KR20190133568A

KR20190133568A - Dock8 유전자 단일염기다형성을 이용한 아토피 피부염 진단용 조성물과 검출 방법

Info

Publication number: KR20190133568A
Application number: KR1020180058661A
Authority: KR
Inventors: 허원일; 서성준
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2019-12-03
Also published as: KR102072504B1; WO2019225972A1

Abstract

본 발명은 DOCK8 유전자 단일염기다형성을 이용한 아토피 피부염 진단용 마커 조성물과 검출 방법에 대한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 289번째 염기가 A이고, 상기 289번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물과 DOCK8 유전자의 다형성을 마커로 검출하는 방법에 대한 것이다.
본 발명을 이용하여 아토피성 피부염을 조기에 발견하고 초기에 적절하게 대응하여 효과적으로 치료할 수 있게 하기 위한 아토피 피부염의 유전자 진단 시약 및 진단용 칩을 개발할 수 있다.

Description

DOCK8 유전자 단일염기다형성을 이용한 아토피 피부염 진단용 조성물과 검출 방법{Composition and method for diagnosing atopic dermatitis using DOCK8 SNP}

본 발명은 DOCK8 유전자 단일염기다형성을 이용한 아토피 피부염 진단용 마커 조성물과 검출 방법에 대한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 289번째 염기가 A이고, 상기 289번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물과 DOCK8 유전자의 다형성을 마커로 검출하는 방법에 대한 것이다.

아토피 피부염(atopic dermatitis, AD)은 습진성 손상과 건조하고 가려운 피부가 주요 증상이며, 쉽게 재발되는 만성 피부 염증 질환이다. AD는 유전적 소인과 환경적 요인의 조합에 의하여 발생하는 것으로 생각되고 있다. AD는 다수의 유전자에 의하여 발생하고, 집안 내력으로 세대 간에 유전되며, 어린 시절에 발병한다는 특징이 있다. AD 가족력이 있는 집단의 연구(cohort study)를 통하여 상염색체 우성의 방식으로 유전되는 것으로 밝혀졌다. AD는 약 20%의 어린이에서 발생하며(Nutten S, Annals of nutrition & metabolism 2015, 66 Suppl 1:8-16), 유소아 아토피가 사춘기전후에 저절로 낫지 않아서 성인이 돼서도 계속 앓거나 사춘기 이전에는 전혀 아토피를 앓지 않았던 사람이 성인이 된 다음에 아토피 증상이 처음으로 발생한 경우나 유소아 아토피를 앓다가 좋아졌던 환자가 사춘기 이후에 다시 재발한 경우를 성인 아토피라고 한다. 따라서 AD에 대한 유전적 배경을 이해하고 조기 진단과 치료법을 개발하는 것이 중요하다. 또한 AD를 조기 진단하기 위해서는 AD 같은 복잡다단한 현상을 일으키는 원인이 되는 변이를 규명하는 것이 필요하다.

전체 엑솜 시퀀싱(whole-exome sequencing, WES)은 유전체에서 엑솜(exome)으로 알려진 모든 단백질을 코딩하는 약 3X10⁷bp의 염기서열을 분석하는 기술이다. 엑솜이 인간 유전체에서 차지하는 비율은 2% 보다 낮지만, 이 부위의 변이는 나머지 98%에서 발생하는 변이보다 훨씬 심각한 결과를 초래할 수 있다. WES의 목적은 모든 단백질 코딩 부위를 포함하는 빅 데이터(big data)에서 선별 과정(filtering process)을 통하여 멘델리안 방식으로 유전되는 질병 유발 돌연변이나 흔하고도 복잡한 질환의 발병 위험도를 높이는 단일염기 다형성(single-nucleotide polymorphisms, SNP) 등의 유전적 변이를 찾아내는 것이다.

흔한 질환은 흔한 변이로부터 발생된다는 가설(the common disease-common variant hypothesis, CD-CV)은 유전체 연관 연구(genome-wide association studies, GWASs)를 통해 가장 효과적으로 검증해 볼 수 있다. 한편, CD-CV에서 유전성(heritability)이 상실되는 문제로부터 개개인에서 발생한 희귀한 유전적 변이가 더 중요한 작용을 한다는 가설이 생겨나기도 하였다. 최근 흔한 질환의 흔한 유전적 변이는 다른 인종 간에서도 공통적으로 나타나는 것으로 보고된 바 있다(Marigorta UM et al., PLoS genetics 2013, 9(6):e1003566). 유전적 변이의 희귀성 또는 공통성의 중요성은 아직 정확하게 알려지지 않았으므로, 희귀한 변이 뿐만 아니라, 흔하고 보편적인 변이도 확인할 필요가 있다.

본 발명자들은 성인 아토피 피부염(AD)을 일으키는 유전적 변이를 동정하기 위하여 한국인의 아토피 환자와 천식이나 비염으로 이행된 환자 그리고 대조군에 대하여 WES를 실시하고, 대립유전자(allele)를 비교하였다. 분석 결과, 대조군에 비해 아토피에서 발견되는 다수의 유전적 변이가 관찰되었으며, 이 중 특히 DOCK8 유전자의 변이가 유전성 AD와 밀접하게 연관되어 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 289번째 염기가 A이고, 상기 289번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은

아토피 피부염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여

(1) 피검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및

(2) 상기 핵산 시료의 염기서열을 분석하여 DOCK8 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계

를 포함하는 DOCK8 유전자의 다형성을 마커로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 289번째 염기가 A이고, 상기 289번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

아토피 피부염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여

(1) 피검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및

를 포함하는 DOCK8 유전자의 다형성을 마커로 검출하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 289번째 염기가 A이고, 상기 289번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 ‘상보적(complementary)'이라고 한다. 또한 본 명세서에서 ‘유전체 DNA(genomic DNA, gDNA)’는 한 개체의 유전자의 총 염기서열로서, 거의 완전한 유전정보를 포함하고 있는 DNA를 의미한다.

한편 본 명세서에서 유전자의 변이를 표기할 때 ’은 단백질 코딩 부위의 변이를 의미하며, ‘염기 위치)(염기일문자)(기호 >)(염기일문자)’는 해당 염기 위치에서 선행 표기된 염기가 후행 표기된 염기로 치환된다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)'* 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르지닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 쓰레오닌; U(Sec):셀레노시스테인; V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신.

본 명세서에 표기되는 ‘아미노산 일문자)(아미노산 위치)(아미노산 일문자)’는 천연형 단백질(wild-type protein)의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산이 후행 표기된 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다.

‘아토피(atopy)’는 아토피 소인을 가지고 있는 개인에서 피부, 호흡기 점막, 안점막, 장점막 등에 나타나는 일련의 알레르기 증상을 말하며, 이러한 아토피 소인(알레르기 체질)은 유전되어 가계의 다음 세대로 전달된다. 아토피 소인에 의한 알레르기 질환으로 알레르기 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 결막염, 아토피성 두드러기 등이 있으며, 이들 질환은 단독 또는 여러 질환이 동시에 나타날 수 있다.

‘아토피성 피부염’또는 ‘아토피 피부염(atopic dermatitis)’은 아토피 알레르기를 가진 사람에서 나타나는 대표적인 피부 질환으로, 흔히 태열이라고 불리는 만성 피부질환이다. 피부의 붉은 반점, 부종, 피부 건조증 및 가려움증이 주요 증상이며, 면역학적 특성을 보여 다른 알레르기 질환인 두드러기, 금속 알레르기, 천식이나 알레르기성 비염 등을 동반하는 경우(아토피 행진)가 있다.

본 명세서에서 ‘진단’은 질병 발생의 예측 및 발병 위험도(risk) 또는 발병 감수성(susceptibility)를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다.

본 발명의 목적상, 상기 진단은 아토피 피부염의 진단을 의미한다. 본 발명에서의 아토피 피부염은 바람직하게는 유전적 소인(genetic factor)에 의하여 유발되는 유전성(hereditary) 아토피 피부염일 수 있으며, 유전적 소인에 환경적인 영향이 더해져서 증상이 심화된 것일 수 있다. 또한 본 발명에서의 아토피 피부염은 성인 아토피 피부염일 수 있다. 상기 ‘성인 아토피 피부염’이란 구체적으로 ①유소아 아토피가 사춘기전후에 저절로 낫지 않아서 성인이 돼서도 계속 앓거나 ②사춘기 이전에는 전혀 아토피를 앓지 않았던 사람이 성인이 된 다음에 아토피 증상이 처음으로 발생한 경우나 ③유소아 아토피를 앓다가 좋아졌던 환자가 사춘기 이후에 다시 재발한 경우를 말하며, 바람직하게는 사춘기 이전에는 전혀 아토피를 앓지 않았던 사람이 성인이 된 다음에 아토피 증상이 처음으로 발생한 경우를 말한다. 성인 아토피는 아토피 발병시 아토피행진으로 갈 확률이 조기 발병보다 상당히 줄어든다고 보고된 바 있다(Garmhausen D Allergy 2013; 68: 498-506).

본 발명에서는 피검체에서 아토피 피부염의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 DOCK8 유전자의 다형성(polymorphism)을 진단 마커로 검출한다. ‘DOCK8'은 'Dedicator of cytokinesis 8‘으로 세포내의 시그널 네트워크에 관여한다. 9p24.3 위치에 존재하며, DOCK8의 돌연변이가 Hyper-IgE 신드롬과 연관이 된다는 보고가 있다. (Karin R et al., J Allergy Clin Immunol. 2009;1234(6):1289).

본 발명에서의 DOCK8은 가장 바람직하게는 인간에서 유래한 것으로서, 인간 DOCK8 유전자의 mRNA와 단백질의 서열정보는 GenBank database에 NM_203447.3의 accession number로 공지되어 있다. (서열번호 2 및 서열번호 3)

본 명세서에서 상기‘다형성(polymorphism)’이란 유전적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대립형질(또는 대립유전자)의 발생을 의미하며, ‘단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)'는 하나의 염기의 다형성을 의미한다. 구체적으로 유전체에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예를 들어 AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립유전자(A 또는 G)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNP는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 또한 SNP가 특정 질환과 유전적으로 밀접하게 연관되어 있는 경우에는, SNP는 확인된 정상인(normal) 또는 야생형(wild-type, WT) 개체 또는 대립유전자와 비교하여 특정 위치의 하나의 염기의 변이가 발생한 것을 의미하기도 한다.

본 발명에 따른 아토피 피부염 진단용 마커인 DOCK8의 SNP 부위는 DOCK8의 단백질 코딩 부위(coding region)에 위치하며, 아토피 피부염과 관련된 SNP 대립형질은 DOCK8 단백질 기능의 손상을 야기하는 것일 수 있다. 구체적인 DOCK8 SNP와 아토피 피부염과의 연관성은 다음과 같다:

1) 서열번호 1의 염기서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드에서 289번째 염기: 서열번호 1은 SNP rs529208의 염기서열이며, 이 염기는 9번 염색체 상에서는 286,593번째 염기에 해당한다. 아토피 피부염과 아토피 행진 환자들의 엑솜시퀀싱 결과 후보 유전자변이로 선택되었으며, 상기 아토피 피부염과 관련된 변이는 DOCK8 유전자의 단백질 코딩 부위(coding region)에서 289번째 염기가 C에서 A로 된 것(c.289C>A)으로, DOCK8 단백질에서는 97번째 아미노산 프롤린이 트레오닌으로 치환된 것(Pro97Thr 또는 P97T)이다. DOCK8 유전자의 mRNA 염기서열(개시 코돈부터 종결 코돈까지의 서열)과 단백질의 아미노산 서열은 각각 본 명세서에 서열번호 2와 서열번호 3으로 기재되어 있다.

이에 따라, 본 발명에 따른 아토피 피부염의 진단용 조성물은 상기 DOCK8 SNP를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 것이다. 보다 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 289번째 염기가 A이고, 상기 289번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 것이다.

상기 검출 제제는 구체적으로는 상기 DOCK8 SNP를 포함하는 부위의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하여 SNP 염기를 확인할 수 있는 프로브일 수 있다. 즉, 서열번호 1의 289번째 염기를 검출할 수 있는 프로브인 것이다.

'프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA), DNA 등에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질(또는 대립유전자, allele)을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출 방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화(hybridization)란, 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 통상적으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 5XSSPE(750mN NaCl, 50mM sodium phosphate, 5mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30℃의 조건이 대립형질 특이적(allele-specific) 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

또한 상기 검출 제제는 DOCK8 SNP를 포함하는 부위의 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수도 있다. 즉, 서열번호 1의 289번째 염기를 증폭할 수 있는 프라이머쌍인 것이다.

'프라이머(primer)'는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소(DNA polymerase)가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, T_m)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 상기 증폭 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 폴리뉴클레오티드의 특정 구간의 양쪽 끝부분(5‘말단 또는 3’말단)의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 쌍(세트)로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 앞서 서술한 DOCK8의 SNP 부위의 cDNA 또는 genomic DNA의 염기서열을 참조하여 본 발명에 따른 아토피 피부염의 진단을 위한 프라이머쌍을 용이하게 디자인할 수 있다. 본 발명에 따른 DOCK8의 SNP를 검출하기 위한 PCR cycle 조건은 실시예의 실험 방법에 구체적으로 기재되어 있다.

보다 구체적으로, 상기 프라이머쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 쌍일 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지 된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출하고자 하는 표적이 되는 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.

또한 본 발명에 따른 진단용 조성물은 DOCK8 SNP를 검출할 수 있는 진단용 키트 또는 진단용 마이크로어레이(microarray)로 제작될 수 있다.

프로브를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 프로브는 DOCK8 SNP의 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질 간에 명확한 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 혼성화 조건은 전술한 바와 같다.

상기 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하는 과정은 종래 기술을 사용하여 용이하게 실시할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

또한 본 발명은

아토피 피부염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여

(1) 피검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및

(2) 상기 핵산 시료의 염기서열을 분석하여 DOCK8 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계

를 포함하는 DOCK8 유전자의 다형성을 마커로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 피검체의 시료는 피검체에서 분리된 혈액, 전혈, 혈장, 가래, 타액, 안구액, 정액, 세포와 조직(예를 들어 피부 등) 등 핵산 시료를 분리할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 혈액을 사용할 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 적절히 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등의 전처리를 할 수 있다. 핵산 시료를 분리하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

본 명세서에서 ‘검출’은 본 발명에 따른 진단 마커, 구체적으로는 DOCK8 SNP의 특정 염기의 존재 또는 부존재를 분석, 영상화, 확인 또는 확립하는 것을 의미한다.

상기 DOCK8의 단일염기다형성(SNP) 부위는 전술한 바와 같다. 구체적으로는 서열번호 1의 289번째 염기인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 단일염기다형성 부위가 서열번호 1의 289번째 염기가 A인 경우에 아토피 피부염으로 진단하거나, 아토피 피부염 발병 위험 또는 감수성이 높은 것으로 판단하게 된다.

상기 염기를 결정하는 단계는 당업계에 염기서열을 분석하고 결정하기 위하여 통상적으로 사용되는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 시퀀싱(sequencing), 엑솜 시퀀싱(exome sequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화(microarray hybridization), 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization), PCR 연장 분석 및 Taqman 기법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 방법으로 수행할 수 있다.

따라서 본 발명은 DOCK8 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위인 rs529208의 염기의 변이를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물 상기 변이를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 중증의 증상을 동반하는 아토피 피부염 환자들의 유전체 DNA의 단백질 코딩 부위를 분석한 결과, DOCK8 유전자의 상기 SNP의 특정 염기 변이가 아토피 피부염 환자 및 행진환자의 IgE 증가와 밀접하게 연관되어 있는 것으로 규명하였으며, 이를 이용하여 아토피 피부염을 진단하기 위한 유전자 진단 시약을 개발하는데 이용할 수 있다.

도 1은 엑솜시퀀싱에서 산출되는 변이들의 필터링 과정의 모식도이다.
도 2는 아토피 환자들의 임상정보인 총 IgE 수준과 DOCK8 변이와의 연관성을 나타냈다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험 방법>

환자

본 연구는 중앙대학교병원 윤리위원회의 승인을 받아 이루어졌다. 대조군 79명과 성인 아토피 환자(사춘기 이전에는 전혀 아토피를 앓지 않았던 사람이 성인이 된 다음에 아토피 증상이 처음으로 발생) 84명, 아토피 행진 환자(발병시기 무관) 70명을 대상으로 말초혈액 샘플을 수득하였다. 성인 아토피 환자는 천식, 비염등이 동반되지 않는 순수 아토피 환자이고, 아토피 행진 환자는 아토피에 천식과 비염등이 동반한 환자이다. 각 구성원은 피부과 전문의의 진단을 받았으며, 먼저 성인아토피환자 20명, 그리고 아토피 행진 환자 20명을 대상으로는 엑솜시퀀싱을 진행하여 후보 변이를 확인하였고 (표 1;후보 변이 DOCK8을 검증하기 위한 엑솜시퀀싱 환자들의 임상정보), 대조군은 KPGP 40명을 사용하였다. 대조군 79명과 아토피 환자 84명, 아토피 행진 환자 70명을 대상으로는 생어시퀀싱을 진행하여 후보 변이를 검증하였다.

Whole-exome sequencing

유전체 DNA(genomic DNA)는 아토피 환자 및 아토피 행진 환자들에서 수득한 말초혈액으로부터 QIAamp DNA mini kit(Qiagen Inc, Valencia, CA, USA)를 이용하여 분리하였다. DNA의 양과 질은 Nanodrop spectrometer(Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA)과 Qubit Fluorometer(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)로 확인하였다. WES는 제조자의 표준 프로토콜에 따라 SureSelect Human All Exon V4+UTR 71 Mb(Agilent, CA, USA)을 이용하여 실시하였다. Genomic DNA는 Covaris(Covaris, Woburn, MA, USA)을 이용하여 절단하였다(shearing). Paired-end DNA sequencing library는 shearing, end-repair, A-tailing, peak detection, PE adaptor ligation, 그리고amplification 과정을 통하여 제작하였다. 상기 제작한 라이브러리(Library)는 bait sequence와 24시간 동안 혼성화하고, 분리한 뒤, index index barcode tag을 이용하여 증폭하고 양과 질을 결정하였다. 엑솜 라이브러리(exome library)는 HiSeq SBS kit의 100-bp paired-end mode로 시퀀싱하였다.

Whole-Exome Sequencing 과정과 염기서열 배열(alignment)

FASTQ format의 sequence reads는 Burrows-Wheeler Aligner(BWA, v0.7.7) 프로그램을 이용하여 정확한 mate pair 정보를 갖는 SAM 파일을 생성되도록 ‘mem’그리고 seed value parameter ‘-k 45’로 human assembly UCSC hg19에 맵핑(mapping)하였다(Li H et al., Bioinformatics 2009, 25(14):1754-1760). Read group tag은 샘플명을 포함하였다. Picard(v1.92)를 이용하여 SAM 파일을 압축된 BAM 파일로 변환하고 BAM 파일을 염색체 좌표 위치(coordinate)에 따라 정렬하였다. The Genome Analysis Toolkit(v2.3.9Lite)을 이용하여 삽입/결손(insertion/deletion, indel)의 배열 오차를 포함할 수 있는 간격으로 BAM 파일을 국지적으로 재정렬하였다(DePristo MA et al., Nature genetics 2011, 43(5):491-498). 삽입과 결손은 각각 Mutect(Cingolani P et al., Fly 2012, 6(2):80-92)과 GATK Somatic Indel Detector를 이용하여 확인하였다. 단일 염기 변이와 indel은 snpEff(v3.6c)(Cibulskis K et al., Nature biotechnology 2013, 31(3):213-219)를 이용하여 ‘유사함(synonymouse)', ’유사하지 않음(non-synonymous)', '미스센스(missense)', '프레임시프트 점돌연변이(frameshift point mutation)', '프레임쉬프트 삽입/결손(frameshift indel)' 등으로 분류하기 위한 주를 달았다(annotation).

Annotation

필터 1(Filter 1): SnpEff(http://snpeff.sourceforge.net/index.html)는 다양한 유전자의 아미노산 치환과 같은 변이의 주석을 달고, 변이의 효과를 예측하는 프로그램이다. 유전자 변이는 다양한 방식의 효과(예를 들어 ‘비유사 코딩(Non_Synonymous_coding)’‘종결 획득(Stop gained)’‘삽입(Insertion)’‘결손(Deletion)’등)를 유발한다.

필터 2(Filter 2): SnpEff에 의한 영향력 예측 분석은 유전자 변이의 잠정적인 영향력을 분석하는 것이 변이를 빠르게 분류하고 우선 순위를 쉽게 부여할 수 있게 함을 보여주었다(‘높음(High)’‘스플라이스 사이트 수여자(Splice_Site_Acceptor)’ ‘스플라이스 사이트 공여자(Splice_Site_Donor)’‘개시 손실(Start_Lost)’‘프레임쉬프트(Frame_Shift)’‘종결 획득(Stop_Gained)’‘중간(Moderate)’‘비유사 코딩(Non_Synonymous_ coding)’‘코돈 변경(Codon_Change)’‘코돈 삽입과 결손(Codon_Insertion and Deletion)’등)

필터 3(Filter 3): dbNSFP의 SIFT와 Polyphen2.

SIFT score는 아미노산 치환이 단백질 기능에 미치는 영향을 예측한다. SIFT의 예측은 PSI-BLAST를 통해 수집한 밀접하게 연관된 서열과의 배열에서 파악되는 아미노산의 보존 정도에 기반하고 있다. 범위는 0부터 1까지로, 0.05 보다 작은 score를 갖는 치환은 기능에 손상적인 것으로(수치가 낮을수록 손상 정도가 커지는 것으로), score가 높을수록 치환은 용인될 가능성이 높을 것으로 예측된다. Polyphen2 HDIV score는 HumDiv(hdiv_prob)에 기반하고 있다. score는 0부터 1 사이의 범위에 있으며, score가 0.957과 1 사이이면 ‘손상 개연성(probably damaging)’으로, 0.453부터 0.956 사이는 ‘손상 가능성(possibly damaging)', 0부터 0.452 사이는 '양호함(benign)'에 해당된다(score 수치가 높을수록 손상이 높음을 제시함).

필터 4(Filter 4): dbNSFP의 PhyloP은 계통수(phylogenetic tree)의 분지 이상의 진화 속도의 차이는 허용하면서, 양성 또는 음성 선택(positive or negative selection)이 진행 중인 위치를 찾는다. PhyloP score가 높을수록 보존된 위치임을 나타낸다(http://varianttools. sourceforge.net/Annotation/DbNSFP).

필터 5(Filter 5): PhastCons는 DNA 서열에 작용하는 정제 선택(purifying selecton)의 강도를 측정한다. 높은 PhastCons score(0.2)는 해당 유전체 부위가 기능적으로 중요하다는 중요한 근거가 된다.

필터 6(Filter 6): dbNSFP의 1000 유전체 대립유전자 빈도(the 1000 Genome allele frequency)는 빈도가 0.01보다 낮거나 알려지지 않은 유전자 변이를 선택한다. Filter 6는 전 세계 인종에서 관찰되는 소수 대립유전자 빈도(minor allele frequency, MAF)가 0.01이상 나오는 보편적인 변이를 제거하는 것이다.

필터 7(Filter 7): 한국 개인 유전체 프로젝트(The Korean Personal Genome Project, KPGP)는 국제적인 개인 유전체 프로젝트의 일환이다. KPGP는 KPGP dataset(http://kpgp.kr/)로부터 MAF 빈도 0.002 미만 또는 알려지지 않은 변이를 선택한다. 즉, Filter 7에서는 한국인의 MAF 0.002 이상의 보편적인 변이를 제거하는 것이다.

Sanger sequencing

WES로 선별된 단일염기다형성(SNP)을 Sanger 방법으로 검증하기 위한 PCR 조건은 다음과 같다: 95℃, 10min(1cycle); 95℃, 30s; 55-58℃, 30s; 72℃, 40s(35 cycles); 72℃, 1min 30s(1cycle). PCR 반응액(total volume 50μL)은 25μL의 2×EF-Taq premix(SolGent, Seoul, South Korea), 2.5μL의 oligonucleotide primer(10pmol/μL), 18μL의 증류수, 그리고 20ng의 genomic DNA를 포함하는 2μL의 template을 포함하였다. PCR 생성물은 PCR purification kit(Favorgen, Pingtung, Taiwan)를 이용하여 분리 정제하고, 제조사 매뉴얼에 따라 Applied Biosystems 3500 DNA sequencer(Foster City, CA, USA)를 이용하여 시퀀싱하였다.

통계 분석

로지스틱 회귀 분석을 이용하여 분석 대상인 SNP와 AD의 연관성에 대한 천연 오차 비율(crude odds ratio, ORs)과 95% 신뢰 구간(confidence intervals, CI)을 계산하였다. DOCK8 다형성과 AD와의 연관성은 Fisher's exact test를 이용하여 검정하였다.

<실시예 1>

Whole exome sequencing 분석

천식과 비염이 동반하지 않은 아토피 피부염 환자 20명과 천식과 비염을 동반한 아토피 피부염 환자 (아토피 행진) 20명을 대상으로 말초혈액 샘플에서 분리한 유전체 DNA에 대하여 whole-exome sequencing(WES)를 실시하였다.

각 개인으로부터 얻어진 WES 데이터는 AD와 관련된 변이 후보를 선별해내기 위하여 도 1에 도시된 바와 같이 단계적으로 필터링하였고, 후보 유전자 변이인 DOCK8을 검출하게 되었다.

아미노산 치환과 변이 종류(‘비유사 SNP(non-synonymous SNP)’‘종결 획득(stop gained)’‘삽입(insertion)’‘결손(deletion)’등)은 1단계 필터(필터 1)로 결정되었다. ‘비유사 SNP’는 다른 아미노산의 코돈으로 전환시키는 단일염기의 변화를 의미한다. 각 환자에게서 상당수의 ‘비유사 SNP’가 관찰되었으며, 필터 5에서 발견된 변이들은 보편적인 변이(1% 보다 높은 MAF)라는 점 외에도, 척추동물 100여 종 간에 잘 보존된 염기서열을 가지고 있으며, 변이로 단백질 기능이 손상되었을 것으로 예측되는 기능성 유전자임을 보여주었다.

<실시예 2>

AD 환자의 공통적인 유전자 변이의 특징

WES을 통해 DOCK8 변이의 염색체 위치, 아미노산 변화 그리고 기능성 예측의 지수를 확인하였다. 상기 유전자는 기능적으로 중요하면서, SIFT(변이가 기능을 손상시키거나 유해한 것일 가능성)과 PhyloP (척추동물 100여 종간에 잘 보존되어 있음) 분석 결과로도 뒷받침되는 것으로 나타났다. DOCK8 유전자의 SIFT 지수가 낮고, PhyloP과 Phastcon 지수가 높게 나온 것은 유전자 변이가 DOCK8의 기능을 손상시키는 것으로 판단되었다. 또한 DOCK8의 MAF의 1000 genome globlal 지수는 1000명당 52%, 아시아인에서는 72%를 나타냈으며, KPGP 지수는 한국인 1,000명당 74%의 범위에 있을 것임을 보여주었다. (표 2; 아토피 가계에서 엑솜시퀀싱으로 산출된 DOCK8 유전자의 단백질 기능 스코어)

<실시예 3>

AD와 DOCK8 SNP 변이 연관성

앞선 실시예에서 확인한 바와 같이, 아토피 피부염과 관련하여 의미있는 기능성 예측 점수(functional prediction score)를 가지면서 보편적 변이인 DOCK8 유전자에 대하여 WES로 확인된 변이와 아토피 피부염의 상관관계를 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)으로 검증하였다. Sanger seqeuncing에 사용된 프라이머는 표 3에 기재한 바와 같다.

SNP	서열번호	프라이머 서열
rs529208	4	5‘GATGACACACCTGAACAGC-3’(정방향)
rs529208	5	5'-GTAGATGTGATTGGGATTGTC-3' (역방향)

대조군 79명과 성인 아토피 환자 84명, 아토피 행진 환자 70명 에서 DOCK8변이의 Allele와 genotype 빈도를 각각 측정해본 결과 C 와 A allele의 빈도의 차이는 크지 않았다.

아토피 환자들의 임상정보인 총 IgE 와의 DOCK8 변이와의 연관성을 154명의 아토피피부염과 아토피피부염 행진 환자를 대상으로 비교 실시를 했다. 도 2에 나타나듯이, 알러지 환자의 대부분의 혈액에서 증가되어 있는 총 IgE 수치가 DOCK8 변이와의 연관성을 보였다. AA genotype에서 총 IgE 수치가 CC 와 CA genotype 보다 증가되어 있는 것을 확인하였다.

이상의 결과는 각 가계의 AD 환자에서 발견된 DOCK8 변이가 IgE와 연관되는 SNP일 가능성이 매우 높음을 시사하고 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 아토피성 피부염을 조기에 발견하여 초기에 적절하게 대응하여 효과적으로 치료할 수 있게 하기 위한 아토피 피부염의 유전자 진단 시약과 진단용 칩을 개발하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Composition and method for diagnosing atopic dermatitis using DOCK8 SNP <130> NP18-0033 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens rs529208 <400> 1 tttgggtaaa caaaacatgg cctcggagag cctttgcggg agaaattata aaaattcagc 60 aaagctttgt gatctcattt tggatctcct caggattcct catcaagttg caattaagga 120 gagaaaaatt ccgccttggg gtgggatttt aattactcat catgttatga cttgactttc 180 tgtgctgcat ttttttccat atcactactt ctgtgtttga cagctcctcc aaagagtcgc 240 tccgttttat gccaggagcg aagtacttac taagtcaaag gaaagcaagg caaacatcta 300 ctattgcctt tgtgctttta ccagaaaact gggtgagaac ctccttttcc ttttccctgc 360 ccctccagcc tcagttttat gaccctgtgg agccagtgga ctttgaagga cttctgatga 420 cacacctgaa cagcctggat gtgcagcttg cccaggagct cggggacttc actgatgacg 480 acttggacgt ggtgttcacg 500 <210> 2 <211> 7470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens DOCK8 mRNA <400> 2 gacagacgag gtttgcgctt 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tgctacacgg aggctgccat 5100 gtgcctggtg cacgccgctg cgttagtggc tgagtatctg agcatgctgg aggaccacag 5160 ctacctgccc gtgggcagtg tcagcttcca gaatatttct tccaatgtgc tggaggagtc 5220 tgtggtctct gaggacaccc tgtcacctga cgaggatggg gtgtgcgcag gccagtactt 5280 caccgagagt ggcctggtag gcctcctgga gcaggccgcg gagctcttca gcacgggagg 5340 cttatatgag acagttaatg aggtctacaa gctggtcatc cccatcctag aagcgcatcg 5400 agaattccgg aagctgacac tcactcacag caagctgcag agagccttcg acagcatcgt 5460 taacaaggat cataagagaa tgtttggaac ctacttccga gttggtttct ttggatccaa 5520 atttggggat ttggatgaac aggagtttgt ctacaaagag cctgcaatta ccaagcttcc 5580 tgagatctca catagactag aggcatttta tggtcaatgt tttggtgcag aatttgtgga 5640 agtgattaaa gactccactc ctgtggacaa aaccaagttg gatcctaaca aggcctacat 5700 acagatcact tttgtggagc cctactttga tgagtatgag atgaaagaca gggtcacata 5760 ctttgagaag aatttcaacc tccggaggtt catgtacacc accccgttca ccctggaggg 5820 gcggcctcgg ggagagctgc atgagcagta cagaaggaac acagtcctga ccactatgca 5880 cgccttcccc tacatcaaga ccaggatcag cgtcatccag aaggaggagt ttgttttgac 5940 accgattgaa gttgccattg aagacatgaa gaagaagacc ctgcagttag cagttgccat 6000 taaccaggag ccgcctgatg caaagatgct tcagatggtg ctgcaaggct ctgtgggagc 6060 tactgtaaat cagggaccac tggaagtagc ccaagtgttt ttggctgaaa ttcctgctga 6120 tccaaaactc tatcgacatc acaacaagtt gaggttatgc tttaaggaat tcatcatgag 6180 atgtggtgaa gctgtagaga aaaacaagcg tctcatcacg gcagaccaga gggaatatca 6240 gcaggaactc aaaaagaact ataacaagct aaaagagaac ctcaggccaa tgatcgagcg 6300 gaaaattcca gaactgtaca agccaatatt cagagttgag agtcaaaaga gggactcctt 6360 ccacagatct agtttcagga aatgtgaaac ccagttgtca cagggcagct aagaaaagcc 6420 atcttcattc gtggagactg tggccctgca accctggaga aggacttgct ggtacttaaa 6480 aaatgggaca tttgccaccc aggactgact gtacactccc tgatcagcca gcactctgga 6540 agctttggga tcccaggaac catggaatta ttcccaaatg gactctgacc agatttttgc 6600 catactgggg ggtggcggga tggaggatgg gtactcaggc atgactgcgt atttattaaa 6660 gtgtgttttt ccacaatgta ccaaacaagg cataagcagc ttctcctgct gactggccaa 6720 tcactgccca tctgagagat gatttcctct ggcccatatt tgaatttatt ggagtaactc 6780 aaattgcctg aggaaaaatg gaaaaattat ccaccagtcg attcaaactg aatttcactc 6840 tttataggaa ggcagggcaa acttgtagga gtacgaaaca ttttcaataa atctacaaag 6900 ggaagcctta ctacaattcc aaaaatcatc atggttggaa atttgggagg agattatttg 6960 tgaacttgtt acccttttgg taatggtgga ctaattgctg tatagttatt tttgttttat 7020 tattactgtt acattaattt aacatgcatt tatagaagaa tacattcaaa gcactgatgt 7080 aggagataca cggtacttgg agcagtcagc cagaaatcac agatactgct ttcacttaaa 7140 tggaaacaat tctccgataa tgctttgctt tttttcttat gtcactcttg tgtactatct 7200 atttttctcc tctctgggac caagtttctt tttataaagc aataatatct ctgttttcat 7260 ttcagaacat tgtgctgtct gtcagcatat gtatatcagc tacaaaatat attcaacttt 7320 gacttctttt gacaaaggac tttaggaaaa agaggaacaa agacattatt tgagaattaa 7380 attatatatt tttaatatga ctgtgacctt gactgataat aaagatgtaa taagaattgc 7440 aagctaaatg ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7470 <210> 3 <211> 2099 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens DOCK8 protein (NM_203447.3) <400> 3 Met Ala Thr Leu Pro Ser Ala Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Lys Ile 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Ser Ser Ala Glu Ile Arg Lys Gln Phe Thr Leu Pro Pro 20 25 30 Asn Leu Gly Gln Tyr His Arg Gln Ser Ile Ser Thr Ser Gly Phe Pro 35 40 45 Ser Leu Gln Leu Pro Gln Phe Tyr Asp Pro Val Glu Pro Val Asp Phe 50 55 60 Glu Gly Leu Leu Met Thr His Leu Asn Ser Leu Asp Val Gln Leu Ala 65 70 75 80 Gln Glu Leu Gly Asp Phe Thr Asp Asp Asp Leu Asp Val Val Phe Thr 85 90 95 Pro Lys Glu Cys Arg Thr Leu Gln Pro Ser Leu Pro Glu Glu Gly Val 100 105 110 Glu Leu Asp Pro His Val Arg Asp Cys Val Gln Thr Tyr Ile Arg Glu 115 120 125 Trp Leu Ile Val Asn Arg Lys Asn Gln Gly Ser Pro Glu Ile Cys Gly 130 135 140 Phe Lys Lys Thr Gly Ser Arg Lys Asp Phe His Lys Thr Leu Pro Lys 145 150 155 160 Gln Thr Phe Glu Ser Glu Thr Leu Glu Cys Ser Glu Pro Ala Ala Gln 165 170 175 Ala Gly Pro Arg His Leu Asn Val Leu Cys Asp Val Ser Gly Lys Gly 180 185 190 Pro Val Thr Ala Cys Asp Phe Asp Leu Arg Ser Leu Gln Pro Asp Lys 195 200 205 Arg Leu Glu Asn Leu Leu Gln Gln Val Ser Ala Glu Asp Phe Glu Lys 210 215 220 Gln Asn Glu Glu Ala Arg Arg Thr Asn Arg Gln Ala Glu Leu Phe Ala 225 230 235 240 Leu Tyr Pro Ser Val Asp Glu Glu Asp Ala Val Glu Ile Arg Pro Val 245 250 255 Pro Glu Cys Pro Lys Glu His Leu Gly Asn Arg Ile Leu Val Lys Leu 260 265 270 Leu Thr Leu Lys Phe Glu Ile Glu Ile Glu Pro Leu Phe Ala Ser Ile 275 280 285 Ala Leu Tyr Asp Val Lys Glu Arg Lys Lys Ile Ser Glu Asn Phe His 290 295 300 Cys Asp Leu Asn Ser Asp Gln Phe Lys Gly Phe Leu Arg Ala His Thr 305 310 315 320 Pro Ser Val Ala Ala Ser Ser Gln Ala Arg Ser Ala Val Phe Ser Val 325 330 335 Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Ile Tyr Leu Val Val Lys Ile Glu Lys Val 340 345 350 Leu Gln Gln Gly Glu Ile Gly Asp Cys Ala Glu Pro Tyr Thr Val Ile 355 360 365 Lys Glu Ser Asp Gly Gly Lys Ser Lys Glu Lys Ile Glu Lys Leu Lys 370 375 380 Leu Gln Ala Glu Ser Phe Cys Gln Arg Leu Gly Lys Tyr Arg Met Pro 385 390 395 400 Phe Ala Trp Ala Pro Ile Ser Leu Ser Ser Phe Phe Asn Val Ser Thr 405 410 415 Leu Glu Arg Glu Val Thr Asp Val Asp Ser Val Val Gly Arg Ser Ser 420 425 430 Val Gly Glu Arg Arg Thr Leu Ala Gln Ser Arg Arg Leu Ser Glu Arg 435 440 445 Ala Leu Ser Leu Glu Glu Asn Gly Val Gly Ser Asn Phe Lys Thr Ser 450 455 460 Thr Leu Ser Val Ser Ser Phe Phe Lys Gln Glu Gly Asp Arg Leu Ser 465 470 475 480 Asp Glu Asp Leu Phe Lys Phe Leu Ala Asp Tyr Lys Arg Ser Ser Ser 485 490 495 Leu Gln Arg Arg Val Lys Ser Ile Pro Gly Leu Leu Arg Leu Glu Ile 500 505 510 Ser Thr Ala Pro Glu Ile Ile Asn Cys Cys Leu Thr Pro Glu Met Leu 515 520 525 Pro Val Lys Pro Phe Pro Glu Asn Arg Thr Arg Pro His Lys Glu Ile 530 535 540 Leu Glu Phe Pro Thr Arg Glu Val Tyr Val Pro His Thr Val Tyr Arg 545 550 555 560 Asn Leu Leu Tyr Val Tyr Pro Gln Arg Leu Asn Phe Val Asn Lys Leu 565 570 575 Ala Ser Ala Arg Asn Ile Thr Ile Lys Ile Gln Phe Met Cys Gly Glu 580 585 590 Asp Ala Ser Asn Ala Met Pro Val Ile Phe Gly Lys Ser Ser Gly Pro 595 600 605 Glu Phe Leu Gln Glu Val Tyr Thr Ala Val Thr Tyr His Asn Lys Ser 610 615 620 Pro Asp Phe Tyr Glu Glu Val Lys Ile Lys Leu Pro Ala Lys Leu Thr 625 630 635 640 Val Asn His His Leu Leu Phe Thr Phe Tyr His Ile Ser Cys Gln Gln 645 650 655 Lys Gln Gly Ala Ser Val Glu Thr Leu Leu Gly Tyr Ser Trp Leu Pro 660 665 670 Ile Leu Leu Asn Glu Arg Leu Gln Thr Gly Ser Tyr Cys Leu Pro Val 675 680 685 Ala Leu Glu Lys Leu Pro Pro Asn Tyr Ser Met His Ser Ala Glu Lys 690 695 700 Val Pro Leu Gln Asn Pro Pro Ile Lys Trp Ala Glu Gly His Lys Gly 705 710 715 720 Val Phe Asn Ile Glu Val Gln Ala Val Ser Ser Val His Thr Gln Asp 725 730 735 Asn His Leu Glu Lys Phe Phe Thr Leu Cys His Ser Leu Glu Ser Gln 740 745 750 Val Thr Phe Pro Ile Arg Val Leu Asp Gln Lys Ile Ser Glu Met Ala 755 760 765 Leu Glu His Glu Leu Lys Leu Ser Ile Ile Cys Leu Asn Ser Ser Arg 770 775 780 Leu Glu Pro Leu Val Leu Phe Leu His Leu Val Leu Asp Lys Leu Phe 785 790 795 800 Gln Leu Ser Val Gln Pro Met Val Ile Ala Gly Gln Thr Ala Asn Phe 805 810 815 Ser Gln Phe Ala Phe Glu Ser Val Val Ala Ile Ala Asn Ser Leu His 820 825 830 Asn Ser Lys Asp Leu Ser Lys Asp Gln His Gly Arg Asn Cys Leu Leu 835 840 845 Ala Ser Tyr Val His Tyr Val Phe Arg Leu Pro Glu Val Gln Arg Asp 850 855 860 Val Pro Lys Ser Gly Ala Pro Thr Ala Leu Leu Asp Pro Arg Ser Tyr 865 870 875 880 His Thr Tyr Gly Arg Thr Ser Ala Ala Ala Val Ser Ser Lys Leu Leu 885 890 895 Gln Ala Arg Val Met Ser Ser Ser Asn Pro Asp Leu Ala Gly Thr His 900 905 910 Ser Ala Ala Asp Glu Glu Val Lys Asn Ile Met Ser Ser Lys Ile Ala 915 920 925 Asp Arg Asn Cys Ser Arg Met Ser Tyr Tyr Cys Ser Gly Ser Ser Asp 930 935 940 Ala Pro Ser Ser Pro Ala Ala Pro Arg Pro Ala Ser Lys Lys His Phe 945 950 955 960 His Glu Glu Leu Ala Leu Gln Met Val Val Ser Thr Gly Met Val Arg 965 970 975 Glu Thr Val Phe Lys Tyr Ala Trp Phe Phe Phe Glu Leu Leu Val Lys 980 985 990 Ser Met Ala Gln His Val His Asn Met Asp Lys Arg Asp Ser Phe Arg 995 1000 1005 Arg Thr Arg Phe Ser Asp Arg Phe Met Asp Asp Ile Thr Thr Ile Val 1010 1015 1020 Asn Val Val Thr Ser Glu Ile Ala Ala Leu Leu Val Lys Pro Gln Lys 1025 1030 1035 1040 Glu Asn Glu Gln Ala Glu Lys Met Asn Ile Ser Leu Ala Phe Phe Leu 1045 1050 1055 Tyr Asp Leu Leu Ser Leu Met Asp Arg Gly Phe Val Phe Asn Leu Ile 1060 1065 1070 Arg His Tyr Cys Ser Gln Leu Ser Ala Lys Leu Ser Asn Leu Pro Thr 1075 1080 1085 Leu Ile Ser Met Arg Leu Glu Phe Leu Arg Ile Leu Cys Ser His Glu 1090 1095 1100 His Tyr Leu Asn Leu Asn Leu Phe Phe Met Asn Ala Asp Thr Ala Pro 1105 1110 1115 1120 Thr Ser Pro Cys Pro Ser Ile Ser Ser Gln Asn Ser Ser Ser Cys Ser 1125 1130 1135 Ser Phe Gln Asp Gln Lys Ile Ala Ser Met Phe Asp Leu Thr Ser Glu 1140 1145 1150 Tyr Arg Gln Gln His Phe Leu Thr Gly Leu Leu Phe Thr Glu Leu Ala 1155 1160 1165 Ala Ala Leu Asp Ala Glu Gly Glu Gly Ile Ser Lys Val Gln Arg Lys 1170 1175 1180 Ala Val Ser Ala Ile His Ser Leu Leu Ser Ser His Asp Leu Asp Pro 1185 1190 1195 1200 Arg Cys Val Lys Pro Glu Val Lys Val Lys Ile Ala Ala Leu Tyr Leu 1205 1210 1215 Pro Leu Val Gly Ile Ile Leu Asp Ala Leu Pro Gln Leu Cys Asp Phe 1220 1225 1230 Thr Val Ala Asp Thr Arg Arg Tyr Arg Thr Ser Gly Ser Asp Glu Glu 1235 1240 1245 Gln Glu Gly Ala Gly Ala Ile Asn Gln Asn Val Ala Leu Ala Ile Ala 1250 1255 1260 Gly Asn Asn Phe Asn Leu Lys Thr Ser Gly Ile Val Leu Ser Ser Leu 1265 1270 1275 1280 Pro Tyr Lys Gln Tyr Asn Met Leu Asn Ala Asp Thr Thr Arg Asn Leu 1285 1290 1295 Met Ile Cys Phe Leu Trp Ile Met Lys Asn Ala Asp Gln Ser Leu Ile 1300 1305 1310 Arg Lys Trp Ile Ala Asp Leu Pro Ser Thr Gln Leu Asn Arg Ile Leu 1315 1320 1325 Asp Leu Leu Phe Ile Cys Val Leu Cys Phe Glu Tyr Lys Gly Lys Gln 1330 1335 1340 Ser Ser Asp Lys Val Ser Thr Gln Val Leu Gln Lys Ser Arg Asp Val 1345 1350 1355 1360 Lys Ala Arg Leu Glu Glu Ala Leu Leu Arg Gly Glu Gly Ala Arg Gly 1365 1370 1375 Glu Met Met Arg Arg Arg Ala Pro Gly Asn Asp Arg Phe Pro Gly Leu 1380 1385 1390 Asn Glu Asn Leu Arg Trp Lys Lys Glu Gln Thr His Trp Arg Gln Ala 1395 1400 1405 Asn Glu Lys Leu Asp Lys Thr Lys Ala Glu Leu Asp Gln Glu Ala Leu 1410 1415 1420 Ile Ser Gly Asn Leu Ala Thr Glu Ala His Leu Ile Ile Leu Asp Met 1425 1430 1435 1440 Gln Glu Asn Ile Ile Gln Ala Ser Ser Ala Leu Asp Cys Lys Asp Ser 1445 1450 1455 Leu Leu Gly Gly Val Leu Arg Val Leu Val Asn Ser Leu Asn Cys Asp 1460 1465 1470 Gln Ser Thr Thr Tyr Leu Thr His Cys Phe Ala Thr Leu Arg Ala Leu 1475 1480 1485 Ile Ala Lys Phe Gly Asp Leu Leu Phe Glu Glu Glu Val Glu Gln Cys 1490 1495 1500 Phe Asp Leu Cys His Gln Val Leu His His Cys Ser Ser Ser Met Asp 1505 1510 1515 1520 Val Thr Arg Ser Gln Ala Cys Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Met Arg Phe 1525 1530 1535 Ser Phe Gly Ala Thr Ser Asn Phe Ala Arg Val Lys Met Gln Val Thr 1540 1545 1550 Met Ser Leu Ala Ser Leu Val Gly Arg Ala Pro Asp Phe Asn Glu Glu 1555 1560 1565 His Leu Arg Arg Ser Leu Arg Thr Ile Leu Ala Tyr Ser Glu Glu Asp 1570 1575 1580 Thr Ala Met Gln Met Thr Pro Phe Pro Thr Gln Val Glu Glu Leu Leu 1585 1590 1595 1600 Cys Asn Leu Asn Ser Ile Leu Tyr Asp Thr Val Lys Met Arg Glu Phe 1605 1610 1615 Gln Glu Asp Pro Glu Met Leu Met Asp Leu Met Tyr Arg Ile Ala Lys 1620 1625 1630 Ser Tyr Gln Ala Ser Pro Asp Leu Arg Leu Thr Trp Leu Gln Asn Met 1635 1640 1645 Ala Glu Lys His Thr Lys Lys Lys Cys Tyr Thr Glu Ala Ala Met Cys 1650 1655 1660 Leu Val His Ala Ala Ala Leu Val Ala Glu Tyr Leu Ser Met Leu Glu 1665 1670 1675 1680 Asp His Ser Tyr Leu Pro Val Gly Ser Val Ser Phe Gln Asn Ile Ser 1685 1690 1695 Ser Asn Val Leu Glu Glu Ser Val Val Ser Glu Asp Thr Leu Ser Pro 1700 1705 1710 Asp Glu Asp Gly Val Cys Ala Gly Gln Tyr Phe Thr Glu Ser Gly Leu 1715 1720 1725 Val Gly Leu Leu Glu Gln Ala Ala Glu Leu Phe Ser Thr Gly Gly Leu 1730 1735 1740 Tyr Glu Thr Val Asn Glu Val Tyr Lys Leu Val Ile Pro Ile Leu Glu 1745 1750 1755 1760 Ala His Arg Glu Phe Arg Lys Leu Thr Leu Thr His Ser Lys Leu Gln 1765 1770 1775 Arg Ala Phe Asp Ser Ile Val Asn Lys Asp His Lys Arg Met Phe Gly 1780 1785 1790 Thr Tyr Phe Arg Val Gly Phe Phe Gly Ser Lys Phe Gly Asp Leu Asp 1795 1800 1805 Glu Gln Glu Phe Val Tyr Lys Glu Pro Ala Ile Thr Lys Leu Pro Glu 1810 1815 1820 Ile Ser His Arg Leu Glu Ala Phe Tyr Gly Gln Cys Phe Gly Ala Glu 1825 1830 1835 1840 Phe Val Glu Val Ile Lys Asp Ser Thr Pro Val Asp Lys Thr Lys Leu 1845 1850 1855 Asp Pro Asn Lys Ala Tyr Ile Gln Ile Thr Phe Val Glu Pro Tyr Phe 1860 1865 1870 Asp Glu Tyr Glu Met Lys Asp Arg Val Thr Tyr Phe Glu Lys Asn Phe 1875 1880 1885 Asn Leu Arg Arg Phe Met Tyr Thr Thr Pro Phe Thr Leu Glu Gly Arg 1890 1895 1900 Pro Arg Gly Glu Leu His Glu Gln Tyr Arg Arg Asn Thr Val Leu Thr 1905 1910 1915 1920 Thr Met His Ala Phe Pro Tyr Ile Lys Thr Arg Ile Ser Val Ile Gln 1925 1930 1935 Lys Glu Glu Phe Val Leu Thr Pro Ile Glu Val Ala Ile Glu Asp Met 1940 1945 1950 Lys Lys Lys Thr Leu Gln Leu Ala Val Ala Ile Asn Gln Glu Pro Pro 1955 1960 1965 Asp Ala Lys Met Leu Gln Met Val Leu Gln Gly Ser Val Gly Ala Thr 1970 1975 1980 Val Asn Gln Gly Pro Leu Glu Val Ala Gln Val Phe Leu Ala Glu Ile 1985 1990 1995 2000 Pro Ala Asp Pro Lys Leu Tyr Arg His His Asn Lys Leu Arg Leu Cys 2005 2010 2015 Phe Lys Glu Phe Ile Met Arg Cys Gly Glu Ala Val Glu Lys Asn Lys 2020 2025 2030 Arg Leu Ile Thr Ala Asp Gln Arg Glu Tyr Gln Gln Glu Leu Lys Lys 2035 2040 2045 Asn Tyr Asn Lys Leu Lys Glu Asn Leu Arg Pro Met Ile Glu Arg Lys 2050 2055 2060 Ile Pro Glu Leu Tyr Lys Pro Ile Phe Arg Val Glu Ser Gln Lys Arg 2065 2070 2075 2080 Asp Ser Phe His Arg Ser Ser Phe Arg Lys Cys Glu Thr Gln Leu Ser 2085 2090 2095 Gln Gly Ser <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs529208 forward primer <400> 4 gatgacacac ctgaacagc 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs529208 reverse primer <400> 5 gtagatgtga ttgggattgt c 21

Claims

서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 289번째 염기가 A이고, 상기 289번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속한 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 검출 제제를 포함하는 아토피 피부염 진단용 조성물
제1항에 있어서, 상기 검출 제제는 서열번호 1의 289번째 염기를 검출할 수 있는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 검출 제제는 서열번호 1의 289번째 염기를 증폭할 수 있는 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 쌍인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 아토피 피부염은 유전성(hereditary) 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 아토피 피부염은 성인 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 조성물.
아토피 피부염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여
(1) 피검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및
(2) 상기 핵산 시료의 염기서열을 분석하여 DOCK8 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계
를 포함하는 DOCK8 유전자의 다형성을 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 DOCK8의 단일염기다형성(SNP) 부위는 서열번호 1의 289번째 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 단일염기다형성 부위가 서열번호 1의 289번째 염기가 A인 경우 아토피 피부염으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 염기를 결정하는 단계는 시퀀싱(sequencing), 엑솜 시퀀싱(exome sequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화(microarray hybridization), 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization), PCR 연장 분석 및 Taqman 기법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.