KR20110002748A

KR20110002748A - 혈액내 빌리루빈 농도와 연관된 ｕｇｔ１ａ６ 유전자 단일뉴클레오타이드 다형성 마커 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20110002748A
Application number: KR1020090060384A
Authority: KR
Inventors: 김용성; 김선영; 강태욱; 전여진; 김희진; 김정환; 박종렬; 김종열; 이시우; 장은수; 정상균
Original assignee: 한국생명공학연구원; 한국 한의학 연구원
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2009-07-02
Publication date: 2011-01-10
Also published as: KR101104679B1

Abstract

본 발명은 단일뉴클레오타이드 다형성(SNP)들로 이루어진 피검체의 혈액 내 빌리루빈 농도를 용이하게 예측 위한 키트 및 혈액 내 빌리루빈농도 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 키트를 이용한 예측 방법은 피검체의 혈액 내 빌리루빈 농도를 간편하고 효율적으로 예측할 수 있으며, 상기 방법에 의하여 혈액 내 빌리루빈 농도를 예측할 경우 손쉬운 검사를 통하여 고빌리루빈혈증 및 관련 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 용이하게 진단하여 이에 필요한 최적의 치료를 제공할 수 있다.

단일뉴클레오타이드 다형성, 빌리루빈, 고빌리루빈혈증, 길버트 증후군, 광범위 유전자 연관분석

Description

혈액내 빌리루빈 농도와 연관된 ＵＧＴ１Ａ６ 유전자 단일뉴클레오타이드 다형성 마커 및 그의 용도{UGT1A6 Gene SNP Markers Associated with Serum Bilirubin Concentration and Uses Thereof}

본 발명은 단일뉴클레오타이드 다형성(SNP)들로 이루어진 피검체의 혈액 내 빌리루빈 농도를 용이하게 예측 위한 키트 및 혈액 내 빌리루빈농도 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

SNP는 개체간 DNA에 존재하는 single base pair sequence variation으로 CNV와 더불어 가장 많이 존재하는 변이 가운데 하나이다. 주로 질병과 관련된 유전자를 발견하거나 정상인-환자간의 차이를 알기 위해 연구되며, 정상인 가운데에서도 SNP나 CNV등의 변이에 의해 다양한 표현형(phenotype)을 나타낼 수 있다는 사실들이 보고되고 있다[2; 3; 4; 5]. 이러한 다양한 표현형의 원인이 되는 유전자형(genotype)을 밝히기 위한 방법을 연관 분석이 최근 아주 활발히 적용되고 있다[6; 7; 8; 9; 10; 11]. 2007년부터 활발히 발표된 여러 GWAS 결과들로부터 여 러 다양한 표현형과 연관 있는 SNP들이 밝혀졌으며, 현재는 더욱 정확한 SNP를 탐색하기 위해 복제(replication)와 엄격한 p-value 임계값을 권장하고 있다[12].

빌리루빈(Bilirubin)은 혈액 성분 가운데 적혈구가 수명이 다해 파괴될 때 생성되는 황갈색의 색소(yellow breakdown product)로 널리 알려져 있다. 이렇게 생성된 빌리루빈은 알부민(albumin)과 결합하여 혈장에 존재하고(비결합(간접) 빌리루빈: unconjugated(indirect) bilirubin), 간을 거치면서 알부민과 분리가 된다. 분리된 후 글루쿠론산(glucuronic acid)과 작용하여 결합(직접) 빌리루빈(conjugated(direct) bilirubin)이 된 후, 십이지장으로 이동하여 유로빌리노겐(urobilinogen)으로 환원되어 배설(90%)되거나 재흡수(10%)되어 순환 후 소변으로 배설된다. 혈액 내 빌리루빈 농도가 간접 빌리루빈의 경우 0.8 ㎎/dl 이상, 직접 빌리루빈의 경우 0.4 ㎎/dl 그리고, 전체 빌리루빈의 경우 1.2 ㎎/dl 보다 높은 경우인 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia)은 황달 (jaundice)이나 길버트-모일렌그라흐트 증후군(Gilbert-Meulengrachts syndrome) 등을 유발할 수 있으며 동양인에서 특히 많이 연구되어지고 있다[13; 14; 15; 16; 17; 18; 19]. 지금까지 여러 연구를 통해 고빌리루빈혈증에 대한 메커니즘이 연구되어져 왔으며, 이러한 연구들은 고빌리루빈혈증과 관련된 유전자 및 조절 부위(regulatory region)에 대한 하플로타입(haplotype) 및 특정 SNP에 대한 연관성을 보여주었다[20; 21; 22; 23; 24; 25; 26]. 최근에는 빌리루빈과 관련된 UGT1A 유전자 클러스터(gene cluster) 외에도 다른 대사 유전자(metabolism genes)를 찾는 연구가 이뤄지고 있으며[27], 기존의 특정 유전자 마커(genomic marker)를 이용하여 스캔하는 방식의 연관성 분석(linkage studies)과 더불어[28; 29] GWAS 분석을 통해서도 활발하게 이루어지고 있다[30; 31].

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 피검체의 혈액 내 빌리루빈 농도를 용이하게 예측할 수 있는 유전자 마커를 개발하고자 피검체의 SNP를 심도 있게 비교 연구한 결과, 혈액 내 빌리루빈 농도가 높은 피검체에서 특이적으로 높은 빈도로 나타나는 SNP들을 발굴하였고, 이들 SNP들이 혈액 내 빌리루빈 농도를 매우 높은 정확도로 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 단일뉴클레오타이드 다형성(SNP)들을 포함하는 혈액 내 빌리루빈 농도를 예측하기 위한 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 혈액 내 빌리루빈농도 마커를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열 내지 제 4 서열, 제 8 서열 내지 제 11 서열 및 제 13 서열의 301번째 뉴클레오타이드; 제 5 서열의 314번째 뉴클레오타이드; 제 6 서열의 201번째 뉴클레오타이드; 제 7 서열의 234번째 뉴클레오타이드; 제 12서열의 308번째 뉴클레오타이드; 제 14 서열의 307 번째 뉴클레오타이드; 및 제 15 서열의 136번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)들로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 SNP를 포함하는 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 피검체의 혈액 내 빌리루빈 농도를 예측하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명자들은 피검체의 혈액 내 빌리루빈 농도를 용이하게 예측할 수 있는 유전자 마커를 개발하고자 피검체의 SNP를 심도 있게 비교 연구한 결과, 혈액 내 빌리루빈 농도가 높은 피검체에서 특이적으로 높은 빈도로 나타나는 SNP들을 발굴하였고, 이들 SNP들이 혈액 내 빌리루빈 농도를 매우 높은 정확도로 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

빌리루빈(Bilirubin)은 혈액 성분 가운데 적혈구가 수명이 다해 파괴될 때 생성되는 황갈색의 색소(yellow breakdown product)로 널리 알려져 있다. 이렇게 생성된 빌리루빈은 알부민(albumin)과 결합하여 혈장에 존재하고(비결합(간접) 빌리루빈: unconjugated(indirect) bilirubin), 간을 거치면서 알부민과 분리가 된다. 분리된 후 글루쿠론산(glucuronic acid)과 작용하여 결합(직접) 빌리루빈(conjugated(direct) bilirubin)이 된 후, 십이지장으로 이동하여 유로빌리노겐(urobilinogen)으로 환원되어 배설(90%)되거나 재흡수(10%)되어 순환 후 소변으로 배설된다. 혈액 내 빌리루빈 농도가 간접 빌리루빈의 경우 0.8 ㎎/dl 이상, 직접 빌리루빈의 경우 0.4 ㎎/dl 그리고, 전체 빌리루빈의 경우 1.2 ㎎/dl 보다 높 은 경우 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia)이라 하며, 고빌리루빈혈증의 경우 다양한 관련 질환을 유발할 수 있다[13; 14; 15; 16; 17; 18; 19]. 본 명세서에서 고빌리루빈혈증 관련 질환은 당업계에 공지된 다양한 질환을 포함하며, 바람직하게는 황달(jaundice), 길버트 증후군(Gilbert syndrome), 두빈-존슨 증후군(Dubin-Johnson syndrome), 로터 증후군(Rotor syndrome) 및 크리글러-나이잘 증후군(Crigler-najjar syndrome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 질환인 것이며, 가장 바람직하게는 황달 또는 길버트 증후군이다.

본 명세서에서, 용어 “황달(jaundice)”은 빌리루빈이 몸에 필요 이상으로 과다하게 쌓여 눈의 횐자위(공막)나 피부, 점막 등에 노랗게 착색되는 것을 의미한다. 요컨대, 황달은 빌리루빈이 체내에서 필요 이상으로 과다하게 생성되거나, 생성된 빌리루빈이 몸 밖으로 제대로 배출되지 못하는 경우 발생하게 된다. 황달이 발생했을 때 가장 먼저 나타나는 증상은 소변의 색깔이 짙어지는 것이다. 이는 혈액으로 넘쳐 나오는 빌리루빈이 소변으로 배설되기 때문이며, 빌리루빈으로 인해 소변이 진한 갈색을 띠게 된다. 이후 피부에 색소침착이 시작되면 가장 먼저 눈의 횐자위(공막)가 황색으로 변하는 것이 발견된다.

본 명세서에서, 용어 “길버트 증후군(Gilbert syndrome)”은 빌리루빈과 다른 지방 친화성(lipophilic) 분자를 결합시키는 효소인 글루쿠론산 전이효소(glucuronyltransferase)의 활성 감소로 인하여 유발된 고빌리루빈혈증을 의미한다. 길버트증후군은 약자로 GS라 하며, Gilbert-Meulengrachts syndrome이라고도 불려진다. 길버트증후군은 빌리루빈 수치의 증가가 원인이 되는 가장 보편적인 유전질환으로 인구의 약 5% 이상에서 발견되며, 일부 소화기 전문의(gastroenterologist)들은 인구의 약 10%에 가깝게 보기도 한다.

본 명세서에서, 용어 “두빈-존슨 증후군(Dubin-Johnson syndrome)”은 상염색체열성질환(autosomal recessive disorder)의 하나로 간 효소(ALT, AST)의 상승 없이 결합(직접) 빌리루빈 농도의 상승을 야기하는 질환을 의미한다. 이 질환은 간세포가 결합 빌리루빈을 담즙으로 분비하는 능력을 상실하는 것과 관련된다. 본 질환은 보통 증상이 없으나, 실험실 테스트에 기초하여 유아기에 진단될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “로터 증후군(Rotor syndrome)”은 원인불명의 양성 상염색체 열성 빌리루빈 질환(benign autosomal recessive bilirubin disorder)을 의미한다. 두빈-존슨 증후군과 임상적으로 유사하나 간 조직 내에 황갈색 색소 침착이 없는 점과 경구 담낭 조영술에서 담낭이 조영된다는 점에서 두빈-존슨 증후군과 차이가 있다.

본 명세서에서, 용어 “크리글러-나이잘 증후군(Crigler-najjar syndrome)”은 유아에게 있어서 때때로 뇌손상으로 까지 이어질 수 있는 유전성 희귀 빌리루빈 대사질환을 의미한다.

본 발명의 SNP를 포함하는 키트를 이용하여 혈액 내 빌리루빈 농도를 예측할 경우 손쉬운 검사를 통하여 상기의 고빌리루빈혈증 및 관련 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 용이하게 진단할 수 있으며, 이에 필요한 최적의 치료를 제공할 수 있다.

상기 SNP들은 UGT1A 유전자 클러스터가 모여 있는 곳에 위치하는 것으로, 본 발명자들은 상기 SNP들이 혈액 내 빌리루빈의 농도와 연관성이 높은 것을 입증하였다. 구체적으로, 상기 SNP들은 서열목록 제 1 서열에 포함된 rs6759892, 서열목록 제 2 서열에 포함된 rs7563561, 서열목록 제 3 서열에 포함된 rs6736508, 서열목록 제 4 서열에 포함된 rs10197460, 서열목록 제 5 서열에 포함된 rs6754100, 서열목록 제 6 서열에 포함된 rs6761246, 서열목록 제 7 서열에 포함된 rs2602380, 서열목록 제 8 서열에 포함된 rs7587916, 서열목록 제 9 서열에 포함된 rs10189426, 서열목록 제 10 서열에 포함된 rs11891311, 서열목록 제 11 서열에 포함된 rs6744284, 서열목록 제 12 서열에 포함된 rs887829, 서열목록 제 13 서열에 포함된 rs2219067, 서열목록 제 14 서열에 포함된 rs1453322, 서열목록 제 15 서열에 포함된 rs1817154 및 서열목록 제 16 서열에 포함된 rs4148323이다.

상기 SNP의 명명은 NCBI(the National Center for Biotechnology Information)에 의해 각각의 고유한 SNP에 부여된 공식적인 참조 SNP(Reference SNP; rs) ID 식별번호를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열 내지 제 15 서열에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)들로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 SNP를 포함하는 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 보다 바람직하게는 서열목록 제 1 서열의 301번째 뉴클레오타이드, 제 2 서열의 301번째 뉴클레오타이드, 제 3 서열의 301번째 뉴클레오타이드, 제 4 서열 의 301번째 뉴클레오타이드, 제 5 서열의 314번째 뉴클레오타이드, 제 6 서열의 201번째 뉴클레오타이드, 제 7 서열의 234번째 뉴클레오타이드, 제 8 서열의 301번째 뉴클레오타이드, 제 9 서열의 301번째 뉴클레오타이드, 제 10 서열의 301번째 뉴클레오타이드, 제 11 서열의 301번째 뉴클레오타이드, 제 12서열의 308번째 뉴클레오타이드, 제 13 서열의 301번째 뉴클레오타이드, 제 14 서열의 307번째 뉴클레오타이드 및 제 15 서열의 136번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성들로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 SNP를 포함하는 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열목록 제 1 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제 1 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 2 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 3 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 4 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 5 서열의 314번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 6 서열의 201번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 7 서열의 234번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 8 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다 형성은 A, 상기 서열목록 제 9 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 10 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 11 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 12 서열의 308번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 13 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 14 서열의 307번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 15 서열의 136번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G인 것이다.

상기 SNP의 지노타입(genotype)은 전체 빌리루빈 및 직접 빌리루빈의 농도와 높은 연관성을 나타내었으며(참고: 표 2 및 3), 예를 들어, SNP rs6759892(T/G)에 대한 지노타입의 경우 전체 빌리루빈 농도가 약 1.5배의 차이를 나타낸 바(GG:TT=1.008135593:0.686305732), 본 발명의 키트를 이용할 경우 높은 정확도로 혈중 빌리루빈 농도를 예측할 수 있다(참고: 표 5).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 16 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(rs4148323)을 포함하는 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함한다.

상기 서열은 서열목록 제 1 서열 내지 제 15 서열에 위치하는 SNP를 포함하는 키트에 추가되어 혈액 내 빌리루빈 농도의 예측도를 높일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드는 핵산 증폭을 위한 프라이머 또는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 검출하기 위한 프로브인 것이다.

본 명세서에서 용어 "핵산"은 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).

본 발명은 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 16 서열에서 각 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중가닥의 gDNA에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산은 피검체(예를 들어, 인간)의 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻는다.

본 발명에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 혈액의 경우, 예를 들어, QIAamp DNA Blood Maxi Kit를 이용하여 gDNA를 분리할 수 있다. 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 진핵생물부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명에 있어서, 단일뉴클레오타이드다형성(SNP)의 지노타이핑(genotyping) 방법은 매우 다양하며 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 아피메트릭스 SNP 칩(Affymetrix SNP chip)을 이용한 방법, PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)법, PCR-SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)법, PCR-SSO(Specification Sequence Oligonucleotide)법, 도트혼성화법, PCR-SSO와 도트혼성화법을 조합한 ASO(Allele Specific Oligonucleotide) 혼성화법, TaqMan 법, 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법, Invader 법, SNaPShot 법, MassArray 법, 동적 대립유전자 특이성 혼성화(Dynamic Allele-Specific Hybridization, DASH) 법, 마이크로플레이트 어레이 대각 겔 전기영동(Microplate Array Diagonal Gel Electrophoresis, MADG) 법, GoldenGate 분석법, SNPlex 법 및 BeadArray 법을 포 함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

TaqMan 방법은 Tap 폴리머라아제의 5'-뉴클레아제 성질을 이용하는 방법으로, 반응에는 한 쌍의 TaqMan 프로브와 한 쌍의 PCR 프리이머가 사용된다. 5'-말단에는 리포터 염료(reporter dye)가, 3'-말단에는 흡광 염료(quencher dye)가 공유결합 되어있는 TaqMan 프로브를 이용하며, 다형성 부위(polymorphic site)와 TaqMan 프로브간의 매치(match) 및 미스매치(mismatch)의 차이를 형광물질을 이용하여 감별하는 방법이다. TaqMan 프로브에 리포터 염료 및 흡광 염료가 모두 결합되어 있을 때는 리포터 염료가 흡광 염료에 의해 빛을 발하지 못한다. 그러나 SNP이 위치한 부위와 상보적으로 완전히 일치하는 TaqMan 프로브는 PCR의 어닐링(annealing) 단계에서 결합되고, 신장(extension) 단계에서 Taq 중합효소의 5'-뉴클레아제 활성도에 의하여 5'-말단부의 리포터 염료(FAM 또는 VIC)가 흡광 염료로부터 분리되어 고유한 형광을 나타낸다. 프로브가 표적(target) SNP와 미스매치되면 프로브가 주형으로부터 떨어져 나가기 때문에 더 이상의 반응이 진행되지 않는다. 이 방법은 SNP 이외에도 아주 작은 염기서열의 삽입(insertion)이나 결실 (deletion)도 분석할 수 있다.

미국 Illumina사의 GoldenGate 지노타이핑 분석법은 genomic DNA를 주형으로 사용하여 프라이머 신장과 증폭 단계를 통하여 많은 수의 멀티플렉싱(multiplexing, 1,536-plex)이 가능한 SNP 지노타이핑 방법이다. SNP 지노타이핑을 위해 주형 DNA는 비오틴(biotin)으로 표지하여 잉여의 혼성화 용액(hybridization solution)과 SP-PMPs(streptavidin conjugated paramagnetic particles)로부터 정제된다. 정제된 DNA 주형에 세 가지의 올리고뉴클레오타이드 (oligos)가 첨가되는데 두 가지의 oligo는 SNP 부위의 각각의 대립유전자형에 특이적인 ASOs(Allele-Specific oligos)이고 다른 하나의 oligo는 SNP 부위의 몇 base pair downstream에 혼성화되는 LSO(Locus-Specific Oligo)이다. oligo 혼성화 후에 혼성화 되지 않은 oligos는 제거되며, 대립유전자-특이 신장(allele-specific extension) 후 라이게이션 반응이 수행된다. 라이게이션된 산물을 형광물질로 표지된 universal PCR 프라이머 P1(Cy3), P2(Cy5)와 P3로 PCR 증폭시킨 후에 단일가닥(single-strand)으로 만든다. 단일가닥의 염색 표지된 DNA는 unique address 시퀀스를 통해 상보적인 베드타입(bead type, Array Matrix 또는 BeadChip)에 혼성화되고 형광물질의 시그널을 읽어 자동으로 지노타입을 결정하게 된다. GoldenGate 분석은 1,500여개까지의 SNP을 동시에 지노타이핑할 수 있는 멀티플렉싱 분석이 가능하고 정확하게 타이핑은 가능하지만, 모든 SNP 부위에 대하여 분석이 가능한 것은 아니다.

Affymetrix GeneChip 분석법은 수십만 개의 SNP을 칩-기반으로 하여 동시에 지노타이핑할 수 있는 방법으로 최근 Affimetrix사에서 개발한 것이다. 이 분석방법의 구체적인 일 실시예에 따르면, genomic DNA는 제한효소(StyI 및 NspI)로 우선 절단되고 생성된 모든 단편은 크기에 관계없이 4 bp 돌출부(overhang)를 인지하는 어댑터(adaptor)에 결합하게 된다. 어댑터가 붙여진 DNA 단편을 어댑터의 염기서열을 인지하는 프라이머로 증폭되며, PCR 증폭조건은 200-2,000 bp 크기의 단편을 선택적으로 증폭시키기 위해 최적화되어 있다. 증폭된 DNA는 이후에 조 각(fragmentation)으로 잘려진 후에 표지(labeling)되어 GeneChip 어레이에 혼성화된다. 어레이에는 A 대립유전자 염기서열과 B 대립유전자 염기서열에 완전 매치(perfect match)로 대응되는 25-mer 프로브가 합성되어 있으며 결합의 특이성을 결정하기 위하여 각각의 25-mer 중앙에 위치하는 단일 염기쌍 미스매치(single base pair mismatch)도 포함되어 있어 지노타이핑의 정확성을 점검하는데 사용되고 있다. 최근에는 복합형질 질환의 연관성 연구에 Affymetrix사의 500K SNP 칩(약 50만 개 이상의 SNP 분석 가능)을 이용하여 광범위 유전자 SNP 지노타이핑(genome-wide SNP genotyping)을 수행하여 두 군 간의 유전체 상의 유전적 변이 양상을 찾아낼 수 있다. Affymetrix GeneChip 분석은 자동화되어 수행하기 간편하고 대량의 멀티플렉싱 능력을 보유하고 있기 때문에 광범위 유전자 SNP 지노타이핑이 가능한 장점이 있으나 SNP 칩에 올려진 SNP 부위가 제한효소에 의해 특정 부위의 SNP 부위만이 선별되어 있고 연구자가 개별적인 필요성에 의해 자체 제작하기는 매우 어려운 단점을 가지고 있다. 최근에는 광범위 유전자 SNP 지노타이핑 칩을 이용하여 유전체의 증폭(amplification) 또는 결실(deletion)에 의한 유전자의 복제수 변이(copy number variation) 및 이형접합체의 분포 상황(예; LOH) 등을 조사할 수 있게 되었다. 이러한 추가적인 분석기능은 특히 유전체 상에서 많은 변화를 유발하는 암 세포의 유전적 변화에 대한 특성규명에 유용하게 활용되고 있다.

지노타이핑이 끝나면, 연관 분석(association analysis)을 수행한다. 본 발명에 있어서, SNP를 연관 분석하는 방법은 매우 다양하며 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, SNP 칩을 이용하여 인간유전체 에 널리 퍼져 있는 대량의 SNP을 조사하는 이른바 광범위-유전자 연관 분석(genome-wide association study, GWAS) 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 방법의 경우 발생될 수 있는 임의적인 오류(random error)를 방지하게 위하여 "다단계 접근방법(multi-stage approach method)"을 활용할 수 있다.

예를 들어, 광범위 유전자 연관분석(GWAS)을 이용하여 본 발명의 SNP들을 선별하는 경우, 전체 빌리루빈 및 직접 빌리루빈과 연관된 유의한 SNP들을 선별 및 복제하고, 다단계 접근방법에 의하여 더욱 유의한 SNP를 선별할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기와 같은 방법에 의하여 최종 16 개의 SNP들을 선별하였다(참고: 표 2).

또한, 본 발명이 포함하는 SNP 중 UGT1A6의 첫 번째 엑손에 존재하는 비동의적 코딩(nonsynonymous coding) 타입인 rs6759892의 경우, 33개의 SNP들과 연관 비평형(linkage disequilibrium) 양상을 보인다(참고: 표4).

본 명세서에서 사용되는 용어 "연관비평형(Linkage Disequilibrium)" 이란 집단유전학에서 반드시 동일 염색체상에 존재하지는 않는 둘 이상의 유전자좌(loci)에서의 대립유전자의 비-무작위적 연관(non-random association)을 의미한다. 즉, 연관비평형은 서로 다른 위치의 대립형질들간의 결합의 척도로서, 만약 각 유전자가 완전히 독립적으로 배합된다면, 유전자 집합은 아마도 연관 평형(linkage equilibrium)을 유지할 것이나, 어떤 대립유전자들은 서로 같이 발견되는 예가 많으며 즉, 무작위적으로 뒤섞이지 않으며, 이런 대립유전자는 연관 비평 형상태에 있다. 이러한 연관 비평형 상태는 대립유전자들이 서로 근접하여 위치하거나, 대립형질들이 서로 모여 있으면 더 유리한 경우에 자연선택의 결과로 나타나는 것으로 해석되고 있다.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 서열목록 제 1 서열 내지 제 16 서열의 SNP를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach , IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이러한 유전자 증폭은 서열목록 제 1 서열 내지 제 16 서열의 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍(primer pair)을 기본적으로 이용한다.

본 발명의 명세서에서 “프라이머(primer)”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.

프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭(참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al.(EP 329,822)), 리가아제 체인 반응(LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응(Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페어 체인 반 응(EP 439,182), 3SR(Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA(U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭 단계에 따라 증폭한다.

증폭기술이 적용되는 경우에, 본 발명의 SNP 염기를 확인하기 위해 적합한 프라이머를 디자인하는 것이 중요하다.

PCR에 의한 증폭 반응의 조건 및 사용되는 시약과 효소는 당업계에서 통상적으로 공지된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 혈액 내 빌리루빈 농도의 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검체의 생물학적 시료에 있는 서열목록 제 1 서열 내지 제 4 서열, 제 8 서열 내지 제 11 서열 및 제 13 서열의 301번째 뉴클레오타이드; 제 5 서열의 314번째 뉴클레오타이드; 제 6 서열의 201번째 뉴클레오타이드; 제 7 서열의 234번째 뉴클레오타이드; 제 12서열의 308번째 뉴클레오타이드; 제 14 서열의 307번째 뉴클레오타이드; 및 제 15 서열의 136번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)들로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 SNP를 포함하는 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 방법을 통해 피검체의 혈액 내 빌리루빈농도 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 마커를 검출하는 방법은 상기 SNP를 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한 다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단일뉴클레오타이드 다형성은 서열목록 제 1 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 마커는 서열목록 제 16 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함하는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 빌리루빈 농도의 예측은 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 황달(jaundice), 길버트 증후군(Gilbert syndrome), 두빈-존슨 증후군(Dubin-Johnson syndrome), 로터 증후군(Rotor syndrome) 또는 크리글러 나이잘 증후군(Crigler-najjar syndrome)을 진단하기 위한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제 1 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 2 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 3 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 4 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 5 서열의 314번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 6 서열의 201번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 7 서 열의 234번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 8 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 9 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 10 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 11 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 12 서열의 308번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 13 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 14 서열의 307번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 15 서열의 136번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G인 것이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 단일뉴클레오타이드 다형성(SNP)들로 이루어진 피검체의 혈액 내 빌리루빈 농도를 용이하게 예측 위한 키트 및 혈액 내 빌리루빈농도 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 키트를 이용한 예측 방법은 피검체의 혈액 내 빌리루빈 농도를 간편하고 효율적으로 예측할 수 있으며, 상기 방법에 의하여 혈액 내 빌리루빈 농도를 예측할 경우 손쉬운 검사를 통하여 고빌리루빈혈증 및 관련 질환의 발병 여 부 또는 발병 가능성을 용이하게 진단하여 이에 필요한 최적의 치료를 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

1. DNA 시료 수집

혈액 시료는 한국한의학연구원(KIOM) 및 협력병원을 방문한 건강한 정상인들로부터 추출하였다. 연구 계획은 한의학연구원의 내부검토위원회에서 승인받았으며, 피실험자들로부터 동의를 얻었다. 혈액 내 지놈 DNA는 QIAamp DNA Blood Maxi Kit(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 얻었다. DNA 농도 및 순도는 NanoDrop DN-1000 spectrophotometer(NanoDrop Technologies, Rockland, DE)를 사용하여 측정하였다.

2. 빌리루빈(Bilirubin)의 농도 측정

혈청 중 전체 빌리루빈은 콜산나트륨의 존재 하에 pH 7.2에서 구리이온에 의해 빌리베르딘(biliverdin)으로 산화된다. 이 때 총 빌리루빈의 흡광도가 450 ㎚에서 감소한다. 이 반응에서 흡광도의 감소로부터 전체 빌리루빈 값을 구했다. 한편, 혈청 중 직접 빌리루빈은 구연산, 유산완충액의 존재 하에 pH 3에서 구리이온에 의해 빌리베르딘으로 산화된다. 이때 직접 빌리루빈의 흡광도가 450 ㎚에서 감소하는데, 이 반응에서 흡광도의 감소로부터 직접 빌리루빈 값을 구했다.

3. Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 5.0 실험

SNP 맵핑 분석(mapping assay)은 Affymetrix Genome-Wide Human SNP Nsp/Sty Assay Kit 5.0 chip 실험 프로토콜을 따라 수행하였다. 먼저 지놈 DNA(500 ng)를 NspⅠ 및 StyⅠ 제한효소(NEB, MA)를 사용하여 절단하고 절단된 말단의 4 bp를 인식하는 어댑터(adaptor)를 붙여주었으며, 어댑터 염기서열을 인식하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다(PCR Primer 002). PCR은 200-1,100 bp 크기를 증폭하는데 최적화된 조건으로 수행하였다. Nsp I 및 Sty I 각각의 제한효소로 절단하고 어댑터를 이용하여 PCR 증폭한 두 시료는 합해진 후, clean-up plate (Clontech, CA)를 이용하여 정제하였다. 정제 후, 절편화되고, dye(terminal deoxy-nucleotidyl transferase(TdT), Affymetirx)를 붙인 후, SNP 5.0 어레이에 50℃, 60 rpm의 조건에서 16-18 시간 동안 혼성화시켰다. 다음 날 각 어레이를 Affymetrix fluidics station 450을 이용하여 세척 및 염색하고, Affymetrix GeneChip Scanner 3000을 이용하여 스캔하였다. 신호세기(Signal intensity) 데 이터는 먼저 Dynamic Model(DM) 알고리즘을 사용하여 분석하였고, 86% 이상의 call rate를 가지는 시료들은 합쳐진 후 BRLMM-P 알고리즘으로 분석하였다. 데이터 분석은 Affymetrix의 Genotyping Console software(GTC 3.0)를 사용하여 수행하였다.

4. 광범위 유전자 SNP 연관 분석(Genome-wide SNPs association Analysis)

연관 분석은 PLINK software(version 1.05)[32]를 사용하여 수행하였다. 전체 데이터세트를 두 집단(1차 및 2차)으로 나누고, 1차, 2차 단계 각각에서 광범위 유전자 연관 분석(genome-wide association analysis)을 수행하여 복제되는 SNP를 선별하였다. 또, 1, 2차 합한 원래 데이터세트에서도 1차, 2차 각각에서 발견한 SNP가 재현되는지를 조사하였다. 혈액 내 빌리루빈 농도와의 정량적인 분석을 위해 선형 회귀분석(linear regression analysis)을 수행하였는데, 나이와 성별 두 변수로 보정한 후 회귀분석을 수행하였다. 1차, 2차 GWAS 분석에서 1차, 2차 GWAS는 p-value의 임계치를 10^-5 을 기준으로 필터링하였으며, 최종적으로 엄격한 기준으로 10^-7을 적용하여 SNP를 선별하였다[11; 33]. WGAViewer software[34]를 이용하여 유의한 SNP 및 연관 유전자에 대한 주석(annotation)을 실시하였고, 또 연관 불균형(linkage disequilibrium; LD) 양상을 조사하였다.

실험결과

본 발명자들은 건강한 정상 한국인 1,220명에 대해 광범위 유전자 연관분석 을 실시하였는데, GWAS 결과의 재현성을 확인하기 위해, 1차 518명, 2차 702명 그리고 이를 합한 3차 1,220명으로 구분하고 복제 여부를 살펴보았다(표 1).

	KS1(1 차)	KS2(2 차)	Combined(3 차)
샘플 수	518	702	1220
남자(%)	42.28	37.18	39.34
나이(년)	61.45 ± 15.30	61.76 ± 15.87	61.64 ± 15.64
전체 빌리루빈(mg/dL)	0.69 ± 0.30	0.79 ± 0.32	0.75 ± 0.32
직접 빌리루빈(mg/dL)	0.14 ± 0.05	0.15 ± 0.06	0.14 ± 0.06

연관 분석을 수행한 전체 빌리루빈(도 1 및 도 3)과 직접 빌리루빈(도 2) 모두에서 유의한 SNPs가 선별되었고 복제되었다. 전체 빌리루빈의 경우, P-value(≤ 10^-5)를 기준으로 1차에서는 55 개의 SNPs, 2차에서는 95 개의 SNPs가 그리고 3차에서 70 개의 SNPs가 선별되었다. 세 단계에서 공통된 SNPs는 17 개였으며, p-value ≤ 10^-7을 기준으로 다시 필터링하여, 최종 16 개의 SNPs가 선별되었다(표 2). 표 2는 전체 빌리루빈, 표 3은 직접 빌리루빈과 연관된 SNP를 나타낸다.

rsNumber	chr	position	1 ^st p-value	2 ^nd p-value	Combined p-value	type
rs6759892	2	234266408	2.32E-17	1.61E-08	4.54E-21	NONSYNONYMOUS
rs7563561	2	234263730	2.74E-17	4.63E-08	1.46E-20	INTRONIC
rs6736508	2	234260486	3.18E-17	1.65E-08	6.49E-21	INTRONIC
rs10197460	2	234253929	1E-16	5.28E-08	4.24E-20	INTRONIC
rs6754100	2	234260953	1.2E-12	0.000000149	1.46E-16	INTRONIC
rs6761246	2	234268178	2.32E-12	8.75E-08	9.21E-17	INTRONIC
rs2602380	2	234249045	1.19E-11	0.000000136	5.46E-16	INTRONIC
rs7587916	2	234251553	1.59E-11	0.000000167	8.5E-16	INTRONIC
rs10189426	2	234248229	1.99E-10	4.75E-08	3.29E-16	INTRONIC
rs4148323	2	234333883	6.34E-10	6.14E-08	3.99E-16	NONSYNONYMOUS
rs11891311	2	234304049	6.59E-09	1.12E-09	3.18E-15	INTRONIC
rs6744284	2	234290036	7.94E-09	1.57E-09	3.88E-15	INTRONIC
rs887829	2	234333309	9.58E-09	2.81E-11	6.94E-17	INTRONIC
rs2219067	2	234176744	1.14E-08	0.00000498	5.32E-12	UPSTREAM
rs1453322	2	234230177	1.68E-08	1.09E-08	6.85E-16	INTRONIC
rs1817154	2	234225330	0.00000245	9.77E-08	2.09E-12	INTRONIC

Chr, chromosome; P-value for Korean samples were based on linear regression model corrected for age, sex.

rsNumber	chr	position	1 ^st p- value	2 ^nd p- value	Combined p- value	type
rs6759892	2	234266408	2.32E-17	1.61E-08	4.54E-21	NONSYNONYMOUS
rs7563561	2	234263730	2.74E-17	4.63E-08	1.46E-20	INTRONIC
rs6736508	2	234260486	3.18E-17	1.65E-08	6.49E-21	INTRONIC
rs10197460	2	234253929	1E-16	5.28E-08	4.24E-20	INTRONIC
rs6754100	2	234260953	1.2E-12	0.000000149	1.46E-16	INTRONIC
rs6761246	2	234268178	2.32E-12	8.75E-08	9.21E-17	INTRONIC
rs2602380	2	234249045	1.19E-11	0.000000136	5.46E-16	INTRONIC
rs7587916	2	234251553	1.59E-11	0.000000167	8.5E-16	INTRONIC
rs10189426	2	234248229	1.99E-10	4.75E-08	3.29E-16	INTRONIC
rs4148323	2	234333883	6.34E-10	6.14E-08	3.99E-16	NONSYNONYMOUS
rs11891311	2	234304049	6.59E-09	1.12E-09	3.18E-15	INTRONIC
rs6744284	2	234290036	7.94E-09	1.57E-09	3.88E-15	INTRONIC
rs887829	2	234333309	9.58E-09	2.81E-11	6.94E-17	INTRONIC
rs2219067	2	234176744	1.14E-08	0.00000498	5.32E-12	UPSTREAM
rs1453322	2	234230177	1.68E-08	1.09E-08	6.85E-16	INTRONIC
rs1817154	2	234225330	0.00000245	9.77E-08	2.09E-12	INTRONIC

우리딘 다이포스페이트 글리코실트랜스퍼라아제(Uridine diphosphate glycosyltransferase; UGT1A) 유전자 패밀리(isoform) 클러스터를 중심으로 2번 염색체의 234,230,177 bp 부터 234,333,883 bp 까지 약 100 kb에 걸쳐 유의한 SNPs들이 연속적으로 관찰되었으며, 강한 연관성을 보여주었다(도 4a-4b).

이 중 UGT1A1 유전자의 첫번째 엑손에 속해있는 rs4148323(G>A) 같은 경우 이미 여러 연구를 통해 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia)과 연관이 있는 것으로 밝혀졌으며[27; 35; 36; 37], 또한, UGT1A1 유전자의 프로모터 지역(2q34-37)의 (TA)n 반복의 다형성(polymorphism)은 고빌리루빈혈증 증후군(hyperbilirubinemic syndrome)인 길버트 증후군(Gilbert syndrome)에 영향을 준다는 보고도 있다.

본 연구에서 새로 발견한 SNP인 rs6759892(T/G)의 경우, UGT1A6의 첫번째 엑손에 존재하는 비동의적 코딩 타입(nonsynonymous coding thpe)으로써 직접 빌리루빈에서도 동일하게 발견되었으며, 이와 연관된 33 개의 SNPs가 강한 연관불균형(r2 > 0.8) 양상을 보여주었다(표 4).

SNP	R-square	D-prime
rs10189426	0.88	1.00
rs12615708	0.94	1.00
rs7571915	1.00	1.00
rs10202865	1.00	1.00
rs10197460	1.00	1.00
rs10167119	1.00	1.00
rs7586110	1.00	1.00
rs7577677	1.00	1.00
rs4347832	1.00	1.00
rs4261716	1.00	1.00
rs13002774	1.00	1.00
rs4553819	1.00	1.00
rs11902131	1.00	1.00
rs6753320	1.00	1.00
rs6736508	1.00	1.00
rs6753569	1.00	1.00
rs6736743	1.00	1.00
rs10168155	1.00	1.00
rs10175809	1.00	1.00
rs10168333	1.00	1.00
rs10168416	1.00	1.00
rs10173355	1.00	1.00
rs11680450	1.00	1.00
rs10171367	1.00	1.00
rs10179094	1.00	1.00
rs7563561	1.00	1.00
rs7608175	1.00	1.00
rs12623271	1.00	1.00
rs10445704	1.00	1.00
rs13015720	1.00	1.00
rs1105880	1.00	1.00
rs2070959	1.00	1.00
rs1105879	1.00	1.00

특이한 점으로 이 SNP는 기존에 알려진 UGT1A1 의 rs4148323 보다 높은 p-value를 3 차에서 모두 나타내고 있다.

SNP rs6759892(T/G)에 대한 지노타입(genotype)과 전체 빌리루빈 농도 사이의 연관성은 다음 표 5와 같이 분석되었다.

평균간 차이		지노타입	전체 빌리루빈 농도
지노타입 기준		AA	1.008135593
		AB	0.814195122
		BB	0.686305732
allele 기준	우성(dominant)	G(AA 또는 AB)	0.838592751
	우성(dominant)	T(BB)	0.686305732
	열성(recessive)	G(AA)	1.008135593
	열성(recessive)	T(AB 또는 BB)	0.736820809

UGT1A 클러스터에 속하는 여러 UGT1A 변이들(9가지 UGT1A gene, 4개의 pseudogene)은 동일한 엑손 2, 3, 4, 5를 가지고, 서로 다른 엑손 1을 사용함으로써 서로 다른 단백질을 만들어 낸다. 이 때, 각 단백질이 결합하는 기질 특이성을 결정하는 것이 바로 엑손 1 부위의 염기 서열이다. 현재까지 밝혀진 바로는 UGT1A1과 UGT1A4만이 빌리루빈과 인 비트로에서 결합할 수 있고, 이 중 UGT1A1이 실제 인체 내에서 빌리루빈 분해에 관여하는 유일한 효소로 알려져 있다[38].

본 실험에서 흥미 있는 점은 인 비보에서 빌리루빈 분해에 관여한다고 알려져 있는 UGT1A1뿐 아니라 UGT1A6의 엑손 및 프로모터 부분에서 빌리루빈 농도와 강한 연관성을 보이는 SNP를 발견한 점이다. 실제로는 전체 빌리루빈과 직접 빌리루빈 모두에서 UGT1A1 보다는 UGT1A6 부분에서 더 강한 연관을 보였다.

혈액 내 빌리루빈 농도는 간 기능과 혈액 이상을 조사하는 지표 중 하나로 쓰이며, 빌리루빈 농도가 높은 고빌리루빈혈증은 황달(jaundice)을 유발할 수 있다. 한편, 최근에는 빌리루빈이 효과적인 항산화제 역할을 하여 동맥경화증과 같은 질병에 예방 효과가 있는 것으로 밝혀지고 있는 등, 그 의학적 중요성이 계속 밝혀지고 있다. 지금까지 여러 연구를 통해 고빌리루빈혈증에 대한 메커니즘이 연구되어져 왔으며, 이러한 연구들은 고빌리루빈혈증과 관련된 유전자 및 조절부위에 대한 하플로타입 및 특정 SNP에 대한 연관성을 보여주었다[15; 16; 17; 18; 19; 20; 21]. 최근에는 빌리루빈과 관련된 UGT1A 유전자 클러스터 외에도 다른 대사 유전자를 찾는 연구[29]가 이뤄지고 있으며, 기존의 특정 유전자 마커를 이용하여 스캔하는 방식의 연관 분석과 더불어[30; 31] GWAS 분석을 통해서도 활발하게 이루어지고 있다[32; 33].

본 실험에서 밝힌 UGT1A6 유전자의 SNP는 기존에 밝혀진 UGT1A1 유전자의 엑손 1 코딩 부위 혹은 프로모터 부위의 변이보다도 더 혈중 빌리루빈 농도와 연관이 있는 것으로 밝혀져 개인의 빌리루빈 농도 차이를 이해하고 예측하는 데 유용하게 쓰일 것으로 기대된다. 한편, UGT1A1의 유전적 변이는 이리노테칸(irinotecan)과 같은 항암제에 대한 부작용을 예측하는데 있어 임상적으로 쓰이고 있는데[39; 40; 41], 본 연구에서 밝힌 UGT1A6 유전자의 SNP도 비슷하게 약물 반응성을 예측하는 마커로 쓰일 수 있으리라 기대되는데, 많은 후속 연구가 필요할 것으로 기대된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1은 전체 빌리루빈 농도를 이용한 다단계 GWAS의 광범위 유전자 p-value 플롯(Genome-wide p-value plot of multi-stage GWAS)을 나타내는 도면이다. 도면에서 첫 번째 패널은 1단계, 중간 패널은 2단계, 마지막 패널은 3단계를 나타낸다. X 축은 SNP의 위치를, Y 축은 p-value의 로그 값을 나타낸다.

도 2는 직접 빌리루빈 농도를 이용한 다단계 GWAS의 광범위 유전자 p-value 플롯(Genome-wide p-value plot of multi-stage GWAS)을 나타내는 도면이다. 도면에서 첫 번째 패널은 1단계, 중간 패널은 2단계, 마지막 패널은 3단계를 나타낸다. X 축은 SNP의 위치를, Y 축은 p-value의 로그 값을 나타낸다.

도 3은 전체 빌리루빈의 다단계 GWAS에서 연관분석의 염색체 이데오그램(ideogram)을 나타내는 도면이다. 첫 번째 패널은 1단계, 중간 패널은 2단계, 마지막 패널은 3단계를 나타낸다. 빨간색 실선은 유의미한 p-value(≤ 10^-7) 값을 갖는 SNP를 나타낸다. SNP에 대한 상세한 정보는 표 1에 나타내었다. X 축은 SNP의 위치를 나타내며, Y 축은 p-value의 로그 값을 나타낸다.

도 4a-4b는 전체 빌리루빈을 이용하여 가장 연관성 있는 SNP 주위로 연관 시그널 및 연관 불균형(linkage disequilibrium; LD)을 포함한 Gene view 데이터를 나타낸 도면이다. UGT1A6 유전자에서 가장 연관성 있는 비-동의적(non-synonymous) SNP rs6759892는 28개 intronic SNP, 하나의 5’-UTR SNP, 두 개의 비-동의적 SNP(rs2070959, rs1105879) 및 두 개의 동의적(synonymous) SNP와 연관 불 균형을 나타낸다. 상기 플롯은 WGAViewer software version 1.25z를 이용하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> UGT1A6 Gene SNP Markers Associated with Serum Bilirubin Concentration and Uses Thereof <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 taacttttca gagagggaga agcagacttg tggagctgaa gagaaacacc cagaagctca 60 ggtgaaagct gacacggcca tagttggttc atattaacca tgtgattaaa atggttaaat 120 attaatttgg gttcttacat atcaaagggt aaaattcaga gcaagggaga ggtagacagg 180 acctgtgaaa agcagtggtt agtttaggga aaatacctag gagccctgtg atttggagag 240 tgaaaactct ttattaccgt tgttacttta actctttcca ggatggcctg cctccttcgc 300 kcatttcaga gaatttctgc aggggttttc ttcttagcac tttggggcat ggttgtaggt 360 gacaagctgc tggtggtccc tcaggacgga agccactggc ttagtatgaa ggatatagtt 420 gaggttctca gtgaccgggg tcatgagatt gtagtggtgg tgcctgaagt taatttgctt 480 ttgaaagaat ccaaatacta cacaagaaaa atctatccag tgccgtatga ccaagaagag 540 ctgaagaacc gttaccaatc atttggaaac aatcactttg ctgagcgatc attcctaact 600 g 601 <210> 2 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctgacttctg cagccccacc tcacagccta tcaaatagat taaattgctc ctgcatctta 60 tgtcacatat gtctttgtaa cttggtgagc taatctgtag tggattcatt gacatgtagt 120 tatgttttta tagccatttc ataaaatatt cataaattca atgtttgcca ttttagtatt 180 ctagattcag caaatttctt attttaagtc tcaaacattt tgcaggtcct ttgaaatctt 240 gcaggtgggt cctggctcca ttacttatgg gtcgtaggtc atacaagggt ctgaaagagt 300 kagcacctta gaagcaaacc tctccatagg gtccacgttt ccagaccttc ctattcccaa 360 catgaaatta ccttcatgca catctttggg tctctcctct attcaaaatg ccagctatcc 420 tccatttact ttttgggaaa tctgctcttg ccaacagaga tttgttttat cttaggatct 480 acttctttca ccccactgga atatgtccca agcctgagtc attcagcctg cagcaatccc 540 tgagaaaaaa aaaaaatcgg cctttgcctg gacactcaag tgatacctga ggacaccttg 600 a 601 <210> 3 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gttacttttc cctacctatt ttattcctct tttctatctc cttccccacc tatgtctttc 60 ctttctgtca ctttttctgc atgattcctg ccccagaggg gtcaacaaga aagggcatcc 120 cactggctga ctcatgcagg gaagctgtca gtaattaatt agcaaggcag ggaagttgta 180 ccccaagtct tggtttcaac actagaggac tttaggaggt ggttcaatgt agtgtttgag 240 cacgcggacc ctggagtcct ccaagcctga tttcataagt acttcagctg tgacacttgc 300 rtaaacttgg gtaaaaactc agcgttatct agattaaata tgataataca tgcagatgac 360 tggcatgtgg ctatgaatca gcaatacccg taattgggtg ggtgatatgc attttccagc 420 acaattatct ccaacctcca caagattaat gatcttaacc atgcattcag actctcttca 480 gaacaacatg gtgagatatc aatattgtct tcttgatgca agtttccctt gaatgattta 540 aacttcagat gggtggactg tctccttagg gagaatttgc aaattaaata taataaaagc 600 t 601 <210> 4 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tacactaaac atgatgaaaa atacagtaga accataagag atcatttttt actctgacat 60 gcaatttact agagagaaga aacgcgcaga gggtataaac gtcatatcac atgcatttag 120 gccacacttt agctccctgc aatagcaaca ggaggtagca acaaaattat tatagtagtg 180 tagtatgtac tagaggaaag tgactaagca aatgtctagt accagttagg gtgtcctgga 240 aggaaccatc ttgtgcttct acaagaatta tgccctgagg ttggctgttg aatccctcac 300 kaaatgctcc tcagtgtgtt gcctaacaca cactgctgag ctcacccatt aaaatctgca 360 tgatggaatt cagcccaatg caatgagaat tcccatggac ttcctctgtg caaggcaaag 420 catgggtgct gtggaaggag gatgaaaaca ggtagaagat gtaatctcat cctcaagggg 480 tgctcggtag aatggaggaa a 501 <210> 5 <211> 614 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ttaaccatgc attcagactc tcttcagaac aacatggtga gatatcaatg ttgtcttctt 60 gatgcaagtt tcccttgaat gatttaaact tcagatgggt ggactgtctc cttagggaga 120 atttgcaaat taaatataat aaaagctaac atatattgga ggcttaccgt gtaccaggtg 180 ctaccctaag tatttacatg gaagctggca ttattggcag acctattttt cagatgatga 240 aactgaggca cagaggggtt gagtgacttg cccaaggtta tgcctcaagt aagtggggga 300 gccagaattc aagmccatac attctttgta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaggaaaga 360 aaaaaaggct gagtgtggtg gctcacacat gtaatcacag cactttagga ggccaaggca 420 ggaagatcac ttaagcccag gagtttgaga ccagcctgga caacataggg agacactgtc 480 tctacaaaaa atgttttaaa aattagctgg gcctggtggc atatgcctgt ggtcccagct 540 actcaggagg ctgaggtggg aggatctcct gtaaacccag gaggttaagg ctgcagtaag 600 ccatgactat tcca 614 <210> 6 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 aagggcttca ggcaactccc tctatctttt atgcctcaat tttcttttcc agttcctttt 60 ttatcagaga gaaagcctca aacaggtccc aaagaccctt acctctcttc tttacacctg 120 ctgatttctc tgttaacaat ttgaacagtt ggcagtagcc actgtgaaaa ggcaagggtg 180 aggggatggg gataactgaa mtggttccag ggattctggg gcatgaaata aaaacataga 240 atgtcaggat tcttttaatt gggacataat atagttgtac acatttgggg ggttcatgtg 300 atattttgat acacgtatac aatgtgcgat gatcaaatca gggtaattga gatatccatc 360 accttgaaca tttattcctt ccttatgttg ggaacattcc cattcttcat ttctagctat 420 tttgaactgc agtatacatt cttgttaacc atagtcaccc tactgtgcta tcgcactttg 480 gacttactca ttctatctaa t 501 <210> 7 <211> 534 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gttttaggtg aaaagaattc aggctttgtc tataccatcc atggcaggtg cggctctggg 60 ggtgggatat ggttacagat aaataagaga tctgtgcttc cccccttgct gtaagattct 120 ggctatagtc caagatccaa attcaaagtt agcttttggt ggacaagact aaggcctccc 180 actaaaatta tttacttcaa gtttttattt tcaaagtttt caaacataca caayggagag 240 actcagtgta atgagcaccc acttatccat tcttaggtta aataattttc actattttgc 300 tctactaatt catctatccc tttattctat ctttttaaag aaaactttta aaaataaatt 360 tgtatgtttt taaaaagaaa ttcttggcat gtcattccat cactgaacaa ttcatttaat 420 ataaaaaata agaaaaattt gttacatagc cacaatatca ttatcatatc taagacaata 480 aaaattcttt aatattatct catttacagt ccataataaa atttccccgg attg 534 <210> 8 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tggtatgttc attgcagctc tattcagaat agaaaagaca tgaaatcaac ctaggtgccc 60 gtcaacagtg gcttagatga agaaaatgtg gaacacatac tccatggaat atgcagccat 120 aaaaaaagaa tgaaatcatg tcctttgtaa caacatggat gcagctggag gtcattaccc 180 taagggaata tatacaggca cagaacacca aataccattg ttttcactta gaaatgggag 240 ctaaatagtg ggtacttttg ggcataaaga tggcaacaat agacactatg gactcctaaa 300 rgggagagga aaggctgcaa gagttgaaaa actattgggt actatgctca gtacttgggt 360 gatgggagca atcatgcccc aaacatcagc atcacacaat atactcaggt aacctgcaca 420 tgtactcctg aatctaaaat aaaagttgag tatgtataag aggaagtcat tcatcataaa 480 ggtctccatc ctcatcatct tccattgagt gggctgtgga ggaggaggag tagatgttga 540 ttttgctgtc tcagggtggc agaggcagaa gaggtagagg aggtggaagt ggaggcagga 600 g 601 <210> 9 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tataaaaacc tatatatgat tttatatcac ctatgataga gggttatcta taaaatatga 60 aacatcaaac tatatatggt ttcatttatt ttgattataa atatctttta tgagatatga 120 aataaatgtg tttatgtgtc tattaaagaa tatggatgta tgaaagtttt tatacttgtg 180 gaagattaca tatattaatg tatgtattta tgactatacg tgtaaagcca gcggagttct 240 cacagaggaa ttcagaactc aaagaaggct ttccggcaaa gagccttgga tatggcccaa 300 ycacagaagt aaattgtcat tgacagaagg atggacactt catattgctc cttccttgtt 360 tcagatgcca ggatgtgtct gggaaaagca tgcagttggt tacatcttgc tgggaaacag 420 gattcagagt ctgtgtctta tctgtctgat gagaaggaag cattacttga tgatggagta 480 tgtgtttgca catgtatgtg tttgtgtatg tgcaggtgtg tttgtgtgca gtgtcccaga 540 ccctgcatag gggattttct tgaaggtctc ctgtaacaaa atctccttga ggctatccag 600 g 601 <210> 10 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 atgattttca ggggaaagat gatgcaacag taaattacaa ttgttgacat gataattttt 60 agttgtccca tcttgcaaat gatagacagg tgaccacagg agacctaggc actcacatga 120 aatagaagtg tcagagaggt tgactcagtg gaagtggggc aatgaagttg ggatggatgt 180 ctgtgattag agaatgacac acgaagttca gtttccagac agggatctgt gctgtcaaga 240 gattttctgg tcaggatttg gggtctggtg catgatgtgg ggacatctca gagttcggaa 300 rgcaaagtaa tggttgcatc tcaaatgatt cttctacttg gaatgctgaa attatcaaga 360 aatggcggaa ggggctaggg aggagataag actgtgaatc tataagccca gtgaagctgg 420 ggacagtgat gaatggacat gcgtccaaga agggaagcat ttctcaggag aggctcatca 480 catcaccaaa cccaccctac tgcactccag gtttctatag tgggatctac tcctttacca 540 aaaatttcag aggcagcttt cattaatcca gaatatttgg gtttcgttga aatggtactc 600 t 601 <210> 11 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 agatactttg tggggctgtg attctgccta ccacagacac taagcttaaa gtgaaaccca 60 catcttattc aaaacttgga ggttttcctt catttggcca tttaaattta atttttgttt 120 ctgtcctccg tagtcttcta ttctccaggc ttcagagctc tcagcttacc attcaattat 180 ctcctttctc tccttatatt ccttttttca ttttttaaaa acaatacttt caaagagcaa 240 aaattttaga atttgatgag gtttattcta gtgaagtttt tatcgtttgt actttttgta 300 ycctaaggaa gctttgttta ccccaagata tagtttctac attctcttaa aaacactaaa 360 gagttccagt ttatatgttt agctctgtga gattgggaga ggggagctag atcactcagg 420 tcaggctttc gggatgcctt tttctgtctc tggacgttgc tggggtgacc tcactgacac 480 ccatggcttc agctaccaca tatgctgatg gctccaagtc tatctgtgca gcccagaccc 540 ctcctcatct ccagaccctg gaagctgatg ccttgggcag ctcctcctat ttcccaggca 600 c 601 <210> 12 <211> 428 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 caaaaaccaa tcgatacacc aagttaatgt ttgactgtgt cacgtgacta taaaaagctg 60 tcagtccaca aaggtagcag ggagttcact ttcagagata aagaaggtgg agctttatta 120 ggtttcttaa taggcaacaa cagttgaact ggctggaatt tcatactcaa atcacattct 180 tgagtgaaca cagcaaagta cttccagaac ctcaggatcc attaaattag tatttccaca 240 gaccaacaag tgttaccaga gaggaagaag gacgactatg tagtgaacaa gttaggcttc 300 ttttccaraa attaaacaga aggcttttta gaaagccttt tagaaagaaa agaacacaac 360 tgtacccccg ctttcgccat ggaaacctgt aagagtgccc actccacagc tcccccggta 420 ctgcctgc 428 <210> 13 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 aggagaacag cacgggaaag acctggcccc atgattcaat tacctccacc aggtcccttt 60 cacaatatgt gggaattcaa ggtgagattt gggtggggac acagccaaac catatcaggg 120 acaaattcca aaaacattag ctttattcaa atttactttc ctttttacct ttctgagtcg 180 tcaagttcta aaagcactgc ttaattttgt ttctaaactc acattgcagc acagggcatg 240 atctgccctc aagacaaaga ccataagcta ctctttcctg gaaaatgtac aagttggtat 300 stcagcaaat gctactcatg tttcttatcc ttatgagtaa atcattggca gtatgtgtga 360 ttttttttgg ggggtcaaca ggaaaataaa cggcctcttt ttgggggcag gttttgcctg 420 tatttctcct gcctacaaat attataggag cttagaattc cagctgctgg ctcactcttg 480 gctgaagttc tctgatggct c 501 <210> 14 <211> 409 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gttgggtatc acattcttag ggtagaccaa aggaaagaag ctggtgaggg gaagcagcag 60 taactgacac cagggatttc ataaagacgt agaaaggtta ggtcctaacg caggcggagg 120 ctccacctgg gctcacctgt ttcaggaaga ctcacaggaa aggaaaaaaa aaaaagatgt 180 ttaactaagg gagatgccac atgaagcatg tgcgtgttta tctgcacatc ttaataggga 240 tgcccaggaa cgtgtaaact gaaaagaaaa tactaagtgc cgcccgtctc ccacaacaag 300 tgaatcraac cctcctggcc agcgggaccc caaagaaacc ttcaaaactg agtcacagcc 360 acgacgggac agaaggctgg acacgcctcg tcacactccc tcccttttg 409 <210> 15 <211> 511 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gaattccttc ctactggacc tagtcatcaa ttctgctgga actcaccaaa aactaaaaaa 60 gcctggcagt gattcctttt ttttttctta attaaaacta tcttgatgtt ctcttgaatg 120 atgatctgct atcttkgtta aagtatttaa ttacagcatt ggatgtaatt cccctggata 180 gactcaatga gtttttgcta ctggagacct tcaggaaaaa cccctatgta ggatctgaga 240 cactgcatgc tgacacatgt gtgcatgcac acacacaaac acgcgtggac acacacaggc 300 acagatgcac actccatcaa gtgatgcttc cttctcatca gacacttcag actatgactc 360 ctgttgtcca gcaagataca acaaactgta tgcttttcca agacacagcc tgcccttcta 420 aataaggaaa gagaaatcca gtgtccatag gtctttcaat gacagttcac ttttgtaggt 480 atgttgtaac caaggctctt tgtcaaaggg c 511 <210> 16 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 tcaaacatta acttggtgta tcgattggtt tttgccatat atatatatat aagtaggaga 60 gggcgaacct ctggcaggag caaaggcgcc atggctgtgg agtcccaggg cggacgccca 120 cttgtcctgg gcctgctgct gtgtgtgctg ggcccagtgg tgtcccatgc tgggaagata 180 ctgttgatcc cagtggatgg cagccactgg ctgagcatgc ttggggccat ccagcagctg 240 cagcagaggg gacatgaaat agttgtccta gcacctgacg cctcgttgta catcagagac 300 rgagcatttt acaccttgaa gacgtaccct gtgccattcc aaagggagga tgtgaaagag 360 tcttttgtta gtctcgggca taatgttttt gagaatgatt ctttcctgca gcgtgtgatc 420 aaaacataca agaaaataaa aaaggactct gctatgcttt tgtctggctg ttcccactta 480 ctgcacaaca aggagctcat ggcctccctg gcagaaagca gctttgatgt catgctgacg 540 gaccctttcc ttccttgcag ccccatcgtg gcccagtacc tgtctctgcc cactgtattc 600 t 601

Claims

서열목록 제 1 서열 내지 제 4 서열, 제 8 서열 내지 제 11 서열 및 제 13 서열의 301번째 뉴클레오타이드; 제 5 서열의 314번째 뉴클레오타이드; 제 6 서열의 201번째 뉴클레오타이드; 제 7 서열의 234번째 뉴클레오타이드; 제 12서열의 308번째 뉴클레오타이드; 제 14 서열의 307번째 뉴클레오타이드; 및 제 15 서열의 136번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)들로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 SNP를 포함하는 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 피검체의 혈액 내 빌리루빈 농도를 예측하기 위한 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 단일뉴클레오타이드 다형성은 서열목록 제 1 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제 16 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 빌리루빈 농도의 예측은 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 황달(jaundice), 길버트 증후군(Gilbert syndrome), 두빈-존슨 증후군(Dubin-Johnson syndrome), 로터 증후군(Rotor syndrome) 또는 크리글러 나이잘 증후군(Crigler-najjar syndrome)을 진단하기 위한 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제 1 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 2 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 3 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 4 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 5 서열의 314번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 6 서열의 201번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 7 서열의 234번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 8 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 9 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 10 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 11 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 12 서열의 308번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 13 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 14 서열의 307번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 15 서열의 136번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드는 핵산 증폭을 위한 프라이머 또는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 검출하기 위한 프로브인 것을 특징으로 하는 키트.
혈액 내 빌리루빈 농도의 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검체의 생물학적 시료에 있는 서열목록 제 1 서열 내지 제 4 서열, 제 8 서열 내지 제 11 서열 및 제 13 서열의 301번째 뉴클레오타이드; 제 5 서열의 314번째 뉴클레오타이드; 제 6 서열의 201번째 뉴클레오타이드; 제 7 서열의 234번째 뉴클레오타이드; 제 12서열의 308번째 뉴클레오타이드; 제 14 서열의 307번째 뉴클레오타이드; 및 제 15 서열의 136번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)들로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 SNP를 포함하는 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 방법을 통해 피검체의 혈액 내 빌리루빈농도 마커를 검출하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단일뉴클레오타이드 다형성은 서열목록 제 1 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 마커는 서열목록 제 16 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 빌리루빈 농도의 예측은 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 황달(jaundice), 길버트 증후군(Gilbert syndrome), 두빈-존슨 증후군(Dubin-Johnson syndrome), 로터 증후군(Rotor syndrome) 또는 크리글 러 나이잘 증후군(Crigler-najjar syndrome)을 진단하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 서열목록 제 1 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 2 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 3 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 4 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G, 상기 서열목록 제 5 서열의 314번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 6 서열의 201번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 7 서열의 234번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 8 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 9 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 10 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 11 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목록 제 12 서열의 308번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 13 서열의 301번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 C, 상기 서열목 록 제 14 서열의 307번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 A, 상기 서열목록 제 15 서열의 136번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성은 G인 것을 특징으로 하는 방법.