KR101492710B1

KR101492710B1 - Fgf23 유전자를 이용한 전립선암 진단용 마커 및 이를 이용한 전립선암 예측 및 진단 방법

Info

Publication number: KR101492710B1
Application number: KR20130036319A
Authority: KR
Inventors: 명순철; 김원용; 김해종; 이재혁
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2013-04-03
Publication date: 2015-02-13
Also published as: KR20140120974A

Abstract

본 발명은 FGF23 유전자를 이용한 전립선암 진단용 마커 및 이를 이용한 전립선암 예측 및 진단 방법에 대한 것으로, 보다 상세하게는 FGF23 유전자에 위치한 rs11063118, rs13312789 및 rs7955866 SNP, 마커, 키트, 마이크로어레이 및 전립선암 예측 및 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 전립선암 진단을 위한 SNP, 마커, 키트, 마이크로어레이 및 전립선암 예측 및 진단 방법은 전립선암을 예측 및 진단하는데 탁월한 효과가 있다.

Description

FGF23 유전자를 이용한 전립선암 진단용 마커 및 이를 이용한 전립선암 예측 및 진단 방법{Makers for the diagnosis to prostate cancer using FGF23 gene and method for predicting and detecting to prostate cancer using the same}

본 발명은 FGF23 유전자를 이용한 전립선암 진단용 마커 및 이를 이용한 전립선암 예측 및 진단 방법에 대한 것으로, 보다 상세하게는 FGF23 유전자에 위치한 rs11063118, rs13312789 및 rs7955866 SNP의 다형성을 분석하는 전립선암 예측 및 진단 방법에 관한 것이다.

전립선암(prostate cancer)은 전립선에서 발생하는 악성 종양으로 서양에서 암으로 인한 사망률이 2위를 차지하며(Jamel A et al., CA Cancer J Clin 2010;60;277-300), 비슷하게 한국에서도 암 사망률의 주요 원인으로 지난 10년간 전립선암 발생이 빠르게 증가했다(Park SK et al., Prostate 2006; 66:1285-1291). 수십년 넘게 식이, 직업, 성병인자들을 포함하는 전립선암에 대한 외인성 위험 인자에 대한 역학 조사가 이뤄졌지만, 전립선암의 위험인자는 나이, 민족, 가족력에 대해서만 밝혀졌다(Chan JM et al., Cancer causes Control 2006;17:199-208).

섬유아세포 증식인자23(Fibroblast growth factor 23:FGF23)은 섬유아세포 증식인자의 하나로, FGF19의 서브패밀리의 펩타이드 호르몬 중 하나이다. FGF23은 인산염 항상성(phosphate homeostasis)에 중요한 역할을 하며, FGF23의 신호는 호르몬성 비타민 D 대사 1,25(OH)₂D와 함께 내분비 피드백 루프(endocrine feedback loop)의 핵심 요소이다.

FGF23은 총 226개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 혈중 FGF23를 이용해 종양성 골연화증(tumor-introduced osteomalacia), X-염색체 연관 구루병(X-linked hypophosphatemic rickets) 및 상염색체우성 구루병(autosomal-dominant hypophosphatemic rickets)의 위험도를 파악할 수 있는 표지자로 사용되고 있다.

SNP(Single nucleotide polymorphism)은 세포핵 속의 염색체가 갖고 있는 30억개의 염기 서열 중 개인의 편차를 나타내는 하나 이상의 염기변이를 말하며, 사람들 간의 DNA 염기 서열을 비교하면 같은 위치에서 다른 염기가 발견되는데 이러한 다형성을 SNP라고 한다. 이러한 SNP의 패턴을 분석하면 유전형질에 따른 발병 원인을 예측 및 진단할 수 있는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명의 발명자들은 FGF23 유전자 및 암의 연관을 연구하던 중 FGF23 유전자의 다형성이 전립선암과 연관되어 전립선암을 진단할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 FGF23 유전자의 다형성 부위를 포함하는 전립선암 진단용 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 FGF23 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 전립선암 진단용 키트 및 전립선암 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 전립선암 진단용 마커를 이용하여 전립선암 예측 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 시료로부터 상기 전립선암 진단용 다형성 부위를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FGF23 유전자의 다형성 부위를 포함하는 전립선암 진단용 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 FGF23 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 전립선암 진단용 키트 및 전립선암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전립선암 진단용 마커를 이용하여 전립선암 예측 및 진단하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 시료로부터 상기 전립선암 진단용 다형성 부위를 검출하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 전립선암 진단용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)는 FGF23 유전자의 다형성 부위를 포함하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 진단용 마커에서 상기 FGF23 유전자의 다형성 부위는

1)서열번호 1의 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 27번째 염기(FGF23 유전자의 번역시작점으로부터 7185번째 염기) T가 C로 치환되고, 상기 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(Genbank SNP ID: rs11063118),

2)서열번호 2의 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 27번째 염기(FGF23 유전자의 번역시작점으로부터 7505번째 염기) C가 T로 치환되고, 상기 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(Genbank SNP ID: rs13312789) 및

3)서열번호 3의 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 27번째 염기(FGF23 유전자의 번역시작점으로부터 9200번째 염기) G가 A로 치환되고, 상기 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(Genbank SNP ID: rs7955866) 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 전립선암은 전립선에 발생하는 악성종양으로, 요폐(urinary retention, 尿閉) 및 전립선비대 유사 증상을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 FGF23유전자의 다형성과 전립선암 발병위험도와의 연관성을 분석한 결과, FGF23유전자의 다형성인 rs11063118, rs13312789 및 rs7955866 다형성이 전립선암 발병위험과 유의미한 수치로 연관되어 있었다. 이러한 결과를 통해 FGF23 유전자가 전립선암 위험과 관련된 것을 알 수 있으며, 상기 rs11063118, rs13312789 및 rs7955866 다형성이 전립선암 진단에 효과적인 표지로 사용 가능함을 알 수 있다.

따라서 본 발명은 FGF23 유전자의 다형성 부위를 포함하는 전립선암 진단용 마커를 제공한다.

본 발명에 사용된 상기 ‘진단’이라는 용어는 질병 발생의 예측 및 질병 발생위험도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다. 또한 본 발명에서 “다형성(polymorphism)”이란 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대체적 대립형질의 발생을 위미한다. 바림작한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1%이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20%이상의 발생빈도를 나타내는 두개의 대립형질을 가진다.

한편, 본 발명은 서열번호 1의 27번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 27번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3의 27번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 전립선암 진단용 키트를 제공한다.

상기 진단용 키트에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 중합효소에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.

상기 “증폭할 수 있는 프라이머”란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다.

또한 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전립선암 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 1의 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3의 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전립선암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 문헌(Nielsen et al., Science 1991;254:1497-1500)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30 ℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명의 전립선암과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

나아가 본 발명은 전립선암을 예측 및 진단하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로,

(a)검체로부터 핵산시료를 수득하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 숙한 핵산시료에서 서열번호 1 27번째 염기, 서열번호 2의 27번째 염기 및 서열번호 3의 27번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 다형성 부위를 증폭하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 전립선암 예측 및 진단 방법을 제공한다.

상기 방법 중 (a)단계의 검체로부터 핵산을 얻는 단계는 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 (c)단계의 염기 결정은 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism), DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), TDGS(Two-dimensional Gene Scanning), Taq-Man또는 TOGATM에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 의해 수행될 수 있다.

또한 본 발명은 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 시료로부터 전립선암 진단용 다형성 부위를 검출하는 방법을 제공한다. 보다 상게하게는 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 환자의 시료로부터

(a) 검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 수득한 핵산시료에서 서열번호 1의 27번째 염기, 서열번호 2의 27번째 염기 및 서열번호 3의 27번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 다형성 부위를 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 (b)단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 전립선암 진단용 다형성 부위를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 “환자의 시료”는 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리 할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.

상기 “전립선암 진단용 다형성 부위”는 본 발명의 서열번호 1의 27번째 염기, 서열번호 2의 27번째 염기 및 서열번호 3의 27번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 다형성 부위를 말한다.

상기 “검출”은 상기 서열번호 1의 27번째 염기, 상기 서열번호 2의 27번째 염기 및 상기 서열번호 3의 27번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 다형성 부위의 존재 또는 부재를 분석, 영상화, 확인, 확립하는 것을 말한다.

따라서, 본 발명은 전립선암 예측 및 진단을 위한 SNP, 마커, 키트, 마이크로어레이 및 전립선암 예측 및 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 전립선암 진단을 위한 SNP, 마커, 키트, 마이크로어레이 및 전립선암 예측 및 진단 방법은 전립선암의 발병 위험도를 분석할 수 있는 효율적인 도구로써 사용될 수 있어 전립선암 예방 및 진단에 효과적이다.

도 1은 FGF23 유전자의 염색체에서의 유전자 지도, haplotype 및 FGF23유전자의 다형성 간의 LD를 나타낸 것이다. (A. 염색체 12p13.3에서 FGF23 유전자의 유전자 지도; 엑손(exon) 부분은 검정색 블록으로 표시하였으며, 5' 및 3'UTR은 흰색 블록으로 표시함, B. FGF23 유전자의 haplotype; 선별된 5개의 SNP에 대한 haplotype과 빈도를 나타냄, C. FGF23 유전자의 다형성 간의 연관불균형(LD))

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1>

실험 대상 선별 및 실험 대상의 집단연구

서울대학교 분당 병원(경기, 서울) 및 중앙대학교 병원(서울, 대한민국)에서 비교기과 문제로 진료 받은 노인 남성 집단으로부터 전립선암 군과 양성전립선비대증(BPH)군을 선별했다.

genotyping을 위한 말초 혈액 백혈구 샘플은 445명(전립선암 군:272명, BPH 군:173명)의 남성들로부터 얻고 -80℃에서 보관했다. BPH 군(n=173)은 PSA 혈액 테스트, 디지털-직장 검사(DRE) 및 전립선암 여부 확정을 위한 실제 생체 검사를 거친 후 사용되었다. BPH 군의 평균 연령은 67.3세이고 전립선암 군의 평균 연령은 68.2세이다.

BPH 샘플들은 다음과 같은 이유로 대조군으로 사용되었다; 첫째, 70세 또는 80세의 대부분의 남성들은 BPH 증상이 있으므로, 전립선암 군의 진단 평균 연령(68.2세)에서 어느 정도의 BPH 증상은 ‘정상’이다. 둘째, 혈액 샘플 수집은 병원 방문이 필요하고 전립선 비대 증상이 있을 때만 환자의 전립선암 스크리닝을 수행했다.

기재된 모든 정보는 모든 환자 군의 동의를 얻은 것 이다. 본 연구는 중앙대학교 병원 기관 감사위원회와 서울대학교 분당 병원에 의해 입증되었다(IRB No. C2008035, B-0905/075-011).

혈액 샘플은 EDTA 나트륨이 들어있는 튜브에 수집하였다. QIAamp blood extraction kit(Qiagen, 서울, 대한민국)를 이용해 DNA를 추출했다. 글리슨 스코어(The Gleason score)는 상(8-10), 중(4+3, 3+4) 및 하(2-6)의 등급으로 분류하였다.

임상적 및 병적 부분 단계는 병리학적 그리고/또는 방사선학적인 보고를 배경으로 국소성, 국소 진행성(locally advanced), 전이성으로 분류되었다. 연구된 케이스들의 임상적인 특성은 [표 1]에 기재하였다.

전립선암 군(Cases) 및 대조군(Controls)의 특성 비교

	Cases	Controls
N	272	173
Age(yr)±SD	68.2±6.8	67.3±8.8
NSAID use(%)
Yes	198(72.8%)	69(39.9%)
No	74(27.2%))	104(60.1%)
BMI in kg/m²(%)	24.1±3.3	24.0±3.0
Prostate volume(cm3)±SD	37.2±18.6	48.4±26.2
PSA, ng/ml(mean±SD)	48.2±192.8	5.2±6.7
Gleason score, n(%)
low grade	29(11%)
(3+4, 4+3)	202(75%)
high grade	39(14%)
Stage, n(5)
localized	252(92.6%)
locally advanced	10(3.7%)
metastatic	8(2.9%)
unknown	2(0.7%)

< 실험예 2>

잠재적 SNP ( single nucleotide polymorphism ) 선별 및 genotyping

두 개의 데이타베이스(International HapMap, NCBI dbSNPs)로 부터 5개의 SNP를 선별했다(도 1).

International HapMap 데이타 베이스(한족-중국인(CHB:Han Chinese), 일본인(JPN:Japanese))에서 SNP 선별은 다음의 단계로 진행되었다. 1)International HapMap 데이타베이스(version: release 327; http://www.hapmap.org)의 HapMart를 사용해 FGF23 유전자 부분에서 CHB와 JPN 집단으로부터 모든 유전자형을 추출, 2) Haploview software(Cambridge, USA; http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview)를 이용해 마이너 대립유전자 빈도(MAF)와 연관불균형(LD)를 산출, 3) MAF>0.05인 SNP를 선별하고 LD>0.98인 SNPs를 태깅(tagging).

또한, FGF23 유전자 부분에 대한 SNP를 NCBI dbSNPs로부터 추가했다. 선별기준은 위치(엑손에서 SNP를 우선함) 및 아미노산 변화(non-synonymous SNP를 우선함)이다.

Genotyping은 Illumina Golden Gate genotyping system을 사용해 다중복합 수준에서 실행했다(Oliphant A et al., Biotechniques 2002;Suppl:56-58, 60-51). 간략하게, 각 개체의 혈액으로부터 추출된 250ng에 가까운 genomic DNA는 DNA 활성, 상자성입자 결합(paramagnetic particle binding), 올리고뉴클레오티드의 잡종화, 세척, 연장, 연결, PCR에 의한 증폭과 적합한 잡종화 버퍼(buffer)에서 Beadplate의 잡종화를 거치는 genotyping 각 샘플에 사용되었다.

이미지 감도는 BeadXpress Reader로 스캔하고 GenomeStudio software (Illumina Inc., USA)로 genotyping하였다. 고정 데이터를 위한 genotyping 품질 점수는 0.25로 맞췄다.

< 실시예 1>

genotyping 된 SNPs 의 통계적 분석

SNP의 유전자형 빈도는 ²확률을 이용해 Hardy-weinberg 평형(HWE)을 검사했고, 한국인 대조군들 사이의 HWE는 일관된 것을 발견하였다. 데이타는 전립선암과 연관된 SNP 유전자형들의 상대적 위험을 추정하는 것으로 교차비(odds ratio;OR)를 산출하기 위해 비조건적 로지스틱 회귀분석(unconditional logistic regression)을 이용해 분석했다(Moris JA et al., Br Med J( Clin Res Ed ) 1988;296:1313-1316).

환자와 대조군의 유전자형과 haplotype 분포들 상이의 연관을 밝혀내기 위해 로지스틱 분석을 실행했고, 공변인(covariate)으로써 연령(연속수치값)을 조절하였다.

다중비교는 또한 각각의 유의미한 개체의 SNP의 P-value를 계산하기 위한 치환을 사용하므로써 설명될 수 있다. Lewontin의 D'와 LD 계수 r2는 이대립 좌위 9의 모든 쌍 간의 연관불균형을 측정하기 위해 조사되었다. PHASE algorithm ver.2.0을 사용해 성공적으로 genoyping된 SNP들로부터 단상형들이 측정되었고, 연관분석은 SAS version9.1을 사용해 수행했다. 연관불균형에서 서로 대표가 되는 SNP 마커들의 다중 테스트를 위한 최상의 교정을 위해, 독립적 마커 좌위의 실질적인 개수는 마커들 간의 pair-wise LD의 매트릭스들의 스펙트럼 분해에 기반을 둔 SNPSpD 프로그램으로 산출되었다.

동형접합자(A/A), 이형접합자(A/B) 및 마이너 동형접합자(B/B)의 유전자형은 공동우성 모델, 우성모델 및 열성 모델에서 각각 0, 1 및2; 0, 1 및 1; 및 0, 0 및 1로 부여하였다. 기준이 되는 haplotype의 유전적 영향은 SNP로써 같은 방법으로 분석되었다. 예를 들어, 공동우성 모델에서 haplotype-1(-/-, 메이저 동형접합자)의 0 카피(copy), haplotype-1(-/Ht1, 이형접합자)의 1 카피 및 haplotype-1(Ht1/Ht1, 마이너 동형접합자)의 2 카피는 0,1 및 2로 부여하였다.

한국인 집단(전립선암 군 +대조군)에서 전립선암의 위험과 FGF23 유전자의 SNP의 연관에 대한 로지스틱 회귀분석

SNPID	Chr: Coordinate	Position	Alleles	Minor Allele Frequency		Co-dominant		Dominant		Reccessive
SNPID	Chr: Coordinate	Position	Alleles	Pca (n=272)	BPH (n=173)	OR (95%CI)	P-vlue	OR (95%CI)	P-vlue	OR (95%CI)	P-vlue
rs17782469	12: 4487034	Intron	T>G	0.347	0.156	0.81 (0.61-1.09)	0.17	0.73 (0.49-1.10)	0.13	0.84 (0.47-1.51)	0.57
rs11063118	12: 4481564	Intron	T>C	0.202	0.121	1.68 (1.15-2.46)	0.008	1.91 (1.22-3.01)	0.005	1.71 (0.59-4.93)	0.32
rs13312789	12: 4481044	Intron	C>T	0.158	0.09	1.72 (1.11-2.65)	0.01	2.03 (1.23-3.34)	0.006	1.24 (0.36-4.20)	0.73
rs7955866	12: 4479549	CDS (T239M)	G>A	0.164	0.092	1.79 (1.16-2.75)	0.008	2.12 (1.30-3.48)	0.003	1.24 (0.36-4.20)	0.73
rs13312794	12: 4479486	3’UTR	T>G	0.02	0.026	0.86 (0.34-2.19)	0.75	0.86 (0.34-2.19)	0.75	-	-
FGF23_ht1	-	-	-	0.428	0.462	0.91 (0.68-1.21)	0.51	0.87 (0.56-1.34)	0.52	0.90 (0.55-1.49)	0.69
FGF23_ht2	-	-	-	0.342	0.384	0.79 (0.59-1.06)	0.12	0.71 (0.47-1.07)	0.1	0.80 (0.45-1.44)	0.46
FGF23_ht3	-	-	-	0.156	0.087	1.76 (1.14-2.72)	0.01	2.10 (1.26-3.48)	0.004	1.24 (0.36-4.20)	0.73

상기 [표 2]에서 보이듯이, 대조군과 전립선암군에서 다형성들 간의 유전자형 빈도를 로지스틱 회귀분석을 이용해 분석한 결과 선별된 5개의 다형성 중 3개의 다형성이 공동우성모델 및 우성모델에서 전립선암과 유의미하게 연관된 것으로 나타났다. 또한, 마이너 대립유전자 빈도에서 상기 3개의 다형성은 전립선암군이 대조군에 비하여 마이너 대립유전자 빈도가 높은 경향을 보여 전립선암에 특이적인 대립유전자의 빈도가 높은 것을 알 수 있었다.

따라서, 상기 rs11063118, rs13312789 및 rs7955866는 효과적인 전립선암 예측 및 진단용 마커로 사용될 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 전립선암 예측 및 진단을 위한 SNP, 마커, 키트, 마이크로어레이 및 전립선암 예측 및 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 전립선암 진단을 위한 SNP, 마커, 키트, 마이크로어레이 및 전립선암 예측 및 진단 방법은 전립선암의 발병 위험도를 분석할 수 있는 효율적인 도구로써 사용될 수 있어 산업상 이용 가능성이 높다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Makers for the diagnosis to prostate cancer using FGF23 gene and method for predicting and detecting to prostate cancer using the same <130> NP13-0013 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs11063118 <400> 1 ctgagagcct gggatctgga gccagatctg cctgagttca aaccccagct att 53 <210> 2 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs13312789 <400> 2 atctagcaca ggccctggta tgtagtctgt aggtcctcaa gtcatgtcaa ttc 53 <210> 3 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs7955866 <400> 3 cgaaggggcg gcagccttcc gggcccgatt cccccagcgt gcgtgttcac tcg 53

Claims

서열번호 1의 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 27번째 염기가 C이고, 상기 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 27번째 염기가 T이고, 상기 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3의 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 27번째 염기가 A이고, 상기 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 검출제제를 포함하는 전립선암 진단용 마커 조성물.
서열번호 1의 27번째 염기, 서열번호 2의 27번째 염기 및 서열번호 3의 27번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 전립선암 진단용 키트.
서열번호 1의 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 27번째 염기가 C이고, 상기 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 27번째 염기가 T이고, 상기 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3의 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 27번째 염기가 A이고, 상기 27번째 염기를 포함하는 20 내지 100개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전립선암 진단용 마이크로어레이.
전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 환자의 시료로부터
(a) 검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 수득한 핵산시료에서 서열번호 1의 27번째 염기, 서열번호 2의 27번째 염기 및 서열번호 3의 27번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 다형성 부위를 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 전립선암 진단용 다형성 부위를 검출하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 (c)단계의 염기 결정은 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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