KR101092580B1

KR101092580B1 - 위암 감수성 예측용 ｖｃａｎ 다형성 마커 및 이를 이용한위암 감수성 예측 방법

Info

Publication number: KR101092580B1
Application number: KR1020090026194A
Authority: KR
Inventors: 강창원; 주형석
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2009-03-27
Publication date: 2011-12-13
Also published as: KR20100107866A

Abstract

본 발명은 위암 감수성 예측용 다형성 마커, 일배체형 마커 및 이를 이용한 위암 감수성 예측 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 위암 발생의 유전학적 감수성과 관련된 베르시칸 단백질 유전자의 다형성인 rs188703 및 rs160277 및 상기 유전변이로 구성된 일배체형 마커를 확인함으로써 위암의 위험성을 예측 및 분석하는 방법에 관한 것이다.

베르시칸, Versican, VCAN, 단일염기다형성, SNP, 위암, 감수성

Description

위암 감수성 예측용 ＶＣＡＮ 다형성 마커 및 이를 이용한 위암 감수성 예측 방법{Polymorphic markers of VCAN for predicting susceptibility to gastric cancer and the prediction method using the same}

본 발명은 위암 감수성 예측용 다형성 마커, 일배체형 마커 및 이를 이용한 위암 감수성 예측 방법에 관한 것이다.

모든 인간은 개인 간에 약 99.9% 동일한 유전적 염기서열을 지니고 있으며 약 0.1%의 염기서열 차이로 인해 개인 간의 유전적 차이를 나타낸다. 이러한 유전적 차이를 학문적으로 유전적 변이(genetic variation)이라 하는데 변이가 생기는 원인은 DNA 복제과정에서의 오류(error)에 의한 돌연변이 때문이다. 특히 질병에 대한 유전적 위험요인을 규명하기 위해서는 질병대상 유전자의 유전적 다형성을 분류할 수 있는 유전자 표지가 반드시 필요하다. 여기서 말하는 다형성(polymorphism)이란 개인과 개인 간의 DNA 상에 존재하는 염기쌍에 차이가 있는 것을 말하는데, 일반 집단에서 나타나는 대립인자 가운데 낮은 빈도의 대립인자가 1% 이상으로 분포할 경우를 일컫는다.

다형성은 유전적 변이의 분자적 특성에 따라 크게 재발성 다형(recurrent polymorphism)과 유일성 다형(unique polymorphism)으로 구분된다. 재발성 다형은 동일한 대립인자(유전자)가 독립적으로 비교적 일정한 돌연변이율에 의해 반복되어 발생하는 것을 말하며 RFLP(restriction fragment length polymorphism), microsatellite(STR) 및 minisatellite 등이 그 예이다. 이에 비해, 유일성 다형이란 지금까지 단 한 번의 돌연변이에 의해 나타난 경우를 말하는데 단일염기치환 다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)과 삽입/결실 다형성(Ins/Del polymorphism) 등을 말한다. 특히 유일성 다형을 이용한 연구는 집단 내 질병관련 유전적 다형의 내력(history)을 이해하는데 보다 적절하게 활용될 수 있다. 인간 유전체 내에 존재하는 여러 종류의 유전적 변이 가운데 90% 이상으로 가장 빈번하게 관찰되며 질환과 관련된 유전체 연구에 널리 이용되는 것이 SNP이다. SNP가 질병 유전체연구에 있어 많은 관심을 끌고 있는 것은 발생빈도가 높은 만성질환의 발생이나 진전에서 개개인의 차이를 결정짓는 유전적 요인은 인간 유전체에서 비교적 흔한 빈도로 나타나는 이들 SNP에 의해 결정 될 것이라는 가설이 받아들여지기 때문이다(common disease common allele; CDCA).

SNP는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열이 치환되어 나타나는 유전적 변이로 정의되며 어느 한 집단에서 조사된 특정 대립인자(allele)의 MAF(minor allele frequency)가 1% 이상인 경우를 말한다. 최초 분석 당시, SNP는 인간의 유전체 내에서 약 1,000만 개가 있을 것으로 추정하였으나 최근 유전체 분석 기술의 발달로 기대 이상의 SNP을 발굴하게 되어 현재 dbSNP의 Build 129에 등록된 수가 무려 약 1,800만 개 이상으로 조사되었고 validation된 SNP의 숫자만 하더라도 650만 개 이상에 이르고 있으며 향후 지속적인 발굴로 그 수는 더욱 늘어날 것으로 예측하고 있다

유전자의 프로모터 부위에 위치하여 유전자의 발현을 조절하는 기능을 지닌 SNP을 regulatory SNP(rSNP), 유전자를 coding하는 exon 부위에 존재하면 coding SNP(cSNP), intron에 위치하면 intron SNP(iSNP), 그리고 유전자와 유전자 사이의 intergenic region에 존재하는 SNP를 게놈 SNP(gSNP : genomic SNP)라고 한다. 특히 cSNP는 염기서열의 변이에 의해 아미노산의 서열에 변경이 생기는 nonsynonymous SNP(nsSNP)과 염기서열의 변이가 생겨도 아미노산의 서열에는 변경이 없는 synonymous SNP으로 구분된다.

한편, 세포외기질(Extracellualr matrix; ECM)은 조직을 지탱하는 기계적인 힘을 제공하고, 세포의 다양한 생명활동을 조절하는 고도로 조직된 구조이다 (Theocharis AD. Connect Tissue Res. 2008, Vol.49, 230-234). 베르시칸 단백질(Versican, VCAN)은 세포외기질의 주요성분으로, 세포의 형태변화를 지지하여 세포가 분열하고 이동할 수 있도록 돕는 역할을 수행한다(Evanko SP, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999, Vol.19, 1004-1013; Wight TN. Curr Opin Cell Biol. 2002, Vol.14, 617-623).

베르시칸 유전자는 인간 게놈의 5q14.3 좌위에 위치하며 15개의 엑손(exon) 으로 이루어져 있다. 베르시칸 단백질은 구조적으로 3개의 도메인으로 나뉘며, 구체적으로는 N 말단에 있는 G1 도메인, C 말단에 있는 G3 도메인 및 G1과 G3 사이에 위치한 중앙 부분으로 구분된다. 아미노기 말단의 G1 도메인은 히알루론산(hyaluronic acid) 결합부위를 포함하고 있으며, 카르복실기 말단의 G3 도메인은 표피성장인자 유사반복영역(epidermal growth factor-like repeats), 렉틴 유사 서열( lectin-like), 상보 조절 단백질 유사 모티프(complement regulatory protein-like motif) 등의 서열로 이루어져 있다(Zimmermann DR. Embo J. 1989, Vol.8, 2975-2981). 한편 단백질의 중앙 부분에는 두 개의 글리코사아미노글리칸(glycosaminoglycan) 부착부위가 존재하는데, 상기 글리코사아미노글리칸은

GAG-α 도메인 및 GAG-β으로 구성되어 있다. 이곳에서 선택적 스플라이싱(alternative splicing)이 일어나, 4가지의 이형 단백질(isoform)이 만들어진다(Dours-Zimmermann MT. J Biol Chem. 1994, Vol.269, 32992-32998). V0 이형단백질은 모든 도메인을 모두 포함하는 반면, V1 이형단백질은 GAG-α 도메인이 없고, V2 이형단백질은 GAG-β도메인이 없으며, V3 이형단백질은 두 GAG 도메인이 모두 제거되어 있다.

흑색종(melanoma), 전립선암, 유방암, 위암 등을 포함한 다양한 암에서 versican의 과발현이 관찰되었고, versican의 발현량이 증가하면 환자의 예후가 나빠지는 것으로 알려져 있다. 특히, GAG-β 도메인을 포함하는 V1 이형단백질을 실험적으로 과발현시키면, 세포분열과 종양성장 및 혈관생성(angiogenesis)이 촉진되며, 세포사멸(apoptosis)이 감소하는 것으로 관찰되었다(Sheng W, et al. Mol Biol Cell. 2005, Vol.16, 1330-1340; LaPierre DP, et al. Cancer Res. 2007, Vol.67, 4742-4750). V1은 발암과정을 촉진하는 EGFR의 발현과 CDK2의 kinase 활성을 증대시키고, 세포사멸을 유도하는 Bad 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져있다(Sheng W, et al. Mol Biol Cell. 2005, Vol.16, 1330-1340). 반면 GAG-β가 생략된 V2 이형단백질은 세포의 증식과 EGFR 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Sheng W, et al. Mol Biol Cell. 2005, Vol.16, 1330-1340). 이러한 보고들을 통해 베르시칸이 발암과정에서 중요한 역할을 담당하고 있으며, 특히 GAG-β 도메인은 세포분열과 EGFR 신호전달과정에 연관되어 있음을 알 수 있다.

하지만, 아직까지 베르시칸과 암 사이의 유전적 관련성은 보고된 바 없다. 이에 본 발명자들은 환자-대조군 연구를 통해 베르시칸 유전자와 위암사이의 유전학적 관련성을 최초로 제시하였으며, 베르시칸 단백질 GAG-β도메인의 아미노산서열을 변화시키는 유전변이들이 위암감수성의 유전적 소인을 예측하는데 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 상기 위암 감수성 예측용 단일염기다형성 마커를 이용한 위암 감수성 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 위암 감수성 예측용 단일염기다형성 마커가 집적된 위암 감수성 예측용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인간 게놈 5q14.3 지역에 존재하는 위암 감수성 예측용 일배체형 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 위암 감수성 예측용 단일염기다형성 마커를 이용한 위암 감수성 예측 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 게놈의 5q14.3 지역에 존재하는 위암 관련성 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함하는 위암 감수성 예측용 키트를 제공한다.

또한, 상기 위암 관련성 단일염기다형성 마커에 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된 위암 감수성 예측용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 인간 게놈 5q14.3 지역에 존재하는 단일염기다형성 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측용 일배체형 마커를 제공한다.

아울러, 본 발명은 위암 예측을 위해, 상기 위암 관련성 단일 염기다형성 마 커를 검출하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism: SNP)은 인간 게놈에 약 0.1%(약 1000 염기에 1 염기)의 비율로 존재하는 가장 빈도가 높은 다형이다. 즉, 이 단일염기다형성이란, 게놈 유전자의 하나의 염기가 다른 염기로 치환하는 것에 의해, 예컨대 야생형이 G-C 염기 쌍인 데 대하여, 다형성에서는 A-T 염기 쌍으로 되어 있는 상태를 의미한다. 또한 이중가닥 염색체의 각각의 대립 유전자가 다형 형태인 경우(동형 접합 다형성)와, 한쪽이 야생형, 다른 쪽이 다형성인 경우(이형 접합형 다형성)가 존재한다. 이러한 하나의 염기의 변이는, 코돈 변이에 의한 변이 아미노산의 합성(미스센스 변이)이나 종지 코돈의 생성에 의한 불완전 단백질의 합성(넌센스 변이)을 발생시키는 경우가 있다. 따라서 단일염기다형성의 유무가 여러 가지 질병에도 관련되는 것이 명백해지고 있으며(예컨대 폐암에 관한 p 53 유전자의 SNP: Biros et al., Neoplasma 48(5):407-11, 2001), 진단이나 유전적 치료법 등을 목적으로서 단일염기다형성의 유무를 정확히 판정하는 것(SNP 타이핑)의 중요성이 강하게 인식되고 있다. 또한, 이 단일염기다형성은 질환이 쉽게 걸리는 성질이나 약제 반응성에 관련되는 유전자를 탐색할 때의 유용한 다형성 마커이기도 하고, 테일러 메이드(tailor-made) 의료를 위한 중요한 유전자 정보로서도 주목받고 있다.

일배체형은 하나의 집단 내에서 발견된 여러 부위의 단일염기다형성을 통계학적인 개연성에 근거해 조합한 것으로, 각각의 단일염기다형성보다 더 정확하고 신뢰할 수 있는 기능성 유전정보를 제공하는 것으로 알려져 있다.

5q14.3은 염색체 5번 염색체의, 동원체(centromere)의 아래인 장완부(long arm; q)의 14.3번째 밴드를 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 인간 게놈 5q14.3 지역에 존재하는, rs188703(서열번호 64)의 다형성 부위 및 rs160277(서열번호 65)의 다형성 부위를 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함하는 위암 감수성 예측용 키트를 제공한다.

미국국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information : NCBI)의 다형성 데이터베이스(dbSNP)에 따르면, 베르시칸(versican) 유전자에는 총 21개의 기능유전변이가 존재한다. 이 중 19개는 아미노산서열을 변화시키는 다형성(synonymous single nucleotide polymorphism, nsSNP)이고, 2개는 프레임쉬프트 변이(frameshift mutation)이다. 본 발명자들은 21개의 기능유전변이와 위암과의 관련성을 환자-대조군 연구를 통하여 분석하였다.

먼저, 데이터베이스에 등록된 총 21개의 기능유전변이의 다형성 여부를 DNA 풀( DNA pool)을 이용하여 검증한 결과(표 1 참조), 6개의 nsSNP만이 5% 이상의 빈도로 다형성을 보임을 알 수 있었다(표 3 참조). 검증된 6개의 유전변이를 430명 의 위암환자와 406명의 정상인 유전체 DNA에서 분석한 결과, 베르시칸 단백질의 1826번째 아미노산 서열을 아르기닌에서 히스티딘으로 (R1826H), 2937번째 아미노산을 아스파틱산에서 타이로신으로 (D2937Y) 변화시키는 두 개의 nsSNP이 위암감수성과 유의미한 관련성이 있음을 확인하였다. 두 다형성은 모두 발암과정에서 중요한 역할을 수행할 것으로 생각되는 GAG-β도메인에 위치하고 있었다. 열성모델 (recessive model)에서 열성 대립형질(minor allele) 동형접합체(homozygote)가 위암감수성 감소와 유의미한 관련이 있었고, 특히 장관성 위암 (intestinal-type gastric cancer)의 감수성과 강한 관련성을 보였다(표 4 및 5 참조).

두 다형성은 구체적으로 rs188703(서열번호 64)의 +301번째 위치에 존재하며 아미노산 서열이 G 또는 A로 될 수 있으며, 또한, rs160277(서열번호 65)의 +301번째 위치에 존재하며 G 또는 T가 될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드의 변환으로 rs188703에서는 CGU에 의해 암호화되는 아르기닌이 CAU에 의해 암호화되는 히스티딘으로 치환되게 되며, rs160277에서는 GAU에 의해 암호화되는 아스파틱산이 UAU에 의해 암호화되는 타이로신으로 치환되게 된다.

두 다형성은 서로 매우 강한 상관관계 (R² = 0.99)를 보이고 있어, 일배체형 (haplotype) 분석을 실시하였다. 1826번째 아미노산이 히스티딘이고 2937번째 아미노산이 타이로신인 일배체형이(H1826-Y2937) 위암감수성을 유의미하게 감소시키는 것을 확인하였다. 이배체형(diplotype) 분석에서도 열성모델에서 위암감수성과의 유의미한 관련성이 관찰되었다.

정리하면, 베르시칸 유전자의 GAG-β도메인에 위치하는 R1826H와 D2937Y의 열성 대립형질(minor allele)은 위암감수성을 유의미하게 감소시켰으며, 이러한 관련성은 장관성 위암에서 더욱 두드러졌다.

따라서 본 발명은 상기의 다형성 부위를 판별할 수 있는 프로브 및 프라이머를 제공하며, 이를 포함하는 키트를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 1) rs188703(서열번호 64)의 다형성 부위인 +301번째 아미노산 서열이 G 또는 A이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 위암 관련성 폴리뉴클레오티드; 또는,

2) rs160277(서열번호 65)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

를 증폭하여, 위암 관련성 다형성 부위를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측용 키트를 제공한다.

상기 키트의 프로브는 엄격한 혼성화 조건하에서 상기 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하도록 제작된 것이 바람직하며, 상기 다형성 부위를 포함하는 연속적인 20 내지 100개의 염기를 포함하도록 상기 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 15 내지 50머 길이, 바람직하게는 15 내지 30머의 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머의 길이의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 것은 모두 사용 가능하다.

상기 특이적 결합은 비특이적인 혼성체가 형성되지 않고, 특이적인 혼성체가 형성되는 것을 의미하고, 상기 엄격한 혼성화 조건은 통상적인 방법에 따라 혼성체를 형성하는 핵산의 융해 온도(Tm) 등에 기초하여 결정할 수 있다. 구체적인 혼성화 상태를 유지할 수 있는 세정 조건으로는 통상 「1×SSC, 0.1%SDS, 37℃」정도의 조건, 더욱 엄격하게는 「0.5×SSC, 0.1%SDS, 42℃」정도의 조건, 더욱더 엄격하게는 「0.1×SSC, 0.1%SDS, 65℃」정도의 조건을 들 수 있다.

상기 프로브는 임의의 고형 기질에 고정화해 이용할 수도 있다. 상기 고형기질로는 유전자 팁, cDNA 마이크로 어레이, 올리고 DNA 어레이, 멤브레인 필터(membrane filter) 등도 포함된다.

상기 키트의 프라이머 쌍은 하기 프라이머 쌍 1 또는 2로 사용되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 15 내지 50머 길이, 바람직하게는 15 내지 30머의 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머의 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 사용 가능하다.

또는 상기 프라이머 쌍은 상기 다형성 부위를 포함하는 연속적인 15 내지 50개의 염기로 구성되며, 상기 다형성 부위의 염기를 3'말단으로 갖는 올리고뉴클레오티드를 적어도 하나 가질 수 있다. 상기 3' 말단에 다형성 부위를 가짐으로써, 상기 단일 핵산 분자의 변이에 의해, 상기 다형성 부위가 변이되지 않은 개체로부터 수득한 게놈 DNA 시료에서는 증폭 반응이 일어나지 않는 것은 당업자에게 자명하다. 프라이머 쌍은 구체적으로 하기와 같다:

프라이머 쌍 1: 서열번호 28로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 29로 기재되는 역방향 프라이머; 또는

프라이머 쌍 2: 서열번호 52로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 53로 기재되는 역방향 프라이머.

이때, 상기 키트는 PCR 반응의 요소로서 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture) 및 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 PCR 결과를 확인하는데 필요한 6-FAM, NED 또는 HEX 등의 형광물질, 아가로스와 전기영동 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 증폭반응 요소가 상기 프라이머 쌍과의 사전혼합물(premix) 형태로 제공될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고뉴클레오티가 집적된 산재성 위암 감수성 예측용 마이크로어레이를 제공한다:

1) rs188703(서열번호 64)의 다형성 부위인 +301번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 위암 관련성 올리고뉴클레오티드; 또는,

2) rs160277(서열번호 65)의 다형성 부위인 +301번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 위암 관련성 올리고뉴클레오티드.

상기 올리고뉴클레오티드는 시료에 포함된 DNA를 증폭하면서 형광물질로 표지된 증폭산물과 미스매치가 있는 경우 혼성화되지 않고, 매치되는 경우 혼성화되어 형광을 나타내어, 상기 형광을 검출함으로써 시료의 산재성 위암 감수성을 예측할 수 있다. 이때, 상기 올리고뉴클레오티드 상의 단일 핵산 분자의 미스매치로도 혼성화가 되지 않는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명의 마이크로어레이는 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이를 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 올리고뉴클레오티드를 탐침 DNA 분자로 이용하여 마이크로어레이의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로파이펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 인간 게놈 5q14.3 지역에 존재하는 단일염기다형성 마커인 ① rs188703(서열번호 64)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G이고; ② rs160277(서열번호 65)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G인 위암 감수성 예측용 일배체형 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 게놈 5q14.3 지역에 존재하는 단일염기다형성 마커인 ① rs188703(서열번호 64)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 A이고; ② rs160277(서열번호 65)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 T인 위암 감수성 예측용 일배체형 마커를 제공한다.

상기의 일배체형 마커는, 위암 중 장관성 위암의 경우 그 감수성이 특히 감소되었으므로(표 4 및 5 참조), 바람직하게는 장관성 위암의 감수성 예측용 마커로 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 위암 발명이 개체(실험군) 및 대조군의 혈액 시료로부터 분리된 게놈 DNA로부터

1) 피검 개체의 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;

2) 상기 DNA를 대상으로 하기 위암 관련성 다형성 부위를 검출하는 단계:

①rs188703(서열번호 64)의 다형성 부위인 +301번째 아미노산 서열이 G 또는 A이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 10 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 위암 관련성 폴리뉴클레오티드; 및/또는,

②rs160277(서열번호 65)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 10 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 위암 관련성 폴리뉴클레오티드

3) 상기 2)단계에서 다형성 부위의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 위암을 예측하기 위해 위암 관련성 다형성 유전자를 검출하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측을 위한 유전자 다형성 검출 방법을 제공한다.

아울러, 4) 상기 3)단계에서 다형성 부위의 유전자형이 rs188703에서 AA이면, 위암 감수성이 낮은 것으로 판정하고, 다형성 부위의 유전자형이 rs160277에서 TT이면 위암 감수성이 낮은 것으로 판정하는 단계를 추가적으로 포함하는 위암 감수성 예측을 위한 유전자 다형성 검출 방법을 제공한다.

단계 2)의 검출방법은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(micoarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 방법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, 제한효소절편길이분석(restriction fragment length polymorphisms, RFLP), 질량분석법 (MALDI-TOF mass spectrometry) 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 "TaqMan™" 프로브로 통상적으로 지칭되는 이중으로 표지된 형광원성 (fluorogenic) 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 PCR 검출 및 정량이 또한 본 발명에 따라 수행될 수 있다. 이러한 프로브는 2개의 상이한 형광 염료로 표지된 짧은 (예를 들어, 20-25개의 염기) 올리고데옥시뉴클레오티드로 구성된다. 각각의 프로브의 5' 말단에는 리포터 염료가 있고, 3' 말단에는 켄칭(quenching) 염료가 표지된다. 올리고뉴클레오티드 프로브 서열은 PCR 앰플리콘 내에 존재하는 내부 표적 서열에 상보적이다. 프로브가 손상되지 않으면, 2개의 형광단 간에 에너지 전달이 발생하고 리포터로부터의 방출이 FRET에 의해 켄칭된다. PCR의 신장 단계동안, 프로브가 반응에서 사용된 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 절단됨으로써, 리포터가 올리고뉴클레오티드-켄쳐로부터 유리되고 리포터 방출 강도에서의 증가가 일어난다. 따라서, TaqMan™ 프로브는 표지 및 켄쳐가 있는 올리고뉴클레오티드이고, 이때 표지가 증폭 동안 증폭에서 사용된 중합효소의 엑소뉴클레아제 작용에 의해 방출된다. 이는 합성 동안 증폭의 실시간 측정을 제공한다. 다양한 TaqMan™ 시약을 Applied Biosystems(USA) 뿐만 아니라 다양한 전문 판매자 예컨대 Biosearch Technologies(예를 들어, 블랙 홀(black hole) 켄쳐 프로브)로부터 시판된다. 이중-표지 프로브 전략에 관한 추가적인 상세사항은 WO92/02638에 기재되어 있다.

rs188703(R1826H) 및 rs160277(D2937Y)로 이루어진 다형성 마커 및 일배체형 마커는 위암 감수성과 밀접한 관련이 있으므로, 이를 측정함으로써 위암 발생 전, 위암 발생 감수성을 예측하여 위암을 예방하는데 유용하게 이용될 수 있고, 위암의 유전적 소인을 분석하는데 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 연구대상

본 발명은 430명의 위암환자와 406명의 정상인 유전체 DNA를 이용하였다. 위암환자와 정상인의 혈액 및 조직시료는 서울대학교병원, 한양대학교 구리병원, 인제대학교 백병원, 충남대학교병원, 을지대학교병원에서 각 기관의 내부윤리위원회 의 승인 하에 수집되었다. 대조군에는 위내시경이나 위장조영술을 포함하는 건강검진결과 정상으로 판명된 사람만을 포함시켰다.

위암환자의 진단 시 연령은 57.3 ± 12.9세 (평균 ± 표준편차)이고, 정상인은 52.1 ± 8.4세 이었다. 남성의 비율은 환자군이 66.5%, 정상인이 69.5%로 두 그룹 모두에서 남성의 비율이 더 높았다.

위암환자군을 로렌 분류법 (Lauren's classification)에 근거하여 분류하면, 장관성 위암환자가 178명, 산재성 위암환자가 252명 이었으며, 혼합형은 분석에 포함되지 않았다. 또한 위암의 병기에 따라 분류하면 1A기 42명, IB기 66명, II기 86명, IIIA기 106명, IIIB기 58명, IV기 72명으로 구성되어 있었다.

연구대상으로부터 획득한 냉동위조직이나 혈액시료에서 Puregene^TMDNA purification kit (Gentra, Minneapolis, MN), 혹은 DNeasy® tissue kit (Qiagen, GmbH, Germany)을 사용하여 유전체 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 이중나선 DNA만을 특이적으로 정량하는 PicoGreen® (Molecular Probes, Eugene, OR) 형광염료를 사용하여 농도를 측정한 후, genotyping에 적합한 2.5 - 10 ng/ul의 농도로 보관하였다. 또한 동일한 양의 모든 검체 DNA를 혼합한 DNA pool을 구축하여 다형성 검증(validation)에 사용하였다.

< 실시예 2> 다형성의 선정

미국국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 다형성데이터베이스(dbSNP)에 따르면, versican 유전자에는 총 21개의 기능유전변이가 존재한다(표 1). 이 중 19개는 아미노산서열을 변화시키는 nsSNP(non-synonymous SNP)이고, 2개는 frameshift mutation이다. 본 발명자들은 베르시칸의 21개 기능 유전변이 모두를 분석하였다. 표 1의 다형성의 위치는 NC_000005를 기준서열로하여 나타내었고, 아미노산 서열의 변화는 NP_004376를 기준으로 하여 나타내었다.

베르시칸 유전자의 기능유전변이

다형성	핵산위치	대립형질	기능
rs36065652	40354	C>T	L255F
rs2652098	40490	C>T	S300L
rs12651836	40589	G>T	G333V
rs2287926	47826	G>A	G428D
rs11745614	48993	C>G	S817C
rs309559	65787	A>G	K1516R
rs35443373	65970	G>A	S1577N
rs3813671	66248	A>G	T1670A
rs34469464	66610..66611	->C	Frameshift
rs188703	66717	G>A	R1826H
rs35949614	66811	G>T	E1857D
rs34050047	66816	C>A	A1859E
rs1061380	67886	A>C	I2216L
rs34421683	67922	A>-	Frameshift
rs160278	68142	T>A	F2301Y
rs3734094	68183	G>C	V2315L
rs59948995	69293	G>A	V2685I
rs160277	70049	G>T	D2937Y
rs16900532	70273	C>A	N3011K
rs13184139	81601	A>T	D3165V
rs13166485	81602	T>A	D3165E

< 실시예 3> 유전자형 분석 ( Genotyping )

다형성의 유전자형은 MALDI-TOF 질량분석기를 이용한 MassARRAY^TM system (Sequenom, SanDiego, CA)을 활용하여 분석하였다. 분석에 사용된 연쇄중합반응용 (polymerase chain reaction; PCR) 프라이머 (primer)와 염기연장반응용 (extension reaction) 프라이머 서열을 표 2에 제공하였다. Genotyping에 사용된 프라이머는 Assay Design 3.1 (Sequenom, SanDiego, CA) 프로그램을 사용하여 설계하였다.

Versican 다형성 분석을 위한 프라이머 서열

다형성	증폭_정방향	증폭_역방향	연장반응
rs36065652	ACGTTGGATGCCCTTCTTTTTTTTCCAGGTG(서열번호 1)	ACGTTGGATGTCACACTCTTTTGCAGCCTC(서열번호 2)	tttATTTACTGGGGACAGTGA (서열번호 3)
rs2652098	ACGTTGGATGTTTGACCAGTGCGATTACGG(서열번호 4)	ACGTTGGATGAGTAGACCACCTCCACACTG(서열번호 5)	CGCACGCTGGCATCC (서열번호 6)
rs12651836	ACGTTGGATGCGTTTAAAGCAGTAGGCATC(서열번호 7)	ACGTTGGATGGAGAACCCTGTATCGTTTTG(서열번호 8)	GTTTTGAGAACCAGACAG (서열번호 9)
rs2287926	ACGTTGGATGCTGAAGCAGAAGGTGAGTAG(서열번호 10)	ACGTTGGATGAGCCACCAAATTACCCACAC(서열번호 11)	tAAATTACCCACACCTACTG (서열번호 12)
rs11745614	ACGTTGGATGGGGCAATTTTGAAGAGGCTG(서열번호 13)	ACGTTGGATGGCCACTGTATCAAAATGGTC(서열번호 14)	CATCCAAGCCTTTAGAGT (서열번호 15)
rs309559	ACGTTGGATGCCCATTCCATGAGGAATTTG(서열번호 16)	ACGTTGGATGTGTGCCTGATGACCAACTTC(서열번호 17)	CTGATTCTGCCCCTTTT (서열번호 18)
rs35443373	ACGTTGGATGGCTGATGCAGAACTTGGAAC(서열번호 19)	ACGTTGGATGGCAAGGGCTACAGAAGTAAC(서열번호 20)	aATTTGGTGAAGAGGTAGAAAAAA(서열번호 21)
rs3813671	ACGTTGGATGCAATGTTCACCATGGTAACTG(서열번호 22)	ACGTTGGATGCTGTGATTATCCTGCTAGTG(서열번호 23)	TCCTGCTAGTGTCTAAAG (서열번호 24)
rs34469464	ACGTTGGATGCACCAACACAGTCTGAAAGG(서열번호 25)	ACGTTGGATGGTCTGTGCCCCCAAATTTTC(서열번호 26)	TTGTTTCTGTAAAGACAGG (서열번호 27)
rs188703	ACGTTGGATGGAGCCCTGCTCCATAAAGAC(서열번호 28)	ACGTTGGATGAGCAGTATCCATCAACCTGG(서열번호 29)	GGCTGACCACTCTCCCAC (서열번호 30)
rs35949614	ACGTTGGATGGAAACCACCACTGTTTCTTC(서열번호 31)	ACGTTGGATGGACAAAGTGCCAGCTACTTC(서열번호 32)	TTCGGCTTGAATTGCATA (서열번호 33)
rs34050047	ACGTTGGATGGAAACCACCACTGTTTCTTC(서열번호 34)	ACGTTGGATGGACAAAGTGCCAGCTACTTC(서열번호 35)	ccGCTACTTCCTTTTCGGCTTGAATT(서열번호 36)
rs1061380	ACGTTGGATGCTTAGCTACTGCATTAGTAAC(서열번호 37)	ACGTTGGATGTTGATTGGTGAATCTGTGAC(서열번호 38)	CTACATGTTCAGCTGGTA (서열번호 39)
rs34421683	ACGTTGGATGCCAGCTGAACATGTAGTCAC(서열번호 40)	ACGTTGGATGTGTTGGTCTCATGCCTTTCG(서열번호 41)	TGTTTTGTACTTTCTTCCTTTT (서열번호 42)
rs160278	ACGTTGGATGGGTCCAACTTCTTTTGCCAC(서열번호 43)	ACGTTGGATGATCCCCACACTTCTCAAGTG(서열번호 44)	CTCAAGTGACAAAATTGAAGACT(서열번호 45)
rs3734094	ACGTTGGATGGTTACTGACCCACTACCTTC(서열번호 46)	ACGTTGGATGAACAGAATGGAAAATGTGGC(서열번호 47)	gggtAAAAGAAGTTGGACCACTC(서열번호 48)
rs59948995	ACGTTGGATGTGCTCCTAGCACAGAAACAG(서열번호 49)	ACGTTGGATGAACTGTGGCAGACTTACGAG(서열번호 50)	TGCCGTGGGAAGTAAAA (서열번호 51)
rs160277	ACGTTGGATGCATCTTGATTGCTTCTCCAG(서열번호 52)	ACGTTGGATGTTGCTGTGGAAGGAACTGAG(서열번호 53)	cttaTCCAAGATTTCCAAAACAAAACC(서열번호 54)
rs16900532	ACGTTGGATGGATGCTGCTATCGTGGAATC(서열번호 55)	ACGTTGGATGCACGCTTTCTTCTTCTCCAG(서열번호 56)	cactCTTTCTTCTTCTCCAGAAATAAA(서열번호 57)
rs13184139	ACGTTGGATGGCGTTTAATAAGCTCCTGCC(서열번호 58)	ACGTTGGATGAGCACTGCCCTTGGAATTTG(서열번호 59)	AGTCACATGTCTCGGTA (서열번호 60)
rs13166485	ACGTTGGATGGCGTTTAATAAGCTCCTGCC(서열번호 61)	ACGTTGGATGAGCACTGCCCTTGGAATTTG(서열번호 62)	TAGTCACATGTCTCGGT (서열번호 63)

PCR 반응은 2.5 ng 유전체 DNA, 1X 완충용액, 1 mM MgCl₂, 200 uM dNTP mixture, 0.1 unit HotStart Taq polymerase 혼합물에 200 nM의 상기 PCR 프라이머를 첨가한 5 ul 용액에서 수행하였다. 반응조건은 94℃ 15분 초기 변성화 후, 94℃ 20초, 56℃ 30초, 72℃ 1분의 주기를 45회 반복하고, 72℃ 3 분의 최종 연장단계로 이루어진다. PCR 반응 후, 0.3 unit의 SAP (shrimp alkaline phosphatase)을 첨가하고 37℃ 20분, 85℃ 5분간 배양하여 잔여 dNTP를 제거한다. hME 연장반응은 위의 반응결과물에 50 uM d/ddNTP terminator mix와 600 nM extension primer, 0.576 unit thermo sequenase enzyme을 첨가하여 실행한다. 94℃에서 2 분간 초기 변성화를 실행한 후, 94℃ 5초, 52℃ 5초, 72℃ 5초의 짧은 주기를 40회 반복한다. 16 ul의 증류수와 3 mg의 Clean Resin을 첨가한 후, 최종 반응산물을 SpectroChip(Sequenom, SanDiego, CA)에 옮겨 Analyzer Compact 질량분석기로 유전자형을 결정하였다.

< 실시예 4> 다형성 검증 ( Validation )

먼저, versican 유전자의 21개 기능변이의 다형성 여부를 검증하기 위하여, DNA pool을 사용하여 각 다형성의 대립형질빈도 (allele frequency)를 측정하였다. 그 결과 21개의 다형성 중 6개만이 5% 이상의 minor allele 빈도를 보이는 것으로 확인되었고 (rs2652098, rs2287926, rs309559, rs188703, rs160278, rs160277), 이들 다형성에 대한 430명의 위암환자와 406명의 정상인의 유전자형을 개별분석 (indivudal genotyping) 하였다.

< 실시예 5> 통계분석

카이제곱 독립성검정을 사용하여 Hardy-Weinberg 평형 (Hardy-Weinberg equilibrium; HWE)과 위암 감수성간의 관련성을 분석하였다. 환자군과 대조군 사이의 성별, 연령의 차이를 보정하기 위해 logistic 회귀분석을 사용하였다. 모든 통계분석에는 SPSS 11.5 프로그램을 활용하였다.

< 실시예 6> Versican 다형성의 위암 관련성

6개 다형성 모두 대조군에서 유전자형의 예측빈도와 관찰빈도 사이의 유의한 차이는 발견되지 않았다 (HWE P > 0.05; 표 3 참조). 한편 6개 다형성 중 versican 단백질의 1826번째 아미노산을 아르기닌에서 히스티딘으로 변화시키는 rs188703 (R1826H)와 2937번째 아미노산을 아스파틱산에서 타이로신으로 변화시키는 rs160277 (D2937Y)은 위암감수성과 유의한 관련성을 보였다 (P < 0.05; 표 3). 이 두 다형성은 모두 베르시칸 단백질의 GAG-β도메인에 위치하고 있었다.

베르시칸 다형성의 위암 관련성

다형성	대립형질	기능	대조군의 minor allele 빈도	위암 관련성 (P)	HWE (P)
rs2652098	C>T	S300L	0.13	0.83	0.12
rs2287926	G>A	G428D	0.20	0.37	0.23
rs309559	A>G	K1516R	0.46	0.096	0.10
rs188703	G>A	R1826H	0.42	0.019	0.19
rs160278	T>A	F2301Y	0.46	0.083	0.083
rs160277	G>T	D2937Y	0.42	0.027	0.15

rs188703 (R1826H)의 A 대립형질 (H1826)은 G 대립형질 (R1826)에 비해 위암감수성이 20% 가량 낮게 나타났다 (OR = 0.79, 95% CI = 0.65-0.96, P = 0.019). 또한 AA 유전자형은 GG+GA 유전자형에 비하여 나이와 성별을 보정한 후의 위암감수성을 35% 감소시켰다 (OR = 0.65, 95% CI = 0.44-0.95, P = 0.028, 표 4 참조). rs160277 (D2937Y)의 T 대립형질 (Y2937)과 TT 유전자형에서도 rs188703과 유사한 위암감수성 감소현상이 관찰되었다. 두 다형성의 위암감수성과의 관련성은 모두 통계적으로 유의하였다.

< 실시예 7> Versican 다형성의 위암타입별 관련성

Lauren의 분류법에 따르면 위암은 장관성 위암(intestinal-type)과 산재성 위암(diffuse-type)으로 나뉘는데, 두 위암은 조직학적, 병리학적으로 매우 독특한 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 환자군을 장관성 위암군과 산재성 위암군으로 나누어 rs188703(R1826H)와 rs160277(D2937Y)의 위암감수성 관련성을 분석하였다 (표 4).

장관성위암 및 산재성위암과 versican 다형성 사이의 관련성

대립형질, 유전자형	대조군	위암환자군			장관성위암군			산재성위암군
대립형질, 유전자형	N = 406	N = 430	OR (95% CI)	P	N = 178	OR (95% CI)	P	N = 252	OR (95% CI)	P
rs188703 (R1826H)
G (R)	468 (0.58)	545 (0.64)	1		230 (0.65)	1		315 (0.63)	1
A (H)	340 (0.42)	313 (0.36)	0.79 (0.65-0.96)	0.019	126 (0.35)	0.75 (0.58-0.98)	0.032	187 (0.37)	0.82 (0.65-1.03)	0.083
GG+GA	326 (0.81)	373 (0.87)	1		160 (0.90)	1		213 (0.85)	1
AA	78 (0.19)	56 (0.13)	0.65 (0.44-0.95)	0.028	18 (0.10)	0.44 (0.24-0.80)	0.0075	38 (0.15)	0.76 (0.50-1.17)	0.22
rs160277 (D2937Y)
G (D)	467 (0.58)	545 (0.64)	1		230 (0.65)	1		315 (0.63)	1
T (Y)	335 (0.42)	313 (0.36)	0.80 (0.66-0.98)	0.027	126 (0.35)	0.76 (0.59-0.99)	0.041	187 (0.37)	0.83 (0.66-1.04)	0.11
GG+GT	324 (0.81)	373 (0.87)	1		160 (0.90)	1		213 (0.85)	1
TT	77 (0.19)	56 (0.13)	0.64 (0.43-0.94)	0.024	18 (0.10)	0.43 (0.23-0.78)	0.0057	38 (0.15)	0.76 (0.50-1.17)	0.21

그 결과 rs188703과 rs160277 다형성 모두 장관성 위암에서 더욱 유의미한 관련성이 발견되었다. rs188703의 A 대립형질과 rs160277의 T 대립형질은 장관성 위암의 감수성을 25% 가량 감소시켰으며 (rs188703, OR = 0.75, 95% CI = 0.58-0.98, P = 0.032; rs160277, OR = 0.76, 95% CI = 0.59-0.99, P = 0.041), AA 유전자형과 TT 유전자형은 56% 이상 장관성 위암감수성을 낮추는 것으로 나타났다 (rs188703, OR = 0.44, 95% CI = 0.24-0.80, P = 0.0075; rs160277, OR = 0.43, 95% CI = 0.23-0.78, P = 0.0057; 나이, 성별 보정값).

산재성 위암에서도 rs188703의 A 대립형질과 rs160277의 T 대립형질의 빈도가 정상인군보다 줄어드는 유사한 현상이 관찰되었지만, 그 차이가 유의미하지 않았다.

< 실시예 8> 일배체형 분석

두 다형성의 분배불균형(linkage disequilibrim)을 Haploview 4.1 프로그램을 이용하여 분석한 결과, 강한 상관관계가 나타났다(R² = 0.99). 이에 본 발명자들은 PHASE 2.1 프로그램을 사용하여 일배체형(haplotype)을 재구성하고 일배체형과 위암감수성의 관련성을 분석하였다 (표 5).

일배체 및 이배체 분석

구분	대조군	위암환자군			장관성위암군			산재성위암군
구분			OR (95% CI )	P		OR (95% CI )	P		OR (95% CI )	P
일배체형	2N = 812	2N = 860			2N = 356			2N = 504
G-G (R-D)	470 (0.58)	545 (0.63)	1		230 (0.65)	1		315 (0.63)	1
A-T (H-Y)	339 (0.42)	315 (0.37)	0.80 (0.66-0.98)	0.027	126 (0.35)	0.76 (0.59-0.98)	0.037	189 (0.38)	0.83 (0.66-1.04)	0.11
이배체형	N = 404	N = 430			N = 178			N = 252
G-G/G-G + G-G/A-T	327 (0.81)	373 (0.87)	1		160 (0.90)	1		213 (0.85)	1
A-T/A-T	77 (0.19)	57 (0.13)	0.67 (0.45-0.98)	0.040	18 (0.10)	0.44 (0.24-0.81)	0.0079	39 (0.15)	0.79 (0.52-1.22)	0.29

rs188703-rs160277의 대립형질이 A-T (H1826-Y2937)인 일배체형이 G-G (R1826-D2937)에 비해 20% 낮은 위암감수성을 나타냈고 (OR = 0.80, 95% CI = 0.66-0.98, P = 0.027), 특히 장관성 위암의 감수성을 24% 감소시키는 것을 확인하였다(OR = 0.76, 95% CI = 0.59-0.98, P = 0.037). 하지만 산재성 위암과는 유의한 차이가 없었다.

한편, 나이와 성별을 보정한 이배체형 (diplotype) 분석에서도 A-T/A-T가 위암감수성 감소와 유의한 관련성을 보였다(OR = 0.67, 95% CI = 0.45-0.98, P = 0.040). 특히 장관성 위암의 감수성은 56% 낮아지는 것으로 분석되었다(OR = 0.44, 95% CI = 0.24-0.81, P = 0.0079).

결론적으로, versican 단백질의 1826번째 아미노산이 히스티딘이고 2937번째 아미노산이 타이로신인 일배체형이 (H1826-Y2937) 위암감수성, 특히 장관성 위암의 감수성을 유의하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Polymorphic markers of VCAN for predicting sussusceptibility to gastric cancer and the prediction method using the same <130> 9p-03-21 <160> 65 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs36065652 forward primer <400> 1 acgttggatg cccttctttt ttttccaggt g 31 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs36065652 reverse primer <400> 2 acgttggatg tcacactctt ttgcagcctc 30 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs36065652 Ext. primer <400> 3 tttatttact ggggacagtg a 21 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs2652098 forward primer <400> 4 acgttggatg tttgaccagt gcgattacgg 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs2652098 reverse primer <400> 5 acgttggatg agtagaccac ctccacactg 30 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs2652098 Ext. primer <400> 6 cgcacgctgg catcc 15 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs12651836 Forward primer <400> 7 acgttggatg cgtttaaagc agtaggcatc 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs12651836 reverse primer <400> 8 acgttggatg gagaaccctg tatcgttttg 30 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs12651836 ext. primer <400> 9 gttttgagaa ccagacag 18 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs2287926 forward primer <400> 10 acgttggatg ctgaagcaga aggtgagtag 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs2287926 reverse primer <400> 11 acgttggatg agccaccaaa ttacccacac 30 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs2287926 ext. primer <400> 12 taaattaccc acacctactg 20 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs11745614 forward primer <400> 13 acgttggatg gggcaatttt gaagaggctg 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs11745614 reverse primer <400> 14 acgttggatg gccactgtat caaaatggtc 30 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs11745614 ext. primer <400> 15 catccaagcc tttagagt 18 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs309559 forward primer <400> 16 acgttggatg cccattccat gaggaatttg 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs309559 reverse primer <400> 17 acgttggatg tgtgcctgat gaccaacttc 30 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs309559 ext. primer <400> 18 ctgattctgc ccctttt 17 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs35443373 forward primer <400> 19 acgttggatg gctgatgcag aacttggaac 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs35443373 reverse primer <400> 20 acgttggatg gcaagggcta cagaagtaac 30 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs35443373 ext. primer <400> 21 aatttggtga agaggtagaa aaaa 24 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs3813671 forward primer <400> 22 acgttggatg caatgttcac catggtaact g 31 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs3813671 reverse primer <400> 23 acgttggatg ctgtgattat cctgctagtg 30 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs3813671 ext. primer <400> 24 tcctgctagt gtctaaag 18 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs34469464 forward primer <400> 25 acgttggatg caccaacaca gtctgaaagg 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs34469464 reverse primer <400> 26 acgttggatg gtctgtgccc ccaaattttc 30 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs34469464 ect. primer <400> 27 ttgtttctgt aaagacagg 19 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs188703 forward primer <400> 28 acgttggatg gagccctgct ccataaagac 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs188703 reverse primer <400> 29 acgttggatg agcagtatcc atcaacctgg 30 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs188703 ext. primer <400> 30 ggctgaccac tctcccac 18 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs35949614 forward primer <400> 31 acgttggatg gaaaccacca ctgtttcttc 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs35949614 reverse primer <400> 32 acgttggatg gacaaagtgc cagctacttc 30 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs35949614 ext. primer <400> 33 ttcggcttga attgcata 18 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs34050047 forward primer <400> 34 acgttggatg gaaaccacca ctgtttcttc 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs34050047 reverse primer <400> 35 acgttggatg gacaaagtgc cagctacttc 30 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs34050047 ext. primer <400> 36 ccgctacttc cttttcggct tgaatt 26 <210> 37 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1061380 forward primer <400> 37 acgttggatg cttagctact gcattagtaa c 31 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1061380 reverse primer <400> 38 acgttggatg ttgattggtg aatctgtgac 30 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1061380 ext. primer <400> 39 ctacatgttc agctggta 18 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs34421683 forward primer <400> 40 acgttggatg ccagctgaac atgtagtcac 30 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs34421683 reverse primer <400> 41 acgttggatg tgttggtctc atgcctttcg 30 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs34421683 ext. primer <400> 42 tgttttgtac tttcttcctt tt 22 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs160278 forward primer <400> 43 acgttggatg ggtccaactt cttttgccac 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs160278 reverse primer <400> 44 acgttggatg atccccacac ttctcaagtg 30 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs160278 ext. primer <400> 45 ctcaagtgac aaaattgaag act 23 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs3734094 forward primer <400> 46 acgttggatg gttactgacc cactaccttc 30 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs3734094 reverse primer <400> 47 acgttggatg aacagaatgg aaaatgtggc 30 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs3734094 ext. primer <400> 48 gggtaaaaga agttggacca ctc 23 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs59948995 forward primer <400> 49 acgttggatg tgctcctagc acagaaacag 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs59948995 reverse primer <400> 50 acgttggatg aactgtggca gacttacgag 30 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs59948995 ext. primer <400> 51 tgccgtggga agtaaaa 17 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs160277 forward primer <400> 52 acgttggatg catcttgatt gcttctccag 30 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs160277 reverse primer <400> 53 acgttggatg ttgctgtgga aggaactgag 30 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs160277 ext. primer <400> 54 cttatccaag atttccaaaa caaaacc 27 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs16900532 forward primer <400> 55 acgttggatg gatgctgcta tcgtggaatc 30 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs16900532 reverse primer <400> 56 acgttggatg cacgctttct tcttctccag 30 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs16900532 ext. primer <400> 57 cactctttct tcttctccag aaataaa 27 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs13184139 forward primer <400> 58 acgttggatg gcgtttaata agctcctgcc 30 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs13184139 reverse primer <400> 59 acgttggatg agcactgccc ttggaatttg 30 <210> 60 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs13184139 ext. primer <400> 60 agtcacatgt ctcggta 17 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs13166485 forward primer <400> 61 acgttggatg gcgtttaata agctcctgcc 30 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs13166485 reverse primer <400> 62 acgttggatg agcactgccc ttggaatttg 30 <210> 63 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs13166485 ext. primer <400> 63 tagtcacatg tctcggt 17 <210> 64 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele <222> (301) <223> R is A or G <400> 64 gtggaaaagc cccttatttc tgccccataa tttggttctc ctaatcgctc tgaaatcact 60 atttccctgg atgtttgggt tatattttca gcaactactc tgtccattac tgtactcaaa 120 accagtcctg ttggctcagt ggagaatgta gtttccacat gcggagacaa agtgccagct 180 acttcctttt cggcttgaat tgcatactct acgtttaatg aaaatgaaga aacagtggtg 240 gtttctgggt cggcagcagc ttctccagag ccctgctcca taaagacaga ggcaggacta 300 rgtgggagag tggtcagccc ttcctgaacc ccaggttgat ggatactgct gtgctcagtg 360 gtctgtgccc ccaaattttc taatgtattt gtttctgtaa agacaggagt agaatctgtc 420 atttcccttt cagactgtgt tggtgttgtc aaggacataa aacttttcct ggtacctgaa 480 tcactagatg tagctacatt tggactttct aattcaaagg gtaaaattaa ttgatccgat 540 ctctgtgtag atgaatatac ctcaaatgta gaagccgtac ctgtagttcc ctcctcctcc 600 t 601 <210> 65 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele <222> (301) <223> K is G or T <400> 65 ttctcgctgc cacttgctgt tctgatgctg ctatcgtgga atcctgccct ctgattaaag 60 ctgcttgagt ttcagggttt atttctggag aagaagaaag cgtgggcctc tcagaagtct 120 gtggacttag ccaaggcacc acacctgcct cgaccccata ggtggcagaa gcagaagtag 180 agtgtggcca ctgtgtagca ccttctaatt caatttcatc ggcagttgta ataacagttc 240 cagcctcagg tgttttaatg gtgggaaaca tcttgattgc ttctccagaa acttgaccat 300 kggttttgtt ttggaaatct tggagaatct cagttccttc cacagcaata agttctgtgg 360 gagaagcttc catttcttct aataactcag gtttaccatc atcttctgaa ggttctaatt 420 ttgtgtcagg agataaagag ggaggctcag ttatgtgaag gtattcctca cttgatggtt 480 tgaaagtcgc ttcaatattt acatgaattt ccttaaaaga atcctgtggg gacattacag 540 atgagccgac gtctattcct ggcagagcac tgggctgggg gatctctgtg tgtccagagg 600 c 601

Claims

rs188703(서열번호 64)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함하는 위암 감수성 예측용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 키트는 rs160277(서열번호 65)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 위암은 장관성 위암인 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 28로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 29로 기재되는 역방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측용 키트.
제 2항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 52로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 53로 기재되는 역방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 상기 다형성 부위를 포함하는 연속적인 15 내지 50개의 염기로 구성되며, 상기 다형성 부위의 염기를 3'말단으로 갖는 올리고뉴클레오티드를 적어도 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측용 키트.
rs188703(서열번호 64)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 위암 관련성 올리고뉴클레오티드가 집적된 위암 감수성 예측용 마이크로어레이.
제 7항에 있어서, 상기 마이크로어레이는 rs160277(서열번호 65)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 위암 관련성 올리고뉴클레오티드가 추가적으로 집적되는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측용 마이크로어레이.
1) 피검 개체의 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;

2) 상기 DNA를 대상으로 rs188703(서열번호 64)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 10 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 위암 관련성 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 및,

3) 상기 2)단계에서 다형성 부위의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 위암 감수성 예측을 위한 유전자 다형성 검출 방법.
제 9항에 있어서, 상기 방법은 rs160277(서열번호 65)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 10 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 위암 관련성 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 검출 및 유전자형 확인하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측을 위한 유전자 다형성 검출 방법.
제 9항에 있어서,

4) 상기 3)단계에서 다형성 부위의 유전자형이 AA이면 위암 감수성이 낮은 것으로 판정하는 단계

를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측을 위한 유전자 다형성 검출 방법.
제 10항에 있어서, 상기 rs160277의 다형성 부위의 유전자형이 TT이면 위암 감수성이 낮은 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측을 위한 유전자 다형성 검출 방법.
베르시칸(Versican) 단백질의 1826번째 아미노산이 히스티딘(histidine) 또는 아르기닌(arginine)이고 상기 1826번째 아미노산을 포함하는 10 ~ 30개의 연속적인 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 위암 감수성 예측용 바이오칩.
제 13항에 있어서, 상기 바이오칩은 베르시칸 단백질의 2937번째 아미노산이 타이로신(tyrosine) 또는 아스파틱산(aspartic acid)이고 2937번째 아미노산을 포함하는 10 ~ 30개의 연속적인 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 예측용 바이오칩.