KR101793775B1

KR101793775B1 - 비흡연자 폐암 발병 위험성 예측용 마커 및 그에 의한 폐암 발병 위험성을 예측하는 방법

Info

Publication number: KR101793775B1
Application number: KR1020140141525A
Authority: KR
Inventors: 박재용; 강효경; 이신엽; 전효성; 최진은
Original assignee: 경북대학교병원
Priority date: 2014-10-20
Filing date: 2014-10-20
Publication date: 2017-11-06
Also published as: KR20160046343A

Abstract

본 발명은 폐암 발병 위험성과 유의적 상관관계를 갖는 특정 단일염기다형성(SNP)의 염기를 확인하여 폐암 발병 위험성을 예측하는 방법, 상기 SNP를 포함하는 폐암 발병 위험성 예측용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 관한 것이다.

Description

비흡연자 폐암 발병 위험성 예측용 마커 및 그에 의한 폐암 발병 위험성을 예측하는 방법{A marker for predicting the risks of developing lung cancer among never-smoker and a method for predicting the risks of developing lung cancer using the same}

글로벌 통계에서는 전 세계 모든 폐암의 25%, 환태평양 국가 아시아에서 30~40%가 평생 비흡연자에서 발생되고 남성 폐암은 15%, 여성 폐암은 53%로 추정된다. 특히, 폐암에 걸린 여자 중 비흡연자의 비율은 미국(15%)에 비해, 홍콩에서 44%, 한국에서 75%, 대만에 90%에 이르기까지 아시아 국가에서 현저하게 높게 나타난다.

메타 분석으로 비흡연자 중 폐암의 가족력과 관련된 폐암의 위험도가 1.5배 증가됨을 발견했고 이는 비흡연자의 폐암 위험도가 일부 유전적으로 결정될 수 있음을 제안한다. 비흡연자에서의 후보유전자 연관성 연구는 적당한 시료 크기의 몇몇 연구에 국한되어 있고 담배연기의 발암물질 대사에 관련된 유전자와 DNA 손상 복구유전자를 포함하여 흡연자에서 발견된 후보유전자와 동일한 세트에 초점을 두고 있다.

genome-wide association (GWA) 연구의 수는 흡연자에서 주로 수행된다. 5p15.33 (TERT -CLPTM1L), 6p21.33 (BAT3 - MSH5) 및 15q25.1 (CHRNA5 - CHRNA3) 위치에 있는 다형성이 유럽인을 배경으로 한 인종에서 폐암의 위험도에 영향을 주는 것으로 보여진다. 비흡연에서 실시되는 재현 연구는 GWA 연구에서 확인된 세 군데 위치 중 5p15.33 만 폐암 위험도와 연관성을 보였다. 미국인의 비흡연자의 GWA 연구는 5p15.33의 다형성은 연관성이 없지만 13q31.3의 새로운 유전적 다형성 GPC5 rs2352028이 비흡연에서 폐암의 위험도와 연관성이 있음을 보여준다. 그러나 백인에서 실시한 후속연구에서는 GPC5 rs2352028과 비흡연자의 폐암 위험도와의 연관성은 보여지지 않았다. 최근에 아시아 인구에서 3q28 and 18p11.22 위치의 다형성이 비흡연 폐암 위험도에 기여함을 보여주고 이는 더 많은 인구에서 후속연구로 재현되어야 할 것이다. 낮은 재현성, 낮은 예측가능성, 설명되지 않는 유전성과 같은 GWA 연구의 가치를 제한하는 몇 가지 중요점이 있다. 게다가 GWA 연구에서 확인 된 변화의 대부분은 원인이 아니기 때문에 GWA 연구 결과의 생물학적 기초에 대한 이해는 불완전하다.

발암은 악성 성장 (성장 신호의 자급자족, 성장 억제 신호에 무감각, 세포 사멸의 회피, 잠재적인 무한 증식, 지속된 혈관형성, 조직 침윤과 전이)을 총괄적으로 지시하는 세포 생리학의 변화 결과로 다수 유전자 및 후생 유전학적 변화의 축적에 의한 다중-단계 과정이다. 비록 GWA 연구가 이전에 폐의 발암에 역할을 갖는 것으로 밝혀지지 않은 유전자가 폐암의 위험도에 영향을 미친다는 것을 발견했지만 본 발명자들은 발암과정에 중요한 역할을 한다고 알려진 유전자의 다형성이 폐암의 감수성에 기여할 것이라는 가설을 세웠다. 본 발명에서 비흡연 여성의 폐암 감수성에 영향을 미치는 유전적인 요인을 확인하기 위해 본 발명자들은 한국인 비흡연 여성에서 암과 관련된 유전자의 잠재적 기능성 다형성과 폐암 위험도 사이의 연관성을 평가하였다.

대한민국 등록특허 제10-0809102호 (2008년 2월 25일)

본 발명의 하나의 목적은, 환자로부터 얻은 유전자 시료에 대하여 CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기의 다형성(NCBI refSNP ID: rs13009079)을 확인하는 단계를 포함하는, 폐암 발병 위험성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는 그의 cDNA를 포함하는, 폐암 발병 위험성 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는 그의 cDNA를 포함하는, 폐암 발병 위험성 예측용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는 그의 cDNA를 포함하는, 폐암 발병 위험성 예측용 키트를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 환자로부터 얻은 유전자 시료에 대하여 CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기의 다형성(NCBI refSNP ID: rs13009079)을 확인하는 단계를 포함하는, 폐암 발병 위험성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 이용되는 CIR1 유전자의 다형성에 관한 서열은 이하의 표 1에 나타낸다. 표 1에서 NCBI의 refSNP ID는 상기 SNP의 서열 및 그 위치를 나타내는 것이다. 당업자라면 상기 번호를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다. NCBI에 등록되어 있는 SNP의 refSNP ID에 해당하는 구체적인 서열은 계속되는 유전자에 대한 연구 결과에 따라 약간씩 변경될 수 있으며, 이러한 변경된 서열 또한 본 발명의 범위 내에 포함됨은 당업자에게 자명할 것이다.

유전자	NCBI refSNP ID	서열	서열번호
CIR1	rs13009079	GGTTACTATTGCAGCTTGATGGCCC[C/T]TGGGACTCCAGGTTTTTGAGTGGAC	1

본 발명의 일 양태로서, CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기에 있어서 유전자형이 CC 인 경우가, TT 또는 TC인 경우보다 폐암 발병 위험성이 낮다고 예측할 수 있다.

본 발명에서 확인된 CIR1 유전자 중의 SNP는 폐암 발병 위험도를 예측할 수 있는 조직학적 특이성을 가진 바이오 마커로 적용이 가능하다. 본 발명의 다형성 분석을 통한 폐암 발병 위험도 예측은, 소량의 환자 혈액만으로 쉽게 결정할 수 있는 장점이 있다.

상기에서, 환자는 폐암 발병 전의 일반 환자로서 폐암 발병 위험성을 예측하여 관리하고자 하는 환자 또는 폐암, 즉 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비세포암이 발병한 환자를 의미한다. 또한, 상기 환자는 폐암, 즉 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비세포암을 수술로 절제한 환자를 포함하며, 바람직하게는 비흡연자 또는 비흡연 여성일 수 있다. 이들 폐암 환자로부터 획득한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등으로부터 유전자 시료를 얻는데, 그 유전자 시료는 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함한다.

폐암의 이상적인 치료법은 조기발견하여 수술로 완전히 암을 제거하는 것이지만, 폐암의 진단시 환자의 반수 이상이 수술을 할 수 없을 정도로 진행된 상태이므로 조기치료는 현실적으로 어렵다. 본 발명의 상기 방법을 이용하면 폐암 발병 위험성을 손쉽게 예측할 수 있으며, 폐암 발병 위험성을 관리함으로써 폐암을 조기발견하여 수술로 암을 완전히 제거하여 완치시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "예측"이란 환자가 폐암 발병할 가능성이 있는지를 판별하는 것과 관련된다. 본 발명의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대한 폐암 발병 위험성이 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 환자에 있어서의 폐암 발병 위험성을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 환자로부터 단리된 유전자 시료에 대하여, CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기에 위치하는 SNP 의 염기를 확인하기 위한 시약을 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에 함유되는 시약은, 바람직하게는 CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

따라서, 본 발명은 일 양태로서 상기 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 20 내지 60개, 보다 더 바람직하게는 40 내지 60개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열(polymorphic sequenc)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위(polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다. 본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.

본 발명의 조성물에 함유되는 시약은, 바람직하게는 CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 조성물을 일 양태로서 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드이다.

대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드는 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행된다. 예를 들어, 5×SSPE (750mM NaCl, 50mM Na Phosphate, 5mM EDTA, pH 7.4) 및 25 ~ 30℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 대립 유전자 특이적 프로브일 수 있다. 즉, 본 발명에 있어서, 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화 하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 폐암 발병 위험성을 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 진단 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 대립 유전자 특이적 프라이머일 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 폐암 발병 위험성을 예측하기 위한 마이크로어레이 등의 진단 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 함유되는 시약은, 바람직하게는 CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리펩티드 및 이를 포함하는 조성물을 일 양태로서 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 폐암 발병 위험성 예측용 조성물, 폐암 발병 위험성 예측용 마이크로어레이 또는 키트 등에서 사용될 수 있다. 다르게는 상기 폴리펩티드를 대신하여 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 사용할 수 있다. 상기 항체로는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드; 또는 그의 cDNA는, 폐암 발병 위험성예측용 마이크로어레이 또는 키트의 제조를 위한 용도로써 제공될 수 있다. 상기 마이크로어레이 또는 키트는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제작될 수 있다.

본 발명에서 상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, cDNA 등을 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

본 발명에서 상기 키트는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, cDNA 등 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 일 양태로서, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 추가로 포함할 수 있다. 다른 일 양태로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 폐암 발병성 위험 예측용 키트일 수 있으며, DNA 칩 키트는 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

본 발명의 SNP 의 유전자형의 확인은 시퀀싱 분석, 자동염기서열분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱 (pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법 (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법 (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법 (specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법 (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있다. 나아가, 상기 SNP 다형성의 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리 할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트 (Chi-square test), 선형 회귀선 분석(linear regression line analysis), 다변량 로지스틱 회귀분석 (multiple logistic regression analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수 (continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비 (odds ratio) 및 95% 신뢰구간 (confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.

본 발명에 따른 폐암 발병 위험성 예측 기술은 폐암 미발병 환자에서의 폐암 발병 위험성을 미리 예측하여 폐암 발병 위험성이 높은 환자에 대하여 적절하고 특별한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 연구대상

발굴 연구에서 환자군은 경북대학교 병원(대한민국, 대구)에서 폐암으로 진단받은 181명의 비흡연 여성 환자(평생 동안 100개 미만의 담배를 피운 사람)로 구성하였다. 정상인 대조군 179명은 경북대학교 병원 건강검진센터를 찾은 건강한 지원자로부터 임의로 선택하였고 연령에 따라 환자군과 매치하였다. 환자군은 이전 논문에서 기술하였듯이 분자 역학 연구상 폐암이 진행중인 환자로부터 수집하였다(Lee SY, et al., J Thorac Oncol 2010, 5:1152-1158; Bae EY, et al., Respirology 2012, 17:699-706). 이번 연구는 경북대학교병원의 임상시험 심사 위원회의 승인(승인번호 KNUHBIO_09-1018)을 받았고, 모든 대상자로부터 동의서를 받았다. 환자군 및 대조군의 Genomic DNA samples은 경북대학교 인체자원 은행에서 제공받았고 QuickGene-810 system (Fujifilm, 일본)을 이용하여 말초 혈액 임파구에서 추출하였다. 모든 환자와 대조군은 한국인이고 그들은 대구광역시나 인근지역에 거주하고 있었다.

재현 연구는 596명의 환자와 1,194명의 대조군으로 구성하였다. 환자군은 경북대학교병원 190명, 고려대학교병원 108명, 서울대학교병원 189명, 분당서울대학교병원 109명으로 구성하였다. 대조군은 경북대학교 인체자원은행 267명, 서울대학교병원 395명, 분당서울대학교병원 232명, 그리고 한국 질병관리본부에서 300명의 생물자원(4851-307, KBP-2011-24)과 이와 매치되는 역학자료(4845-302)를 제공받았다. 모든 대상자에 대한 서면 동의서는 각각의 참여 기관에서 받았다. 연구 프로토콜은 각 기관의 임상시험 심사위원회에 의해 승인 받았다.

실시예 2. 다형성 선정과 유전자형 분석

암과 관련된 경로에 관여하는 유전자들을 SABiobioscience (http:// sabiobiosciences.com) 및 DAVID Bioinformatics Resources 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov)을 통해 1,784 후보유전자들을 선정하였다. 선정한 후보 유전자들은 세포사멸 관련 유전자 96개, 신생혈관생성 관련 유전자 86개, DNA 손상 신호와 회복에 관여하는 유전자 74개, 발암물질대사 관련 유전자 38개, 유전체 안정성에 관여하는 유전자 34개, 세포주기 관련 유전자 65개, 성장인자 관련 유전자 69개, 신호전달 경로에 관여하는 유전자 67개, 그리고 침윤과 전이에 관여하는 유전자 42개 등을 포함하고 있다. 이렇게 선정한 유전자에서 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ SNP) 를 이용하여 유전자 기능에 영향을 줄 것으로 생각되는 프로모터 부위(~1.0kb), 엑손을 포함하여 엑손 주위 20 bp 내외 부위, 그리고 5'-비 번역부위 및 3'-비 번역부위에 존재하는 잠재적 기능성을 가지는 다형성들을 선정하였다. 그리고 엑손 부위에 존재하는 다형성들 가운데 아미노산 변화가 있는 다형성만 선정하였다. 4,215개 다형성 중 1,151개 유전자의 1,969개 다형성을 유전자 칩(Affimetrix Inc., 미국)을 이용하여 다형성을 분석하였다.

재현 연구는 발굴 연구에서 P < 0.05로 의미가 있는 16개의 다형성을 선정하여 SEQUENOM's MassARRAY® iPLEX assay (SEQUENOM Inc., 미국)와 RFLP를 이용하여 다형성을 분석하였다. 모든 유전자형 분석은 정확한 결과를 도출하기 위해, 환자군 및 대조군의 상태에 대한 지식 없이 수행하였다. 또한, 재현 연구에서 시료의 약 5%를 무작위로 선택하여 다른 검사자에 의해 유전자형 분석을 하게 하였고, 그 결과 원래의 검사자가 실시한 분석결과와 100% 일치하였다.

실시예 3. 통계학적 분석

환자군 및 대조군은 연속 변수에 대해서는 Student's t-테스트를 사용하여 비교하였고, 카테고리별 변수에 대해서는 χ²테스트를 사용하여 비교하였다. 개체에서 관찰된 유전자형 빈도와 예상되는 유전자형 빈도를 비교하기 위하여, 적합도 검정(goodness-of-fit) χ²테스트를 사용하여 자유도1(one degree of freedom)로 하디-웨인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 테스트하였다. 폐암 발생위험도는 비-조건적 로지스틱 회귀분석(unconditional logistic regression analysis)을 이용하여 대응비(odds ratio, OR)와 95% 신뢰구간(confidence interval, CI)으로 평가하였고, 가능한 교란변수(연속변수로 연령)를 고려하여 계산하였다. 모든 분석은 윈도우 프로그램을 위한 통계학적 분석프로그램 (Statistical Analysis Software), 버전 9.2 (SAS사, 미국)을 사용하여 수행하였다.

실험결과 : 다형성과 폐암 위험도와의 연관성

발굴 연구 및 재현 연구에 선택된 환자군과 대조군의 임상적 특성을 표 2에 정리하였다. 발굴 연구에서 환자군과 대조군 사이의 평균 연령에서는 큰 차이가 없는데 재현 연구에서는 환자군의 평균연령이 대조군보다 유의성 있게 높았다. 환자군 중, 발굴 연구는 88.4% (181명 중 160명), 재현 연구는 91.3% (596명 중 544명)가 선암으로 구성되어 있다. 폐암환자 중 병기와 EGFR 돌연변이의 분포는 발굴 연구와 재현 연구 간에 유의한 차이를 보였다(각각 P<0.001, 및 P=0.002). EGFR 돌연변이 양성에서의 차이는 각 참여기관 간의 서로 다른 감도와 검출 방법에 기인할 수 있다.

	발굴 연구			재현 연구			결합 연구
	환자군 (n=181)	대조군 (n=179)	P	환자군 (n=596)	대조군 (n=1194)	P	환자군 (n=777)	대조군 (n=1373)	P
연령(세)
평균±표준편차	61.7 ±9.9	60.8 ±9.7	0.353^a	61.7 ±11.1	57.0 ±12.1	<0.001^a	61.7 ±10.8	57.5 ±11.8	<0.001^a
조직학적 유형
편평세포암	9(5.0)^b	-		25 (4.2)	-	-	34 (4.4)	-	-
선암	160 (88.4)	-		544 (91.3)	-	-	704 (90.6)	-	-
대세포암	2(1.1)	-		4 (0.7)	-	-	6 (0.8)	-	-
소세포암	9(5.0)	-		5 (0.8)	-	-	14 (1.8)	-	-
비소세포폐암	2(0.6)	-		18 (3.0)	-	-	19 (2.4)	-	-
병기
I기	52(28.7)	-		271 (50.5)^d	-	-	323 (45.0)	-	-
II기	10(5.5)	-		39 (7.3)	-	-	49 (6.8)	-	-
III기	42(23.2)	-		97 (18.1)	-	-	139 (19.4)	-	-
IV기	77(42.5)	-		130 (24.2)	-	-	207 (28.8)	-	-
EGFR 돌연변이 상태^c
음성	19(67.9)	-		93 (37.8)^e	-	-	112 (40.9)	-	-
양성	9(32.1)	-		153 (62.2)	-	-	162 (59.1)	-	-
a : t-test 결과를 나타냄 b : 괄호 안의 숫자는 column percentage 를 나타냄 c : EGFR 돌연변이 상태는 발굴 연구에서 28명 및 재현 연구에서 246명임 d : P<0.001 e : P=0.002

발굴 연구에서 1,969개의 다형성 중, 다음과 같이 554개의 다형성이 제외되었다 : i) 유전자형분석이 실패한 다형성 81개, ii) 유전자형이 확인된 비율이 90% 미만인 다형성 123개, iii) 작은 대립유전자 빈도가 5% 미만인 다형성 264개, iv) 대조군에서 하디-웨인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)이 P < 0.05인 다형성 86개. 따라서, 929개 유전자의 1,415개의 다형성과 폐암 위험도와의 연관성을 분석하였다. 대략 다형성의 50%는 프로모터 부위, 21%는 엑손(nsSNPs), 16%는 엑손-인트론 주위, 7%는 5'-비 번역부위, 6%는 3'-비 번역부위에 위치하고 있었다.

발굴 연구에서 분석된 1,415개의 다형성 중에 유전자형 분포에서 P < 0.05로 폐암 발생위험도와 유의미한 결과 (표 3)를 보인 다형성을 대상으로 596명의 환자군과 1194명의 대조군을 대상으로 재현연구를 수행하였다. 재현 연구에서 CIR1 rs13009079T>C 다형성이 연령으로 보정했을 때 발굴 연구에서와 같은 방향으로 폐암 발생 위험도와 유의하게 연관성이 있음을 보여주었다(표 5). 또한, 결합 분석에서 CIR1 rs13009079T>C 는 폐암 발생 위험도를 유의하게 감소시켰다(공우성 모델에서 대응비 = 0.80, 95% CI = 0.68-0.93, P = 0.003). Cochran-Mantel-Haenszel 검정법을 사용하여 발굴 연구와 재현 연구 사이의 대응비를 조사해본 결과 어떠한 이질성도 관찰하지 못했다(P ≥ 0.05).

유전자

다형성

발굴 연구

재현 연구

결합 연구

모델, P-값

ID No.

염기

글로벌^a

우성^a

열성^a

공우성^b

글로벌^a

우성^a

열성^a

공우성^b

글로벌^a

우성^a

열성^a

공우성^b

CIR1

rs13009079

T>C

0.02

0.01

0.83

0.04

0.10

0.03

0.34

0.04

0.01

0.003

0.45

0.01

a : 환자군과 대조군 간의 유전자형 분포를 양측(two-sided) χ²테스트로 확인한 결과임
b : 환자군과 대조군 간의 유전자형 분포를 Cochran-Armitage trend test 로 확인한 결과임

CIR1 rs13009079
발굴 연구
유전자형	환자수 (%)	대조군수(%)	P ^a	Adjusted OR (95% CI)^b	P ^b
TT	113 (62.8)	88 (49.2)	0.02	1.00
TC	56 (31.1)	81 (45.3)		0.53 (0.34-0.83)	0.01
CC	11 (6.1)	10 (5.6)		0.85 (0.35-2.09)	0.72
우성			0.01	0.57 (0.37-0.87)	0.01
열성			0.83	1.09 (0.45-2.65)	0.84
공우성			0.04	0.69 (0.49-0.98)	0.04
OR : 대응비(odds ratio) CI : 신뢰구간(confidence interval) ^a환자군과 대조군 간의 유전자형 분포를 양측(two-sided) χ²테스트로 확인한 결과임 ^bORs, 95% CIs 및 P-값은 비조건적 로지스틱 분석으로 계산하였고 연령으로 보정함

CIR1 rs13009079
재현 연구						P _H ^c
유전자형	환자수 (%)	대조군수(%)	P ^a	Adjusted OR (95% CI)^b	P ^b	P _H ^c
TT	346 (59.7)	629 (54.3)	0.10	1.00
TC	205 (35.3)	458 (39.6)		0.81 (0.65-1.00)	0.05	0.09
CC	29 (5.0)	71 (6.1)		0.70 (0.44-1.11)	0.13	0.71
우성			0.03	0.79 (0.65-0.98)	0.03	0.18
열성			0.34	0.76 (0.49-1.20)	0.24	0.48
공우성			0.04	0.82 (0.69-0.97)	0.02	0.38
OR : 대응비(odds ratio) CI : 신뢰구간(confidence interval) ^a환자군과 대조군 간의 유전자형 분포를 양측(two-sided) χ²테스트로 확인한 결과임 ^bORs, 95% CIs 및 P-값은 비조건적 로지스틱 분석으로 계산하였고 연령으로 보정함 ^c발굴 연구 샘플과 재현 연구 샘플 간의 보정된 ORs 의 heterogeneity에 대한 Wald test 결과를 나타냄

CIR1 rs13009079
결합 연구
유전자형	환자수 (%)	대조군수(%)	P ^a	Adjusted OR (95% CI)^b	P ^b
TT	459 (60.3)	717 (53.6)	0.01	1.00
TC	261 (34.3)	539 (40.3)		0.75 (0.62-0.91)	0.003
CC	40 (5.3)	81 (6.1)		0.74 (0.49-1.10)	0.13
우성			0.003	0.75 (0.62-0.90)	0.002
열성			0.45	0.83 (0.56-1.23)	0.34
공우성			0.01	0.80 (0.68-0.93)	0.003
OR : 대응비(odds ratio) CI : 신뢰구간(confidence interval) ^a환자군과 대조군 간의 유전자형 분포를 양측(two-sided) χ²테스트로 확인한 결과임 ^bORs, 95% CIs 및 P-값은 비조건적 로지스틱 분석으로 계산하였고 연령으로 보정함

다음으로, 연령, 질병의 병기, EGFR 돌연변이 상태에 따라 모든 대상자를 분류하여 세 개의 다형성과 폐암 위험도 사이의 연관성을 조사하였다. 표 7에서 보여주듯이, CIR1 rs13009079은 연령, 병기, EGFR 돌연변이 상태에 따라 폐암 위험도와 유의한 차이는 없었다(P for heterogeneity > 0.05). 따라서 이러한 결과는 연령, 병기, EGFR 돌연변이 상태가 비흡연 여성에서 다형성과 폐암 위험도 사이의 연관성에 있어 중요한 영향을 미치지 않음을 나타낸다.

	환자수			대조군수			P ^a	OR (95% CI)^b	P ^b	P _H ^c
	TT	TC	CC	TT	TC	CC	P ^a	OR (95% CI)^b	P ^b	P _H ^c
연령(세)
≤60	198 (60.7)	115 (35.3)	13 (3.9)	387 (53.5)	294 (40.7)	42 (5.8)	0.07	0.77 (0.61-0.97)	0.02
>60	261 (60.1)	146 (33.6)	27 (6.22)	330 (53.8)	245 (39.9)	39 (6.4)	0.10	0.84 (0.69-1.03)	0.09	0.58
병기
I+II	258 (60.7)	150 (35.3)	17 (4.0	717 (53.6)	539 (40.3)	81 (6.1)	0.02	0.76 (0.63-0.92)	0.004
III+IV	201 (60.0)	111 (33.1)	23 (6.9)	717 (53.6)	539 (40.3)	81 (6.1)	0.05	0.85 (0.69-1.04)	0.11	0.43
EGFR 돌연변이 상태
음성	65 (59.1)	42 (38.2)	3 (2.7)	717 (536)	539 (40.3)	81 (6.1)	0.27	0.77 (0.55-1.08)	0.13
양성	95 (59.4)	57 (35.6)	8 (5.0	717 (53.6).6)	539 (40.3)	81 (6.1)	0.38	0.82 (0.62-1.08)	0.16	0.78
OR : 대응비(odds ratio) CI : 신뢰구간(confidence interval) ^a환자군과 대조군 간의 유전자형 분포를 양측(two-sided) χ²테스트로 확인한 결과임 ^bORs, 95% CIs 및 P-값은 공우성 유전 모델에서 비조건적 로지스틱 분석으로 계산하였음 ^c두 subgroup 간의 보정된 ORs 의 heterogeneity에 대한 Wald test 결과를 나타냄

<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> A marker for predicting the risks of developing lung cancer among never-smoker and a method for predicting the risks of developing lung cancer using the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is c or t <400> 1 ggttactatt gcagcttgat ggcccytggg actccaggtt tttgagtgga c 51

Claims

비흡연 여성 환자로부터 얻은 유전자 시료에 대하여,
CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기의 다형성(NCBI refSNP ID: rs13009079)을 확인하는 단계를 포함하는,
비흡연 여성의 폐암 발병 위험성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 다형성을 확인한 결과, 유전자형이 CC 인 경우가 TT 또는 TC인 경우보다 폐암 발병 위험성이 낮다고 분류하는 것을 특징으로 하는, 방법.
CIR1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 26번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 비흡연 여성의 폐암 발병 위험성 예측용 조성물.
제3항의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 비흡연 여성의 폐암 발병 위험성 예측용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드가 대립 유전자 특이적 프로브 또는 대립 유전자 특이적 프라이머인, 비흡연 여성의 폐암 발병 위험성 예측용 조성물.
제3항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는, 비흡연 여성의 폐암 발병 위험성 예측용 조성물.
제3항의 폴리뉴클레오티드, 그와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그에 의해 특이적으로 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는, 비흡연 여성의 폐암 발병 위험성 예측용 마이크로어레이.
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