성 예측 및 판단 방법은 류마티스 관절염의 발생 위험도를 분석할 수 있는 효율적인 도구로서 사용될 수 있다.

Description

류마티스 관절염 감수성 진단 방법{Method for prognosing sensitivities for rheumatoid arthritis}

본 발명은 신규한 류마티스 관절염 감수성 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HSPA1A에 위치한 rs1043618 SNP의 다형성을 분석하는 류마티스 관절염 감수성 진단 방법에 관한 것이다.

류마티스 관절염(RA, Rheumatoid arthritis)은 원인 불명으로 점진적인 관절 파괴에 이르르는 만성 염증 질병이다. 역학 자료에 따르면, 유전적 및 환경적 인자들 둘 다 RA 민감성에 연관되어 있다. RA의 유전 가능성은 53-60%이며(MacGregor AJ, Snieder H, Rigby AS, Koskenvuo M, Kaprio J, Aho K., Silman AJ. Characterizing the quantitative genetic contribution to rheumatoid arthritis using data from twins. Arthritis Rheum 2000;43:30-7) RA환자의 형제들에게 나타나는 상대적인 위험성은 2~17(%)이다(Seldin MF, Amos CI, Ward R, Gregersen PK. The genetics revolution and the assault on rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1999;42:1071-9); 이 발견들 모두에서 유전적 물질이 아마도 RA에 기여하고 있는 것으로 보인다. 가족(Jawaheer D, Seldin MF, Amos CI, Chen WV, Shigeta R, Monteiro J, et al, A genomewide screen in multiplex rheumatoid arthritis families suggests genetic overlap with other autoimmune diseases. Am J Hum Genet 2001;68:927-36; MacKay K, Eyre S, Myerscough A, Milicic A, Barton A, Laval S, Barrett J, et al, Whole-genome linkage analysis of rheumatoid arthritis susceptibility loci in 252 affected sibling pairs in the United Kingdom. Arthritis Rheum 2002;46:632-9; Fife M, Steer S, Fisher S, Newton J, McKay K, Worthington J, et al, Association of familial and sporadic rheumatoid arthritis with a single corticotropin-releasing hormone genomic region (8q12.3) haplotype. Arthritis Rheum 2002;46:75-82; Cornelis F, Faure S, Martinez M, Prud'homme JF, Fritz P, Dib C, Alves H, et al, New susceptibility locus for rheumatoid arthritis suggested by a genome-wide linkage study. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:10746-50.) 및 질환 대조(case-control)(Okamoto K, Makino S, Yoshikawa Y, Takaki A, Nagatsuka Y, Ota M, et al, Identification of I kappa BL as the second major histocompatibility complex-linked susceptibility locus for rheumatoid arthritis. Am J Hum Genet 2003;72:303-12; Suzuki A, Yamada R, Chang X, Tokuhiro S, Sawada T, Suzuki M, et al, Functional haplotypes of PADI4, encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4, are associated with rheumatoid arthritis. Nat Genet 2003;34:395-402) 샘플을 이용한 이전 데이타는 RA 민감성을 다중 유전자 또는 염색체 상의 유전자 좌위와 연관된 것으로 제시하고 있다. 이 연구들은 일부 집단에 대한 연구였지만, 다른 민족(ethnic)집단에서는 많은 결과가 그렇지 않은 것으로 나타났고 아직까지 다소 논쟁의 여지가 있다.

6p21 염색체 상에서 인간 MHC 유전자 좌위 (인간 류코싸이트 안티젠 (HLA) 좌위로도 알려짐) 들은 일부 집단에서 RA 민감성과 연관된 것으로 알려져 왔다 (Cornelis F, Faure S, Martinez M, Prud'homme JF, Fritz P, Dib C, Alves H, et al, New susceptibility locus for rheumatoid arthritis suggested by a genome-wide linkage study. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:10746-50; Jawaheer D, Li W, Graham RR, Chen W, Damle A, Xiao X, et al, Dissecting the genetic complexity of the association between human leukocyte antigens and rheumatoid arthritis. Am J Hum Genet 2002;71:585-94). densly-packed 3.6Mb MHC 부분은 약 224개의 유전자를 포함하고 있다. 이들 중 40%가 면역체계 역할을 가진 것을 생각된다(The MHC sequencing consortium. Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex. Nature 1999;401:921-3). 몇몇 이전의 연구에서 shared epitope을 암호화하는 HLA-DRB1 대립유전자들 여러 개와 RA 민감성이 강하게 연관된 것으로 보고되었다. 그러나, 이 연관은 아프리카계 미국인과 중남미계 미국인 집단에서 나타나지 않았다 (McDaniel DO, Alarcon GS, Pratt PW, Reveille JD. Most African-American patients with rheumatoid arthritis do not have the rheumatoid antigenic determinant (epitope). Ann Intern Med 1995;123:181-7; Teller K, Budhai L, Zhang M, Haramati N, Keiser HD, Davidson A. HLA-DRB1 and DQB typing of Hispanic American patients with rheumatoid arthritis: the "shared epitope" hypothesis may not apply. J Rheumatol 1996;23:1363-8; Dizier MH, Eliaou JF, Babron MC, Combe B, Sany J, Clot J, et al. Investigation of the HLA component involved in rheumatoid arthritis (RA) by using the marker association-segregation chi-square (MASC) method: rejection of the unifying-shared-epitope hypothesis. Am J Hum Genet 1993;53:715-21). 게다가 RA 위험성을 증가시키는 HLA-DRB1 대립유전자의 분자 역할은 아직 밝혀지지 않았다.

HLA-DRB1과 더불어, HLA 영역에 위치한 다른 유전자들이 다양한 집단에서 RA 민감성에 영향을 주는 것으로 보고되었다(Jawaheer D, Li W, Graham RR, Chen W, Damle A, Xiao X, et al, Dissecting the genetic complexity of the association between human leukocyte antigens and rheumatoid arthritis. Am J Hum Genet 2002;71:585-94.; Barton A, Ollier W. Genetic approaches to the investigation of rheumatoid arthritis. Curr Opin Rheumatol 2002;14:260-9); 30개 이상의 유전자들이 RA와 연관된것으로 보고되었고, 이런 연관들 중 일부는 HLA-DRB1 민감성 대립유전자로부터 독립적인 것으로 보인다. 게다가 다른 유전적 영역에 위치한 20개 이상의 유전자들이 RA와 연관된 것으로 조사되었다(Barton A, Ollier W. Genetic approaches to the investigation of rheumatoid arthritis. Curr Opin Rheumatol 2002;14:260-9). 종합적으로 RA 민감성에 대한 이 결과들은 많은 유전자들의 복합적 영향으로부터 발생하는 것으로 생각된다.

이에 본 발명자들은 한국인 군집(population)에서 류마티스 관절염 관련 SNP를 확인하여 새로운 기능의 다형성을 밝히고자 연구를 진행하던 중, 상기 HSPA1A 유전자의 한 다형성 부위가 류마티스 관절염에 대한 감수성과 밀접한 연관을 가지고 있다는 점을 알아내어 이를 이용하는 류마티스 관절염 감수성 진단용 마커를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 류마티스 관절염 감수성 진단용으로 HSPA1A 유전자의 다형성 부위를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 HSPA1A 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 류마티스 관절염 감수성 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 HSPA1A 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 류마티스 관절염 감수성 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 류마티스 관절염 감수성 진단용 마커를 이용하여 류마티스 관절염 감수성을 예측 및 판단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 류마티스 관절염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 염기서열 분석반응을 통해 rs1043618 부위의 다형성을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 류마티스 관절염 감수성 진단용으로 HSPA1A 유전자의 다형성 부위를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HSPA1A 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 류마티스 관절염 감수성 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HSPA1A 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 류마티스 관절염 감수성 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 류마티스 관절염 감수성 진단용 마커를 이용하여 류마티스 관절염 감수성을 예측 및 판단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 류마티스 관절염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 염기서열 분석반응을 통해 rs1043618 부위의 다형성을 검출하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 류마티스 관절염 감수성 진단용 SNP(single nucleotide polymorphism)는 HSPA1A 유전자의 다형성 부위를 포함하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 본 발명에서의 마커에서 상기 HSPA1A 유전자의 다형성 부위는 서열번호 1의 DNA로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 147번째 염기(HSPA1A 유전자의 번역시작점으로부터 +49번째 염기) T가 C로 치환되고 상기 147번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(Genbank SNP ID: rs1043618)로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

HSPA1A 유전자 다형성과 류마티스 관절염 발병위험도와의 잠재적인 연관성을 분석한 결과, rs1043618 다형성이 류마티스 관절염 발병위험도 증가와 확실하게 연관되어 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해 HSPA1A 유전자가 류마티스 관절염의 발병에 관련되었을 수 있으며 rs1043618 다형성이 류마티스 관절염 감수성에 대한 효과적인 표지로 사용 가능함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 HSPA1A 유전자의 다형성 부위를 포함하는 류마티스 관절염 감수성 진단용 마커를 제공한다.

본 발명에서 사용된 상기 “진단”이라는 용어는 질병 발생의 예측 및 질병 발생위험도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다. 또한 본 발명에서 용어 “감수성(susceptibility, sensitivity)”은 류마티스 관절염에 대한 민감도, 즉 류마티스 관절염 발생위험도의 증가 및 감소를 나타낸다. 그리고 본 발명에서 용어 “다형성(polymorphism)”이란 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대체적 대립형질의 발생을 의미한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두개의 대립형질을 가진다.

바람직하게는 류마티스 관절염 감수성 진단을 위해서는 HSPA1A 이외에 다른 SNP와의 조합도 가능하다. 표 2에 기재된 SNP ID (NCBI (National Center for Biotechnology Information) 사이트 참조)를 가지는 각각의 SNP가 추가적으로 류마티스 관절염 감수성 진단의 목적으로 사용될 수 있다.

특히 HLA-DMB의 SNP (rs2071556)의 경우 한국인에게서 많이 나타나는 HLA-DRB1*0405에 대해서 음성인 (즉, HLA-DRB1*0405-negative) 개체의 류마티스 관절염에 대한 감수성 및 중증도의 판단에 매우 유용하다(표 4 및 표 6 참조). 보다 구체적으로, 상기 HLA-DMB 유전자의 다형성 부위는 서열번호 4의 DNA로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 4247번째 염기인 A가 C로 치환되고 상기 4247번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(Genbank SNP ID: rs2071556)로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명은 서열번호 1의 147번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 류마티스 관절염 감수성 진단용 키트를 제공한다.

상기 진단용 키트에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각 종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.

상기 “증폭할 수 있는 프라이머”란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머에는 리가제 연쇄 반응 (ligase chainreaction : LCR)에서는 사용되는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 프라이머로는 바람직하게 서열번호 2 및 3으로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머일 수 있다. 또한 증폭된 염기서열을 확인하는 방법으로 프라이머 연쇄반응을 이용할 수 있다. 아울러, 한편 HLA-DMB의 SNP 증폭을 위한 프라이머는 바람직하게는 서열번호 5 및 6으로 표시되는 염기서열일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 147번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 문헌(Nielsen 등, Science, 254, 1497-1500(1991))에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30 ℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명의 류마티스 관절염과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

나아가 본 발명은 류마티스 관절염 감수성을 예측 및 판단하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로,

a) 검체로부터 핵산시료를 수득하는 단계;

b) 상기 a)단계에서 수득한 핵산시료에서 서열번호 1의 147번째 염기의 다형성 부위를 증폭하는 단계;

c) 상기 b) 단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염 감수성 예측 및 판단 방법을 제공한다.

상기 방법 중 a)단계의 검체로부터 핵산을 얻는 단계는 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 c)단계의 염기 결정은 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism), DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), TDGS(Two-dimensional Gene Scanning), Taq-Man또는 TOGATM에 의해 수행될 수 있다.

아울러, 본 발명은 류마티스 관절염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 염기서열 분석반응을 통해 rs1043618 다형성 부위에서의 다형성을 검출하는 방법을 제공한다. 상기에서 rs1043618 다형성 부위는 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 147번째 염기의 다형성을 나타내며, 환자의 시료는 유전자형 분석(genotyping)이 가능하도록 게놈 DNA를 분리할 수 있는 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 염기 서열 분석은 염기 결정을 위하여 상기에 기재한 방법을 사용할 수 있다.

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

도면의 기재는 다음 내용을 참조할 수 있다: 도 1은 연간 비평형과 비교하여 볼 때, 환자-대조군 연관성 분석결과를 나타낸 것이다. A: 전체 샘플에 대한 χ2 테스트 (첨가 모델)로 얻은 P 값의 음수 로그값은 바 그래프로 도시하였다. HLA 영역내의 테스트된 유전자로부터의 SNP는 채워진 바로 표시되고, 영역 밖의 것들은 비워진 바로 표시되었다. 각각의 SNP와 HLA-DRB1*0405 대립유전자간의 LD (대조군 군집에서 델타값(Δ)으로 측정된 것)는 선 그래프로 도시되었다. B: HLA-DRB1*0405 대립유전자가 없는 환자 및 대조군 샘플에서 얻은 P 값은 음수 로그값을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 류마티스 관절염 감수성 진단을 위한 SNP, 마커, 키트, 마이크로어레이 및 류마티스 관절염 감수성 예측 및 판단 방법을 제공한다. 본 발명의 류마티스 관절염 감수성 진단을 위한 SNP, 마커, 키트, 마이크로어레이 및 류마티스 관절염 감수성 예측 및 판단 방법은 류마티스 관절염의 발생 위험도를 분석할 수 있는 효율적인 도구로서 사용될 수 있다.

도 1은 연간 비평형과 비교하여 볼 때, 환자-대조군 연관성 분석결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험방법>

1. 실험대상과 HLA - DRB1 typing

총 549명의 RA환자(92%가 여성)와 396명의 대조군(88%이 여성)을 한양대(서울, 대한민국) 류마티스 병동에서 모집했다. 환자들과 대조군들의 평균 나이는 환자가 50.3±11.5살, 대조군 41.9±14.1살이었다. 평균 RA 발병 나이는 37.9±11.9살이었다. 모든 환자들이 RA 분류를 위한 개정된 기준(American College of Rheumatology 1987 revised criteria; Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988;31:315-24)에 만족 했고, 모든 정보 제공은 서면 동의 받았다. RA 환자는 방사선 사진술 강도 마커로써 Steinbrocker 등에 의해 제안된 단계체계를 이용해 1-4단계로 나눴다(Steinbrocker, O, TC. Batterman RC. Therapeutic criteria in rheumatoid arthritis. JAMA 1949;140:659-662).

모든 환자(샘플)는 12th International Histocompatibility Workshop 실험방법(Bignon J, D Fernandez-Vian MA. 1997 Protocols of the 12th International Histocompatibility Workshop for typing of HLA class II alleles by DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization with sequeuce specific oligonucleotide probes (SSOP). In: Charron D, ed. Genetic diversity of HLA: Functional and medical application. Paris, France; EDK, 584-595)에 따라 PCR 및 서열 특이적 올리고뉴클레오티드-프로브 혼성화를 이용하여 HLA-DRB1에 대해 유전자 타이핑(genotyping)을 하였고, 이어서 direct DNA 시퀀싱을 하였다(Kotsch K, Wehling J, Blasczyk R. Sequencing of HLA class II genes based on the conserved diversity of the non-coding regions: sequencing based typing of HLA-DRB genes. Tissue Antigens 1999;53:486-97).

게놈 DNA(genomic DNA)는 모든 샘플 혈액의 백혈구에서 일반적 실험방법에 따라 추출했고 이중가닥 DNA 특이적 형광 염색물질인 PicoGreen(Molecular Probes)를 정량화하고 Gemini EM 96-well microplate spectrofluorometer (Molecular Devices)를 이용해 측정했다. DNA 풀은 각각 환자의 단계에 맞춰 혼합 균일 몰량(mixing equimolar amounts)에 의해 구성했다(stages 1 (n=70), 2(n=146), 3(n=221), 4(n=112), controls(n=396)).각 DNA 풀의 최종농도는 2.5 ng/ml에 맞췄다.

2. 후보유전자 & SNP

잠재적 RA 민감성 유전자 시험을 위해 62개의 후보 유전자(표 1)를 선정했다. 리스트에 HLA 영역에 있는 16개의 유전자, 염증과 면역 제어 과정에 연관된 유전자 22개, 선천적 면역에 연관된 8개가 포함되어 있다. 나머지는 유전자 발현과 조절 또는 호르몬 암호화 리셉터 또는 관절과 연골 단백질이다. 이런한 후보 유전자들의 SNP분석을 위해 CHOISS 프로그램(Lee S, Kang C. CHOISS for selection of single nucleotide polymorphism markers on interval regularity. Bioinformatics 2004;20:581-2)을 사용해 National Center for Biotechnology Information SNP database 에서 293개의 SNP를 선택했다. 이러한 각 후보 유전자들은 SNP에 의해 약 5kb의 간격을 갖는 것으로 적용되었다. 이 SNP들은 저자들의 분석으로 인증되었다.

3. 풀링된 각각의 샘플들의 SNP genotyping

풀링된 DNA 샘플들은 처음에 SNP를 확인하고, 환자와 대조군간의 대립 유전자 빈도차를 계산하기 위해 사용되었다. 각각 풀링된 샘플들은 MassARRAY system (Sequenom, Inc.)을 이용해 4번 반복하여 시험했다. 샘플들은 PCR과 primer 연장반응에 의해 384 well plates에서 allelotype 되고 MALDI-TOF mass spectrometry (Bruker BiFlex III)는 384 well 마이크로칩 (SpectroCHIP)을 이용해 실시했다. SpectroTYPERsoftware(Sequenom, Inc.)는 결과 대립유전자들을 호출하는 사용됐다. 2개의 대립유전자 특이 mass peaks에 대해 관찰된 signal-ro-noise 비율로부터 계산된 대립 유전자 빈도는 heterozygote 수정 없이 각 SNP의 질환과 대조군 간의 차이를 추정하는데 사용됐다(Le Hellard S, Ballereau SJ, Visscher PM, Torrance HS, Pinson J, Morris SW, et al. SNP genotyping on pooled DNAs: comparison of genotyping technologies and a semi automated method for data storage and analysis. Nucleic Acids Res 2002;30:e74; Bansal A, van den Boom D, Kammerer S, Honisch C, Adam G, Cantor CR, et al. Association testing by DNA pooling: an effective initial screen. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:16871-4; Germer S, Holland MJ, Higuchi R. High-throughput SNP allele-frequency determination in pooled DNA samples by kinetic PCR. Genome Res 2000;10:258-66).

환자와 대조군간의 관찰된 대립 유전자 차이가 0.05보다 컸을 때, 환자와 대조군의 해당 SNP들을 측정된 각 샘플 그룹의 대립 유전자 빈도 순으로 MassARRAY system의 genotyping 방법에 따라 MassARRAY system을 이용해 genotyping했다.

4. 대립유전자적 연관성을 위한 확률 분석

RA와 SNP간의 연관성은 2X2 분할표를 위해 상가적(additive), 우성과 열성 모델에 따라 chi square test로 평가했다. OR(Odds ratios)와 95%의 신뢰 구간은 SNP 마커들을 위해 계산되었다. P value가 0.05 이상으로 나온 SNP는 분석에서 제외하였다. SNP와 RA 강도 진행의 연관성은 1-4 단계로 나뉜 환자들로 평가했다. 다중 SNP haplotype의 빈도는 베이시안 알고리즘 기반의 haplotype 프로그램을 이용해 평가했다. 적용할 때, 잠재연관성에 대한 독립 시험의 개수로 p값을 곱하여 본페로니 검정의 P값을 계산하였다.

<실험결과>

1. 잠재(적) SNP 스크리닝과 개별 genotyping

62개의 후보 유전자에서 선택된 293개의 SNP중 173개(59%)는 0.05를 넘는 부수적 대립 유전자 빈도로 계산됐다. 처음 평가들은 환자와 대조군 DNA 샘플들을 200씩 동일하게 넣은 단일 풀에서 시행했다. 대조군 풀이 일반적으로 공공 SNP DB에 있는 SNP의 검증을 위해 쓰인다고 해도, 환자와 대조군 샘플의 풀은 대조군에서는 무시될 정도였으나 환자 샘플에서는 상당한 minor 대립유전자 빈도의 SNP를 포함하기 위하여 이 연구에서 사용됐다. 대립 유전자 빈도가 4개의 독립적인 실험에서 대립유전자 특이적 MASS PEAK으로부터 계산되었다 할지라도, 이 계산은 연관성 확률 분석에 바로 쓰일 수 있을 만큼 정확하지 않다. 이 데이터들 오직 불필요한 SNP를 제외하는데 쓰인다.

173개의 유익한 SNP는 상응하는 독립적 실험들에서 시험된 대조군과 질환 DNA풀 간의 대립 유전자 빈도계산의 대상이다. 대조군 풀은 396개의 대조군 샘플을, 질환 풀은 549개의 환자 샘플을 갖는다. 한 두 개의 SNP는 대부분의 유전자 각각으로부터 시험됐다. 그러나 27 SNP 전부는 295kb 길이의 장편 ESR1(long estrogen receptor 1) 유전자에 대해서 평가되었다.

13개의 유전자의 17개의 SNP에서 질환과 대조군 풀에서 대립 유전자 차이 계산은 0.05 이상 (가장 큰 것은 0.15)이었고, 2x2 컨틴전시 테이블 (contingency table)에 대한 χ2 TEST의 P값은 0.05 이하 (가장 작은 것은 3 x 10^-11)였다. 이들 잠재적 RA 연관 SNP들 (표 2)은 각각의 genotyping 대상이 됐다. 13개 유전자들은 9개가 HLA 영역 (염색체 6p21.3)에 있는 것이고 4개는 HLA부분 밖에 위치했다: CD86 (또는 B7-2), T 셀 표면 분자 CD28, CTLA4와 상호작용하는 B-세포 활성 항원; DEK, 일부 RA 환자에서 자가항원으로 나타나는 스플라이시오좀(spliceosome)의 구성성분; 에스트로겐 수용체 1(ESR1, ESRA, ESR, 또는 ER); 수용체-상호작용 세린/트레오닌 인산화효소 2(RIPK2, CARDIAK, RIP2 또는 RICK). 549명의 환자와 396명의 대조군의 17개 잠재 SNP의 GENOTYPING 결과는 표 2에 나타냈다.

a : SNP ID는 NCBI dbSNP에 등록되었음

b : 대조군에 비해서 실험군에서 더 빈도가 높은 위험 대립유전자 (risk allele)는 앞에 기재하였다.

c : 위험 대립유전자의 빈도를 나타내었다.

2. RA 민감성 연관

SNP의 대립유전자 빈도 비교 χ2 TEST 로부터 얻어진 P값의 log는 도 1A에 나타냈다. 11개의 SNP는 P값이 0.05 미만이었다. HLA 영역 밖(도 1A에서 blank bar로 표시)에 위치한 4개 유전자들의 5개 SNP는 P값이 0.05 이상이었다. 반면에 HLA 영역내 (도 1A에서 filled bar로 표시)의 목표 유전자의 SNP는 C4B SNP, RA237을 제외하고 모두 다 0.05보다 낮았다.

P값이 0.05보다 낮은 SNP의 genotyping은 우성과 열성모델에 따라 분석했다 (표 3). 가장 낮은 P값은 TNF의 인트론1에 있는 SNP RA010-1에서 발견되었다 (P = 3.9x10^-14, OR = 2.7, 95%-CI = 2.1-3.5 in the dominant model). 다른 TNF SNP (RA300, 프로모터에 위치)도 P값이 매우 낮게 나타났다(P=2.0x10^-6, OR = 1.8, 95%-CI = 1.42.2 in the additive model). 본페로니 검정 후, P 값은 각각 7.7x10^-14 과 4.1x10^- ⁶ 로 나타났다. 두번째와 세번째로 낮은 P 값은 TNXB에서의 SNP 2개에서 나타났다 (P값은 각각 4.3x10^-13 and 1.1x10^-12). HSPA1A 와 MICA에서의 SNP의 P 값은 10^-8 대이며, 반면에 HLA - DMB, NFKBIL1,ATP6V1G2,BAT1의 P 값은 10^- ⁶ 에서 10^-3대를 나타내었다.

a : 0.05 보다 낮은 P 값은 지수로 나타내었고, 다른 것들은 그렇지 않았다. 개별 SNP에 대한 3가지 유전 모델 (genetic model)에서 가장 낮은 P 값은 밑줄로 표시하였다.

3. HLA - DRB1 에 비의존적인 RA 민감성 연관

HLA 영역 내에서 HLA-DRB1유전자는 한국인 군집 (Kim HY, Kim TG, Park SH, Lee SH, Cho CS, Han H. Predominance of HLA-DRB1*0405 in Korean patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 1995;54:988-90)와 다른 인종 군집 (Wordsworth BP, Lanchbury JS, Sakkas LI, Welsh KI, Panayi GS, Bell JI. HLA-DR4 subtype frequencies in rheumatoid arthritis indicate that DRB1 is the major susceptibility locus within the HLA class II region. Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86:10049-53)에서 RA와 매우 강하게 연관됐다. 0405 대립 유전자는 한국인들간에 가장 위험한 대립유전자로 밝혀졌다: P < 0.001, OR = 3.3, 95%-CI = 1.86.0 (상기 Kim HY et al. 참조). 게다가 최근 논문들은 일본 인구에서 HLA-DRB1 대립유전자에 의해 다른 RA 유전자가 영향을 받을 수 있음을 보고되었다 (Kochi Y, Yamada R, Kobayashi K, Takahashi A, Suzuki A, Sekine A, et al. Analysis of single-nucleotide polymorphisms in Japanese rheumatoid arthritis patients shows additional susceptibility markers besides the classic shared epitope susceptibility sequences. Arthritis Rheum 2004;50:63-71; Ota M, Katsuyama Y, Kimura A, Tsuchiya K, Kondo M, Naruse T, et al. A second susceptibility gene for developing rheumatoid arthritis in the human MHC is localized within a 70-kb interval telomeric of the TNF genes in the HLA class III region. Genomics 2001;71:263-70). 우리가 RA와 연관되었다고 확인한 SNP가 HLA-DRB1에 영향을 받는지 알아보기 위해, 우리는 HLA-DRB1 유전좌위의 모든 샘플들을 genotyping하고 각 SNP와 HLA-DRB1 *0405간의 연관비평형(linkage disequilibrium)을 측정했다. LD 델타(LDΔ) 값은 선 그래프로 도 1A에 표시했다. 전체적인 양상은 SNP의 P값과 비슷했다 (도 1A에서 바 그래프로 표시). HLA 영역 밖의 RA와 연관된 5개의 SNP는 LD 델타 값이 매우 낮았고 (0.002 내지 0.033), HSPA1A, C4B 및 HLA - DMB의 HLA 영역에 위치한 SNP (각각 0.11, 0.083 및 0.0059)도 같은 결과를 나타냈다. 다른 SNP의 델타 값들은 0.22~0.55였고 대부분의 HLA 영역에 국한된 SNP들은 HLA-DRB1*0405에 영향을 받는 것으로 제안되었다.

그러므로 HLA-DRB1*0405를 가지고 있지 않은 서브그룹에서 RA연관성을 자세히 분석했다. Additive 모델의 χ2검정의 p값의 log 는 그림 1b에 막대그래프로 나타냈다; 2개의 SNP의 P값은 0.05보다 낮았다. 유전적 모델분석은 표 4에 나타냈다. SNP RA277-1 of HSPA1A는 additive 모델에서 RA와 상당히 연관되어 있고(P = 6.3x10^-5, Pc=1.3x10^-4, OR = 1.7, 95%-CI = 1.32.1 in the additive model), 반면에 SNP RA232 of HLA - DMB는 근소하게 우성그룹에서 연관성을 나타냈다(P=0.02, Pc=0.04, OR=1.5, 95%-CI=1.12.1). 반대로 다른 SNP (MICA, TNXB, NFkB1L1, ATP6V1G2, BAT1 및 TNF에서) 의 P값은 0.05보다 높았다. 이러한 결과는 HSPA1A 및 HLA-DMB가 RA 민감성과 연관되어 있고, 이 민감성은 강력한 위험 대립 유전자인 HLA-DRB1*0405에 비의존적임을 암시한다.

4. HAPLOTYPE 분석

HLA 영역의 8개 유전자의 11개 SNP는 RA 민감성과 명백하게 연관된 것으로 생각되기 때문에 HLA-DRB1*0405 대립 유전자를 가지고 있지 않은 환자들의 HAPLOTYPE의 구조를 분석했다. TNF의 RA010-1와 TNXB의 RA246는 HAPLOTYPE 분석에서 제외했다. 왜냐하면 이들이 TNF의 RA300과 TNXB의 PA245와 높은 연관 비평형 상태이기 때문이다 (Δ값이 각각 0.82, 0.95). 본페로니 검정 Pc값은 관찰된 9개의 SNP HAPLOTYPE들의 총 개수(41)로 P 값을 곱하여 계산됐다. 3개의 HAPLOTYPE (표 5에 리스트됨)은 Pc값이 0.05보다 낮았다. HAPLOTYPE 001과 032는 대조군보다 질환에서 상당히 낮게 나타났다. 반면에 036은 질환에서 대조군보다 상당히 더 자주 나타났다.

a : SNP 좌위는 텔로미어에서 중심체의 순으로 나였되었다. 각각의 SNP에 대해서 1은 그 대립유전자가 대조군에 비해서 환자에서 더 빈도가 높음을 나타내고 0은 그렇지 않다.

b : P 값은 본페로니 검정을 위해서 환자 또는 대조군에서 관찰된 haplotype 구조의 전체 수(41)로 곱해진 것이다.

5. RA 중증도와의 연관성

방사선 사진상의 중증도와 연관되는 SNP를 찾기 위해 환자 샘플을 2 그룹으로 나눴다: 1단계와 2~4단계. HLA - DMB 의 SNP RA232은 1단계에서 2-4단계까지 진행에서 상당히 연관됐다 (P 값은 4.5x10^-3)(표 6). HLA-DRB1*0405 대립유전자가 없는 환자들은 1단계와 2-4단계로 나눴을때, SNP RA232도 비슷한 연관성을 보였다(표 6); 그러나 HLA-DRB1*0405에 대해 LD에서는 아니었다 (도 1A). NFKBIL1의 SNP RA296도 *0405 음성 환자에서 중증도 진행에 강하게 연관됐으나(P값은 3.0x10^-3) 이 SNP는 전체 환자 풀에서는 연관성이 없는 것으로 나타났다 (P값은 0.055). 반면에 다른 SNP들의 P값은 총 환자 풀 또는 *0405 음성 환자 풀 중에서 STAGE SUBGROUP의 쌍간에 비교했을 때 0.05보다 높았다. 종합적으로 이러한 결과는 HLA-DMB는 *0405 대립유전자의 상태와 상관없이 1단계와 2-4단계의 방사선사진 중증도의 진행과 관계가 있고 NFKBIL1은 *0405 대립유전자-음성 환자에서의 진행과 관련이 있는 것으로 나타났다.

a : 대립 유전자 1, 및 2는 RA232에 대해서는 C와 A를 각각 나타내고, RA295에 대해서는 C와 T를 각각 나타낸다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 류마티스 관절염 감수성 진단을 위한 SNP, 마커, 키트, 마이크로어레이 및 류마티스 관절염 감수성 예측 및 판단 방법을 제공한다. 본 발명의 류마티스 관절염 감수성 진단을 위한 SNP, 마커, 키트, 마이크로어레이 및 류마티스 관절염 감수성 예측 및 판단 방법은 류마티스 관절염의 발생 위험도를 분석할 수 있는 효율적인 도구로서 사용될 수 있다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) SUNGSHIN WOMEN`S UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Method for prognosing sensitivities for rheumatoid arthritis <130> NP12-0035 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2430 <212> DNA <213> rs1043618 <400> 1 ataaaagccc aggggcaagc ggtccggata acggctagcc tgaggagctg ctgcgacagt 60 ccactacctt tttcgagagt gactcccgtt gtcccaaggc ttcccagagc gaacctgtgc 120 ggctgcaggc accggcgcgt cgagtttccc ggcgtccgga aggaccgagc tcttctcgcg 180 gatccagtgt tccgtttcca gcccccaatc tcagagccga gccgacagag agcagggaac 240 cggcatggcc aaagccgcgg cgatcggcat cgacctgggc accacctact cctgcgtggg 300 ggtgttccaa cacggcaagg tggagatcat cgccaacgac cagggcaacc gcaccacccc 360 cagctacgtg gccttcacgg acaccgagcg gctcatcggg gatgcggcca agaaccaggt 420 ggcgctgaac ccgcagaaca ccgtgtttga cgcgaagcgg ctgatcggcc gcaagttcgg 480 cgacccggtg gtgcagtcgg acatgaagca ctggcctttc caggtgatca acgacggaga 540 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gggcagttgg gaagggaatg gagaacagag aagagagtgg 4740 aaatcacatg ctcacttgaa ctttcctggg gaacgtctcc tcacagcgtg cacaagagcc 4800 tccctttaga aatggagtgt tcattttatc atgggaaaag aatctgagtg ggacatgatt 4860 cagaacagga ccggcccaag gaagtgcagg ggctgtggag tgggatggag acaagctctg 4920 aaaggacaca tgggagatct agatgtagaa ggtacacaag tagtaggata actcacagga 4980 tggatccact ggaggttaag acatgtggta agacagtgta ataggaagct gctcagttgg 5040 agaaagtaag gaagcaaaca ttgttaccgt gggggcaatg gagaggacag tgaggagccc 5100 tttatcctga taagggtggc tttgaggtaa aggaaggaaa gaggatgcct tgagaggccc 5160 cactgtatta gagaggacct ggaagccagg atgctaattc tggggagatg gattccccag 5220 gcttactcta ggagtagagg tccatgggac gagggtttga tttgagaaag atcattttct 5280 tgggagtggg tggtgtgagc tagacccttg gagctgggat aaaggacctt ttaacccact 5340 gagaggtggc tgcaataaat ggaattgccc tgggggtgag caacagaaac tgggtcaagt 5400 aagtttctat tttttgcagc acctgggctg tcccccatgc agaccctgaa ggtttctgtg 5460 tctgcagtga ctctgggcct gggcctcatc atcttctctc ttggtgtgat cagctggcgg 5520 agagctggcc actctagtga 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gtgccataga ggacagcaac tggtgattgt ttcagagaaa 6420 taaactttgg tggaaatatt gtt 6443 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> PF2 <400> 5 ctctggtggt gtggttgatg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> PR2 <400> 6 ctgctgcgac agtccactac 20

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 147번째 염기가 시토신(cytosine)이고 상기 147번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
서열번호 1의 147번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 류마티스 관절염 감수성 진단 키트.
제2항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 감수성 진단 키트.
제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 마이크로어레이.
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류마티스 관절염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 염기서열 분석반응을 통해 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 147번째 염기의 다형성을 검출하는 방법.