KR101782227B1 - 시나칼셋 반응성과 연관된 casr 유전자의 단일뉴클레오타이드 다형성 마커 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 이차성부갑상선항진증 치료에 사용되는 시나칼셋의 약물 반응을 예측할 수 있는 단일뉴클레오타이드 다형성과 일배체형 마커를 개시한다. 본원에 따른 일배체형 마커는 만성신장질환 환자에서 질병이환율과 사망률의 위험도를 높이는 이차성부갑상선항진증 치료에 대한 예측가능한 지표로 활용되어 개인맞춤약물요법에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

시나칼셋 반응성과 연관된 CASR 유전자의 단일뉴클레오타이드 다형성 마커 및 그 용도 {Haplotype and Single Nucleotide Polymorphism Markers of CASR gene for detecting susceptibility to cinacalcet and its use}

본원은 단일뉴클레오타이드 다형성 마커를 이용한 약물에 대한 감수성을 검출하는 분야이다.

이차성부갑상선항진증(SHPT, secondary hyperparathyroidism)은 만성신장질환에서 보편적으로 발현되는 합병증이다. 신장기능의 감소로 야기된 미네랄 항상성의 조절불능은 신장에서의 인산배설의 감소, FGF-23의 상승 그리고 칼시트리올 합성의 감소를 야기한다. 이러한 변화는 지속적인 부갑상선호르몬(PTH)의 분비와 PTH의 자극을 동반하여 부갑상선 과증식과 SHPT의 발생에 기여한다. 상승된 칼슘, 인산농도와 SHPT는 신장성 골형성증장애, 에리스로포이에틴 저항, 혈관성 석회화 그리고 심혈관계 질환 유발과 관련되어 있다. 이러한 임상적 특성들은 만성신부전의 투석단계 환자에서 질병 이환과 사망률을 증가시키는 강력한 요소이다(Delmez JA, Slatopolsky E. Hyperphosphatemia: its consequences and treatment in patients with chronic renal disease. Am J Kidney Dis 1992;19:303-17). 이러한 환자군에서 적절한 PTH를 유지하는 것은 필수적인 사항이다. 그러나 PTH를 조절하면서 비정상적으로 유지된 칼슘과 인산을 동시에 조절하는 치료요법에는 어려움이 있어서 기존의 치료요법인 인산결합제와 비타민 D 제제의 치료는 고칼슘혈증와 고인산혈증 그리고 불응성 부갑상선항진증과 PTH의 과억제를 종종 유발하곤 했다(Locatelli F, Cannata-Andia J, Drueke T, et al. Management of disturbances of calcium and phosphate metabolism and chronic renal insufficiency with emphasis on the control of hyperphosphatemia. Nephrol Dial Transplant. 2002;17:723-31).

부갑상선 세포내의 칼슘감지수용체의 세포외 칼슘에 대한 감수성을 증가시키는 시나칼셋(cinacalcet)은 새로운 치료요법제 중의 하나이다(Desmond P, Robert H. Clinical Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Profile of Cinacalcet Hydrochloride. Clin Pharmacokinet 2009;48(5):303-11). 이 약제는 칼슘 조절점의 기준을 낮추어서 투여 1-4시간안에 체내에 순환하는 PTH 수치를 감소시켜, “의학적 부갑상선절제술”로 활용되어왔으며 일부환자에서는 수술적 치료를 대체해왔다.

시나칼셋 치료는 PTH와 칼슘과 인의 곱(Ca×P)의 수치를 감소시켜서 목표수치에 도달하는 환자가 41%에 달하는 치료효과를 보여주었으나 (Bolton K, Coburn JW, Chertow GM, et al. KDOQI Clinical Practice Guidelines for Bone Metabolism and Disease in Chronic Kidney Disease 2002. Available from: http://www2.kidney.org/professionals/KDOQI/guidelines_bone/Guide1.htm.), 기존 치료제인 인산결합제와 비타민 D 제제로 치료를 할 때는 10%의 환자에서만 K/DOQi의 가이드라이에서 제시하는 목표수치에 도달하였다(Quarles LD. Cinacalcet HCl: A novel treatment for secondary hyperparathyroidism in stage 5 chronic kidney disease. Kidney International. 2005;68(Supplement 96):s24-s8).

시나칼셋은 40%이상의 환자에서는 PTH를 효과적으로 조절했지만, 그 치료효과는 개인간에 유의할 만한 차이가 있고 약물 저항성을 보이는 결과들이 있었다. 특히, 요독성 말기신부전 환자에서 칼슘감지 수용체나 비타민 D 수용체의 감소가 시나칼셋 약물 저항성의 원인으로 제시되어 (Fukuda N, Tanaka H, Tominaga Y, et al. Decreased 1,25-dihydroxyvitamin D3 receptor density is associated with a more severe form of parathyroid hyperplasia in chronic uremic patients. J Clin Invest 1993;92:1436-42), 칼슘감지 수용체나 비타민 D 수용체의 발현에 영향을 주는 유전적인 다형성이 치료에서 고려되어야 할 요소로서 제시되어왔다.

미국특허 제7,595,161호는 시나칼셋의 반응성을 유전자 수준에서 검출하는 기술에 관한 것으로 CASR의 Arg990Gly (c.2968A>G, rs1042636) 의 동형접합 (G/G) 또는 이형접합 (G/A) 변이를 갖는 경우 시나칼셋 약효가 높을 것으로 판단하는 방법을 개시한다. 그 외 VDR 유전자의 다형성도 PTH 조절과 연관된 것으로 나타났다(Chudek J, et al, Kokot F. Plasma parathyroid hormone, phosphatemia and vitamin D receptor genotype: are they interrelated? J Nephrol. 2000;13(1):54-8).

그러나, 현재까지 알려진 결과들은 PTH 호르몬 조절과 CASR 단백질의 Arg990Gly의 변이와의 관련성만 제시되어 CASR 의 다른 유전적 다형성과 하플로타입에 따른 시나칼셋 반응성에 대한 기술 개발이 필요하다.

본원은 만성신장질환 환자에서 질병이환율과 사망률의 위험도를 높이는 이차성부갑상선항진증 치료에 영향을 미치는 단일염기다형성과 일배체형 마커를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 단일뉴클레오타이드 다형성 (SNP, single nucleotide polymorphism) rs1042636, rs1802757 및 rs10190의 대립 유전자를 포함하는 CASR 유전자 일배체로, 상기 rs1042636는 서열번호 1의 1236번째 뉴클레오타이드, 상기 rs1802757는 서열번호 2의 1093번째 뉴클레오타이드, 상기 rs10190는 서열번호 2의 1197번째 뉴클레오타이드에 위치하는 것인, CASR (Calcium-sensing receptor) 유전자 일배체에 관한 것이다.

본원에 따른 일구현예에서 상기 rs1042636, rs1802757 및 rs10190 대립 유전자를 포함하는 CASR 유전자 일배체는 GCC, ATT, ACC 또는 ACT이다.

다른 양태에서 본원은 단일뉴클레오타이드 다형성 rs1042636, rs1802757 및 rs10190의 대립 유전자를 포함하는 CASR 유전자 일배체 검출용 물질을 포함하는, 시나칼셋 반응 예측용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 일 구현예에서 조성물에 포함되는 일배체 검출용 물질은 rs1042636의 경우 서열번호 1의 1236번째 뉴클레오타이드, rs1802757의 경우 서열번호 2의 1093번째 뉴클레오타이드, rs10190의 경우 서열번호 2의 1197번째 뉴클레오타이드에 위치하는 다형성을 검출하기 위한 물질로, 특히 상기 일배체는 GCC, ATT, ACC 또는 ACT이다.

다른 양태에서 본원은 또한 단일뉴클레오타이드 다형성 rs1802757의 검출용 조성물을 포함하는 시나칼셋 반응 예측 검출용 조성물로, 상기 rs1802757은 서열번호 2의 1093번째 뉴클레오타이드에 위치하는 것인, 시나칼셋 반응 예측용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 일 구현예에서 서열번호 2의 1093번째 뉴클레오타이드에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성 rs1802757의 다형성 염기는 T인이다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원의 조성물에 포함되는 검출용 물질 또는 시약은 핵산증폭방법, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 교잡, 염기서열 분석법, 교잡법, 5‘뉴클레아제 분해법, 단일가닥 구조 다형성, 프라이머 특이적 신장법, 또는 올리고라이게이션 분석법에 사용되는 물질 또는 시약을 포함한다.

다른 양태에서 본원은 또한 시나칼셋의 치료가 필요한 대상체의 시나칼셋에 대한 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하기 위해서, 상기 대상체 유래의 생물학적 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 단일뉴클레오타이드 다형성 (SNP, single nucleotide polymorphism) rs1042636, rs1802757 및 rs10190의 대립 유전자형을 분석 또는 결정하는 단계; 및 상기 분석 결과 상기 대립 유전자형이 GCC인 경우 상기 대상체는 시나칼셋 반응군으로, 상기 대립 유전자형이 ATT인 경우 상기 대상체는 시나칼셋 불응군으로 판단하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 방법은 단일뉴클레오타이드 다형성 및 이를 포함하는 일배체형을 검출할 있는 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 핵산증폭방법, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 교잡, 염기서열 분석법, 교잡법, 5‘뉴클레아제 분해법, 단일가닥 구조 다형성, 프라이머 특이적 신장법, 또는 올리고라이게이션과 같은 방법으로 분석될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 단일뉴클레오타이드 다형성과 일배체형 마커는 만성신장질환 환자에서 질병이환율과 사망률의 위험도를 높이는 이차성부갑상선항진증 치료에 사용되는 시나칼셋의 약물반응에 대한 예측가능한 지표로 활용되어 개인맞춤약물요법에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 시나칼셋 사용 3개월 후 iPTH의 농도 변화를 나타낸 결과이다.

본원은 칼슘감지수용체를 암호화하는 CASR 유전자의 엑손 및 3’비전사부위의 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 CASR 유전자의 특정 일배체형 및 단일뉴클레오타이드 다형성이 시나칼셋에 대한 반응성과 관련이 있다는 발견에 근거한 것이다.

시나칼셋은 만성신장질환 환자의 합병증으로 질병이환율과 사망률의 위험도를 높이는 이차성부갑상선항진증 치료에 사용되는 약물이다. 이차성부갑상선항진증은 칼슘과 인등의 미네랄 조절불능의 지속으로 인한 부갑상선의 과자극으로 초래되는 만성신장질환에 보편적으로 발현되는 합병증이다. 이차성부갑상선항진증은 신장성 골형성증장애, 에리스로포이에틴 저항, 혈관성 석회화 그리고 심혈관계 질환 유발과 관련되어 있다. 이러한 임상적인 특성들은 만성신부전의 투석단계 환자에서 질병 이환과 사망률을 증가시키는 강력한 요소중의 하나로서 시기적절한 치료가 필수적이다. PTH 분비와 합성을 조절하는 기전에는 칼슘과 인, 비타민 D, FGF-23 그리고 뼈대사 등 많은 경로가 관여한다. 시나칼셋은 부갑상선의 주세포에 위치한 칼슘감지수용체에 직접 작용하여 세포외액의 칼슘농도에 대한 민감도를 높여서 부갑상선호르몬의 분비를 억제하는 작용을 하여 ‘의학적 부갑상선절제술’로서 수술요법을 연기하거나 대체하는 약물이다. 그러나 약제에 대한 개인간의 반응성 차이가 유의하게 있음이 보고되고 있어 더욱 효과적으로 시나칼셋을 치료요법으로 사용할 수 있는 불응성요소를 파악하는 것이 필요하다.

CASR은 인종간의 유전적다형성 발현빈도의 차이가 높고, 칼슘감지수용체에 직접 작용하는 시나칼셋은 유전적다형성에 영향을 받을 수밖에 없기 때문에 시나칼셋의 약물반응에 대한 예측가능한 지표의 개발이 필요하다.

본원에서는 CASR 유전자에 위치하는 SNP들이 시나칼셋 약물 반응성과 연관이 높은 것을 발견하였다.

따라서 한 양태에서 본원은 단일뉴클레오타이드 다형성(SNP, single nucleotide polymorphism) rs1042636, rs1802757 및 rs10190의 대립 유전자를 포함하는 CASR 유전자 일배체에 관한 것이다.

본원에서 단일뉴클레오타이드 다형성(Single Nuncleotide Polymorphism, SNP)는 개체간 DNA에 존재하는 단일염기 변이로 CNV(copy number variation)과 더불어 유전자 수준에서 가장 많이 존재하는 변이 가운데 하나이다. 주로 질병과 관련된 유전자를 발견, 특정 질환에 대한 감수성, 질환의 진단 또는 예후 측정용으로 사용하거나 정상인-환자간의 차이를 알기 위해 연구되나, 정상인 집단의 경우에도 SNP나 CNV등의 변이가 발견되며, 이로 인해 다양한 표현형을 나타낼 수 있다는 것이 보고되었다[L. Feuk, A.R. Carson, and S.W. Scherer, Structural variation in the human genome. Nat Rev Genet 7 (2006) 85-97; D. Pinto, C. Marshall, L. Feuk, and S.W. Scherer, Copy-number variation in control population cohorts. Hum Mol Genet 16 Spec No. 2 (2007) R168-73.]. SNP의 명명은 NCBI(the National Center for Biotechnology Information)에 의해 각각의 고유한 SNP에 부여된 공식적인 참조 SNP(Reference SNP; rs) ID 식별번호를 의미한다.

본원에서 대립 유전자는 상이한 다형성 부위에서 발견되는 상이한 서열 변이체를 의미하며, 서열변이는 하나 이상의 서열의 치환, 결실, 부가를 포함하며, 본원에서는 치환을 포함한다.

본원에서 일배체는 하나의 염색체상에 존재하는 대립 유전자의 세트로서 통계적으로 유의한 수준에서 하나의 그룹으로서 유전되며 대립 유전자 간은 연관 비평형 관계에 있다.

본원에서는 CASR 유전자의 세 개의 rs1042636, rs1802757 및 rs10190 SNP가 시나칼셋 반응성과 관련되어 있음을 규명한 것으로, 본원에 따른 SNP, rs1042636는 CASR 유전자 엑손 7에 위치하며 서열번호 1의 서열에서 1236번째 위치의 뉴클레오타이드에 변이가 있는 것이다. 일 구현예에서 rs1042636의 상기 위치에서의 뉴클레오타이드는 A 또는 G이다.

본원에 따른 SNP, rs1802757는 CASR 유전자 3’ 비전사 부위에 위치하며 서열번호 2의 서열에서 1093번째 위치의 뉴클레오타이드에 변이가 있는 것이다. 일 구현예에서 rs1802757의 상기 위치에서의 뉴클레오타이드는 C 또는 T이다.

본원에 따른 SNP, rs10190는 CASR 유전자 3’ 비전사 부위에 위치하며 서열번호 2의 서열에서 1197번째 위치의 뉴클레오타이드에 변이가 있는 것이다. 일 구현예에서 rs10190의 상기 위치에서의 뉴클레오타이드는 C 또는 T이다.

본원에 따른 SNP 염기 변이가 이중가닥의 gDNA(genomic DNA, 유전체)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다.

일배체형은 개개의 단일뉴클레오타이드 다형성보다 더 정확하고 신뢰할 수 있는 기능성 유전적 정보를 제공한다. 일배체형을 구성하는 단일뉴클레오타이드 다형성간의 강한 연관관계가 있음을 증명하는 것으로 세대간의 연속성을 보장하고 유전형의 변화가 없이 일정하게 유지되어 지속적 바이오마커로서 활용가능하다. 일배체형을 통해 개개 단일뉴클레오타이드 다형성 정보만으로 확인하기 어려운 결과를 단일뉴클레오타이드 다형성 조합으로 분석가능하게 하는 장점도 있다.

이로 제한하는 것은 아니나, 본원에서 SNP 분석에 사용한 검체는 한국인을 대상으로 한 것으로 본원의 SNP는 한국인 또는 유전적 배경이 유사한 아시아인에 특이적인 것일 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에서 사용한 용어 “한국인”은 한국사람을 조상으로 하는 한국인 집단으로, 10세대 이상의 조상이 한국인인 경우를 일컫는 것이다.

본원에서 발굴된 세 종류 SNP 중 rs1802757는 단독으로 시나칼셋 반응성 여부의 예측에 사용될 수 있다. 이런 측면에서 본원은 단일뉴클레오타이드 다형성 rs1802757의 검출용 조성물을 포함하는 시나칼셋 효능 예측 검출용 조성물에 관한 것이다.

다른 양태에서 본원은 또한 단일뉴클레오타이드 다형성 rs1042636, rs1802757 및 rs10190 대립 유전자를 포함하며, 상기 대립 유전자는 상기 SNP의 순서대로 ATT 또는 GCC인, CASR 유전자 일배체 검출용 물질을 포함하는, 시나칼셋 효능 예측 검출용 조성물에 관한 것이다.

본원에서 검출용 물질이란 상기 SNP 부위의 특정 뉴클레오타이드의 존재 여부를 검출할 수 있는 물질로, 핵산 또는 단백질을 포함하는 것이다. 예를 들면 핵산의 경우 상기 부위를 결합(미스매치 포함)할 수 있는 프로브 또는 상기 SNP 주변을 플랭킹하는 부위에 결합하여 증폭을 개시할 수 있는 프라이머, 또는 이 모두를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면 단백질의 경우, 상기 SNP에 의해 초래된 아미노산 변이에 결합할 수 있는 결합할 수 있는 물질, 예를 들면 항체를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "핵산"은 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 것으로 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).

본원에서 핵산은 피검체(예를 들어, 인간)의 다양한 유래일 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 혈액으로부터 얻는다.

본 발명에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 혈액의 경우, 예를 들어, QIAamp DNA Blood Maxi Kit를 이용하여 gDNA를 분리할 수 있다. 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시될 수 있다(Sambrook, J. et al.,Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal.Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 진핵생물부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본원에서 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완벽한 상보적인 서열이 이 용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본원에 따른 SNP 위치를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다.

일 구현예에서 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach , IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본원에서“프라이머(primer)”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한온도 및 적합한 완충액 하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.

프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 base의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본원에 일배체 결정 또는 SNP 결정 또는 지노타이핑(genotyping) 방법은 매우 다양하며 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 아피메트릭스 SNP 칩(Affymetrix SNP chip)을 이용한 방법, PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)법, PCR-SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)법, PCR-SSO(Specification Sequence Oligonucleotide)법, 도트혼성화법, PCR-SSO와 닷(dot)혼성화법을 조합한 ASO(Allele Specific Oligonucleotide) 혼성화법, TaqMan 법, 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법, Invader 법, SNaPShot 법, MassArray 법, 동적 대립유전자 특이성 혼성화(Dynamic Allele-Specific Hybridization, DASH) 법, 마이크로플레이트 어레이 대각 겔 전기영동(Microplate Array Diagonal Gel Electrophoresis, MADG) 법, GoldenGate 분석법, SNPlex 법 및 BeadArray 법, 증폭 기술로 PCR 증폭(참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al.(EP 329,822)), 리가아제 체인 반응(LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응(Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페어 체인 반응(EP 439,182), 3SR(Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA(U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구현예에서는 증폭기술이 사용되며, 본원에 따른 SNP 염기를 확인하기 위해 적합한 프라이머 및 프로브를 디자인하는 것이 중요하다. PCR에 의한 증폭 반응의 조건 및 사용되는 시약과 효소는 당업계에서 통상적으로 공지된 것을 사용할 수 있다. TaqMan 방법은 Tap 폴리머라아제의 5'-뉴클레아제 성질을 이용하는 방법으로, 반응에는 하나의 TaqMan 프로브와 한 쌍의 PCR 프리이머가 사용된다. 5'-말단에는 리포터 염료(reporter dye)가, 3'-말단에는 흡광 염료(quencher dye)가 공유결합 되어있는 TaqMan 프로브를 이용하며, 다형성 부위(polymorphic site)와 TaqMan 프로브간의 매치(match) 및 미스매치(mismatch)의 차이를 형광물질을 이용하여 감별하는 방법이다. TaqMan 프로브에 리포터 염료 및 흡광 염료가 모두 결합되어 있을 때는 리포터 염료가 흡광 염료에 의해 빛을 발하지 못한다. 그러나 SNP이 위치한 부위와 상보적으로 완전히 일치하는 TaqMan 프로브는 PCR의 어닐링(annealing) 단계에서 결합되고, 신장(extension) 단계에서 Taq 중합효소의 5'-뉴클레아제 활성도에 의하여 5'-말단부의 리포터 염료(FAM 또는 VIC)가 흡광 염료로부터 분리되어 고유한 형광을 나타낸다. 프로브가 표적(target) SNP와 미스매치되면 프로브가 주형으로부터 떨어져 나가기 때문에 더 이상의 반응이 진행되지 않는다. 이 방법은 SNP 이외에도 아주 작은 염기서열의 삽입(insertion)이나 결실 (deletion)도 분석할 수 있다. 미국 Illumina사의 GoldenGate 지노타이핑 분석법은 genomic DNA를 주형으로 사용하여 프라이머 신장과 증폭 단계를 통하여 많은 수의 멀티플렉싱(multiplexing, 1,536-plex)이 가능한 SNP 지노타이핑 방법이다.

일 구현예에서 SNP 지노타이핑을 위해 주형 DNA는 비오틴(biotin)으로 표지하여 잉여의 혼성화 용액(hybridization solution)과 SP-PMPs(streptavidin conjugated paramagnetic particles)로부터 정제된다. 정제된 DNA 주형에 세 가지의 올리고뉴클레오타이드 (oligos)가 첨가되는데 두 가지의 oligo는 SNP 부위의 각각의 대립유전자형에 특이적인 ASO(Allele-Specific oligos)이고 다른 하나의 oligo는 SNP 부위의 몇 base pair downstream에 혼성화되는 LSO(Locus-Specific Oligo)이다. oligo 혼성화 후에 혼성화 되지 않은 oligo는 제거되며, 대립유전자-특이 신장(allele-specific extension) 후 라이게이션 반응이 수행된다. 라이게이션된 산물을 형광물질로 표지된 universal PCR 프라이머 P1(Cy3), P2(Cy5)와 P3로 PCR 증폭시킨 후에 단일가닥(single-strand)으로 만든다. 단일가닥의 염색 표지된 DNA는 unique address 시퀀스를 통해 상보적인 베드타입(bead type, Array Matrix 또는 BeadChip)에 혼성화되고 형광물질의 시그널을 읽어 자동으로 지노타입을 결정하게 된다. GoldenGate 분석은 1,500여개까지의 SNP을 동시에 지노타이핑할 수 있는 멀티플렉싱 분석이 가능하고 정확하게 타이핑은 가능하지만, 모든 SNP 부위에 대하여 분석이 가능한 것은 아니다.

Affymetrix GeneChip 분석법은 수십만 개의 SNP을 칩-기반으로 하여 동시에 지노타이핑할 수 있는 방법으로 최근 Affimetrix사에서 개발한 것이다. 이 분석방법의 구체적인 일 실시예에 따르면, genomic DNA는 제한효소(StyI 및 NspI)로 우선 절단되고 생성된 모든 단편은 크기에 관계없이 4 bp 돌출부(overhang)를 인지하는 어댑터(adaptor)에 결합하게 된다. 어댑터가 붙여진 DNA 단편을 어댑터의 염기서열을 인지하는 프라이머로 증폭되며, PCR 증폭조건은 200-2,000 bp 크기의 단편을 선택적으로 증폭시키기 위해 최적화되어 있다. 증폭된 DNA는 이후에 조각(fragmentation)으로 잘려진 후에 표지(labeling)되어 GeneChip 어레이에 혼성화된다. 어레이에는 A 대립유전자 염기서열과 B 대립유전자 염기서열에 완전 매치(perfect match)로 대응되는 25-mer 프로브가 합성되어 있으며 결합의 특이성을 결정하기 위하여 각각의 25-mer 중앙에 위치하는 단일 염기쌍 미스매치(single base pair mismatch)도 포함되어 있어 지노타이핑의 정확성을 점검하는데 사용되고 있다.

지노타이핑이 끝나면, 연관 분석(association analysis)을 수행한다. 본 발명에 있어서, SNP를 연관 분석하는 방법은 매우 다양하며 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 또는 SNP 칩을 이용하여 인간유전체에 널리 퍼져 있는 대량의 SNP을 조사하는 이른바 광범위 유전자 연관 분석(genome-wide association study, GWAS) 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 방법의 경우 발생될 수 있는 임의적인 오류(random error)를 방지하기 위하여 "다단계 접근방법(multi-stage approach method)"을 활용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "연관비평형(Linkage Disequilibrium)" 이란 집단유전학에서 반드시 동일 염색체상에 존재하지는 않는 둘 이상의 유전자좌(loci)에서의 대립유전자의 비-무작위적 연관(non-random association)을 의미한다. 즉, 연관비평형은 서로 다른 위치의 대립형질들간의 결합의 척도로서, 만약 각 유전자가 완전히 독립적으로 배합된다면, 유전자 집합은 아마도 연관 평형(linkage equilibrium)을 유지할것이나, 어떤 대립유전자들은 서로 같이 발견되는 예가 많으며 즉, 무작위적으로 뒤섞이지 않으며, 이런 대립유전자는 연관 비평형상태에 있다. 이러한 연관 비평형 상태는 대립유전자들이 서로 근접하여 위치하거나, 대립형질들이 서로 모여 있으면 더 유리한 경우에 자연선택의 결과로 나타나는 것으로 해석되고 있다.

다른 양태에서 본원은 시나칼셋의 치료가 필요한 인간 대상체의 시나칼셋에 대한 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하기 위해서, 본원에 따른 SNP하플로타입 및/또는 rs1802757 SNP를 검출하는 방법에 관한 것이다.

일 구현에에서 상기 방법은 인간 대상체 유래의 생물학적 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 단일뉴클레오타이드 다형성(SNP, single nucleotide polymorphism) rs1042636, rs1802757 및 rs10190의 대립 유전자형을 분석하는 단계; 및 상기 분석 결과 상기 대립 유전자형이 GCC인 경우 상기 대상체는 시나칼셋 반응군으로, 상기 대립 유전자형이 ATT, ACC 또는 ACT인 경우 상기 대상체에서 시나칼셋 불응군으로 판단하는 단계를 포함한다.

본원에서 시나칼셋의 치료가 필요한 대상체는 시료나칼셋의 치료가 필요하거나 필요할 것으로 예상되는 또는 시나칼셋의 치료여부 결정전에 치료가 효과가 있을지 여부에 대한 판단이 필요한 대상체를 포함하는 것이다.

본원에서 시나칼셋 불응군은 시나칼셋을 3개월 이상 사용시에도 부갑상선 호르몬수치가 상승한 환자로 정의되었으며(Cronin RE. Management of secondary hyperparathyroidism and mineral metabolism abnormalities in dialysis patients. Uptodate.com. accessed DEC 06,2015.), 그 외 감소를 보인 모든 환자를 반응군으로 정의한다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커를 이용한 방법을 통해 불응군 및 반응군으로 판단된 경우, 약물 투여량을 달리할 수 있다. 불응군 및 반응군에서 약물투여 용량(중간값(범위))은 반응군 25(12.5-75)mg/day 대 불응군 50(25-100)mg/day) 이며, 불응군에서 고용량을 사용한다(P<0.001).

시나칼셋 투여시 이에 대한 초기의 반응이 시나칼셋의 치료효과를 좌우하는 중요한 요소라고 지적되고 있으므로 (Segura T et al. Analysis of the efficacy and factors influencing the response of secondary hyperparathyroidism patients on hemodilaysis to cinacalcet. Nefrologia 2010;30:443-351, Kim et al. rapid decrease of intact parathyroid hormone could be a predictor of better response to cinacalcet in hemodilaysis patients. Yonsei Med J.2013;54(2):453-463) 초기치료의 불응군이 이후의 치료실패군이 될 가능성이 높다. 따라서 본원에 따른 방법은 약물의 효과적 사용을 위해 초기 치료시 불응군, 반응군의 판단에 유용하게 사용될 수 있다.

다른 구현예에서는 시나칼셋의 치료가 필요한 인간 대상체의 시나칼셋 약효를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위해서, 상기 인간 대상체 유래의 생물학적 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 단일뉴클레오타이드 다형성 (SNP, single nucleotide polymorphism) rs1042636, rs1802757 및 rs10190 대립 유전자형을 분석하는 단계; 상기 분석 결과 상기 대립 유전자형이 GCC인 경우 ATT, ACC 또는 ACT인 경우와 비교하여, 상기 시나칼셋은 상기 대상체에서 약효가 있을 것으로 판단하거나, 또는 상기 대립 유전자형이 ATT, ACC 또는 ACT인 경우 대립 유전자 형이 GCC인 경우와 비교하여 상기 시나칼셋은 상기 대상체에서 효능이 낮을 것으로 판단하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 SNP의 하플로타입 및 SNP를 검출하는 방법 및 이에 사용되는 검체 또는 생물학적 시료는 상기 기재한 것을 참고할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험방법

대상환자

한국의 3차 병원에서 2011년7월-2014년 7월까지 연구대상 환자들이 선정되었다. SHPT (Secondary hyperparathyroidism) 로 진단되고 iPTH≥ 300pg/ml인 환자들이 포함되었다. 환자들은 18세 이상이며 시나칼셋으로 3개월 이상 치료를 받았다. 모든 환자들은 혈액투석 혹은 복막투석환자이며 식이제한, 인결합제 사용 혹은 비타민 D 제제 사용들의 적절한 의료적 치료를 받고 있었다. 주요 제외기준은 심각한 병존 간질환, 활동성 암환자. 혹은 강한 CYP3A4 저해제인 케토코나졸, 이트라코나졸, 클래리스로마이신, 시메티딘, 아미오다론, 에리스로마이신, 딜티아젬 그리고 베라파밀을 복용하는 환자였다. 이 연구는 헬싱키 선언에 준하며 서울대학교 병원의 윤리위원회의 승인을 받았다(IRB #: H-1408-082-604). 모든 환자들에게서 동의서를 취득하였다.

자료수집

만성신장질환의 원인질환, 투석종류와 기간, 병용 약물과 생화학적지표인 칼슘, 인산, 알칼리성 인산분해효소(ALP), iPTH, 크레아티닌, 추정 사구체여과율(MDRD eGFR), 알부민, 헤모글로빈 수치를 약물투여 전에 수집하였다. Cinacalcet 3개월의 치료 후에 변화된 생화학적 지표들이 수집되었다. 반응군과 불응군은 혈청 iPTH 수치의 변화로 나누어졌다. 불응군은 3개월간의 시나칼셋 치료에도 불구하고 iPTH가 증가를 보인 군으로 규정지었다. 반면에 반응군은 iPTH가 조금이라도 감소를 보인 군으로 규정하였다. 혈청 칼슘과 인산의 농도는 표준 방법으로 측정되었고 iPTH는 인간 혈청에서 생물학적으로 무손상인 84개의 연쇄 아미노산으로 구성된 PTH의 양을 결정하는 이중항체 면역방사측정법 의해 측정되었다(ELSA PTH, Cisbio Bioassays, 30200 Codolet, France). 본 연구 전체에서는 알부민값으로 교정한 혈청 칼슘 농도가 사용되었다.

유전형 분석법

칼슘, 인, 그리고 뼈의 대사와 관련된 9개의 유전자에서 25개의 SNP이 기존의 연구와 데이터베이스에서 연구대상으로 선정되었다; CASR과 VDR 은 칼슘조절과 관련 있으며; FGFR1, KL, RGS14 과 SLC34A1는 인농도와 관련 있고, ALPL , NR4A2, 과 PTHLH는 뼈의 대사와 관련이 있다. 말초혈액샘플은 EDTA 함유 튜브에 수집되었고 DNA 분리이전에 -80˚C에 저장되었다. SNaPshot 분석법은 제조사의 지침에 따라 수행되었다 (ABI PRISM SNaPShot Multiplex kit, Life Technologies).

통계 분석법

각 단일뉴클레오티드 다형성에 대한 Hardy-Weinberg Equilibrium(HWE)을 적합도 카이제곱검정으로 대조군의 기대 유전형빈도수와 비교되었고 P>0.05의 유의수준을 보인 단일 뉴클레오티드다형성들이 HWE를 만족하는 것으로 하였다. 독립표본 t-검정과 Mann-Whitney 검정이 모수적 혹은 비모수적 환자의 특성이나 생화학적지표의 변화의 차이를 결정하는데 사용되었다. 카이제곱 검정 혹은 피셔의 정확성 검증이 환자특성 중 범주적 변수 사이의 차이를 평가하는데 사용되었다. 무조건 로지스틱 회귀분석와 카이제곱검정 혹은 피셔의 정확성 검정은 유전자의 다형성 빈도분석과 유전형간의 cinacalcet 반응성과의 연관성 분석에 사용되었다. 통계적인 분석은 IBM SPSS Statistics 21.0 for windows (SPSS Inc., an IBM Company, Armonl, New York, USA) 프로그램을 사용하였다.

하플로타입과 하플로타입 빈도수 분석은 Haploview software (version 4.2, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA) 프로그램을 사용하였다. 유의수준 P<0.05 를 통계적으로 유의한 것으로 규정하였다.

실시예 1: 피검자의 정보와 혈액검체 수집 및 게놈 DNA 추출

이차성부갑상선항진증으로 시나칼셋을 3개월이상 복용한 환자 68명을 대상으로 환자의 인적 정보, 만성신장병 원인질환, 투석종류, 투석기간, 합병증 상황, 약물투여전의 생화학적 지표와 투여 3개월의 생화학적지표의 차이를 수집하였다. 환자의 연구시작 전 특성들은 칼슘 수치 외에는 양군간에 균형을 이루었다; 기저 칼슘농도 (median(range))는 9.72(7.40-13.52)(반응군) 대 10.50(9.18-11.88)(불응군) (P=0.001) 이었다. 환자들은 32명의 남성(45.7%) 과 38명의 여성(54.3%)으로 구성되었다. Cinacalcet 치료시작 시의 평균나이는 반응군 49(21-75)대 불응군 52(24-71)세 이었다(p=0.325). 기저 평균 iPTH 수치는 68명의 환자에서 수집할 수 있었고 각군마다의 수치는 622(300-1493)pg/ml(반응군) 대. 601(316-1183)pg/ml (불응군)(P=0.375) 이었다. 부갑상선 과증식과 아데노마 상태는 양군간에 차이가 없었다(p=0.726).

채취된 혈액에서 DNA 정제 키트를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. NanodropTM을 이용하여 260nm, 280nm, 230nm에서 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 측정하였다.

실시예 2: 피검자의 약물반응성에 따른 반응군 및 불응군 확정

실시예 1에서 수집된 부갑상선 호르몬 수치는 PTH(intact-parathyroid hormone, 활성부갑상선호르몬)의 84개의 아미노산으로 구성된 활성부감상선 호르몬으로 이중항체 면역방사계측법(ELISA PTH, Cisbio Bioassays, 30200 Codolet, France)을 제조자의 방법대로 사용하여 측정되었다. 시나칼셋 투여 3개월 후 부갑상선 호르몬 수치가 감소한 군은 반응군으로 부갑성선 호르몬 수치가 오히려 증가한 군을 불응군으로 구분하여 비교하였을 때, 시나칼셋 사용 3개월의 생화학적 지표의 변화는 아래 표 1와 도 1과 같았으며 부갑상선 호르몬 수치 감소의 차이가 유의하게 차이가 있었다. 시나칼셋의 투여용량은 12.5mg에서 100mg까지 환자 상태에 따라 투여되었고 불응군에서 50(25-100)mg, 반응군에서 25(12.5-75)mg이 사용되어 불응군에서 유의하게 높은 용량을 사용하였다(P<0.001). 표 1에서 3개월간의 생화학적 지표는 3개월간의 치료동안의 평균값으로 산정되었다.

[표 1] 시나칼셋 사용 3개월후의 반응군과 불응군간의 생화학적 지표변화의 차이

실시예 3: CASR 유전자부위의 선택적 증폭 및 SNP 위치 확인

CASR 유전자중 다음 3개의 단일 뉴클레오타이드 다형성을 선정하여 분석하였다(표 2).

[표 2] 분석에 사용된 프라이머 염기서열

CASR 유전자의 엑손과 3’비전사부위를 증폭하기 위해 실시예 1에서 수집한 혈액샘플에서 수득한 게놈 DNA를 주형으로 하고 SNP유전형 분석키트(ABI PRISM SNaPShot Multiplex kit, Foster City, CA, USA)에 포함된 각 부위에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행(95℃에서 10분후 95℃:30초, 55℃:60초, 72℃:1분에서 35 사이클, 72℃: 5분)한 후, CASR 유전자의 상기 각 부위를 각각 증폭시켰다.

상기 증폭된 각 유전자의 단편을 주형으로 하고, 상기 SNP 유전형 분석키트에 포함된 프라이머를 사용하여 프라이머 연장 반응(primer extension reaction)을 수행한(96℃: 10초, 50℃: 5 초, 60℃: 30 초에서 25사이클)이후 분석된 각각의 염기서열을 sequencer인 ABI 3730xl DNA analyzer에 전기영동시키고 염기서열 분석용 컴퓨터 프로그램 Genemapper software(version 4.0; Applied Biosystems)에 적용하여 각 유전자 단편의 염기에 단일뉴클레오타이드 다형성이 존재하는지를 확인하였다(표 3).

[표 3] CASR 유전자 단일뉴클레오타이드 다형성 정보와 발현빈도

상기 표 3에서, rs number는 NCBI dbSNP에 공식적으로 등록되어 등록번호를 부여받은 SNP의 번호를 나타내고, 위치는 SNP이 존재하는 염색체상의 영역을 의미하며 MAF(minor allele frequency)는 두 개의 대립유전자 중 변이형이 발현하는 빈도를 나타낸다.

실시예 4: CASR SNP와 시나칼셋 약물반응 차이와의 연관성 분석

실시예 2 에서 비교한 반응군과 불응군의 환자정보를 바탕으로 실시예 3에서 분석한 CASR SNP들의 발현빈도와의 연관성을 로지스틱 회귀분석으로 분석하였을 때, 그 결과는 아래의 표 4과 같다.

카이제곱검정에서 CASR rs1042636는 반응군과 불응군에서 유의하게 유전형의 빈도수차이가 있는 것으로 나타났다. 우성유전모델(dominant genetic model)에서 또한 카이제곱검정으로 CASR rs1042636이 시나칼셋 반응성과 유의한 연관이 있음을 입증하였다 (OR: 0.267 (0.074-0.957), P=0.035) (표 5).

로지스틱 회귀분석에서 CASR rs1042636 (OR: 0.074 (0.008-0.721), P=0.025), 과 rs1802757 (OR: 8.625 (1.077-69.075), P=0.042) 이 유전형 모델에서 cinacalcet 반응과 연관된 것으로 나타났다. rs1042636 의 A 에서 G 로의 뉴클레오타이드의 대체는 불응군이 될 위험도를 감소시켰고, 반면 rs1802757의 C에서 T로의 대체는 불응군의 위험도를 증가시켰음을 시사한다.

[표 4] CASR 유전자의 SNP과 시나칼셋에 의한 PTH 조절과의 연관성

상기 표 4에서 약어 설명은 다음과 같다. AA: homozygote major allele (동형접합우성형질), AB: heterozygote allele (이형접합대립형질), BB: homozygote minor allele (동형접합열성형질) 유의한 결과는 굵은 글씨체로 표시되어 있다.

상기 결과는 rs1042636의 염기 A에서 G로의 대체는 불응성의 위험을 90% 이상 낮추었고 rs1802757의 C에서 T로의 대체는 불응성의 위험도를 10배 이상 증가시킨 것을 나타낸다.

실시예 5: CASR 일배체형의 형성

상기 실시예 3에서 확인된 CASR 유전자의 각 SNP 상호간의 연관불균형(linkage disequilibrium, LD) 정도를 분석하고자, 컴퓨터 분석 프로그램인 Haploview software (version 4.2, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA)를 이용하여, 상기 SNP 데이터에 의한 연관불균형 계수(linkage disequilibrium coefficient)와 D’을 산출하여 4개의 일배체형이 구성되었다(표 5).

[표 5] CASR rs1042636, rs1802757 및 rs10190간에 형성된 일배체형

상기 표 5에서, rs1042636는 엑손 7번이 암호화하는 단백질의 990번 염기(서열번호 1의 1236번째 염기) A가 G로 변이됨을 나타내고, 이는 또한 R990G로 표시될 수 있는데, 엑손 7이 암호화하는 단백질의 990번 아미노산인 아르기닌을 글라이신으로 변이됨을 나타내며, rs1802757은 3′비전사부위의 염기(서열번호 2의 1093번째 염기) C가 T로 변이됨을 나타내고, rs10190은 3′비전사부위의 염기(서열번호 2의 1197번째 염기) C가 T로 변이됨을 나타낸다. 상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, 일배체형 중에서 H1 내지 H4의 총 빈도는 100%이고, 그 중 H1이 가장 높은 빈도를 나타냈다.

실시예 6: 형성된 일배체형 발현빈도와 시나칼셋 약물 반응성과의 연관분석

실시예 5에서 조합된 일배체형 데이터를 환자 65명에서 시나칼셋 약물 반응군과 불응군 간의 발현빈도의 차이가 있는지를 분석하였다(표 6).

[표 6] CASR 일배체형과 시나칼셋 약물반응성과의 연관성

상기 표 6에서 CASR 일배체형 GCC는 시나칼셋 불응성의 위험을 65% 감소시켰으며(P=0.015) ATT 일배체형은 시나칼셋 불응성의 위험을 2.8배 높였음(P=0.014)을 알 수 있다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> aplotype and Single Nucleotide Polymorphism markers of CASR gene for detecting susceptibility to cinacalcet and its use <130> DP201511007P <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1505 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (1236) <223> A or G <400> 1 atgccagtgc ctgtaacaag tgcccagatg acttctggtc caatgagaac cacacctcct 60 gcattgccaa ggagatcgag tttctgtcgt ggacggagcc ctttgggatc gcactcaccc 120 tctttgccgt gctgggcatt ttcctgacag cctttgtgct gggtgtgttt atcaagttcc 180 gcaacacacc cattgtcaag gccaccaacc gagagctctc ctacctcctc ctcttctccc 240 tgctctgctg cttctccagc tccctgttct tcatcgggga gccccaggac tggacgtgcc 300 gcctgcgcca gccggccttt ggcatcagct tcgtgctctg catctcatgc atcctggtga 360 aaaccaaccg tgtcctcctg gtgtttgagg ccaagatccc caccagcttc caccgcaagt 420 ggtgggggct caacctgcag ttcctgctgg ttttcctctg caccttcatg cagattgtca 480 tctgtgtgat ctggctctac accgcgcccc cctcaagcta ccgcaaccag gagctggagg 540 atgagatcat cttcatcacg tgccacgagg gctccctcat ggccctgggc ttcctgatcg 600 gctacacctg cctgctggct gccatctgct tcttctttgc cttcaagtcc cggaagctgc 660 cggagaactt caatgaagcc aagttcatca ccttcagcat gctcatcttc ttcatcgtct 720 ggatctcctt cattccagcc tatgccagca cctatggcaa gtttgtctct gccgtagagg 780 tgattgccat cctggcagcc agctttggct tgctggcgtg catcttcttc aacaagatct 840 acatcattct cttcaagcca tcccgcaaca ccatcgagga ggtgcgttgc agcaccgcag 900 ctcacgcttt caaggtggct gcccgggcca cgctgcgccg cagcaacgtc tcccgcaagc 960 ggtccagcag ccttggaggc tccacgggat ccaccccctc ctcctccatc agcagcaaga 1020 gcaacagcga agacccattc ccacagcccg agaggcagaa gcagcagcag ccgctggccc 1080 taacccagca agagcagcag cagcagcccc tgaccctccc acagcagcaa cgatctcagc 1140 agcagcccag atgcaagcag aaggtcatct ttggcagcgg cacggtcacc ttctcactga 1200 gctttgatga gcctcagaag aacgccatgg cccacrggaa ttctacgcac cagaactccc 1260 tggaggccca gaaaagcagc gatacgctga cccgacacca gccattactc ccgctgcagt 1320 gcggggaaac ggacttagat ctgaccgtcc aggaaacagg tctgcaagga cctgtgggtg 1380 gagaccagcg gccagaggtg gaggaccctg aagagttgtc cccagcactt gtagtgtcca 1440 gttcacagag ctttgtcatc agtggtggag gcagcactgt tacagaaaac gtagtgaatt 1500 cataa 1505 <210> 2 <211> 1306 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (1093) <223> C or T <220> <221> variation <222> (1197) <223> C or T <400> 2 aatggaagga gaagactggg ctagggagaa tgcagagagg tttcttgggg tcccagggaa 60 gaggaatcgc cccagactcc tttcctctga ggaagaaggg ataatagaca catcaaatgc 120 cccgaattta gtcacaccat cttaaatgac agtgaattga cccatgttcc ctttaaaatt 180 aaaaaaaaga agagccttgt gtttctgtgg ttgcatttgt caaagcattg agatctccac 240 ggtcagattt gctgttcacc cacatctaat gtctcttcct ctgttctatc ccacccaaca 300 gctcagagat gaaactatgg ctttaaacta ccctccagag tgtgcagact gatgggacat 360 caaatttgcc accactagag ctgagagtct gaaagacaga atgtcaccag tcctgcccaa 420 tgccttgaca acagactgaa ttttaaatgt tcacaacata aggagaatgt atctcctcct 480 atttatgaaa accatatgat attttgtctc ctacctgctg ctgctattat gtaacatcca 540 gaaggtttgc acccctccta taccatatgt ctgcttctgt ccaggacatg atactgatgc 600 catgtttaga ttccaggatc acaagaatca cctcaaattg ttaggaaggg actgcataaa 660 ccaatgagct gtatctgtaa ttaatattcc tatatgtagc tttatcctta ggaaaatgct 720 tctgttgtaa tagtccatgg acaatataaa ctgaaaaatg tcagtctggt ttatataagg 780 cagtattatt gagctctatt tccccacccc actatcctca ctcccataag ctaagcctta 840 tgtgagcccc ttcagggact caagggtcca gaagtccctc ccatctctac cccaaagaat 900 tcctgaagcc agatccaccc tatccctgta cagagtaagt tctcaattat tggcctgcta 960 atagctgcta gggtaggaaa gcgtggttcc aagaaagatc caccctcaaa tgtcagagct 1020 atgttccctc cagcagtggt attaatactg ccggtcaccc aggctctgga gccagagaga 1080 cagaccgggg ttyaagccat ggcttcgtca tttgcaagct gagtgactgt aggcagggaa 1140 ccttaacctc tctaagccac agcttcttca tctttaaaat aaggataata atcattyttt 1200 cccctcagag ctcttatgtg gattaaacga gataatgtat ataaagtact ttagcctggt 1260 acctagcaca caataagcat tcaataaata ttagttaata ttatta 1306

Claims (10)

1. 단일뉴클레오타이드 다형성(SNP, single nucleotide polymorphism) rs1042636, rs1802757 및 rs10190의 대립 유전자를 포함하는 CASR 유전자 일배체로, 상기 rs1042636는 서열번호 1의 1236번째 뉴클레오타이드, 상기 rs1802757는 서열번호 2의 1093번째 뉴클레오타이드, 상기 rs10190는 서열번호 2의 1197번째 뉴클레오타이드에 위치하는 것인, CASR (Calcium-sensing receptor) 유전자 일배체 검출용 물질을 포함하는 시나칼셋 반응 예측용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 rs1042636, rs1802757 및 rs10190 대립 유전자를 포함하는 CASR 유전자 일배체는 GCC, ATT, ACC 또는 ACT인, 시나칼셋 반응 예측용 조성물.
   
3. 단일뉴클레오타이드 다형성 rs1802757의 검출용 물질을 포함하는 시나칼셋 반응 예측 검출용 조성물로, 상기 rs1802757은 서열번호 2의 1093번째 뉴클레오타이드에 위치하는 것인, 시나칼셋 반응 예측용 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 서열번호 2의 1093번째 뉴클레오타이드에 위치하는 다형성 염기는 T인, 시나칼셋 반응 예측용 조성물.
   
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 검출용 물질은 핵산증폭방법, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 교잡, 염기서열 분석법, 교잡법, 5‘뉴클레아제 분해법, 단일가닥 구조 다형성, 프라이머 특이적 신장법, 또는 올리고라이게이션 분석법에 사용되는 물질인, 시나칼셋 반응 예측용 조성물.
   
6. 시나칼셋의 치료가 필요한 대상체의 시나칼셋에 대한 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하기 위해서,
   상기 대상체 유래의 생물학적 시료를 제공하는 단계;
   상기 시료에서 단일뉴클레오타이드 다형성(SNP, single nucleotide polymorphism) rs1042636, rs1802757 및 rs10190의 대립 유전자형을 분석하는 단계; 및
   상기 분석 결과 상기 대립 유전자형이 GCC인 경우 상기 대상체는 시나칼셋 반응군으로, 상기 대립 유전자형이 ATT인 경우 상기 대상체는 시나칼셋 불응군으로 판단하는 단계를 포함하는, CASR 유전자의 대립 유전자 형을 검출하는 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 대립 유전자형은 핵산증폭방법, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 교잡, 염기서열 분석법, 교잡법, 5‘뉴클레아제 분해법, 단일가닥 구조 다형성, 프라이머 특이적 신장법, 또는 올리고라이게이션 방법으로 분석되는 것인, 방법.
   
8. 제 6 항에 있어서,
   상기 시나칼셋의 치료가 필요한 대상체는 이차부갑상선기능항진증 환자인 것인, 방법.
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