KR101359782B1

KR101359782B1 - 간세포암종의 재발 진단용 단일 염기 다형성

Info

Publication number: KR101359782B1
Application number: KR1020110025175A
Authority: KR
Inventors: 정영화; 유은실; 이영주; 김정아; 이종은
Original assignee: 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2010-03-22
Filing date: 2011-03-22
Publication date: 2014-02-07
Also published as: CN102906276B; KR20110106245A; US20130023442A1; CN102906276A

Abstract

본 발명은 간세포암종의 재발 진단용 단일 염기 다형성(SNP)에 관한 것으로, 상기 SNP는 간세포암종 수술후 재발 위험성과 높은 상관관계를 나타내므로, 이러한 SNP를 이용하여 간세포암종의 재발 진단용 마이크로어레이 또는 진단키트를 개발할 수 있으며, 간세포암종의 재발 방지용 약물을 스크리닝함으로써 간세포암종의 수술후 재발을 방지할 수 있다.

Description

간세포암종의 재발 진단용 단일 염기 다형성{Single nucleotide polymorphism for recurrence of hepatocellular carcinoma}

본 발명은 간세포암종 수술후 재발을 예측하는 데에 유용한 단일 염기 다형성(SNP), 이를 이용한 간세포암종의 재발 진단용 마이크로어레이 또는 진단키트 및 간세포암종의 재발 개선용 약물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

간세포암종(hepatocellular carcinoma; HCC)은 우리나라 암 발생과 사망에서 전체 악성 종양 중 3위를 차지할 만큼 매우 흔하고 중요한 암이다. 간세포암종은 악성 종양 중에서 가장 대표적인 과혈관성(hypervascular) 종양이다.

간세포암종에 관한 가장 바람직한 치료법은 수술이지만, 종양의 절개할 수 없는 크기 및 수, 나쁜 간기능, 다양한 간내 또는 원격 전이 등으로 인하여 간세포암종 환자 중 10 내지 20% 이하의 환자들만이 수술을 할 수 있다. 심지어 수술이 가능한 간세포암종 환자에서도 수술후 잦은 재발이 오랜 기간 생존에 주요한 제한요소로 작용하고 있다.

간세포암종의 발생과 빠른 진행에는 여러 가지 기전이 관여하는데, 그 중에서도 저산소증에 의한 혈관 신생(angiogenesis)의 촉진이 매우 중요한 역할을 한다. 또한, 간 내에 저산소증이 발생할 경우, 전이성 종양 항원 1(metastatic tumor antigen 1; MTA1)은 저산소증 유도 인자(hypoxia inducible factor 1; HIF1)를 구조적으로 안정화시킴으로써 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)의 발현을 증가시켜 악성 종양의 혈관 신생 과정에 기여하게 된다(Moon EJ, et al., 2004; Moon EJ, et al., 2006).

한편, B형 간염 바이러스 감염 후 5-10 % 정도가 만성 B형 간염으로 이행하게 되고 이들 중 일부는 간경변이나 드물게 간세포암종이 발생하게 된다. 이렇듯 B형 간염 바이러스 감염 후 나타나는 다양한 임상경과는 바이러스 자체의 차이 뿐만 아니라 각 개인이 가지고 있는 유전적 소양의 차이에 따른 것으로 생각되고 있다.

유전적 소양이란 개인마다 유전자에 미세한 차이가 있다는 것을 말하는데, 최근 인간 유전체 연구를 통해 이 차이가 사람마다 어느 정도인지 보고되고 있다. 유전자의 기능에 변화를 주는 유전적 변이들 중에 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms; SNPs)이 있는데, 인간유전체에 존재하는 SNPs는 약 11백만 개의 SNPs 중에서 710,000개의 다형성이 유전자 내에 존재한다(NCBI, dbSNP).

이러한 염기 배열상의 작은 변화가 실제로 각종 질병에 대한 감수성 등에 영향을 주는지에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 이러한 특성을 결정하는 유전자를 발견하려는 노력을 하고 있다(Ludwig JA, and Weinstein JN, 2005; Suh Y, and Vijg J, 2005; Chanock S, 2001).

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자는 간세포암종의 수술후 재발과 의미있는 상관관계를 나타내는 SNP를 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 간세포암종 수술후 재발을 예측하는 데에 유용한 단일 염기 다형성(SNP)을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 단일 염기 다형성(SNP)을 이용한 간세포암종의 재발 진단용 마이크로어레이를 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 간세포암종의 재발 진단용 키트를 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 단일 염기 다형성(SNP)을 이용한 간세포암종의 재발 진단방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 단일 염기 다형성(SNP)을 이용한 간세포암종의 재발 방지용 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221)[서열번호 1]의 C 대립유전자 (CC 또는 GC 유전자형); IGF2 유전자의 -13021C/T(rs3741208)[서열번호 2]의 T 대립유전자 (CT 또는 TT 유전자형); FGF2 유전자의 66378C/T(rs1048201)[서열번호 3]의 T 대립유전자 (CT 또는 TT 유전자형); FGF2 유전자의 50012A/G(rs6534367)[서열번호 4]의 G 대립유전자 (GG 또는 GA 유전자형); IGF2 유전자의 6310(rs2585)[서열번호 5]/4702(rs3802971)[서열번호 6]의 GC 반수체형; IGF2 유전자의 -11228(rs2239681)[서열번호 7]/-13021(rs3741208)[서열번호 2]의 동형접합체 CC 반수체형; 및 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681)[서열번호 7]/-13021(rs3741208)[서열번호 2]의 CT 반수체형으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포암종의 재발 예측용 단일 염기 다형성(SNP)을 제공한다.

상기 간세포암종의 재발은 간세포암종으로 근치적 간절제술을 시행한 환자에서의 수술 후 재발에 관한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 간세포암종의 재발 예측용 단일 염기 다형성(SNP)의 폴리뉴클레오타이드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포암종의 재발 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 간세포암종의 재발 진단용 마이크로어레이는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제작될 수 있으며, 예를들어 상기 간세포암종의 재발 진단용 마이크로어레이를 구성하는 폴리뉴클레오타이드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 및 알데하이드로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있고, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조 일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이를 포함하는 간세포암종의 재발 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 진단용 키트는 본 발명의 마이크로어레이 이외에 피검체로부터 해당 SNP를 포함하는 DNA를 분리 및 증폭하는데 사용되는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 본 발명의 서열을 참조하여 당업자는 용이하게 설계할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 SNP를 지노타이핑하기 위해서 단일 염기 연장(single-base extension, SBE) 반응을 이용하는 간세포암종의 재발 진단용 키트를 제공한다. 이 경우 증폭(정방향 및 역방향) 및 연장(지노타이핑) 프라이머들을 단일 염기 연장(single-base extension, SBE) 용으로 설계해야 한다.

상기 단일 염기 연장 반응을 이용하는 간세포암종의 재발 진단용 키트는 SNaPshot 방법의 유전형 분석용 키트일 수 있다.

상기 단일 염기 연장 반응을 이용하는 간세포암종의 재발 진단용 키트는 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221)[서열번호 1]의 C 대립유전자(CC 또는 CG 유전자형); IGF2 유전자의 -13021C/T(rs3741208)[서열번호 2]의 T 대립유전자(CT 또는 TT 유전자형); IGF2 유전자의 6310(rs2585)[서열번호 5]/4702(rs3802971)[서열번호 6]의 동형접합체 GC 반수체형; 및 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681)[서열번호 7]/-13021(rs3741208)[서열번호 2]의 CT 반수체형 여부를 확인할 수 있도록 설계된 것이다.

본 발명의 일 실시예는 IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 증폭용 정방향 프라이머; IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 증폭용 역방향 프라이머; IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 지노타이핑용 프라이머; IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 정방향 프라이머; IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 역방향 프라이머; IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 지노타이핑용 프라이머; IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 증폭용 정방향 프라이머; IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 증폭용 역방향 프라이머; IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 지노타이핑용 프라이머; IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 증폭용 정방향 프라이머; IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 증폭용 역방향 프라이머; IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 지노타이핑용 프라이머; IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 증폭용 정방향 프라이머; IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 증폭용 역방향 프라이머; 및 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 지노타이핑용 프라이머를 포함하고 단일 염기 연장 반응을 이용하는 간세포암종의 재발 진단용 키트를 제공한다.

일 실시예에 따르면, 상기 간세포암종의 재발 진단용 키트에서 상기 IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 증폭용 정방향 프라이머는 서열번호 17의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 증폭용 역방향 프라이머는 서열번호 18의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 지노타이핑용 프라이머는 서열번호 35의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 정방향 프라이머는 서열번호 20의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 역방향 프라이머는 서열번호 21의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 지노타이핑용 프라이머는 서열번호 36의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 증폭용 정방향 프라이머는 서열번호 37의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 증폭용 역방향 프라이머는 서열번호 38의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 지노타이핑용 프라이머는 서열번호 39의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 증폭용 정방향 프라이머는 서열번호 40의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 증폭용 역방향 프라이머는 서열번호 41의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 지노타이핑용 프라이머는 서열번호 42의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 증폭용 정방향 프라이머는 서열번호 43의 프라이머; 상기 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 증폭용 역방향 프라이머는 서열번호 44의 프라이머; 및 상기 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 지노타이핑용 프라이머는 서열번호 45의 프라이머일 수 있다.

또한, 본 발명은 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221)의 C 대립유전자 (CC 또는 GC 유전자형); IGF2 유전자의 -13021C/T(rs3741208)의 T 대립유전자 (CT 또는 TT 유전자형); FGF2 유전자의 66378C/T(rs1048201)의 T 대립유전자 (CT 또는 TT 유전자형); FGF2 유전자의 50012A/G(rs6534367)의 G 대립유전자 (GG 또는 GA 유전자형); IGF2 유전자의 6310(rs2585)/4702(rs3802971)의 GC 반수체형; IGF2 유전자의-11228(rs2239681)/-13021(rs3741208)의 동형접합체 CC 반수체형; 및 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681)/-13021(rs3741208)의 CT 반수체형으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 뉴클레오타이드 중 어느 하나 이상의 다형성 부위의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포암종의 재발 진단방법을 제공한다.

상기 핵산은 DNA, mRNA 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함할 수 있다.

상기 다형성 부위의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 뉴클레오타이드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화하는 단계 및 얻어진 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

예를 들어 대상자의 조직, 체액 또는 세포로부터 DNA를 분리해 낸 후 PCR을 통해 DNA를 증폭시킨 후 SNP 분석을 실시한다. SNP 분석은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 실시간 PCR 시스템을 이용하여 SNP 분석을 수행하거나, 디데옥시법에 의해 직접적인 핵산의 뉴클레오타이드 서열의 결정을 통하여 수행할 수 있으며, 또는 SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오타이드 서열을 결정하거나, 대립형질 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe ybridization), 대립형질 특이적 증폭 방법(allele-specific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오타이드 결합 어세이법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis) 및 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism) 등을 이용하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 간세포암종의 재발 진단용 단일 염기 다형성(SNP)의 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 후보물질과 접촉시키는 단계; 및 후보물질이 상기 폴리펩티드의 기능을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포암종의 재발 방지용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 폴리펩티드와 후보물질 간의 반응 확인은, 단백질-단백질, 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질과 후보물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 상기 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 간세포암종의 재발 진단제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명에 따르면, 간세포암종 수술후 재발을 예측하는 데에 유용한 단일 염기 다형성(SNP)을 제공함으로써 이러한 SNP를 이용하여 간세포암종의 재발 진단용 마이크로어레이 또는 진단키트를 개발할 수 있으며, 간세포암종의 재발 개선용 약물을 스크리닝함으로써 간세포암종의 수술후 재발을 방지할 수 있다.

도 1은 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 위치에서의 유전자형에 따른 간세포암종 누적 재발율을 나타낸 것이고,
도 2는 IGF2 유전자의 -13021C/T(rs3741208) 위치에서의 유전자형에 따른 간세포암종 누적 재발율을 나타낸 것이고,
도 3은 IGF2 유전자의 6310(rs2585)/4702(rs3802971)의 GC 반수체형에 따른 간세포암종 누적 재발율을 나타낸 것이고,
도 4는 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681)/-13021(rs3741208)의 CC 반수체형에 따른 간세포암종 누적 재발율을 나타낸 것이고,
도 5는 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681)/-13021(rs3741208)의 CT 반수체형에 따른 간세포암종 누적 재발율을 나타낸 것이고,
도 6 내지 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 간세포암종의 재발 진단용 키트를 이용한 간세포암종의 재발 진단용 단일 염기 다형성 여부를 확인하기 위한 지노타이핑 결과를 나타낸 것이다.

이하, 하기 실시 예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> SNP 선별

혈관신생과 관련 유전자, 즉 VEGF, HIF1a, IGF2, FGF2, MTA1의 ± 2kb 구간 내에 포함되는 쌍대립인자(biallelic) SNP를 대상으로 하였다. 이러한 유전자의 SNPs 위치는 이미 알려져 있는 유전자 정보(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/project/SNP)를 참고로 하여 주로 5'비번역, 프로모터, 엑손 및 유전자좌 부위를 선택하였다.

대상 SNPs ID는 다음과 같다.

rs699947, rs25648, rs3025000, rs3025010, rs3025035, rs3025040, rs10434, rs998584, rs45533131/ rs1957757, rs2301113, rs2057482/ rs2585, rs3802971, rs3213221, rs3741212, rs2239681, rs3741208, rs1004446, rs7924316, rs3842748, rs2070762/ rs308395, rs308428, rs11938826, rs17472986, rs308442, rs308379, rs308381, rs6534367, rs1048201, rs3747676/ rs4983413, DL1002505.

상기 SNPs 중에서 반수체형(haplotype) 빈도가 5% 이상을 나타내는 SNPs을 선택하여 PHASE software v2.1.을 이용하여 반수체형의 빈도를 분석하였으며, 또한 Haploview program v3.2(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/index.php)를 이용하여 linkage disequilibrium을 분석하였다.

<실시예 2> SNP 유전자형 분석

1.SNP 유전자형 분석

실시예 1의 SNP을 포함하는 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트와 SNP 부위를 포함하는 TaqMan 프로브를 primer express software를 이용하여 제작하였다. TaqMan 프로브는 SNP의 서열에 따라 야생형과 돌연변이 대립유전자에 맞는 각각의 프로브를 제작하였다.

TaqMan 프로브의 한 쪽은 형광 염료를 태킹하였고 다른 한 쪽에는 형광 염료의 색을 억제할 수 있는 퀀처를 태깅하여 프로브를 제작하였다. 이때 야생형과 돌연변이 대립유전자에 각각 다른 색의 형광 염료를 태깅하였다.

하기 표 1에 기재된 세 종류의 프라이머를 함께 섞은 후 PCR 반응을 실행하면 Taq 폴리머라아제의 엑소뉴클리아제(exonuclease) 활성 성질에 따라 단일염기쌍 미스매치를 구분할 수 있었다.

rs No.	Strand	프라이머 서열
rs1048201	Forward	정방향	ATGATATACATATCTGACTTCCCAA (서열번호 8)
		역방향	AAGAGACTGGTATAAAATCAGAATTCA (서열번호 9)
		지노타이핑	CGTGCCGCTCGTGATAGAATAGCTCCAGGATTTGTGTGCTGTTGC (서열번호 10)
rs6534367	Forward	정방향	TTCTTCTATTATGCARTTGTTTGAAG (서열번호 11)
		역방향	TTACATTCTCAACTAGTGTTCTACATTG (서열번호 12)
		지노타이핑	ACGCACGTCCACGGTGATTTATAAATRTATACAATTTTGATTATT (서열번호 13)
rs308428	Forward	정방향	GCATGTTTTGGGAACCAA (서열번호 14)
		역방향	ATTAAAACCCTCCATTGACTCC (서열번호 15)
		지노타이핑	CGTGCCGCTCGTGATAGAATGAAGTTTGGAATGGCAAGAAGTAAG (서열번호 16)
rs3741208	Reverse	정방향	acaggtaaagcttccttcc (서열번호 17)
		역방향	gccatcaggaggagaga (서열번호 18)
		지노타이핑	CgACTgTAggTgCgTAACTCgagggcVgttgttgcctctcccggY (서열번호 19)
rs2585	Forward	정방향	AATGTCACCTGTGCCTGC (서열번호 20)
		역방향	TTAAAGACAAAACCCAAGCATG (서열번호 21)
		지노타이핑	TGCGGCCCGTGTTTGACTYAACTCA (서열번호 22)
DL1002505	Forward	정방향	TGTCCGGCAGCAGGAGGA (서열번호 23)
		역방향	ACGCACACTGCCAGACCA (서열번호 24)
		지노타이핑	aggactgggcctcctgcgtgctggc (서열번호 25)
rs308395	Forward	정방향	gaggcacgtccatacttg (서열번호 26)
		역방향	cagcgtctcacacactga (서열번호 27)
		지노타이핑	ctcttctatggcctactttctactg (서열번호 28)
rs11938826	Forward	정방향	TTGGGGAAGGCTGATAAT (서열번호 29)
		역방향	GCCATATTTCGGCTAACA (서열번호 30)
		지노타이핑	CCCAGAAAAGAGGGTACTTCACACCAG (서열번호 31)
rs3213221	Reverse	정방향	taggacggaggccaggtc (서열번호 32)
		역방향	aggtgcccctcccaaac (서열번호 33)
		지노타이핑	aattttacacgagggKtgaccatct (서열번호 34)

SNP 마커 분석 결과는 2명 이상의 연구자가 독립적으로 call하여 읽은 결과의 일치성을 검증하여 최종 결과로 판정하였다. 개인의 SNP 마커 결과는 단일 염기 다형성 대립인자에 따라 주대립인자 동형체 (major allele homozygote), 이형체(heterozygote), 소수 대립인자 동형체 (minor allele homozygote)로 나타내었다. 전체 대상자에 대한 결과는 주대립인자와 소수대립이자의 비율 및 세 가지 유전자형의 빈도로 표시하고 Hardy-Weinberg equilibrium을 검증하였다.

MTA1의 간세포암종 조직내 발현과 SNPs 사이의 연관관계 및 상대적 위험도는 오즈비(odds ratio)를 산출하였으며, student's t 검정과 카이제곱 검정 등을 이용하였다.

2. 결과

수술후 재발과 유의한 연관성이 있는 SNPs는 IGF2 와 FGF2 유전자에서 발견되었다. IGF2 유전자에서는 -291 C/G (rs3213221)의 C 대립유전자 (CC 또는 GC 유전자형) (P=0.005)이나 -13021 (rs3741208)의 T 대립유전자 (CT 또는 TT 유전자형) (P=0.003)을 가지는 경우 수술 후 재발이 유의하게 많았다.

FGF2 유전자의 경우는 66378 C/T (rs1048201)의 T 대립유전자 (CT 또는 TT 유전자형) (P=0.044)이나 50012 A/G (rs6534367)의 G 대립유전자 (GG 또는 GA 유전자형) (P=0.019)를 가질 때 수술 후 재발 위험성이 유의하게 높았다.

반수체형(Haplotype) 분석에서는 IGF2 유전자에서만 통계적 유의성을 찾을 수 있었다. IGF2 유전자의6310(rs2585)/4702(rs3802971) 위치의 반수체형 GC를 가지는 환자에서 유의하게 재발이 높았다 (OR 1.653 (1.149-2.379), P=0.02). 특히 동형접합체 GC 반수체형을 가지는 환자의 경우에서는 그렇지 않은 환자들에 비해 간세포암종의 재발이 유의하게 높았다(OR 2.779 (1.205-6.40), P=0.04). 또한 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681)/-13021(rs3741208) 위치에서는 CT 반수체형이 수술 후 높은 재발률과 관련이 있었으며(OR 1.88 (1.247-2.834), P=0.006), 반면 동형접합체 CC 반수체형 환자들에서 수술 후 재발률이 유의하게 낮았다 (OR 0.243 (0.07-0.841), P=0.049).

또한, 각각의 SNP에 따라 수술 후 누적 재발율을 비교해 보았을 때 IGF2 유전자의 -291 C/G (rs3213221)의 C 대립유전자 (CC 또는 GC 유전자형)의 경우가 GG 유전자형에 비해 누적 재발율이 유의하게 높음을 알 수 있었다 (P=0.009). C 대립유전자 (CC 또는 GC 유전자형)의 경우와 GG 유전자형의 경우 1년째 누적 재발률이 도 1과 같이, 각각 32.5%와 22%였으며, 2년과 3년째 누적 재발률은 그룹별로 각각 46.9%, 34.5%와 64.4%,. 39.6%을 나타내었다. 도 2와 같이, IGF2 유전자의 -13021 C/T (rs3741208) 위치에서 T 대립유전자 (CT 또는 TT 유전자형)를 보이는 경우가 CC 유전자형을 보이는 경우에 비해 수술 후 누적 재발률이 유의하게 높았다 (CT or TT vs. CC; 1년째 누적재발률33.5% vs. 22.9%, 2년 52% vs. 34.2%, 3년 74.4% vs. 38.4%, P=0.001).

도 3과 같이, IGF2 유전자의 6310(rs2585)/4702(rs3802971) 위치에서 동형접합체 GC 반수체형을 보이는 경우가 수술 후 재발률이 GC 반수체형이 전혀 없거나 이형접합체인 경우에 비해 유의하게 높았다 (P=0.019). 또한, IGF2 유전자의 -11228(rs2239681)/-13021(rs3741208) 위치에서 CC 반수체형과 CT 반수체형이 유의한 관련성을 나타내었다. -11228/-13021 CC 동형접합체의 경우 누적 재발률이 의미있게 낮았다 (P=0.027) (도 4 참조). 그리고, 도 5와 같이 -11228/-13021 CT 반수체형을 가지는 환자들에서 CT 반수체형이 전혀 없는 환자들에 비해 수술 후 재발률이 의미있게 높았다 (P=0.001).

< 실시예 3> 간세포암종의 재발 진단용 키트 및 간세포암종의 재발 진단용 단일 염기 다형성 분석 방법

간세포암종 수술 후 재발을 예측하는 데에 유용한 단일 염기 다형성 부위 rs3741208, rs2585, rs2239681, rs3802971 및 rs3213221의 단일 염기 다형성의 지노타이핑을 위한 증폭(정방향 및 역방향) 및 연장(지노타이핑)용 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다. 하기 서열번호 35의 경우(5′-GCCTSCTGACCACCAGCAAGAAATTGGACAGGAGACYGARGAGAAA-3′), 서열번호 46 (5′-GCCTGCTGACCACCAGCAAGAAATTGGACAGGAGACCGAAGAGAAA-3′), 서열번호 47 (5′-GCCTGCTGACCACCAGCAAGAAATTGGACAGGAGACTGAAGAGAAA-3′), 서열번호 48 (5′-GCCTCCTGACCACCAGCAAGAAATTGGACAGGAGACCGAAGAGAAA-3′), 서열번호 49 (5′-GCCTCCTGACCACCAGCAAGAAATTGGACAGGAGACTGAAGAGAAA-3′), 서열번호 50 (5′-GCCTGCTGACCACCAGCAAGAAATTGGACAGGAGACCGAGGAGAAA-3′), 서열번호 51 (5′-GCCTGCTGACCACCAGCAAGAAATTGGACAGGAGACTGAGGAGAAA-3′), 서열번호 52 (5′-GCCTCCTGACCACCAGCAAGAAATTGGACAGGAGACCGAGGAGAAA-3′) 및 서열번호 53 (5′-GCCTCCTGACCACCAGCAAGAAATTGGACAGGAGACTGAGGAGAAA-3′)가 약 1:1:1:1:1:1:1:1:1을 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.

rs No.	Strand	프라이머 서열
rs3741208	Reverse	정방향	5′-ACAGGTAAAGCTTCCTTCC-3′ (서열번호 17)
		역방향	5′-GCCATCAGGAGGAGAGA-3′ (서열번호 18)
		지노타이핑	5′-GCCTSCTGACCACCAGCAAGAAATTGGACAGGAGACYGARGAGAAA-3′ (서열번호 35)
rs2585	Forward	정방향	5′-AATGTCACCTGTGCCTGC-3′ (서열번호 20)
		역방향	5′-TTAAAGACAAAACCCAAGCATG-3′ (서열번호 21)
		지노타이핑	5′-GGTCCMCCTTGCGGCCCGTGTTTGACTYAACTCA-3′ (서열번호 36)
rs2239681	Forward	정방향	5′-GTTGGAGCTGGAGGCACA-3′ (서열번호 37)
		역방향	5′-AAATCAGCCTGAAGAGTCACC-3′ (서열번호 38)
		지노타이핑	5′-AGCTGGAGGCACATGGATTGGAGTCCCTGTACCTGCCCCA-3′ (서열번호 39)
rs3802971	Forward	정방향	5′-ATCATCTTTGCCCRTCTCC-3′ (염기서열 40)
		역방향	5′-ACTTCCTACCCCAGAACTCC-3′ (염기서열 41)
		지노타이핑	5′-GGGGGCCGTGCACTGATG-3′ (염기서열 42)
rs3213221	Reverse	정방향	5′-CCCTGCAGCTGTGGATGC-3′ (서열번호 43)
		역방향	5′-CCATGTGCAGAATGAAGC-3′ (서열번호 44)
		지노타이핑	5′-GCTGAGCTCCTGCAATAATGACCGTG-3′ (서열번호 45)

1) PCR 증폭

단일 염기 다형성을 포함하는 부위를 먼저 다중 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR 반응 시 이용되는 PCR 반응 용액의 조성 및 PCR 반응 조건은 각각 하기 표 3 및 표 4와 같다. 보다 상세하게는, 검체시료로부터 DNA를 분리하여 상기 PCR 반응의 주형 DNA로 이용하였다. PCR 반응은 약 95℃에서 약 15분간 전변성(predenaturion)시키고(1 cycle), 약 94℃에서 약 30초 변성(denaturation), 약 55℃에서 약 1분 30초 어닐링(annealing), 약 72℃에서 약 1분 30초 연장(elongation)의 조건을 1사이클로 35사이클, 약 72℃에서 약 10분간 최종 연장(final elongation)시켰다. 상기 반응물은 약 4℃에서 최종 홀드(final hold) 시켰다. 상기 PCR 반응에는 상기 표 2의 각각의 단일 염기 다형성에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 PCR 반응을 위한 프라이머가 이용되었다.

시약(Reagent)	부피(1 웰 당 분량) (㎕)
10X buffer	1
MgCl₂ (25mM)	1.4
dNTP (10mM)	0.3
primer pool (100pmol/㎕)	0.24
Taq (5U/㎕)	0.2
증류수(DW)	5.86
DNA	1
총합계(Total)	10

온도	시간	사이클(cycle)
95℃	15분	1
94℃	30초	35
55℃	1분 30초
72℃	1분 30초
72℃	10분	1
4℃	∞	-

2) PCR 생성물 정제(PCR product purification): SAP & Exo I 처리 (10㎕)

프라이머 확장을 위한 PCR 반응(SNaPshot 반응)을 완성하기 위하여, 상기 PCR 생성물의 정제를 수행하였다. 다시 말해, 상기 PCR 생성물에 하기 SAP & Exo I를 처리하였다. 상기 생성물의 정제의 반응 물질의 조성 및 반응 조건은 각각 하기 표 5 및 표 6과 같다.

물질(Material)	부피 (㎕)
SAP (1 unit/㎕)	5
Exo I (10 unit/㎕)	0.2
PCR 생성물	4
증류수	0.8
총합계(Total)	10

반응온도	반응시간
37℃	1시간
72℃	15분

3) SNaPshot 반응: 단일 염기 연장(one base extension)을 위한 PCR 반응

상기 정제된 PCR 생성물에 SNaPshot Reaction Premix(Applied Biosystems, CA, USA) 및 상기 표 2의 각각의 단일 염기 다형성에 대한 지노타이핑 프라이머를 혼합하여 준 후, PCR 반응을 수행하였다. SNaPshot 반응 물질의 조성 및 반응 조건은 각각 하기 표 8 및 표 9와 같다. PCR 반응은 약 96℃에서 약 10초 변성(denaturation), 약 50℃에서 약 5초 어닐링(annealing), 약 60℃에서 약 30초 연장(elongation)의 조건을 1사이클로 25사이클 수행하였다.

물질(Material)	부피 (㎕)
SNaPshot Ready Reaction Premix	5
Genotyping primer pool (0.15pmol/㎕)	1
정제된 PCR 생성물	2
증류수	2
총합계(Total)	10

반응온도	반응시간
96℃	10초
50℃	5초
60℃	30초
25 사이클(cycle)	-

4) SAP 처리: 반응하고 남은 올리고뉴클레오타이드 제거 과정

반응하고 남은 올리고뉴클레오타이드를 제거하기 위하여, 상기 SNaPshot 반응 산물에 SAP를 첨가 처리하였다. 상기 SAP 처리 반응 물질의 조성 및 반응 조건은 각각 하기 표 9 및 표 10과 같다.

물질(Material)	부피 (㎕)
SAP (1 unit/㎕)	1
증류수	1

반응온도	반응시간
37℃	1시간
72℃	15분

5) 러닝(running)

ABI 3730XL(Applied Biosystems, CA, USA)과 같은 자동 염기서열분석기(automatic sequencer)로 분석하였다. 이때, 분석 결과의 형광색으로 단일 염기 다형성(SNP) 위치에 어떤 뉴클레오타이드 서열(nucleotide sequence)가 있는지를 확인하였다.

6) 데이터 분석

단일 염기 연장이 끝난 생성물을 자동 염기서열분석기인 ABI 3730XL을 통해 분석하면 표지(labeling)된 부분만을 검출하여 도 6 내지 8과 같이 피크로 나타나게 된다. 상기 피크로 나타낸 형광색을 분석(각 염기별로 서로 다른 색의 형광 다이(dye)로 표지된 ddNTP를 사용함)하여 단일 염기 다형성 부위의 서열을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 실시예(실시예 3)에 따른 간세포암종 예후의 진단용 키트 및 간세포암종 예후의 진단용 단일 염기 다형성 분석 방법을 사용할 때, 간세포암종 수술 후 재발을 예측하는 데에 유용한 단일 염기 다형성 부위 중 rs3741208, rs2585, rs2239681, 및 rs3213221의 단일 염기 다형성은 다중으로 분석 가능하였으나, 간세포암종 수술 후 재발을 예측하는 데에 유용한 단일 염기 다형성 부위인 rs3802971의 경우 다중으로 분석할 수 없었고, 단일 분석이 필요한 것으로 나타났다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221)의 C 대립유전자 (CC 또는 GC 유전자형); IGF2 유전자의 -13021C/T(rs3741208)의 T 대립유전자 (CT 또는 TT 유전자형); FGF2 유전자의 66378C/T(rs1048201)의 T 대립유전자 (CT 또는 TT 유전자형); FGF2 유전자의 50012A/G(rs6534367)의 G 대립유전자 (GG 또는 GA 유전자형); IGF2 유전자의 6310(rs2585)/4702(rs3802971)의 GC 반수체형; IGF2 유전자의-11228(rs2239681)/-13021(rs3741208)의 동형접합체 CC 반수체형; 및 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681)/-13021(rs3741208)의 CT 반수체형으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 단일 염기 다형성(SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 수단을 포함하는 간세포암종의 재발 예측용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 간세포암종의 재발은 간세포암종으로 근치적 간절제술을 시행한 환자에서의 수술 후 재발인 것을 특징으로 하는 간세포암종의 재발 예측용 조성물.
IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 증폭용 정방향 프라이머;
IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 증폭용 역방향 프라이머;
IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 지노타이핑용 프라이머;
IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 정방향 프라이머;
IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 역방향 프라이머;
IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 지노타이핑용 프라이머;
IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 증폭용 정방향 프라이머;
IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 증폭용 역방향 프라이머;
IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 지노타이핑용 프라이머;
IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 증폭용 정방향 프라이머;
IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 증폭용 역방향 프라이머;
IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 지노타이핑용 프라이머;
IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 증폭용 정방향 프라이머;
IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 증폭용 역방향 프라이머; 및
IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 지노타이핑용 프라이머를 포함하고 단일 염기 연장 반응을 이용하는 간세포암종의 재발 예측용 키트.
제 3항에 있어서, 상기 IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 증폭용 정방향 프라이머는 서열번호 17의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 증폭용 역방향 프라이머는 서열번호 18의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 -13021(rs3741208) 부위 지노타이핑용 프라이머는 서열번호 35의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 정방향 프라이머는 서열번호 20의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 역방향 프라이머는 서열번호 21의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 6310(rs2585) 부위 증폭용 지노타이핑용 프라이머는 서열번호 36의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 증폭용 정방향 프라이머는 서열번호 37의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 증폭용 역방향 프라이머는 서열번호 38의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681) 부위 지노타이핑용 프라이머는 서열번호 39의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 증폭용 정방향 프라이머는 서열번호 40의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 증폭용 역방향 프라이머는 서열번호 41의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 4702(rs3802971) 부위 지노타이핑용 프라이머는 서열번호 42의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 증폭용 정방향 프라이머는 서열번호 43의 프라이머;
상기 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 증폭용 역방향 프라이머는 서열번호 44의 프라이머; 및
상기 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221) 부위 지노타이핑용 프라이머는 서열번호 45의 프라이머인 것을 특징으로 하는 간세포암종의 재발 예측용 키트.
검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 IGF2 유전자의 -291C/G(rs3213221)의 C 대립유전자 (CC 또는 GC 유전자형); IGF2 유전자의 -13021C/T(rs3741208)의 T 대립유전자 (CT 또는 TT 유전자형); FGF2 유전자의 66378C/T(rs1048201)의 T 대립유전자 (CT 또는 TT 유전자형); FGF2 유전자의 50012A/G(rs6534367)의 G 대립유전자 (GG 또는 GA 유전자형); IGF2 유전자의 6310(rs2585)/4702(rs3802971)의 GC 반수체형; IGF2 유전자의-11228(rs2239681)/-13021(rs3741208)의 동형접합체 CC 반수체형; 및 IGF2 유전자의 -11228(rs2239681)/-13021(rs3741208)의 CT 반수체형으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 이상의 다형성 부위의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 포함하는 간세포암종의 재발 예측용 유전자형 분석방법.
제 5항에 있어서, 상기 다형성 부위의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 뉴클레오타이드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화하는 단계 및 얻어진 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포암종의 재발 예측용 유전자형 분석방법.
제 1항 또는 제 2항에 따른 간세포암종의 재발 예측용 조성물에 포함된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 후보물질과 접촉시키는 단계; 및 후보물질이 상기 폴리펩티드의 기능을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포암종의 재발 예측용 약물의 스크리닝 방법.