ES2843848T3 - Ensayo de referencia para múltiples copias - Google Patents
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Abstract
Un método, que comprende: amplificar una secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra que comprende ADN genómico de un sujeto; amplificar una secuencia de referencia en la muestra, en donde la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases de cualquiera de las SEQ ID NO:9-13, en donde la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas; cuantificar la secuencia de interés amplificada con relación a la secuencia de referencia amplificada; y determinar un número de copias de la secuencia de interés a partir de la secuencia de interés amplificada cuantificada relativa, en donde la amplificación de la secuencia de interés y la amplificación de la secuencia de referencia se realizan mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa TaqMan (qPCR).
Description
DESCRIPCIÓN
Ensayo de referencia para múltiples copias
Antecedentes de la invención
La información relacionada con el número de copias de un objetivo de interés en el genoma de una muestra biológica puede ser conveniente para varios propósitos, lo que incluye la investigación básica y el diagnóstico clínico de diversas enfermedades. Una clase de enfermedades en las que puede ser particularmente conveniente conocer el número de copias de un objetivo de interés es el cáncer. Numerosos cánceres se presentan con un número anormal de copias de uno o más genes. En muchos casos, existe una correlación positiva entre el número de copias y la existencia y/o progresión del cáncer. Por lo tanto, determinar el número de copias de un objetivo de interés en una muestra a partir de un paciente de tejido sospechoso de ser tejido canceroso puede ser útil, por ejemplo, para diagnosticar, tratar y/o monitorear el curso del cáncer del paciente.
Hasta la fecha, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) se ha considerado como una técnica molecular para determinar el número de copias de un objetivo de interés. Para determinar el número de copias de un objetivo de interés, la qPCR puede requerir la amplificación simultánea tanto del objetivo de interés como de una secuencia de referencia en el genoma de la muestra. A partir de las cantidades relativas del amplicón del objetivo de interés y el amplicón de la secuencia de referencia, pueden determinarse los números de copias relativos del objetivo de interés y la secuencia de referencia, y si se asume que se conoce el número de copias absoluto de la secuencia de referencia, puede determinarse el número de copias del objetivo de interés.
Sin embargo, cuando se intenta aplicar la qPCR para determinar el número de copias de un objetivo de interés en una célula cancerosa, la técnica puede volverse difícil como resultado de una o ambas de las anomalías genómicas evolutivas aleatorias (por ejemplo, aneuploidía) encontradas en las células cancerosas y las modificaciones a los ácidos nucleicos que pueden producirse cuando las muestras de tejido se archivan mediante fijación con formalina e inclusión en parafina (FFPE).
Se conoce que se producen anomalías genómicas de diversos tipos en las células cancerosas y que aumentan en cantidad, distribución y complejidad a medida que las células cancerosas se replican con el tiempo. Estas anomalías genómicas incluyen deleciones y multiplicaciones de genes, algunas de las cuales pueden relacionarse con una función específica en humanos y son comunes a ciertos tipos de cáncer, mientras que otras pueden no tener un efecto manifiesto o asociación con una enfermedad. Como resultado, una secuencia de referencia de interés puede sufrir deleción y/o multiplicación en el genoma de una célula cancerosa, lo que hace de esta manera muy difícil determinar el número absoluto de copias de la secuencia de referencia.
Se conoce que como parte del archivo de muestras de cáncer mediante el método FFPE, se producen modificaciones de los ácidos nucleicos (ADN y ARN), tales como el entrecruzamiento de nucleótidos a sí mismos o a proteínas, despurinación de nucleótidos y fragmentación de los ácidos nucleicos. Sin embargo, las ubicaciones y el alcance de estas modificaciones son aleatorias y varían mucho entre las muestras de FFPE, debido en gran parte a uno o más factores, tales como la variabilidad en el tejido de muestra en sí mismo, los reactivos usados en la fijación e inclusión y las variaciones preferidas por el usuario en el método FFPE en diferentes laboratorios. Estos efectos también hacen que sea difícil o imposible determinar el número absoluto de copias de la secuencia de referencia. Ambas observaciones presentan desafíos importantes para los ensayos de genética molecular actuales y las pruebas para determinar la variación del número de copias al nivel de ADN, tales como qPCR.
Por lo tanto, existe la necesidad de seleccionar secuencias de referencia que sean relativamente resistentes a anomalías genómicas inducidas por cáncer y/o modificaciones de ácidos nucleicos inducidas por FFPE. Long y otros describieron en "Multicopy reference assay (MRef) - a superior normalizer of sample input in DNA copy number analysis", publicado en línea (https://www.qiagen.com/nl/resources/download.aspx?id=a0c54902-07a6-493b-9352-885f9063689b&lang=en) un conjunto de secuencias de referencia que se proporciona en múltiples copias en múltiples cromosomas. Katsuhiro Okuda y otros, describieron en "Met gene copy number predicts the prognosis for completely resected non-small cell lung cancer", (CANCER SCIENCE 2008, vol. 99, núm. 11, páginas 2280 - 2285) el uso de un elemento repetitivo con números de copias conocidos como referencia.
Breve descripción de la invención
En una modalidad, la presente descripción se refiere a un método, que comprende cuantificar una secuencia de ácido nucleico de interés con relación a una secuencia de ácido nucleico de referencia, en donde al menos un primer número mínimo de copias de la secuencia de ácido nucleico de referencia está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas del ADN genómico del sujeto; y determinar un número de copias de la secuencia de interés a partir de la secuencia de interés amplificada cuantificada relativa.
El método comprende además amplificar la secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra que comprende
ADN genómico de un sujeto; y amplificar la secuencia de ácido nucleico de referencia en la muestra; antes de cuantificar.
La secuencia de referencia puede tener al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases de cualquiera de las SEQ ID n O:9-13, o en donde la secuencia de referencia comprende 60-150 pares de bases de la SEQ ID NO:9. La al menos una porción está presente en chr1:224126101-224126167, chr1:228152189+228152255, chr1:243203891-243203957, chr1:341341+341407, chr1:648256-648322, chr2:243071747+243071813, chr3:197962284+197962350, chr4:119569035+119569101, chr5:180767956+180768022, chr6:133078-133144, chr6:170922356+170922422, chr8:143260-143326, chr10:38753846+38753912, chr11:114137-114203, chr16:90251361+90251427, chr19:184071-184137, chr20:62933480+62933546 y chrUn_gl000227:58945-59011; la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas.
En una modalidad particular, la secuencia de ácido nucleico de referencia puede tener al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una de
GGCTGYTTGCRGTAGTWRTSTRKSWRSMRSMMRMWSRMYGSVISRCARRSRA RRMARWYWSTWDVWAKKMN (SEQ ID NO:1),
GGCTGCTTGCAGTAGTTGTGTAGCAGCAGCACAATGGCCGCAGACAAGGAAA ACAGTTTCTAGGAATTCC (SEQ ID NO:2),
GGCTGCTTGCGGTAGTTATGTAGCAGC AGCACAATGGCCGCAGACAAGGAAA ACAGTTTCTAGGAATTCC (SEQ ID NO:3),
GGCTGCTTGCGGTAGTTGTCTAGCAGCAGCACAATGGCCGCAGACAAGGAAA ACAGTTTCTAGGAATTCC (SEQ ID NO:4),
GGCTGCTTGCGGTAGTTGTGTAGCAGCAGCACAATGGCCGCAGACAAGGAAA AC AGTTTCT A A A A ATTCC (SE Q ID NO:5),
GGC TGCTTGC GGT AGTTGTGTAGC AGCAGC ACAAT GGC CGC AG AC AAGGA A A
ACAGTTTCTAGGAATTCC (SEQ ID NO:6),
GGCTGC TTGCGGTAGTTGTGTAGC AGCAGC ACAATGGCCGCAGAC AAGGA A A AC AGTTTCT AGG A ATTCN (SEQ ID NO:7),
GGCTGTTTGCGGTAGTAGTCTGTGTAGCAGCAGCACAATGGCCGCAGACGAG G A A A AC AGTTT CT A GG A A (SEQ ID NO:8),
AGT GCAGYRWTGYTGACTCTTCC A AGCTT A ACATTTCTCAS A ARTC AATT AGC TTTGTACTGGGAGG (SEQ ID NO:9),
AGTGCAGCAATGTTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCAGAAGTCAATTAGC TTTGTACTGGGAGG (SE Q ID NO: 10),
AGTGCAGCGATGCTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCACAAGTCAATTAGC TTTGTACTGGGAGG (SEQ ID NO:11),
AGTGCAGCGTTGCTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCACAAATCAATTAGC TTTGTACTGGGAGG (SEQ ID NO: 12),
AGTGCAGTGATGCTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCACAAGTCAATTAGC TTTGTACTGGGAGG (SEQ ID NO: 13),
GTGTAGCAGCAGCACAATGGCCGCAGACAAGGAAAACAGTTTCTAGGAATTC CTCGTATATAATTTTATATTTTTGACAAGATTAATGACCCATGCTCC
(SEQ ID NO:14),
TGCARMGATGCTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCACAAGTCAATTAGCTT TGTACTGGGAGG (SEQ ID NO: 15),
TGCTGACTCTTCC AAGCTTAACATTTCTCACAAGTCAATTAGCTTTGTACTGG GAGGAGGGCGTGAAGGGCTGCTTGCG (SEQ ID NO:16),
CAAGGGACAAGGAAAAATTATCCAAACATTGTTTAAAACAATCATCATTAAT TAGTAACACTTATCCAGGGGGGTTTTTAACCTTTCCCCCACTCAASGATTATT CTAATGTCAGAGTAGAATAAAAAATAAGTGCARMGATGCTGAC
(SEQ ID NO:17),
GGAGGAGGAAAATAGGTAGTTTTTCAAAAGTTTTCAAAAATATGAAAAGAAG AAATGAAATGGTACTTGGAAGAGATTGTTGAAATGGGAGAGACTATGGTGGC
(SEQ ID NO:18),
CAACTAAAAGGCAATGTCACTCCAATAATCACCAGAGTAATCAATTTGCTTA TTGCTGTCCCTTTAAATATAGTTCTCTGG (SEQ ID NO:19),
GGAGAGACTATGGTGGCTTGTTTAGAAGCAGTTGAGATAGATCCAATTGAGA TAGAGATATTGAGTATATAAACAAAAGAATGACAAATTAATAGTGTAATGGA TAACTTGACTTTGGCA (SEQ ID NO:20),
GTGTAATGGATAACTTGACTTTGGCAAAT ATTGTGAATTTTTGTGAAAGT ACA ACTAAAAGGCAATGTCACTCCAATAATCACCAG (S E Q ID N O :21),
GTAATCAATTTGCTTATTGCTGTCCCTTTAAATATAGTTCTCTGGTATCAACTA ACATGTTTTTAACTAATGATGCTTCTTAAAGAAAAGGGAAAAGACCT
(S E Q ID N O :22),
CCCTGGGCCCCTCAGGGGAGTCCCTGCTGGACAGTGAGACAGAGAATGACCA TGATGATGCTTTCCT (S E Q ID N O :23),
GGGTTTATGTTTGATATRTAATGTAATTTTCTAATGCTAAATCAAGTGGTAAT TTTGTTAGTCAAGTTGATTTAGTGGCTTGGGAAGAAAGCT (S E Q ID N O :24),
GAGACCCCCAGGTGTTGAGGCAGGGCTGGGGTGTCCCCTTCCAACCAGGCTG TCAAGGCCCCAACTCTGGGGCAGAGGCAGTGGCAGGG (S E Q ID N O :25),
CA TCCGTTTCACCTGCAGTTGAAGATCCGTGAGGTGCCCAGAAGA TCATGCA GTCAVVCAGTCCCACG (S E Q ID N O :26),
GAKATAAGGAAGCTCGAGGAAGAGAAAAAACAACTGGAAGGAGAAATCATA GATTTTTATAAAATGAMAGCTGCCTCTGAAGC (S E Q ID N O :27),
CCGTTTTGGAGGAGGAACAGATTCCATGTCCACTAGAATGGAATGAACAAGA AATGGAGGAGGAAAATAGGTAGTTTTTCAAAAGTTTTCAAAAATATGAAAAG AAGAAATGAAATGGTACTTGGAAGAGATTGTTGAAATGGGA(SEQ ID N O :28),
TGCTTCTT A A AG A A AAGGGAA A A G ACCTTTTTCTTTCTTTC A GTCTTC A ATGA TTCACTGCTTCATCTCGCTCCACCAAAGATAAATGAAATCTACATCTCT
(S E Q ID N O :29),
CTTTCCCCCACTCAASGATTATTCTAATGTCAGAGTAGAATAAAAAATAAGTG CARMGATGCTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCA (S E Q ID N O :30), O
GGGAGGAGGGCGTGAAGGGCTGCTTGCGGTAGTTGTGTAGCAGCAGCACAAT GGCCGCAGACAAG (S E Q ID N O :31),
La presente descripción se refiere a un kit, que comprende una primera sonda que se hibrida específicamente con al menos una porción de al menos una secuencia de referencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases, en donde la al menos una porción está presente en chrl-121790-133586, chr1-329448-341534, chr1-648129-660266, chr1-222643865-228172047, chr1-243203764-243215874, chr10-38741930-38753964, chr11-114010-126106, chr16-90239446-90251554, chr19-183944-196032, chr2-114323560-114323652, chr2-243064480-243071940, chr20-62921559-62933673, chr3-197950387-197962431, chr4-119557144-120325498, chr4-165196360-165199636, chr5-180756063-180768074, chr6-170921836-170922549, chr7-39837560-63231088, chr7-128296352-128298474, chr8-143133-150475, chr9-49679-49771, chrY-26424506-27537936 o chr6-132951-145064; la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas.
En todavía otra modalidad, la presente descripción se refiere a una composición, que comprende una primera sonda que se hibrida específicamente con al menos una porción de al menos una secuencia de referencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases de cualquiera de las SEQ ID NO:9-13, o en donde la secuencia de referencia comprende 60-150 pares de bases de la SEQ ID NO:9. Al menos una porción puede estar presente en chr1:224126101-224126167, chr1:228152189+228152255, chr1:243203891-243203957, chr1:341341+341407, chrl: 648256-648322, chr2:243071747+243071813, chr3:197962284+197962350, chr4:119569035+119569101, chr5:180767956+180768022, chr6:133078-133144, chr6:170922356+170922422, chr8:143260-143326, chr10:38753846+38753912, chr11:114137-114203, chr16:90251361+90251427, chr19:184071 -184137, chr20:62933480+62933546 y chrUn_gl000227:58945-59011; la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas.
En aún otra modalidad, la presente descripción se refiere a un sistema, que comprende un amplificador de ácido nucleico configurado para amplificar una secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra que comprende ADN genómico de un sujeto y amplificar una secuencia de referencia en la muestra; un depósito de reactivos que contiene al menos un primer cebador configurado para hibridar específicamente con un primer extremo de al menos una secuencia de referencia, en donde la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases de cualquiera de las SEQ ID NO:9-13, o en donde la secuencia de referencia comprende 60-150 pares de bases de la SEQ ID NO:9. La al menos una porción está presente en chr1:224126101-224126167, chr1:228152189+228152255, chr1:243203891-243203957, chr1:341341+341407, chr1:648256-648322, chr2:243071747+243071813, chr3:197962284+197962350, chr4:119569035+119569101, chr5:180767956+180768022, chr6:133078-133144, chr6:170922356+170922422, chr8:143260-143326, chr10:38753846+38753912, chr11:114137-114203, chr16:90251361+90251427, chr19:184071-184137, chr20:62933480+62933546 y chrUn_gl000227:58945-59011; la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas, y un segundo cebador configurado para hibridar específicamente con una secuencia complementaria a un segundo extremo de la al menos una secuencia de referencia; un detector configurado para proporcionar una primera indicación relacionada con una cantidad de la secuencia de interés amplificada y una segunda indicación relacionada con una cantidad de la secuencia de referencia amplificada; y un controlador configurado para cuantificar la secuencia de interés amplificada con relación a la secuencia de referencia amplificada, basado al menos en parte en la primera indicación y la segunda indicación y determinar un número de copias de la secuencia de interés a partir de la secuencia de interés amplificada cuantificada relativa.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente descripción. La descripción puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas en la presente descripción.
La Figura 1A muestra el número de copias calculado de punto decimal de IRS2 determinado por qPCR con un ensayo de referencia de ARNasaP.
La Figura 1B muestra el número de copias redondeado de IRS2 determinado por qPCR con un ensayo de referencia de ARNasaP.
La Figura 2A muestra el número de copias calculado de punto decimal de IRS2 determinado por qPCR con un ensayo de referencia basado en las SEQ ID NO:1-8.
La Figura 2B muestra el número de copias redondeado de IRS2 determinado por qPCR con un ensayo de referencia
basado en las SEQ ID NO:1-8.
La Figura 3A muestra el número de copias calculado de punto decimal de IRS2 determinado por qPCR con un ensayo de referencia basado en las SEQ ID NO:9-13.
La Figura 3B muestra el número de copias redondeado de IRS2 determinado por qPCR con un ensayo de referencia basado en las SEQ ID NO:9-13.
Descripción
Diversas modalidades de la presente descripción proporcionan secuencias de referencia que son relativamente resistentes a las anomalías genómicas inducidas por cáncer y/o modificaciones de ácido nucleico inducidas por FFPE. Más específicamente, la descripción proporciona secuencias objetivo en el genoma que se repiten varias veces, a través de muchos cromosomas, y demuestran un número de copias sustancialmente normal y resistencia a modificaciones y fragmentación graves, incluso en células cancerosas sometidas a FFPE.
En una modalidad, la presente descripción se refiere a un método, que comprende amplificar una secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra que comprende ADN genómico de un sujeto; amplificar una secuencia de ácido nucleico de referencia en la muestra, en donde al menos una copia de la secuencia de ácido nucleico de referencia está presente en cada uno de al menos diez cromosomas del ADN genómico del sujeto; cuantificar la secuencia de interés amplificada con relación a la secuencia de referencia amplificada; y determinar un número de copias de la secuencia de interés a partir de la secuencia de interés amplificada cuantificada relativa.
La amplificación puede realizarse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica. Convenientemente, la amplificación puede realizarse mediante una técnica que permita la cuantificación de la secuencia de interés con relación a la secuencia de referencia. Las técnicas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki y otros (1985) Science 230:1350), PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), PCR digital, reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren y otros (1988) Science 241:1077-1080), amplificación dependiente de helicasa (HDA) (Vincent y otros (2004) EMbO rep 5(8):795-800), HDA termoestable (tHDA) (An y otros (2005) J Biol Chem 280(32):28952-28958), amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) (Walker y otros (1992) Nucleic Acids Res 20(7):16916), amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) (Dean y otros (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(8):5261-5266), amplificación en círculo rodante (RCA) (Liu y otros (1996) J Am Chem Soc 118:1587-1594), RCA asistida por restricción (Wang y otros (2004) Genome Res 14:2357-2366), amplificación isotérmica con un solo cebador (SPIA) (Daffom y otros (2004) Biotechniques 37(5):854-7), amplificación mediada por transcripción (TMA) (Vuorinen y otros (1995) J Clin Microbiol 33:1856-1859), reacción de amplificación con enzimas de corte (NEAR) (Maples y otros, documento US2009017453), reacción de amplificación exponencial (EXPAR) (Van Ness y otros (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4504-4509), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) (Notomi y otros (2000) Nucleic Acids Res 28(12):e63), amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) (Piepenburg y otros (2006) PloS Biol 4(7):1115-1120), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) (Kievits y otros (1991) J Virol Methods 35:273-286), proceso de amplificación inteligente (SMAP) (Mitani y otros (2007) Nat Methods 4(3):257-62), amplificación de nanocadenas (Geiss y otros (2008) Nature Biotechnology 26:317-325; Schwanhausser y otros (2011) Nature 473:337-342; disponible comercialmente como la plataforma nCounter® de NanoString Technologies, Seattle, WA), o secuenciación de próxima generación (NGS) (Rothberg y otros (2011) Nature 475:348-352; Metzker M (2010) Nature Rev Genetics 11:31-46).
En una modalidad particular, la amplificación se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa TaqMan (qPCR).
Generalmente, los ensayos de la plataforma qPCR usan dos objetivos genómicos juntos para determinar el número de copias de un gen o región del genoma en una muestra de prueba. Uno de los objetivos genómicos es un ensayo de qPCR para el objetivo de interés (TOI), y el segundo es un ensayo de referencia de qPCR para lo que se asume que es una región del genoma normal no modificada. Los dos ensayos se ejecutan simultáneamente y en paralelo en la misma muestra de prueba. Después de uno o más ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa, los valores de Cq de cada ensayo (indicativos de la cantidad relativa del amplicón de TOI o de referencia) pueden determinarse mediante técnicas conocidas por el experto en la técnica y/o descritas en más detalle más abajo, y se calcula un delta Cq entre ellos. Este delta Cq calculado puede compararse después con un delta Cq que es representativo de un número de copias conocido para el TOI. Por ejemplo, el delta Cq representativo puede ser un delta Cq determinado a partir de una muestra que se conoce que es normal (es decir, que tiene un número de copias de 2, una copia a partir de cada uno de un par de cromosomas). Este delta Cq calculado final entre la muestra de prueba y la muestra/valor conocido puede transformarse después en un número decimal o un número entero que representa el número de copias del gen o región del genoma en la muestra de prueba.
Por las razones descritas anteriormente, el desafío en las muestras de FFPE de cáncer está en la capacidad de encontrar un objetivo genómico de referencia (objetivo del ensayo de referencia qPCR) que sea tanto normal como relativamente no modificado por fijación e inclusión. Adicional o alternativamente, para algunas muestras, la capacidad de encontrar un objetivo genómico de referencia puede verse complicada por un estado patológico en
particular, lo que incluye, pero no se limita a, el cáncer, donde un objetivo genómico de referencia potencial puede alterarse por el estado patológico y está multiplicado en sí mismo con relación a su población típica.
Cualquier secuencia de ácido nucleico a partir del ADN genómico de un sujeto y de interés para el usuario del método puede amplificarse y cuantificarse de acuerdo con el método. Por ejemplo, la secuencia de interés puede ser al menos una porción de un gen que tiene una asociación con una enfermedad. Como resultará evidente para el experto en la técnica, la muestra puede ser cualquier tejido que contenga probablemente o posiblemente la secuencia de ácido nucleico de interés en el ADN genómico.
El método puede usarse para amplificar y cuantificar una secuencia de interés a partir de tejido sospechoso de ser tejido canceroso, lo que incluye el tejido que se ha sometido a fijación con formalina e inclusión en parafina (FFPE) antes de amplificar la secuencia de interés y amplificar la secuencia de referencia. En dicho uso, la secuencia de interés puede ser al menos una porción de un gen para el que existe una correlación entre el número de copias del gen y la presencia y/o estadio de un cáncer.
Puede amplificarse cualquier secuencia de ácido nucleico de referencia que se conozca o se espere que esté presente en el ADN genómico de la muestra. Sin embargo, un experto en la técnica estará consciente de que, en muchas modalidades, tales como aquellas en las que se sospecha que la muestra es tejido canceroso, y especialmente una muestra sometida previamente a FFPE, cualquier locus particular de una copia de una secuencia de ácido nucleico de referencia puede haber sufrido un evento de recombinación, un evento de aneuploidía o similares. Por lo tanto, el número de copias de la secuencia de referencia en la muestra puede diferir del esperado por el simple recuento del número de loci de la secuencia de referencia en una muestra no patológica a partir del sujeto o un miembro de la especie del sujeto.
Por lo tanto, es conveniente que la muestra comprenda al menos una copia de la secuencia de ácido nucleico de referencia en cada uno de al menos diez cromosomas del ADN genómico del sujeto. La presencia de múltiples copias físicamente dispersas de la secuencia de referencia puede nivelar o promediar los efectos de interrupciones individuales o duplicaciones de diversos loci.
En una modalidad, la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases de cualquiera de las SEQ ID NO:9-13, o en donde la secuencia de referencia comprende 60-150 pares de bases de la SeQ ID NO:9. La al menos una porción puede estar presente en chr1:224126101-224126167, chr1:648256-648322, chr5: 180767956+180768022, chr10:38753846+38753912, chr1:228152189+228152255, chr1:243203891-243203957, chr1: 341341+341407, chr2:243071747+243071813, chr3:197962284+197962350, chr4:119569035+119569101, chr6:133078-133144, chr6: 170922356+170922422, chr8:143260-143326, chr11:114137-114203, chr16:90251361+90251427, chr19:184071-184137, chr20:62933480+62933546 y chrUn_gl000227:58945-59011; la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas.
En una modalidad, el primer número mínimo puede ser 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 copias. Independientemente, el segundo número mínimo puede ser 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 cromosomas. El primer y el segundo número mínimo pueden enumerarse, estimarse o predecirse basado en cualquier genoma de referencia humano disponible.
En una modalidad particular, la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una de
GGCTGYTTGCRGTAGTWRTSTRKSWRSMRSMMRMWSRMYGSMSRCARRSRA RRMARWYWSTWDVWAKKMN(SEQ ID NO:1),
GGC T GCTTGCAGT AGTT GT GT AGC AGC AGC AC A ATGGC CGC AGAC A AGGA A A ACAGTTTCTAGGAATTCC (SEQ ID NO:2),
GGCTGCTTGCGGT AGTTATGT AGC AGC AGC AC A ATGGCCGC AG AC A AGG A A A
ACAGTTTCTAGGAATTCC (SEQ ID NO:3),
GGCTGCTTGCGGT AGTTGTCT AGC AGCAGCAC AATGGCCGC AGAC A AGGA AA ACAGTTTCTAGGAATTCC (SEQ ID NO:4),
GGCTGCTTGCGGT AGITGTGTAGCAGCAGCACA ATGGCCGC AGAC A AGGA AA ACAGTTTCTAAAAATTCC (SEQ ID NO:5),
GGCTGCTTGCGGT AGTT GTGTAGCAGC AGC AC AATGGCCGC AGAC A AGGA A A ACAGTTTCTAGGAATTCC (SEQ ID NO 6),
GGC TGCTTGC GGT AG T T GTG T AGC AGC A GC ACA AT GGC C GC AG A C A AGG A A A
ACAGTTTCTAGGAATTCN (SEQ ID NO:7),
GGCTGTTTGCGGT AGTAGTCTGTGT AGCAGCAGC AC AAT GGCCGCAGACGAG GAAAACAGTTTCTAGGAA (SEQ ID NO:8),
AGTGCAG\'RWTGYTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCASAARTCAATTAGC
TTTGTACTGGGAGG (SEQ ID NO:9),
AGTGCAGCAATGTTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCAGAAGTCAATTAGC TTTGTACTGGGAGG (SEQ ID NO:10),
AGTGCAGCGATGCTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCACAAGTCAATTAGC TTTGTACTGGGAGG (SEQ ID NO:11),
AGTGC AGCGTTGCTGACTCTTCC A AGCTTAAC A TTTCTCAC A A ATC A ATTAGC TTTGTACTGGGAGG (SEQ ID NO:12),
AGTGC AGTGATGCTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCACAAGTCA ATTAGC TTTGTACTGGGAGG (SEQ ID NO:13),
GTGT AGCAGCAGC ACAATGGCCGCAGACAAGGAAAACAGTTTCTAGGAATTC CTCGT ATA TA A TTTTAT ATTTTT GAC A AG ATT A ATG ACCC ATGCT CC
(SEQ ID NO:14),
TGCARMGATGCTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCACAAGTCAATTAGCTT TGTACTGGGAGG (SEQ ID NO:15),
TGCTGACTCTTCCAAGCTTAACATTTCTCACAAGTCAATTAGCTTTGTACTGG GAGGAGGGCGTGAAGGGCTGCTTGCG(SEQ ID NO:16),
CAAGGGACAAGGAAAAATTATCCAAACATTGTTTAAAACAATCATCATTAAT TAGTAACACTTATCCAGGGGGGTTTTTAACCTTTCCCCCACTCAASGATTATT CTAATGTCAGAGTAGAATAAAAAATAAGTGC ARM GAIGCIGAC (SEQ ID NO: 17),
CGAOGAGGAAAATAGGTAGTTTTTCAAAAGTTTTCAAAAATATGAAAAGAAG AAATGAAATGGTACTTGGAAGAGATTGTTGAAATGGGAGAGACTATGGTGGC
( S E Q ID N 018 ) ,
CAACTAAAAGGCAATGTCACTCCAATAATCACCAGAGTAATCAATTTGCTTA TTGCTGTCCCTTTAAATATAGTTCTCTGG (SE Q ID NO: 19),
GGAGAGACTATGGTGGCTTGTTTAGAAGCAGTTGAGATAGATCCAATTGAGA TAGAGATATTGAGTATATAAACAAAAGAATGACAAATTAATAGTGTAATGGA TAACTTGACTTTGGCA (SEQ ID NO 20),
GTGTAATGGATAACTTGACTTTGGCAAATATTGTGAATTTTTGTGAAAGTACA ACTAAAAGGCAATGTCACTCCAATAATCACCAG (SEQ ID NO:21),
GTA ATCA ATTTGCTT ATTGCTGTCCCTTT AA ATAT AGTTCTCTGGT ATCA ACT A AC’ATGTTTTT AACT A ATG ATGCTT CTTA A AG A A AAGGG A A AAGAC CT • (SEQ ID NO:22),
CCCTGGGCCCCTCAGGGGACTCCCTGCTGGACAOTGAGACAGAGAATCACCA TGATGATGCTTTCCT(SEQ ID NO:23),
GGGTTT ATGTTT GAT ATRT AATGT AATTTTCT AATGCT AAATC AAGTGGTAAT TTTGTT AGT C A AGTT G A TTT AGT GGCTTGGG A AG A A AGC T (S E Q ID NO:24),
G AGACCCCC AGGTGTTG AGGC AGGGCTGGGGTGTCCCCTTCC A ACC’AGGCTG TCAAGGCCCC’AACTCTGGGGCAGAGGCAGTGGCAGGG (SE Q ID NO:25),
CATCCGTTTCACCTGCAGTTGAAGATCCGTGAGGTGCCCAGAAGATCATGCA GTCAW CAGTCCCACG(SEQ ID N O :26)r
GARATAAGGAAGCTCGAGGAAGAGAAAAAACAACTGGAAGGAGAAATCATA GATTTTTATAAAATGAMAGC'TGCCTCTGAAGC (SE Q ID NO:27),
CCGTITTGGAGG a g g a a c a g a t t c c a t g t c c ac t a g a a t g g a a t o a a c a a g a
A ATOO AGG AGG A AAATAGGTAGTTTTTCAAAAGTTTTCAAAAATATGAAAAG
AAGAAATGAAATGGTACTTGGAAGAGATTGTTGAAATGGGtA (SEQ ID NO:28),
TCíCTTC’TTAAAGAAAACíCiCiAAAAGACCTTTTTCTTTCTTTCAGTCTTCAATGA
TTC ACTGC TTCATCTCGCTCC ACCA A AGATA A ATOA A ATCTAC ATCTCT
(SEQ ID NO:29),
CTTTCCCCC ACTC A ASG A TT ATTCTA ATGTCAG AGTAG A ATA A A A A AT A AGTG
C ARMGATüCT GACTCTTC C A AGCTT A AC ATTT CTC A (S EQ ID NO30),
GGGAGGAGGGC GTG A AGGGCTGCTTGCGGT AGTTGTGT AGC AGC’AGC AC A AT
GGCCGCAGACAAG (SEQ ID NO:31),
En una modalidad, la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una de las SEQ ID NO:1-8.
En una modalidad, la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una de las SEQ ID NO:9-13.
Un primer conjunto de secuencias, SEQ ID NO:1-8, corresponde a secuencias encontradas en el genoma humano en chr1:121836-121905, chr1:243203810-243203879, chr1:341419+341488, chr1:648175-648244, chr2:243071825+243071894, chr3: 197962362+197962431, chr4:119569113+119569182, chr5: 180768034+180768103, chr6: 132997-133066, chr6:170922434+170922503, chr10:38753924+38753993, chr11:114056-114125, chr16:90251439+90251508, chr19:183990-184059, chr20:62933558+62933627, chrUn_gl000227:58864-58933, chrY:26436540+26436609 y chrY:27525831-27525900.
Un segundo conjunto de secuencias, SEQ ID NO:9-13, corresponde a secuencias encontradas en el genoma humano en chr1:224126101-224126167, chr1:228152189+228152255, chr1:243203891-243203957, chr1:341341+341407, chr1:648256-648322, chr2:243071747+243071813, chr3:197962284+197962350, chr4:119569035+119569101, chr5:180767956+180768022, chr6:133078-133144, chr6:170922356+170922422, chr8:143260-143326, chr10:38753846+38753912, chr11:114137-114203, chr16:90251361+90251427, chr19:184071-184137, chr20:62933480+62933546 y chrUn_gl000227:58945-59011.
En cualquier listado de secuencias de ácido nucleico en la presente descripción, se usa la tabla estándar de la IUPAC de nucleótidos de origen natural y degenerados:
Aunque no se limita por la teoría, el presente inventor ha descubierto que cada uno del primer conjunto y el segundo conjunto de secuencias son ambos altamente repetidos (~20 copias en el genoma humano), físicamente dispersos por todo el genoma humano y relativamente más resistentes a la interrupción y/o duplicación por FFPE que las secuencias típicas de ADN genómico. Como resultado, una secuencia que tenga al menos un 80 % de identidad con respecto a una o más de las SEQ ID NO:1-13 puede ser particularmente adecuada como secuencia de referencia, especialmente en muestras sospechosas de ser tejido canceroso, en particular tejido procesado con FFPE.
Las etapas de amplificación producen una secuencia de interés amplificada y una secuencia de referencia amplificada. Generalmente, siempre que la ejecución de las etapas de amplificación esté sincronizada y la amplificación no haya avanzado hasta un punto en el que la cantidad de cualquier reactivo que no sea la secuencia de interés amplificada y la secuencia de referencia amplificada limite la velocidad, en cualquier punto, las cantidades relativas de la secuencia de interés amplificada y la secuencia de referencia amplificada será proporcional a su número de copias en el ADN genómico de la muestra.
Por lo tanto, el método puede comprender cuantificar la secuencia de interés amplificada con relación a la secuencia de referencia amplificada. La cuantificación puede realizarse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica. Por ejemplo, mediante el uso de dos sondas, cada una de las cuales comprende un resto fluorescente en un primer extremo y un extintor para ese resto fluorescente en un segundo extremo, con una sonda que se hibrida específicamente con la secuencia de interés y la otra se hibrida específicamente con la secuencia de referencia, en qPCR TaqMan, la escisión del extintor por la acción de la polimerasa Taq generará una señal de fluorescencia proporcional a la cantidad de sonda hibridada con la secuencia de interés o la secuencia de referencia. De esta forma, en un ejemplo hipotético simple no limitante, si la señal de fluorescencia a partir de la sonda que hibrida con la secuencia de referencia es cinco veces más intensa que la señal de fluorescencia a partir de la sonda que hibrida con la secuencia de interés, la cantidad relativa de la secuencia de interés amplificada sería 0,2. (Como resultará evidente para el experto en la técnica, pueden usarse expresiones alternativas matemáticamente equivalentes para llegar a una cantidad relativa).
En algunas modalidades, puede omitirse la amplificación del TOI y la secuencia de referencia. Las técnicas para cuantificar secuencias de ácidos nucleicos no amplificadas se conocen por el experto en la técnica.
La medida de cuantificación relativa puede informarse mediante el uso del término "cambio en veces", que se refiere a la cantidad de producto amplificado (que se relaciona con el número de copias) en la secuencia de interés con relación a la del objetivo genómico de referencia. El cambio en veces puede cuantificarse mediante el uso de cualquiera de varios métodos disponibles, lo que incluye, pero no se limita a, los descritos por Livak, y otros (Methods, 25:402-408 (2001)), productos disponibles comercialmente tales como CopyCaller™ (Applied Biosystems), o cualquier otro algoritmo adecuado para comparar cantidades de señales de fluorescencia. En muchas modalidades, el cambio en veces se determina al comparar el CT de la secuencia de interés con el CT del objetivo genómico de referencia. Algunos algoritmos adecuados incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos en la solicitud de EE. UU. núm. de serie 13/107786, "Karyotyping Assay" presentada el 13 de mayo de 2011.
La etapa de cuantificación produce una secuencia de interés amplificada cuantificada relativa. El método puede comprender después determinar un número de copias de la secuencia de interés a partir de la secuencia de interés amplificada cuantificada relativa. La determinación requiere una indicación del número de copias de la secuencia de referencia. Dicha indicación puede proporcionarse mediante el análisis del genoma de una muestra no patológica del sujeto o de uno o más miembros de la especie del sujeto. Esta técnica puede ser especialmente adecuada, con respecto a muestras sospechosas de ser tejido canceroso, para una secuencia de referencia que sea una o más de muy repetida, físicamente dispersa y relativamente resistente a la interrupción y/o duplicación por FFPE. Por ejemplo, puede esperarse que el número de copias de una secuencia de referencia que tiene al menos un 80 % de identidad con respecto a una o más de las SEQ ID NO:1-13 en una muestra no patológica sea sustancialmente igual al número de copias de la secuencia de referencia en una muestra sospechosa de ser tejido canceroso.
En continuación con el ejemplo no limitante hipotético simple que se inició anteriormente, si el número de copias de la secuencia de referencia es 20, entonces puede determinarse que el número de copias de la secuencia de interés amplificada es 20 * 0,2 = 4. (Como debería ser evidente, este es un ejemplo basado en una sola sonda de un cálculo del número de copias. Es una cuestión de rutina para el experto en la técnica, que tiene el beneficio de la presente descripción, realizar el cálculo del número de copias para otras técnicas de ensayo, tales como qPCR).
El número de copias determinado de la secuencia de interés puede usarse para cualquier propósito que se encomiende el experto en la técnica. En una modalidad particular, el método puede comprender además diagnosticar que el sujeto tiene un biomarcador relacionado con el cáncer, basado en que la secuencia de interés está asociada con el cáncer y que el número de copias es indicativo del cáncer.
La presente descripción se refiere a un kit que comprende una primera sonda que se hibrida específicamente con al menos una porción de al menos una secuencia de referencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases, en donde al menos una porción está presente en chrl-121790-133586, chr1-329448-341534, chr1-648129-660266, chr1-222643865-228172047, chr1-243203764-243215874, chr10-38741930-38753964, chr11-114010-126106, chr16-90239446-90251554, chr19-183944-196032, chr2-114323560-114323652, chr2-243064480-243071940, chr20-62921559-62933673, chr3-197950387-197962431, chr4-119557144-120325498, chr4-165196360-165199636, chr5-180756063-180768074, chr6-170921836-170922549, chr7-39837560-63231088, chr7-128296352-128298474, chr8-143133-150475, chr9-49679-49771, chrY-26424506-27537936 o chr6-132951-145064; la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas.
En una modalidad particular, la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una de las SEQ ID NO:1-31.
En una modalidad más particular, la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una de las SEQ ID NO:1-13.
Una "sonda", como se usa en la presente, se refiere a un compuesto que comprende una secuencia de ácido nucleico y un resto detectable. Como tal, y para evitar dudas, cualquier "sonda" a la que se hace referencia en la presente descripción no es de origen natural.
En una modalidad, la primera sonda comprende una secuencia de ácido nucleico configurada para hibridar específicamente con al menos la porción de la al menos una secuencia de referencia, un indicador fluorescente en un primer extremo de la secuencia de ácido nucleico y un extintor de la fluorescencia en un segundo extremo de la secuencia de ácido nucleico.
En una modalidad adicional, la secuencia de ácido nucleico se configura para hibridar específicamente con la totalidad de al menos una secuencia de referencia.
Puede determinarse un porcentaje de identidad de secuencia mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica. En algunas modalidades, la secuencia de referencia tiene al menos 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 99,9 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una de las SEQ ID NO:1-13.
Mediante el uso de técnicas conocidas por el experto en la técnica, la primera sonda puede permitir la detección de al menos la porción de la al menos una secuencia de referencia.
Además de la primera sonda, el kit puede comprender otros componentes. Por ejemplo, el kit puede comprender además un primer cebador configurado para hibridar específicamente con un primer extremo de la al menos una secuencia de referencia, y un segundo cebador configurado para hibridar específicamente con una secuencia complementaria a un segundo extremo de la al menos una secuencia de referencia.
Por "cebadores" se entiende moléculas de ácido nucleico que, en presencia de la al menos una secuencia de referencia y otro(s) reactivo(s), pueden permitir la amplificación de la al menos una secuencia de referencia.
Alternativamente o, además, el kit puede comprender además una segunda sonda que hibrida específicamente con al menos una porción de al menos una secuencia de ácido nucleico de interés. Aparte de la secuencia con la que se hibrida específicamente, la segunda sonda puede tener las mismas características que la primera sonda descrita anteriormente.
Cualquier secuencia de ácido nucleico de interés puede ser el objetivo de hibridación de la segunda sonda. En una modalidad, la secuencia de interés es una porción o la totalidad de un gen asociado con un cáncer.
Alternativamente o, además, el kit puede comprender además un tercer cebador configurado para hibridar específicamente con un primer extremo de la al menos una secuencia de ácido nucleico de interés, y un cuarto cebador configurado para hibridar específicamente con una secuencia complementaria a un segundo extremo de la al menos una secuencia de ácido nucleico de interés. En una modalidad, la presente descripción se refiere a una composición, que comprende una primera sonda que se hibrida específicamente con al menos una porción de al menos una secuencia de referencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases, en donde la al menos una porción está presente en chr1-121790-133586, chr1-329448-341534, chr1-648129-660266, chr1 -222643865-228172047, chr1 -243203764-243215874, chr10-38741930-38753964, chr11 -114010-126106, chr16-90239446-90251554, chr19-183944-196032, chr2-114323560-114323652, chr2-243064480-243071940, chr20-62921559-62933673, chr3-197950387-197962431, chr4-119557144-120325498, chr4-165196360-165199636, chr5-180756063-180768074, chr6-170921836-170922549, chr7-39837560-63231088, chr7-128296352-128298474, chr8-143133-150475, chr9-49679-49771, chrY-26424506-27537936 o chr6-132951-145064; la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas.
En una modalidad particular, la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una de las SEQ ID NO:1-31.
En una modalidad más particular, la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una de las SEQ ID NO:1-13.
La primera sonda puede ser sustancialmente la misma que la primera sonda del kit, descrita anteriormente.
La composición puede comprender además uno o más de (i) un primer cebador configurado para hibridar específicamente con un primer extremo de al menos una secuencia de referencia, y un segundo cebador configurado para hibridar específicamente con una secuencia complementaria a un segundo extremo de al menos una secuencia de referencia; (ii) una segunda sonda que se hibrida específicamente con al menos una porción de al menos una secuencia de ácido nucleico de interés; o (iii) un tercer cebador configurado para hibridar específicamente con un primer extremo de al menos una secuencia de ácido nucleico de interés, y un cuarto cebador configurado para hibridar específicamente con una secuencia complementaria a un segundo extremo de al menos una secuencia de ácido nucleico de interés, sustancialmente igual que el(los) componente(s) adicional(es) correspondiente(s) del kit, descrito(s) anteriormente.
En una modalidad, la presente descripción se refiere a un sistema, que comprende:
un amplificador de ácido nucleico configurado para amplificar una secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra que comprende ADN genómico de un sujeto y amplificar una secuencia de referencia en la muestra; un depósito de reactivo que contiene al menos un primer cebador configurado para hibridar específicamente con un primer extremo de al menos una secuencia de referencia, en donde la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases de cualquiera de las SEQ ID NO:9-13, o en donde la secuencia de referencia comprende 60-150 pares de bases de la s Eq ID NO:9. La al menos una porción está presente en chr1:224126101-224126167, chr1:228152189+228152255, chr1:243203891-243203957, chr1:341341+341407, chr1:648256-648322, chr2:243071747+243071813, chr3:197962284+197962350, chr4:119569035+119569101, chr5:180767956+180768022, chr6:133078-133144, chr6:170922356+170922422, chr8:143260-143326, chr10:38753846+38753912, chr11:114137-114203, chr16:90251361+90251427, chr19:184071 -184137, chr20:62933480+62933546 y chrUn_gl000227:58945-59011; la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas, y un segundo cebador configurado para hibridar específicamente con una secuencia complementaria a un segundo extremo de al menos una secuencia de referencia;
un detector configurado para proporcionar una primera indicación relacionada con una cantidad de la secuencia de interés amplificada y una segunda indicación relacionada con una cantidad de la secuencia de referencia amplificada; y
un controlador configurado para cuantificar la secuencia de interés amplificada con relación a la secuencia de referencia amplificada, basado al menos en parte en la primera indicación y la segunda indicación; y determinar un número de copias de la secuencia de interés a partir de la secuencia de interés amplificada cuantificada relativa.
Los amplificadores de ácido nucleico se conocen por el experto en la técnica. Generalmente, los amplificadores de ácido nucleico usan uno o más cebadores y uno o más agentes químicos o enzimáticos para copiar una secuencia de ácido nucleico molde, tal como una secuencia de interés o una secuencia de referencia. Dicha copia puede realizarse en múltiples ciclos para producir cantidades relativamente grandes de la secuencia de interés y la secuencia de referencia. Convenientemente, el amplificador de ácido nucleico se configura para amplificar la secuencia de interés y la secuencia de referencia simultáneamente y en paralelo, por ejemplo, al añadir diferentes conjuntos de cebadores, uno específico para la secuencia de interés y el otro específico para la secuencia de referencia, a de cualquier otra manera soluciones de reacción idénticas, tales como en diferentes pocillos de una placa de múltiples pocillos.
El sistema comprende además un depósito de reactivo. Generalmente, el depósito de reactivo contiene materiales necesarios para que se produzca la reacción de amplificación, tales como cebadores, agentes químicos o enzimáticos, nucleótidos libres incorporables en copias de secuencias molde, etc. El depósito de reactivo también puede contener una o más sondas u otros compuestos que comprenden restos detectables. Cualquiera de estos materiales puede almacenarse por separado y/o pueden combinarse dos o más de los mismos para su almacenamiento en el depósito de reactivo. Estos materiales están generalmente en solución acuosa y pueden introducirse en la(s) solución(es) de reacción mediante técnicas conocidas por el experto en la técnica. Dicha introducción puede producirse una o varias veces antes, durante o después de un proceso de amplificación. Por ejemplo, algunos reactivos pueden añadirse una vez por ciclo de amplificación.
En una modalidad, el depósito de reactivo contiene al menos un primer cebador configurado para hibridar específicamente con un primer extremo de al menos una secuencia de referencia, en donde la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una de las SEQ ID NO:1-31, tal como las SEQ ID NO:1-13, y un segundo cebador configurado para hibridar específicamente con una secuencia complementaria a un segundo extremo de la al menos una secuencia de referencia.
La secuencia de referencia, la determinación de un porcentaje de identidad de secuencia y las SEQ ID NO:1-38 se describen en otra parte en la presente descripción.
El sistema comprende además un detector. Generalmente, el detector puede configurarse para detectar una sonda para la secuencia de interés, la secuencia de referencia, o ambas. Tras la detección, el detector puede realizar diversas operaciones de procesamiento y/o análisis de señales para proporcionar una primera indicación relacionada con una cantidad de la secuencia de interés amplificada y una segunda indicación relacionada con una cantidad de la secuencia de referencia amplificada.
El sistema comprende además un controlador. El controlador puede configurarse para cuantificar la secuencia de interés amplificada con relación a la secuencia de referencia amplificada, basado al menos en parte en la primera indicación y la segunda indicación; y determinar un número de copias de la secuencia de interés a partir de la secuencia de interés amplificada cuantificada relativa. Puede almacenar el número de copias determinado en una memoria, mostrarlo a un usuario, escribirlo en un archivo legible por computadora o similares.
En una modalidad adicional, el controlador puede configurarse para diagnosticar que el sujeto tiene un biomarcador relacionado con el cáncer, basado en que la secuencia de interés está asociada con el cáncer y que el número de copias es indicativo del cáncer.
Ejemplo 1
Las SEQ ID NO:1-13 se identificaron mediante un proceso de dos fases. Primero, se usó un algoritmo bioinformático para identificar objetivos candidatos en el genoma que cumplían con ciertos criterios asociados con un número de copias sustancialmente normal, incluso en células cancerosas sometidas a FFPE. Generalmente, las secuencias sospechosas de ser relativamente resistentes a anomalías en el número de copias en células cancerosas y/o células sometidas a FFPE se usaron para consultar bases de datos genómicas humanas disponibles públicamente, y solo aquellas secuencias que devuelven múltiples aciertos se consideraron como objetivos candidatos para pruebas adicionales.
La primera fase identificó las SEQ ID NO:1-31. Las SEQ ID NO:2-8 y 10-13 se ubican en el genoma en los loci dados supra. Las SEQ ID NO:14-31 se ubican en el genoma al menos en los siguientes loci:
SEQ ID NO:14, chr1038753941..38753964..38754039 chr11.11250s.
SEQ ID NO:15, chr1038753848..38753866..38753912 chr11.11350s.
SEQ ID NO:16, chr1038753856..38753896..38753934 chr1.5850s.
SEQ ID NO:17, chr1038753715..38753794..38753862 chr1.5950s.
SEQ ID NO:18, chr1038753145..38753206..38753248 chr16.2650s.
SEQ ID NO:19, chr1038753377..38753408..38753457 chr16.2850s.
SEQ ID NO:20, chr1038753232..38753257..38753351 chr20.2650s.
SEQ ID NO:21, chr1038753326..38753360..38753411 chr20.2750s.
SEQ ID NO:22, chr1038753413..38753454..38753513 chr20.2850s.
SEQ ID NO:23, chr11 123673..123696..123739 chr20.3850s.
SEQ ID NO:24, chr1038750797..38750847..38750889 chr3.150s.
SEQ ID NO:25, chr1038741930..38741975..38742018 chr3.1550s.
SEQ ID NO:26, chr1038742246..38742274..38742312 chr3.1850s.
SEQ ID NO:27, chr1038746651..38746676..38746733 chr3.6250s.
SEQ ID NO:28, chr1038753090..38753126..38753234 chr5.2550s.
SEQ ID NO:29, chr1038753486..38753535..38753587 chr5.2950s.
SEQ ID NO:30, chr1038753797..38753835..38753885 chr5.3250s.
SEQ ID NO:31, chr1038753907..38753935..38753971 chr5.3350s.
(Como está consciente el experto en la técnica, a partir de este escrito, la resistencia de una secuencia a las anomalías en el número de copias en células cancerosas y/o células sometidas a FFPE no puede predecirse con suficiente precisión solamente a partir de los datos de la secuencia. Se requieren pruebas adicionales, tales como las que se describen más abajo, para identificar secuencias adecuadas para su uso como ensayo de referencia para múltiples copias).
Se diseñaron numerosos ensayos de referencia de TaqMan, qPCR, mediante el uso de los objetivos candidatos y se probaron en muestras de cáncer junto con un ensayo de objetivo de interés (TOI) TaqMan, qPCR. Los ensayos mapearon a las regiones objetivo muchas veces:
Después de las pruebas iniciales, dos objetivos proporcionaron resultados que sugerían un número de copias sustancialmente normal, incluso en células cancerosas sometidas a FFPE, y se seleccionaron para una ronda final de pruebas en un panel ampliado de muestras.
La ronda final de pruebas evaluó la ejecución de estos dos ensayos de referencia para múltiples copias de qPCR de novo, un ensayo de referencia de una sola copia de qPCR convencional (ARNasaP) y cinco ensayos de TOI por qPCR para el gen IRS2. Los ensayos de qPCR usaron todos como molde ADN genómico extraído a partir de 35 muestras de tejido normal colorrectal sometidas a FFPE. Todos los ensayos se realizaron por duplicado, con el ensayo de referencia y el ensayo del objetivo de interés ejecutados en pocillos separados para generar valores de Cq precisos.
El primer ensayo de referencia para múltiples copias, que corresponde a las SEQ ID NO:1-8, usó un primer conjunto que comprendía un cebador directo, un cebador inverso y una secuencia de sonda. El segundo ensayo de referencia para múltiples copias, que corresponde a las SEQ ID NO:9-13, usó un segundo conjunto que comprendía un cebador directo, un cebador inverso y una secuencia de sonda.
Se esperaba que se determinara un resultado de 2 copias del gen IRS2 para muestras normales, si una prueba generaba resultados precisos. Se proporciona un resumen tipo fotografía de los resultados en las Figuras 1A-3B para cada uno de los tres ensayos de referencia: ARNasaP (Figuras 1A-1B), SEQ ID NO:1-8 (Figuras 2A-2B) y SEQ ID NO:9-13 (Figuras 3A-3B). En cada figura, el número de copias se traza en el eje y, y las 35 muestras por duplicado de los cinco ensayos de TOI de IRS2 diferentes se trazan en el eje x. Cada figura contiene 350 puntos de datos.
Los resultados dependieron no solo del ensayo de referencia usado, sino también del ensayo de TOI de IRS2 usado. Los dos ensayos de referencia para múltiples copias funcionaron bien, junto con los primeros 3 ensayos de TOI de IRS2. En cada figura, la subfigura A tiene un número de copias calculado de punto decimal y la subfigura B tiene un número de copias redondeado.
Claims (14)
1. Un método, que comprende:
amplificar una secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra que comprende ADN genómico de un sujeto;
amplificar una secuencia de referencia en la muestra, en donde la secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases de cualquiera de las SEQ ID NO:9-13, en donde la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y
al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas;
cuantificar la secuencia de interés amplificada con relación a la secuencia de referencia amplificada; y determinar un número de copias de la secuencia de interés a partir de la secuencia de interés amplificada cuantificada relativa, en donde la amplificación de la secuencia de interés y la amplificación de la secuencia de referencia se realizan mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa TaqMan (qPCR).
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la muestra comprende tejido sospechoso de ser tejido canceroso.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde la muestra se ha sometido a fijación con formalina e inclusión en parafina (FFPE) antes de amplificar la secuencia de interés y amplificar la secuencia de referencia.
4. El método de conformidad con la reivindicación 2, que comprende, además:
diagnosticar que el sujeto tiene un biomarcador relacionado con el cáncer, basado en que la secuencia de interés está asociada con el cáncer y el número de copias es indicativo del cáncer.
5. Una composición, que comprende:
una primera sonda que se hibrida específicamente con al menos una porción de al menos una secuencia de referencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases de cualquiera de las SEQ ID NO:9-13, en donde la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y
al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas, en donde la sonda es una sonda TaqMan.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, en donde la primera sonda comprende una secuencia de ácido nucleico configurada para hibridar específicamente con al menos la porción de la al menos una secuencia de referencia, un indicador fluorescente en un primer extremo de la secuencia de ácido nucleico y un extintor de fluorescencia en un segundo extremo de la secuencia de ácido nucleico.
7. La composición de conformidad con la reivindicación 5, que comprende, además:
un primer cebador configurado para hibridar específicamente con un primer extremo de la al menos una secuencia de referencia, y un segundo cebador configurado para hibridar específicamente con una secuencia complementaria a un segundo extremo de la al menos una secuencia de referencia y, opcionalmente, una segunda sonda que se hibrida específicamente con al menos una porción de al menos una secuencia de ácido nucleico de interés.
8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, que comprende, además:
un tercer cebador configurado para hibridar específicamente con un primer extremo de la al menos una secuencia de ácido nucleico de interés, y un cuarto cebador configurado para hibridar específicamente con una secuencia complementaria a un segundo extremo de la al menos una secuencia de ácido nucleico de interés.
9. Un sistema, que comprende:
un amplificador de ácido nucleico configurado para amplificar una secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra que comprende el ADN genómico de un sujeto y amplificar una secuencia de referencia en la muestra, un depósito de reactivo que contiene al menos un primer cebador configurado para hibridar específicamente con un primer extremo de la al menos una secuencia de referencia, en donde la
secuencia de referencia tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con respecto a al menos una porción de ADN genómico que comprende de aproximadamente 60 a aproximadamente 150 pares de bases de cualquiera de las SEQ ID NO:9-13;
la al menos una porción está presente en al menos un primer número mínimo de copias en el genoma; y al menos una copia de la al menos una porción está presente en cada uno de al menos un segundo número mínimo de cromosomas; y
un segundo cebador configurado para hibridar específicamente con una secuencia complementaria a un segundo extremo de la al menos una secuencia de referencia;
un detector configurado para proporcionar una primera indicación relacionada con una cantidad de la secuencia de interés amplificada y una segunda indicación relacionada con una cantidad de la secuencia de referencia amplificada; y
un controlador configurado para cuantificar la secuencia de interés amplificada con relación a la secuencia de referencia amplificada, basado al menos en parte en la primera indicación y la segunda indicación; y determinar un número de copias de la secuencia de interés a partir de la secuencia de interés amplificada cuantificada relativa, en donde el amplificador de ácido nucleico se configura para amplificar la secuencia de interés y amplificar la secuencia de referencia mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa TaqMan (qPCR).
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, la composición de conformidad con la reivindicación 5 o el sistema de conformidad con la reivindicación 9, en donde la al menos una porción está presente en chr1:224126101-224126167, chr1:228152189+228152255, chr1:243203891-243203957, chr1:341341+341407, chr1:648256-648322, chr2:243071747+243071813, chr3:197962284+197962350, chr4:119569035+119569101, chr5:180767956+180768022, chr6:133078-133144, chr6:170922356+170922422, chr8:143260-143326, chr10:38753846+38753912, chr11:114137-114203, chr16:90251361+90251427, chr19:184071-184137, chr20:62933480+62933546 y chrUn_gl000227:58945-59011.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 10, la composición de conformidad con la reivindicación 5 o 10, o el sistema de conformidad con la reivindicación 9 o 10, en donde el primer número mínimo es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 copias y/o en donde el segundo número mínimo es independientemente 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 cromosomas.
12. El sistema de conformidad con la reivindicación 9, en donde la muestra comprende tejido sospechoso de ser tejido canceroso.
13. El sistema de conformidad con la reivindicación 12, en donde la muestra se ha sometido a fijación con formalina e inclusión en parafina (FFPE).
14. El sistema de conformidad con la reivindicación 12, en donde el controlador se configura además para indicar que el sujeto tiene un biomarcador relacionado con el cáncer, basado en que la secuencia de interés está asociada con el cáncer y el número de copias es indicativo del cáncer.
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