KR101141185B1 - 치료의 제안된 효능 검출용 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 아리피프라졸(aripiprazole) 처리에 반응하는 마커를 확인하는 방법에 관한 것이다:

(a) 정신장애(psychiatric disorder)를 가진 환자의 시료(specimen)로부터 게놈 DNA 도파민 D2 수용체(Dopamine D2 Receptor, DRD2) 유전자 또는 이의 상보적인 가닥을 제조하는 단계;

(b) 상기 DRD2 유전자의 TaqIA 다형성의 유전자형을 결정하기 위해 상기 게놈 DNA 또는 이의 상보적인 가닥의 서열을 분석하는 단계; 및

(c) 상기 다형성을 마커로 이용하여 정신장애를 가진 환자에 대한 아리피프라졸 처리의 제안된 높은 치료적 효과를 확인하는 단계.

유전적 다형성 마커, 정신신경증성 질환, 정신장애, 도파민 D2 수용체(Dopamine D2 Receptor, DRD2), 아리피프라졸(aripiprazole), 제안된 효과.

Description

치료의 제안된 효능 검출용 마커{MARKER FOR DETECTING THE PROPOSED EFFICACY OF TREATMENT}

본 발명은 유전적 다형성 마커를 이용하여 정신신경증성 질환(psychoneurotic diseases)을 가진 환자에 대한 아리피프라졸(aripiprazole) 용도의 치료적 효과를 확인하는 방법, 상기 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드, 및 검출용 키트에 관한 것이다.

약물 동력학인 약물 반응성과 관련된 효소 및 단백질의 유전적 다형성은 유전체학의 발달과 함께 급속도로 명확해지고 있다. 인간 게놈 분석에 있어서, 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)은 가장 빈번한 유전적 다형성 마커로서 주목을 끌고 있다.

상기 SNP는 흔한 질환 및 약물 반응과 관련된 인간 게놈을 분석하는데 유용한 것으로 알려져 있다(Brookes, A. J., "The essence of SNPs", Gene, USA, (1999), 234, 177-186; Cargill, M, et al., "Characterization of single-nucleotide polymorphisms in coding regions of human genes", Nature Genet., USA, (1999), 22, 231-238; Evans, W. E., & Relling, M. V., "Pharmacogenomics: translating functional genomics into rational therapeutics", Science, USA, (1999), 286, 487-491).

또한, 복수의 SNP들을 이용한 반수체(haplotype) 분석은 복잡한 유전적 인자들과 관련된 질환에서 질환 감수성을 분석하는데 유용하다(Schlaak, J.F., et. al., "Cell-type and Donor-specific Transcriptional Responses to Interferon-α" J. Biol. Chem., (2002) 277, 51, 49428-49437).

최근에, 맞춤형 의료의 확립을 야기하는 개별 환자의 특정 유전적 다형성과 약물 민감성/약물 반응 사이 관계 해명에 관해 연구되고 있다.

아리피프라졸(aripiprazole)은 부분적인 도파민-세로토닌 작용제(dopamine-serotonin agonist)로서 도파민 D2 수용체(dopamine D2 receptor, DRD2)에 작용하며, 기존의 항정신병 약제(antipsychotic medicine)와는 다른 작용 기작을 가진다(US 5,006,528).

아리피프라졸은 DRD2가 과도하게 자극될 때 DRD2에 대한 억제 작용을 하고, DRD2에 대한 자극이 낮을 때 DRD2를 활성화시키는 작용을 함으로써 뇌에서 도파민 신경의 안정화 작용을 하는 것으로 고려된다(Reist C., et al.：Current Pharmacogenomics (2005) 3, 305-317).

아리피프라졸은 부분적인 도파민-세로토닌 작용제 특성을 가진 것으로 의료 실습에 소개된 첫번째 비정형 항정신병 약제이다. 부분적 작용제로서, 아리피프라졸이 도파민 신경전달을 작용시키는 효과를 나타내거나 약화시키는지는 내생의 도 파민 톤(tone)에서 부위별 변화에 의존될 수 있다. 따라서, 아리피프라졸은 평점 방식에서 뇌 부위내 도파민 활성을 차별적으로 조절하는 치료적 이점을 제공한다. 이런 작용 기작은 양성증상(예를 들면, 환각과 망상)이 증가된 중변연계 도파민 활성과 관련된 반면에, 중간 피질계 도파민 경로에서 감소된 활성이 음성증상(예를 들면, 무의욕증 및 무쾌감증) 및 인지장애를 야기하는 것에 관한 정신분열증의 도파민 가설의 문맥에서 고려된다. 이런 치료적 전망에도 불구하고, 아리피프라졸에 대한 항정신성 반응은 높은 변수가 있으며, 일부 환자는 약물 치료에 전혀 반응하지 않는다.

아리피프라졸과 관련된 응급 치료 부작용은 일부 환자들에서 불면증, 불안, 정좌불능증 또는 정신이상의 악화를 포함한다. 이런 관측은 정신병적 장애에서 아리피프라졸의 작용 메커니즘이 도파민 D2 수용체에서 단순한 부분적 작용 효과에 의한 단독으로 예상되는 것보다 더 복잡한 것을 제시한다.

예를 들면, 아리피프라졸이 도파민 과잉행동증을 약화시키는 반면에 레서핀이 투여된(하이포 도파민성) 쥐에서 운동 활성을 증가시키지 않으며, 이는 행동의 부분적 작용제 방식과 완전히 일치하는 것이 아니다.

Reist C. 등은 아리피프라졸이 신호 파트너의 숙주, 및 로컬 G 단백질 보체 및 농축에서의 변이와 난잡한 상호작용에 의해 특정되는 세포 환경에 대해 의존적인 도파민 D2 수용체의 다양한 효과를 유도할 수 있다고 보고한 바 있다. 이런 다양성은 약물 동력학에서의 유전적 변이, 및 생체 아민 수용체들 및 이들의 다운스트림 신호 파트너를 포함하는 항정신병에 대한 분자적 표적에 대한 통합 데이타의 중요성을 보여주는 기회를 제공한다. 진단과 치료의 결합에 의해 형성된 분자적 의료의 새로운 하위전문분야인 치료진단학은, 항정신병적 치료 결과의 맥락에서 다양한 종류의 바이오마커(DNA 및 단백질을 기초로 한)를 합성하기 위한 잠재성을 제공한다. 도파민 수용체의 유전적 변이는 광범위한 장소에서 고려되기 때문에, 본 발명자들은 5-HT1A(HTR1A) 및 5-HT2A(HTR2A) 수용체에 관해 암호화하는 유전자, 및 CYP2D6- 및 CYP3A4-매개 아리피프라졸 대사의 다양성에 대한 약제유전체학적 중요성을 논의한 바 있다(Christopher Reist, et al., Current Pharmacogenomics, Vol. 3, No. 4. (December 2005), pp. 305-317.).

DRD2 TaqIA 유전자형의 A1 및 A2 대립유전자에 대한 정신분열증을 가진 환자에서 A1 대립유전자은 복잡성을 가지지 않은 환자에 비해 신경이완 악성 증후군(Neuroleptic Malignant Syndrome)을 가지는 정신분열증 환자에서 유의적으로 우성이기 때문에, 신경이완 악성 증후군 및 DRD2 TaqIA 다형성 사이에 관련성이 있다는 것이 보고된 바 있다. 상기 보고서의 표 1에서는 A1/A1이 정신분열증을 가진 환자에서 A2/A2 및 A2/A1로 비교된 종속형이 된 것을 보여주고 있다(Am J. Psychiatry, (2001) 158,1714-1716:Suzuki A., et al.).

이전 연구들은 DRD2 TaqIA 다형성의 하나 또는 둘의 A1 대립유전자을 가지는 개체가 A1 대립유전자을 가지지 않은 개체 보다 더 낮은 DRD2 밀도를 가지고 있음을 입증한 바 있다. 본 연구는 DRD2 TaqIA 유전자형이 정신분열증 환자에서 선택적 도파민 길항제인 네모나프리드(nemonapride)에 대한 치료적 반응과 관련되는지를 조사하는 것에 목적을 두었다. 상기 환자들은 본 연구의 적어도 한달 전 동 안 약물을 투여받은 적 없는 25명의 심하게 악화된 정신분열증 입원 환자였다. 네모나프리드의 고정된 투여량(18 mg/day)을 각 환자에게 3주 동안 투여하였다. 임상 상태는 치료 전 및 치료 3주 후에 Brief Psychiatric Rating Scale(BPRS)에 의해 가망성을 모니터하였다. TaqIA 유전자형(A1 및 A2 대립유전자)은 중합효소 연쇄반응 방법에 의해 결정하였다. 3명의 환자는 A1 대립유전자에 대해 상동성을 가지고, 11명의 환자는 A1 및 A2 대립유전자에 대해 이형성을 가지며, 11명의 환자는 A2 대립유전자에 대해 상동성을 가졌다. 하나 또는 둘의 A1 대립유전자을 가지는 환자들(n=14)은 3주 치료 후 A1 대립유전자이 없는 환자들(n = 11) 보다 총 BPRS 및 양성 증상에서 유의성있게 높은 비율의 개선을 보여준 반면에, 다른 부분적 증상(음성, 불안-우울, 흥분 및 인지증상)의 개선은 두 개의 유전자형군 사이에 유사하였다. 이런 결과는 DRD2 TaqIA 다형성이 정신분열증 환자에서 네모나프리드에 대한 초기 치료적 반응과 관련되고, 이는 중추신경계에서 약물의 DRD2 길항작용의 효능을 조절함에 의한 것임을 제시한다.

본 발명의 주요 목적은 높은 치료적 효과를 획득하는 것이 가능한 투여 환자를 찾기 위해, 정신분열증(schizophrenia)을 가진 환자에 대한 아리피프라졸(aripiprazole)의 치료 효과를 결정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 정신분열증을 가진 환자의 맞춤형 의료(personalized medicine)를 위한 마커를 발견하기 위해 정신분열증을 가진 환자에 대한 부분적인 도파민-세로토닌(dopamine-serotonin) 작용 특성을 가지는 아리피프라졸의 치료적 효과와 관련된 유전적 다형성을 연구한 결과, 건강한 성인 집단에서 가지고 있지 않은 Taq IA 유전자형의 종속형(A1/A1)이 주요형(A2/A2, A2/A1)에 비해 치료적 효과와 유의적으로 관련되고 부작용에서 차이가 없으므로 상기 유전자형이 정신분열증을 가진 환자에 대한 맞춤형 의료를 위한 마커가 될 가능성이 있음을 확인하였으며, 높은 치료적 효과를 획득하는 것이 가능한 투여 환자를 사전에 검출 및 발견할 수 있는 확인용 마커를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

(1) 하기의 단계를 포함하는 아리피프라졸의 치료에 대한 반응 마커를 확인하는 방법:

(a) 정신장애(psychiatric disorder)를 가진 환자의 시료로부터 게놈 DNA 도파민 D2 수용체(Dopamine D2 Receptor, DRD2) 유전자 또는 이의 상보적인 가닥을 제조하는 단계;

(b) 상기 DRD2 유전자의 TaqIA 다형성의 유전자형을 결정하기 위해 상기 게놈 DNA 또는 이의 상보적인 가닥의 서열을 분석하는 단계; 및

(c) 상기 다형성을 마커로 이용하여 정신장애를 가진 환자에 대한 아리피프라졸(aripiprazole) 처리의 제안된 높은 치료적 효과를 확인하는 단계.

(2) 상기 (1)의 방법에 있어서, 상기 DRD2 유전자내 TaqIA의 유전자형은 A1A1, A1A2 및 A2A2로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 유전자형이다.

(3) 상기 (1)의 방법에 있어서, 상기 DRD2 유전자내 TaqIA의 유전적 다형성(DRD2 TaqIA 다형성)은 참고 dbSNP(Database of Single Nucleotide Polymirphism) 등록번호: rs1800497이다.

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 정신장애는 정신분열증(Schizophrenia), 정신분열형 장애(Schizophreniform disorder) 또는 분열 정동형 장애(Schizoaffective disorder)로부터 선택되는 적어도 어느 하나이다.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 마커는 하기 (a) 내지 (c)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전적 다형성이다:

(a) T/T (유전자형 A1A1)인 다형성;　

(b) T/C (유전자형 A1A2)인 다형성; 및

(c) C/C (유전자형 A2A2)인 다형성;

여기서, 상기 다형성은 DRD2 유전자를 포함하는 AF050737 내 32806번째에 위치한다.

(6) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 유전적 다형성은 직접적인 뉴클레오티드 서열분석(direct nucleotide sequencing), 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 도트불랏분석[allele-specific oligonucleotide (ASO)-dot blot analysis], 단일 뉴클레오티드 프라이머 신장 분석(single nucleotide primer extension assay), PCR 단일 가닥 형태 다형성 분석[PCR-single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis], PCR 제한효소 단편 길이 다형성 분석[PCR-restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) analysis], 침입자 분석(Invader assay), 정량적 실시간 PCR 분석(quantative real-time PCR assay), 및 질량분석기를 이용한 유전적 다형성 분석[genetic polymorphism assay employing a mass spectrometer (mass array]으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 기술을 통해 검출된다.

(7) 상기 (6)의 방법에 있어서, 상기 유전적 다형성은 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장 분석을 이용하여 검출된다.

(8) 상기 (6) 또는 (7)의 방법에 있어서, 상기 유전적 다형성은 AF050737 내 32806번째에 위치하는 상기 다형성의 위치로부터 1 내지 몇 개의 염기에 3' 말단 위치를 가지는 서열번호: 3의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드, 또는 상기 올리고뉴클레오티드 중 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 또는 프라이머를 이용하여 검출된다.

(9) 상기 (6)의 방법에 있어서, 상기 PCR 제한효소 단편 길이 다형성 분석은 AF050737 내 32806번째에 위치하는 T/T, T/C 또는 C/C 검출용 제한효소(Taq I)를 이용하여 수행된다.

(10) 하기의 단계를 포함하는 정신장애를 가지는 환자에 대한 아리피프라졸의 치료적 효과를 결정하는 방법:

(a) 정신장애를 가진 환자의 시료로부터 게놈 DNA DRD2 유전자 또는 이의 상보적인 가닥을 제조하는 단계;

(b) 상기 DRD2 유전자의 TaqIA 다형성의 유전자형을 결정하기 위해 상기 게놈 DNA 또는 이의 상보적인 가닥의 서열을 분석하는 단계; 및

(c) 상기 다형성을 마커로 이용하여 정신장애를 가진 환자에 대한 아리피프라졸 처리의 제안된 높은 치료적 효능을 결정하는 단계.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용된, 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드 서열, 핵산 서열 등의 약어는 IUPAC-IUB 명명법[IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)], "뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함하는 명세서 등의 제조에 대한 가이드라인"(edited by Japan Patent Office), 및 관련 분야에서 일반적으로 적용되는 기호에 따른다.

본 발명에서 사용된, "유전적 다형성" 또는 "다형성"은 하나의 유전자 자리에 위치된 대립 유전자들군 또는 각 군에 속하는 각각의 대립 유전자를 의미한다. 단지 하나의 염기가 차이가 있는 다형성은 구체적으로 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)을 의미한다. 단일염기다형성은 본 발명에서 "SNP"로 나타내었다. 용어 "일배체형"은 연속하는 유전자 부위 또는 유전자 집단에서 다중 다형성의 조합을 의미한다.

게다가 본 발명에서, 유전자형은 특정 유전적 다형성 부위에서 유전자 자리에 대한 대립유전자의 상태를 나타낸다. 예를 들면, AF050737에서 32806번 위치의 SNP에 대한 유전자형은 C/T 이형접합체, 또는 T/T 및 C/C 동종접합체로 나타내어진다. 본 발명에 있어서, C/C 동종접합체인 야생형 동형접합체 A2/A2, 및 C/T 이형접합체인 동형접합체 A2/A1는 주요형이고, T/T 동형접합체인 동형접합체 A1/A1는 종속형으로 나타낸다. 종속형 A1/A1이 TaqIA 유전자형의 T/T임을 포함하는 정신병 질환을 가지는 개체가 주요형 A2/A2 또는 A2/A1이 C/C 또는 C/T임을 포함하는 정신병 질환을 가지는 개체 보다 아리피프라졸의 사용에 의해 관찰되는 유의성있는 치료적 효과가 더 높은 가능성이 있음이 예측된다. 따라서, TaqIA 유전자형은 종속형 A1/A1이 TaqIA 유전자형임을 포함하는 정신병 질환을 가지는 환자에서 아리피프라졸의 사용에 의한 높은 치료적 효과를 획득하기 위한 확인 마커로 사용될 수 있다.

게다가, 본 발명에서 밝혀낸 인간 유전자의 유전자 서열은 GenBank와 같은 뉴클레오티드 서열 데이타베이스의 각 등록번호에서 보여주는 뉴클레오티드 서열을 근거로 한다. 게다가, 본 발명에서 사용된 SNP 위치 및 인간 유전적 다형성에 대한 정보는 참고 SNP ID 번호(예를 들면, rs 1800497)로 나타낸다(reference SNP (refSNP) Cluster Report; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP cluster 참조). 본 발명에서 SNP에 대한 정보는 참고 SNP ID 번호에 의해 밝혀낸다.

TaqIA DRD2 다형성의 참고 SNP ID 번호는 rs1800497이다.

본 발명의 표적 SNP는 DRD2 유전자를 포함하는 게놈 서열 AF050737에서 32806번에 위치한다.

제한효소 TaqI는 그 외 TthHB8I 및 TflI로 알려져 있다. EsaBC3는 동일한 인식 서열을 절단한다.

DRD2 유전자의 GenBank 등록번호는 X51362이다.

본 발명에서 사용된, 용어 "유전자"는 이중 가닥 DNA를 구성하는 단일 가닥 DNA(센스 가닥 또는 안티센스 가닥) 뿐만 아니라 이중 가닥 DNA를 포함한다. 별도로 특정하지 않는다면, 본 발명에서 적용되는 유전자(DNA)는 인간 게놈 DNA를 포함하는 이중 가닥 DNA, cDNA(센스 가닥)을 포함하는 단일 가닥 DNA, 센스 가닥에 상보적인 서열을 가지는 단일 가닥 DNA, 및 이들의 단편을 포함한다. 상기 유전자(DNA)는 조절 부위, 암호화 부위, 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 RNA 및 DNA를 포함한다. 용어 "DNA"는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 이의 단편, 상동체, 유도체 및 돌연변이를 포함한다. 용어 "돌연변이"는 자연적으로 발생하는 대립유전자 치환, 비자연적으로 발생하는 대립유전자 치환, 변경(결손, 치환, 첨가 또는 삽입)을 통해 획득된 돌연변이, 및 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 기능이 치환에 의해 변화되지 않는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 예를 들면, 돌연변이 또는 번역 후 변형 등을 통한 자연적으로 발생하는 아미노산 서열의 변경은 돌연변이를 유전자 내로 도입함에 의해 인위적으로 수행될 수 있다.

본 발명은 인간 유전자의 특정 위치에서의 유전자형[도파민 D2 수용체(dopamine D2 receptor, DRD2) 유전자에서 TaqI 제한 효소에 존재하는 것으로 보고된 유전자]을 포함하는 특정 SNP 또는 SNP들인 유전적 다형성이 정신병 질환의 아리피프라졸 처리에 의한 치료적 효과와 매우 연관성이 있고, 아리피프라졸 처리로 계획된 정신병 질환을 가지는 환자에 대한 치료적 효과가 유전적 다형성(특정 위치에서의 유전자형)을 검출함에 의해 사전에 결정될 수 있음의 발견을 기초로 완성되었다. 다시 말하면, 본 발명은 인간 특이적 유전적 다형성, 특히 특정 SNP들이 아리피프라졸이 처리된 개체에 대한 약물 치료적 효과의 결정 마커로 사용될 수 있음을 발견함에 의해 완성되었다.

본 발명의 방법에 따르면, 정신병 질환을 가지는 개체를 위한 아리피프라졸 처리의 치료적 효과가 개체의 특정 SNP 또는 SNP들을 검출함으로써 결정될 수 있다.

본 발명의 방법은 아리피프라졸이 사용되는 개체로부터 유래된 시료의 인간 특이적 유전자의 다형성, 즉 도파민 D2 수용체(DRD2) 유전자에서 TaqI 제한효소 부위에 존재하는 유전적 다형성(유전자형)을 검출하기 위해 필수적인 요건을 제공한다.

본 발명의 방법에 의해 검출되는(분석되는) SNP들, 즉 정신병 질환을 가지는 개체에 대한 아리피프라졸 처리와 관련된 유전적 다형성(또는 유전자형)은, 구체적으로 유전자형 A1/A1[T/T 동종접합체: 유전자형이 DRD2 유전자를 포함하는 게놈 서열 AF050737에서 32806번에 위치하는 유전적 다형성]이다. 검출되는 SNP들은 도파님 D2 수용체 유전자(DRD2) 유전자에서 TaqlA의 유전적 다형성인 참고 SNP ID 번호: rs1800497을 가진다.

본 발명에 따르면, 유전적 다형성(SNP들 및 일배체형) 및 인간 특이적 유전자의 유전자형을 검출함으로써, 정신병 질환을 가지는 개체에 대한 아리피프라졸 처리의 치료적 효과, 기능의 설명, 및 정신병 질환을 가지는 개체에 대한 아리피프라졸 처리의 치료적 효과의 예후 진단의 확인을 위해 정보를 제공하거나 유용한 수단을 제공하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명에 따르면, 정신병 질환을 가지는 환자에 대한 치료 방법을 결정하는 이유가 되는 정보, 특히 아리피프라졸 처리가 정신병 질환을 가지는 환자를 위한 개별적으로 맞추어지는 맞춤의학을 위한 치료 방법으로 권장되는지 아닌지를 결정하는 중요한 정보를 제공하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, 정신병 질환을 가지는 개체는 상업적으로 이용가능한 아리피프라졸 제형(예를 들면, 아빌리파이 TM 정), 장용성 코팅 제형, 저장 제형, 파우더 제형, 급속붕해정, 구강 용액, 급속 용융 구강정을 포함하는 아리피프라졸로 처리된다. 이런 아리피프라졸 제형은 단독으로 또는 다른 항정신병약과 조합으로 사용될 수 있다.

SNP들을 가지는 인간 유전자 샘플의 제조

본 발명에 따르면, 정신병 질환을 가지는 환자의 시료로부터 유래한 도파민 D2 수용체 또는 이의 상보적인 가닥을 포함하는 게놈 DNA 샘플을 제조한다(단계 a). 게놈 DNA 샘플은 특정 유전적 다형성들(SNP들), 특히 DRD2 유전자에서 TaqIA 다형성의 A1A1에 의해 제시되는 SNP들[T/T 동종접합체: DRD2 유전자를 포함하는 게놈 서열 AF050737(참고 SNP ID 번호: rs1800497)에서 32806번에 위치하는 유전자형이 T/T(유전자형)인 유전적 다형성]을 포함한다. 상기 게놈 DNA는 개체(예를 들면, 정신병 질환을 가지는 환자)로부터 일반적인 방법에 의해 제조된다. 또한, 상기 샘플은 유전적 다형성을 가지는 DNA의 상보적 가닥을 가진다.

상기 cDNA 또는 게놈 DNA의 원천은 SNP들을 포함하는 DRD2 유전자를 가지는 다양한 세포 및 조직, 및 이들로부터 유래된 배양된 세포를 포함한다. 상기 원천의 특정 예시로는 혈액(예를 들면, 혈청 또는 혈장), 타액, 림프액, 기도점액, 소변 및 정액 등의 체액을 포함한다. 상기 원천 물질(샘플로서 제공되는)은 바람직하게 아리피프라졸의 투여 전에(다른 약물이 아리피프라졸의 투여 전에 투여되는 경우를 포함) 인간 개체로부터 유래된 DNA 또는 게놈 DNA이다. 상기 원천 물질로부터 RNA의 분리, mRNA의 분리 및 정제, cDNA의 제조, 이의 클로닝 등은 보편적인 방법을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 특정 인간 유전자의 게놈 서열 또는 이의 상보적인 가닥(예를 들면, TaqI DRD2 유전자의 A1A1을 가지는 유전자 또는 이의 상보적인 가닥)이 상기 유전적 샘플로부터 제조된다. 유전적 샘플의 제조는 본 발명의 기재된 DRD2 유전자의 특정 서열 데이타를 기초로하는 보편적으로 적용되는 유전공학기술에 의해 용이하게 수행될 수 있다[예를 들면, Molecular Cloning 2nd Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); 또는 Zoku Seikagaku Jikken Koza "Idenshi Kenkyuho I, II, III" edited by The Japanese Biochemical Society (1986) 참조].

보다 구체적으로, 게놈 DNA 또는 mRNA은 DRD2 유전자의 표적 게놈 서열의 제조를 위해, 제한효소, DRD2 TaqIA 다형성의 특정 다형성 부위를 포함할 수 있는 프로브[예를 들면, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 78, 6613 (1981); or Science, 222, 778 (1983) 참조]를 이용하는 보편적인 방법에 의해 추출되었다. 특히, DRD2 유전자의 표적 게놈 서열은 표적 SNP의 DNA 서열과 선택적으로 혼성화될 수 있는 SNP 부위를 포함하는 프로브를 제조한 다음, 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장 분석(single nucleotide primer extension assay), 침입자 분석(Invader assay), 정량적 실시간 PCR 분석 등을 수행함에 의해 제조된다.

스크리닝을 위해 적용되는 프라이머는 DRD2 TaqIA 다형성의 연속하는 뉴클레오티드 서열 데이타를 기초로 고안된 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 이런 프라이머들은 예를 들면, 자동화된 합성 기구 등의 보편적인 방법에 의해 합성될 수 있다. 스크리닝용 프로브는 일반적으로 표지화된 프로브이다. 그러나, 스크리닝 프로브는 직접적으로 또는 간접적으로 표지된 시약에 특이적으로 결합하는 한 표지되지 않은 프로브일 수 있다. 상기 프로브 또는 리간드의 표지화 시약 및 표지화 기술은 이미 당업계에 잘 알려져 있다. 표지화 시약의 예시로는 방사능 동위원소 표지 시약, 비오틴, 형광 염료, 화학발광 시약, 효소(예를 들면, 루시퍼라제) 및 항체를 포함하며, 이들은 새김눈 번역(nick translation), 무작위 프라이밍(random priming) 또는 키나아제 처리(kinase treatment) 등과 같은 알려진 표지화 기술을 통해 통합될 수 있다.

이렇게 추출된, DRD2 TaqIA의 SNP 부위를 포함하는 DNA 또는 mRNA는 유전자 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있다. 이런 유전자 증폭은 본 발명의 방법을 통해 보다 용이하고 정확한 검출이 가능하다. 유전자 증폭 방법의 예시로는 PCR(Saiki, R. K., Bugawan, T. L., et al., Nature, 324, 163-166 (1986)), NASBA(Comptom, J., Nature, 650, 91-92 (1991)), TMA(Kacian, D. L., and Fultz, T. J., US Patent No. 5,399,491 (1995)), 및 SDA(Walker, G. T., Little, M. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 89, 392-396 (1992))를 포함한다. 예를 들면, PCR의 방법에 의해 증폭된 유전자 단편은 겔 전기영동과 같은 보편적인 기술을 통해 분리 및 정제될 수 있다. 또한, 이런 유전자 단편의 정제는 컬럼의 사용에 의해 수행될 수 있다. 유전자 단편 정제는, 예를 들면 질량분석 또는 전기영동을 통해 확정될 수 있다. 이렇게 증폭된 유전자 단편의 특성에 따라, 상기 유전자 단편은 본 발명에서 적용되는 DRD2 TaqIA 다형성의 A1A1 유전자형의 검출을 위해 적용된다.

다형성의 검출

본 발명의 방법에 따라, 상기 샘플에서 특정 유전자의 게놈 부위내 위치하는 DNA를 시퀀싱(sequencing) 및 분석하여 SNP 존재 유무(SNP의 결정)를 검출할 수 있다. 특히, 상기 검출은, 예를 들면 하기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나를 통해 수행될 수 있다.

(1) 직접적 뉴클레오티드 시퀀싱

다형성의 검출은 직접적 뉴클레오티드 시퀀싱 방법을 통해 특정 유전자의 DNA 서열을 결정함으로써 수행될 수 있으며, 상기 방법은 유전자의 시퀀싱을 위해 보편적으로 적용된다: 예를 들면, 디데옥시(dideoxy) 방법(Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463-5467 (1977)) 또는 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법[Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)]. 유전적 다형성 검출은 상기 직접적 뉴클레오티드 시퀀싱 방법 및 DNA 증폭 방법(예를 들면, PCR)의 조합을 통해 수행될 수 있다. 특히, 상기 직접적 뉴클레오티드 시퀀싱 방법, 및 PCR 또는 유사한 DNA 증폭 방법의 조합이 바람직하고, 이는 상기 조합이 소량의 DNA 샘플이 필요하고 간단하고 신속하게 높은 민감도 및 정확도를 가진 검출이 가능하기 때문이다.

근본적으로, 이런 바람직한 방법은, 예를 들면 PCR에 의해 증폭된 게놈 DNA 단편 또는 디데옥시 방법, 막삼-길버트 방법 또는 유사한 방법을 이용한 이의 정제된 산물에 대해 직접적 뉴클레오티드 시퀀싱을 수행함으로써 수행될 수 있다. 편의를 위해, 바람직한 방법은, 예를 들면 상업적으로 이용가능한 시퀀싱 키트의 사용에 의한 뉴클레오티드 시퀀싱을 통해 수행될 수 있다. 따라서, 상기 인간 유전자의 특정 게놈 DNA 부위에서의 다형성의 존재가 검출될 수 있다.

상기 방법 및 하기 기재된 방법에 있어서, PCR에 의해 증폭된 DNA 단편에 대해 특별히 한정되는 것은 아니며, 적어도 하나의 다형성이 일어나는 것으로 기대되는 특정 부위를 포함하는 DNA 단편이면 가능하다. 상기 DNA 단편은 일반적으로 약 50 내지 수천개의 bp, 바람직하게 50 내지 수백개의 bp의 길이를 가진다.

(2) 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 도트블랏 방법(dot blot method)

또한, 특정 유전적 다형성의 검출은 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(allele-specific oligonucleotide, ASO) 도트블랏 방법을 통해 수행될 수 있다(Conner, B. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S .A. , 80, 278-282 (1983)). 이런 방법은, 예를 들면 표적을 샌드위치하기 위해 고안된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 사용에 의해 PCR로 증폭된 유전자 단편이 SNP 부위를 포함하는 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화되는, 도트블랏 분석을 통해 수행될 수 있다. 따라서, 상기 유전자 단편의 SNP의 존재가 결정될 수 있다.

(3) 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장 분석

또한, 특정 유전자 다형성의 검출은, 일본특허출원 Laid-Open (kokai) No. 2000-279197에 기재된 SNaPshot 분석, 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 또는 점 돌연변이 검출 분석 등과 같은, 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장 분석을 통해 수행될 수 있다. 이런 분석에 있어서, 표적 다형성(SNP) 직전 뉴클레오티드(또는 몇 개의 뉴클레오티드)에 대응하는 것으로 고안된 프로브(즉, 3'-말단이 다형성의 하나 또는 상위(업스트림) 몇 개의 뉴클레오티드에 대응하는 것으로 고안된 프로브)가 DNA 샘플에 어닐링된다. 상기 각 분석은 상업적으로 이용가능항 SNP 검출 키트 및 상기 키트에 첨부되는 소프트웨어의 사용에 의해 수행될 수 있다.

예를 들면, SNaPshot 분석은 ABI PRISM SNaPshot ddNTP 프라이머 연장 키트(PE Applied Biosystems)의 사용에 의해 수행될 수 있다. SNP의 검출은 ABI PRISM 310/377/3100/3700 DNA 분석기(PE Applied Biosystems) 및 GeneScan 소프트웨어의 사용에 의한 반응 후에 생성되는 형광 단편의 검출 및 분석을 통해 수행될 수 있다.

파이로시퀀싱은, 예를 들면 다음과 같은 절차를 통해 수행될 수 있다. 특히, 게놈 DNA는 예를 들면 보편적인 방법을 통해 혈액 샘플로부터 분리하는 단계; 수십 내지 수백개의 뉴클레오티드(다형성을 포함)를 비오틴 표지된 프라이머의 사용에 의해 PCR로 증폭하는 단계; 단일 가닥 DNA를 자석 비드(magnet bead)의 사용에 의해 정제하는 단계; 및 상기 정제된 DNA를 샘플로 적용하는 단계. 표적 다형성의 상위(업스트림) 몇 개의 뉴클레오티드에 대응하는 상보적인 서열을 가지는 것으로 고안된 프라이머를 샘플에 어닐링한 다음, 각 dNTP를 소프트웨어에 입력하는 다형성의 근접해 있는 서열에 따라 차례로 상기 혼합물에 첨가한다. DNA 폴리머라제의 뉴클레오티드 연장으로부터 분리된 피로인산(Pyrophosphoric acid, PPi)은 ATP 설퓨리라제(sulfurylase)에 의해 ATP로 전환하고, 루시퍼라제가 상기 ATP를 이용하여 CCD 카메라 등의 화학발광 검출기로 검출될 수 있는 검출가능한 빛을 생성하게 한다. 따라서, 유전자형 분류(genotyping)는 dNTP들의 첨가를 통해 획득된 발광의 피크를 분석함으로써 수행될 수 있다. 이런 방법은 96개의 샘플에 대해 약 15분 내에 유전자형 분류가 가능하다.

상기 방법은 일반적으로 적용되는 시약 및 기구를 사용할 수 있다. 예시로는 하기 4가지 효소인 DNA 폴리머라제, ATP-설퓨리라제, 루시퍼라제 및 아피라제(apyrase)의 혼합물, 루시페린(luciferin) 및 APS(adenosine 5'-phosphosulfate)를 포함하는 기질 용액, dATP(deoxyadenosine 5'-triphosphate), dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 dNTP을 구성성분으로 포함하는 상업적으로 이용가능한 SNP Reagent Kit(Pyrosequencing AB)와 같은 시약; 및 자동화 DNA 서열 분석(Pyrosequencing AB)을 위한 PSQ96 시스템 등의 기구; 및 상기 분석(Pyrosequencing AB)을 위해 적용되는 SNP 소프트웨어를 포함한다.

또한, 파이로시퀀싱은 예를 들면 미국특허번호 6,159,693에 기재된 방법을 통해 수행될 수 있다. 특히, 분리한 게놈 DNA를 PCR에 의해 증폭하는 단계; 상기 증폭된 PCR 산물을 정제하는 단계; 및 결과 산물이 READIT 시스템(Promega Corporation)의 사용에 의해 피로인산과 반응시킨 다음, 결과 데이타를 분석하는 단계.

(4) PCR 단일 염기 형성 다형성(SSCP) 분석

본 발명의 방법은 PCR-SSCP 방법을 적용할 수 있다(Orita, M., Iwahara, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2776-2770 (1989)). 상기 방법에 있어서, 증폭된 PCR 산물(단일 가닥 DNA)은 비변성된 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 적용시킨 다음, 단일 뉴클레오티드 다형성의 존재를 이동도 차이를 근거로 결정한다.

(5) PCR 제한효소 단편 길이 다형성(RFLP) 분석

본 발명에 있어서, 예를 들면 특정 유전자의 SNP 또는 일배체형의 검출을 위해 표적화된 다형성을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 제한효소 인식부위를 포함하는 경우에는, 상기 검출은 제한효소 단편 길이 다형성 분석을 통해 수행될 수 있다(RFLP 분석: Botstein, D. R., et al., Am. J. Hum. Gen., 32, 314-331 (1980)).

RFLP 방법은, 예를 들면 DRD2내 TaqIA 제한효소 다형성에서 유전적 다형성의 특정 위치에 있는 유전자형에 특히 의존적으로 수행될 수 있다. 예를 들면, DRD2 유전자를 포함하는 게놈 서열 AF050737내 32806번에 위치하는 유전자형이 T/T인 유전적 다형성을 검출하기 위한 것과 같이, DRD2내 TaqIA 제한효소 다형성의 특정 위치에 있는 유전자형을 얻을 경우, 상기 분석은 원하는 유전자형을 포함하는 서열 및 이의 전후 서열을 인식할 수 있는 제한효소를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 RFLP에 사용되는 효소는 목적 유전자형을 포함하는 서열 및 상기 서열의 전후 서열을 인식할 수 있는 공공연히 알려진 다양한 제한효소일 수 있다. 상기 RFLP 분석은, 더 바람직하게 PCR-RFLP 분석; 즉, PCR 또는 이의 변형을 통해 사전에 증폭 및 제조된 다량의 샘플 DNA에서 수행되는 분석으로 수행된다. 따라서, 다형성의 존재는 특정 절단 부위의 존재를 근거로 검출될 수 있다.

이런 방법에 따라 다형성을 검출함에 있어서, 우선, 상기 게놈 DNA는 인간 생물학적 샘플로부터 추출한 다음, 상기 유전자의 다형성을 포함하는 부위의 DNA 절편을 PCR 등을 이용하여 증폭하여, 대량의 DNA 샘플을 제조한다. 그런 다음, 상기 증폭된 DNA 샘플은 특정 제한 효소의 사용으로 분해한 후, DNA 절단 패턴(예를 들면, 절단의 존재, 또는 절단 단편의 염기 길이)을 겔 전기영동 등의 보편적인 방법을 통해 확인한다.

(6) 침입자 분석(Invader assay)

본 발명에 있어서, 특정 유전자의 SNP의 검출은 침입자 분석을 통해 수행될 수 있다. 상기 침입자 분석은 하기 간행물을 참고로 수행될 수 있다: Lyamichev, V., et al., Nat. Bioltechnol., 17(3) 292-296 (1999); 및 국제특허공개 WO 9823774(일본 Kohyo 특허공개번호 2001-526526). 상기 침입자 분석은 표적 DNA의 전처리 증폭의 필요 없이 게놈 DNA의 SNP의 분석이 가능하다. 예를 들면, 침입자 분석은 하기와 같이 수행된다.

예를 들면, DRD2내 TaqIA 다형성 등의 목표인 특정 유전자의 SNP가 존재하는지 또는 존재하지 않는지를 검출하기 위하여, 우선 게놈 DNA를 분리한다. 그런 다음, 15 내지 50 염기 길이로 구성된 5'-플랩(flap) 및 검출되는 뉴클레오티드(본 발명에서 SNP)가 5'-플랩의 3' 말단에 배열되고 상기 목표 유전자형의 뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드들은 표적 게놈 DNA에 상보적인 것으로 합성된 30 내지 수백개의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드로 구성된 첫번째 표적 프로브, 및 검출되는 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드가 3' 말단에 배열되고 그 외 뉴클레오티드들은 표적 게놈 DNA에 상보적인 것으로 합성된 15 내지 수십개의 염기 길이로 구성된 침입자 올리고뉴클레오티드 프로브는, 예를 들면 자동화 합성기(automatic synthesizer)에 의해 합성된다. 상기 분리된 게놈 DNA 및 첫번째 프로브의 5'-플랩을 절단하는 효소(플랩 엔도뉴클레아제)는 상기 프로브들에 동시에 첨가된 다음, 적절한 반응 용액에서 반응된다.

시료에서 게놈 DNA가 원하는 유전적 다형성(SNP)를 가지는 경우, 3' 말단에서 원하는 유전자형의 뉴클레오티드를 가지는 5'-플랩을 분리하는 첫번째 반응이 종결된다. 시료에서 게놈 DNA가 원하는 유전자형의 뉴클레오티드 서열을 가지지 않는 경우, 상기 효소에 의한 절단은 일어나지 않는다. 효소에 의해 절단되고 첫번째 프로브로부터 분리된 5'-플랩은 형광공명에너지전이(fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 프로브에 표적으로서 경쟁적으로 결합되고, 5'-플랩의 3' 말단은 FRET 프로브에 침입한다(침입자). 또한, 효소의 반응이 일어나고 억눌려진 형광염료가 방출된다.

그런 다음, 두번째 반응에 사용되는 FRET 프로브는 검출되는 표적의 존재여부에 관계없이 동일한 서열을 포함하고, 본질적으로 하기 두개의 성분으로 구성되는 것으로 제조된다.

(1) 첫번째 반응을 통해 절단된 산물에 상보적인 3' 부위; 및 (2) 표적과 혼성화되고, 리포터 형광염료 및 켄쳐(quencher) 형광염료를 포함하는, 단일가닥 프로브를 모방하기 위한 이중체를 형성하는 자기 상보적 부위(self-complementary region).

리포터 형광염료 및 켄쳐 형광염료가 동일한 프로브에 결합될 때, 리포터 형광염료의 형광 강도는 형광공명에너지 전이를 통해 억제된다. 반면에, 리포터 형광염료 및 켄쳐 형광염료가 동일한 프로브에 결합되지 않을 때, 리포터 형광염료의 형광 강도는 억제되지 않는다. 절단된 첫번째 프로브로부터 분리된 5' 플랩이 FRET 프로브와 혼성화될 때, 결과 산물은 두번째 반응에서 침입자 올리고뉴클레오티드로서 반응한 후, 효소에 의해 인식되는 침입자 복합체가 생산된다. 따라서, 상기 기재된 효소에 의해 FRET 프로브의 절단이 두개의 형광염료를 분리하여, 검출가능한 형광 신호를 산출한다. 상기 신호는, 예를 들면 표준 형광 마이크로타이터 플레이트 리더(standard fluorescence microtiter plate reader)의 사용에 의해 읽음으로써 표적 SNP(유전적 다형성)의 존재가 검출될 수 있다. 첫번째와 두번째 반응의 조합은 1×0⁶개의 인자에 의해 신호가 증폭될 수 있다. 다른 형광염료를 가지는 두개의 FRET 프로브의 적용은 SNP의 검출 또는 타이핑이 가능하다.

(7) 정량적 실시간 PCR 분석

본 발명에 있어서, 특정 유전자의 다형성의 검출은 정량적 실시간 PCR 분석(TaqMan 분석)에 의해 용이하게 수행된다. 이런 분석은, 예를 들면 하기의 절차를 통해 수행될 수 있다. 특히, 우선 표적 SNP의 유전적 다형성을 확인하기 위해, DNA 절편을, 예를 들면 상기 다형성(뉴클레오티드 부위)을 포함하는 적절한 부위에서 DNA 절편을 검출하기 위한 15 내지 39개의 뉴클레오티드로 형성된 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머로서 제조한다. 이런 경우에 있어서, 상기 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 다형성을 포함하지 않는 것으로 제조한다. 또한, 상기 프로브는 리포터 형광염료 및 켄쳐 형광염료를 모두 가지고, 예를 들면 증폭된 절편의 부분 서열에 대응하는 15 내지 50 bp 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것으로 제조한다. 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 모두가 혼성화되지 않는 부위가 선별된 것이다. 상기 프라이머는 표적 단일 뉴클레오티드 다형성의 존재를 검출하기 위해 대립 유전자 트이적 서열에 상보적인 서열을 가지는 것으로 고안된다. 상기 프로브의 사용에 의해, 검출되는 샘플의 특이적 유전자의 표적 DNA 절편, 예를 들면 TaqIA 다형성을 포함하는 DRD2 유전자가 PCR을 통해 증폭한 다음, 결과 반응 혼합물로부터 유래된 형광을 실시간 측정한다. 따라서, 다형성의 존재가 검출될 수 있다. 또한, 다른 형광염료를 가지는 두개의 프로브의 적용은 대립 유전자 모두의 검출이 가능하다.

상기 기재된 침입자 분석 또는 TaqMan 분석에 적용되는 리포터 형광염료는 바람직하게 FAM(6-carboxy-fluorescein)와 같은 플루오레세인(fluorescein) 형광염료인 반면에, 컨쳐 형광염료는 바람직하게 TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine)와 같은 로다민(rhodamine) 형광염료이다. 이런 형광염료들은 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 실시간 PCR 검출용 키트에 포함된다. 본 발명에 있어서, 상업적으로 이용가능한 형광염료가 적용될 수 있다. 리포터 형광염료 또는 컨쳐 형광염료의 결합 부위는 특별히 한정되지 않으며, 일반적으로 리포터 형광염료는 프로브를 구성하는 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단(바람직하게 5' 말단)에 결합하고, 켄쳐 형광염료는 다른쪽 말단에 결합된다. 올리고뉴클레오티드에 형광염료를 결합시키는 방법은 알려져 있으며, 예를 들면 Noble, et al., (1984), Nuc. Acids Res., 12: 3387-3403 or Iyer, et al., (1990), J. Am. Chem. Soc., 112: 1253-1254에 기재되어 있다.

TaqMan 분석 자체는 알려져 있으며, 상기 TaqMan 분석을 위한 기구 및 키트는 상업적으로 이용가능하다. 본 발명에 있어서, 상기 상업적으로 이용가능한 기구 또는 키트가 적용될 수 있다. 이런 기구 및 키트는, 예를 들면 일본 특허번호 2,825,976에 기재된 방법에 따라, 또는 ABI PRISM 7700 sequencing system user manual(PE Applied Biosystems)에 따라 본 발명을 수행하는데 적용된다.

(8) 질량분석기를 적용하는 유전적 다형성 분석(질량 어레이)

질량 어레이 분석은 다형성들 간에 분자량 차이를 검출한다. 특히, 검출되는 다형성을 포함하는 부위는 PCR을 통해 증폭한 다음, 연장 프라이머가 SNP의 위치 직전 서열과 혼성화한 후, ddNTP/dNTP 혼합물(예를 들면, ddATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 반응 혼합물)의 사용에 의해 연장 반응함으로써 SNP의 종류에 의존적인 길이를 가지는 절편을 산출한다. 결과 절편이 정제된 다음, 예를 들면 MALDI-TOF 질량 분석기의 사용에 의해 분석하여 분자량 및 유전적 다형성 간의 관계가 분석될 수 있다(Pusch, W., Wurmbach, JH., Thiele, H., Kostrzewa, M., MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping, Pharmacogenomics, 3 (4): 537-48 (2002)). 이런 분석은, 예를 들면 Sequenom Mass ARRAY high throughput SNP 분석 시스템(http://www.sequenom.com/Files/applications/hme_assay.html)의 사용에 의해 용이하게 수행될 수 있다.

(9) 그 외 검출 방법들

또한, 본 발명에 있어서 사용되는 유전자의 SNP의 검출은, 예를 들면 DNA 시퀀싱 방법 또는 다향성 또는 돌연변이 검출 방법으로 보쳔적으로 알려진 방법 중 어느 하나를 통해 수행될 수 있다. 상기 방법의 예시로는 하기와 같이 열거된다.

(9-1) 서열 특이적 올리고뉴클레오티드를 적용하는 PCR-SSO 방법

상기 방법은 SNP를 위한 프로브가 담체에 고정하는 단계; 샘플(유전자 증폭된 산물)을 상기 프로브와 혼성화하는 단계; 및 혼성화 효율에서의 차이를 미스매치의 존재를 기초로 결정하는 단계를 포함한다.

(9-2) 점 돌연변이 검출을 위한 PCR-SSP 방법

상기 방법은 점 돌연변이에 대응하는 뉴클레오티드가 3' 말단 뉴클레오티드인 것으로 고안되는 유전자 증폭을 위한 서열 특이적 프라이머를 사용하고, PCR 증폭 효율에서 유의적인 차이가 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드의 상보성에 의존적으로 일어나는 것을 이용하는 것이다.

(9-3) PCR-DGGE(변성 구배 겔 전기영동)

다형성을 포함하는 DNA 절편을 야생형 DNA 절편과 혼성화한 다음, 혼성화된 산물을 점진적으로 증가하는 변성제(예를 들면, 요소 또는 포름아마이드) 농도로 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동할 때, 상기 산물은 낮은 변성제 농도에서 단일 가닥의 DNA 단편으로 변환되고, 이는 미스매치되지 않는 상동의 이중 가닥 DNA 단편의 경우와 비교된다. 단일 가닥 DNA 단편은 이중 가닥 DNA 단편의 이동률 보다 다소 높게 이동함으로써 단일 뉴클레오티드 다형성이 DNA 단편의 이동성의 비교를 통해 검출될 수 있다.

(9-4) PCR-DGGE/GC 클램프 방법(Shefield, V. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 232-236 (1989))

상기 방법은 상기 기재된 PCR-DGGE의 변형으로, 높은 GC 농도를 가지는 부위가 다형성의 검출을 위한 표적 DNA 단편에 첨가된다. 상기 방법은 다형성 뉴클레오티드의 치환, 결손, 첨가 또는 삽입의 검출에서 PCR-DGGE의 불편함을 보완한 것이다. 상기 방법은 다향성 검출을 위한 표적 DNA 단편에 GC 클램프(clamp)를 첨가하는 단계를 요구한다.

(9-5) RNase 보호 분석(Finkelstein, J., et al., Genomics, 7, 167-172 (1990))

(9-6) 원위치 RT-PCR(In situ RT-PCR)(Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993))

(9-7) 원위치 혼성화(In situ hybridization)

(9-8) 서든 블랏팅(Southern blotting)(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press: NY. (1989))

(9-9) 도트 혼성화 분석(Dot hybridization)(예를 들면, Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98: 503-517 (1975) 참조)

(9-10) 형광 원위치 혼성화(Fluorescence in situ Hybridization, FISH)(Takahashi, E., et al., Hum. Genet., 86, 1416 (1990))

(9-11) 경쟁적 게놈 혼성화(Comparative genomic hybridization, CGH)(Kallioneimi, A., et al., Science, 258, 818-821 (1992); Spectral karyotyping: SKY: Rowley, J. D., et al., Blood, 93, 2038-2042 (1999))

(9-12) 프로브로서 효모 인공 크로모좀(yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 클론을 적용하는 방법(Lengauer, C., et al., Cancer Res., 52, 2590-2596 (1992)).

따라서, 본 발명에서 사용된 인간 유전자의 다형성(SNP) 또는 일배채형이 검출될 수 있다.

아리피프라졸(aripiprazole)을 처리한 정신병 질환의 다양한 정신신경증상을 가지는 환자가 본 발명의 마커로서 확인된 유전적 다형성을 가질 때, 상기 환자 대한 아리피프라졸 처리의 높은 개선 효과를 야기하는 가능성이 높은 것이 예측된다.

아리피프라졸이 다양한 방법으로 투여될 때 정신병 질환의 다양한 정신신경 증상에 개선 효과를 나타내는 높은 가능성을 가지는, 아리피프라졸 처리 대상에 있어서, 아리피프라졸이 투여될 때 정신병 질환의 다양한 정신신경 증상에 대한 개선 효과를 나타내는 가능성을 고려하는 경우, 아리피프라졸 처리가 저투여량으로 개시하는지 또는 다른 항정신성 약제(Psychotropic drug)가 아리피프라졸로 변환되는지를 고려함으로써 환자에 대한 불필요한 약제를 투여하는 기회를 줄이고, 약제 투여에 기인한 부작용 발생 및 사고를 줄일 수 있다.

특히, 본 발명의 방법에 따라 검출된 인간 유전자의 유전적 다형성은, 아리피프라졸을 처리할 때 정신신경 증상을 포함하는 정신병 질환에 대한 개선 효과의 가능성과 높은 연관성이 있다. 그러므로, 상기 다형성의 검출 결과를 기초로, 아리피프라졸 처리되는 개별 개체에 대한 맞춤 치료가 가능하고, 즉 이는 개별 환자에 대한 최선의 효능을 가지는 약제를 적절하게 선별하는 치료를 형성하는 것이 가능하다.

올리고뉴클레오티드

또한, 본 발명은 유전적 다형성의 검출을 위한 프라이머 또는 프로브로서 제공하는 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 이는 본 발명의 결정(검출) 방법에서 사용된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 인간 유전자의 특정 다형성을 포함하는 부위가 특별히 증폭할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 상기 올리고뉴클레오티드는 각 특정 다형성의 서열 데이타를 기초로 제조될 수 있고, 보편적인 방법에 의해 합성될 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 올리고뉴클레오티드는 포스포로아미다이트(phosphoroamidite) 방법 또는 포스포트리에스테르(phosphotriester) 방법과 같은 일반적으로 적용되는 화학 합성 방법에 의해 합성될 수 있거나, 또는 Pharmacia LKB Gene Assembler Plus(Pharmacia의 제품)과 같은 상업적으로 이용가능한 자동화 올리고뉴클레오티드 합성 기구의 사용에 의해 합성될 수 있다. 이중 가닥 단편은 화학적으로 합성된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 이의 상보적인 가닥이 적절한 조건 하에서 어닐링에 의해 획득되거나, 적절한 프라이머 및 DNA 폴리머라제의 사용에 의해 합성될 수 있다.

상기 기재된 프로브 또는 프라이머로서 제공되는 올리고뉴클레오티드의 바람직한 예시로는 특정 유전자의 다형성을 포함하는 것으로 고안된 DNA 단편에 대응하는 부분 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이런 올리고뉴클레오티드들은 적어도 10개의 염기의 서열(일반적으로 약 10 내지 35개의 염기 서열)을 가진다. 프라이머 쌍으로 제공하는 올리고뉴클레오티드는 유전자의 DNA 서열에서 SNP를 검출하는 것으로 고안 및 합성되는 두 개의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드들이 될 수 있다. 다형성을 포함하는 DNA 단편 자체는 프로브로서 제공하는 올리고뉴클레오티드로 사용될 수 있다.

상기 기재된 프로브 또는 프라이머로서 제공하는 올리고뉴클레오티드의 바람직한 예시로는 하기 올리고뉴클레오티드들을 포함한다. 바람직한 올리고뉴클레오티드들은 SNP 부위 및 하나 이상의 상기 SNP의 상부(업스트림)를 포함하고, 적어도 15개의 염기 서열을 가진다. 유전적 다형성은 서열번호: 3의 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 가지는 프로브 또는 프라이머를 이용함으로써 검출되거나, 또는 DRD2 유전자를 포함하는 게놈 서열 AF050737내 32806번에 위치하는 다형성인 적어도 10개의 뉴클레오티드가 상기 올리고뉴클레오티드에서 3' 말단 또는 3' 말단으로부터 1 내지 몇개의 하부(다운스트림) 염기에 위치한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 특정 예시로는 실시예에서 보여주는 바와 같이 상기 기재된 유전자를 위한 정방향 프라이머(서열번호: 4) 및 역방향 프라이머(서열번호: 5)를 포함한다. 본 발명의 유전자 특이적 프로브는 도파민 D2 수용체에서 TaqIA 다형성의 A1A1을 검출하기 위한 프로브(서열번호: 3)를 포함한다.

결정을 위한 키트

본 발명의 결정(검출) 방법은 샘플의 특정 인간 유전자의 SNP 검출를 검출하고 유전자형을 결정하기 위한 시약 키트의 사용에 의해 더 용이하게 수행될 수 있다. 또한, 본 발명은 이런 결정을 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트의 한가지 예시는, 상기 인간 유전자의 SNP들 중 어느 하나를 포함하는 부분 또는 전체 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적인 서열과 혼성화하거나, 또는 다형성 부위의 하나 또는 몇개의 상부(업스트림) 염기를 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 서열과 혼성화하는, 적어도 하나의 DNA 단편을 필수 성분으로 포함한다.

본 발명의 키트의 다른 성분은, 예를 들면 표지시약(labeling reagent), 및 PCR을 위해 요구되는 시약[예를 들면, Taq DNA 폴리머라아제, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate) 또는 DNA 증폭용 프라이머]들이 있다. 표지시약의 예로는 방사선 동위원소, 발광물질 및 형광물질과 같은 화학적 변형 물질을 포함한다. DNA 단편 자체는 상기 표지시약과 미리 결합될 수 있다. 본 발명의 키트는, 편리하게 측정을 수행하기 위해 예를 들면, 적절한 반응 희석액, 표준 항체, 완충용액, 세제, 또는 반응 중지용액 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 의해 발견되는 특정 유전자내 유전적 다형성은 정신병 질환의 다양한 정신신경 증상에 대한 아리피프라졸 처리의 개선 효과를 야기하는 가능성과 고도로 연관성이 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 아리피프라졸이 사용되는 개별 개체를 위한 맞춤 의학에서 정신병 질환을 가지는 다양한 정신신경 증상을 개선하기 위해, 환자를 위해 고도로 안정된 약제를 적절하게 선별하는 것이 가능하다.

본 발명은 정신병 질환의 다양한 정신신경 증상에 대한 아리피프라졸 처리의 높은 개선 효과와 연관된 마커로서 인간 특정 유전적 다형성을 검출하기 위한 방법, 즉 정신병 질환의 다양한 정신신경 증상에 대한 개선 효과를 확인하기 위한 마커로서, 아리피프라졸 처리하는 개체로부터 획득된 시료에서 특정 유전적 다형성을 검출하는 방법 뿐만 아니라, 상기 방법을 이용한 진단 시약 및 진단 키트를 제공한다.

본 발명은 정신병 질환의 다양한 정신신경 증상에 대한 아리피프라졸 처리의 높은 개선 효과를 확인하기 위한 마커를 검출하는 방법, 특히 아리피프라졸을 처리한 개체로부터 유래한 시료에서 특정 유전적 다형성을 검출함에 의해 정신병 질환의 다양한 정신신경 증상에 대한 아리피프라졸 처리의 높은 개선 효과의 유뮤를 결정하는 방법, 이를 위한 키트, 이를 위해 이용되는 유전적 다형성 및 유전자형, 상기 유전자형을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 제공한다. 이는 개별 환자를 위한 맞춤 의학에서 투여되는 약제를 선별하기 위해 선택을 지시하기 위해 유용하다.

도 1은 아빌리파이(abilify) 처리 후, 총 PANSS 변화를 나타내는 그림이다.

본 발명은 하기 실시예를 이용하여 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 실시예에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1

1) 개체

정신분열증, 정신분열형 장애, 또는 분열 정동장애를 가진 총 90명의 환자를 각 환자가 고지에 입각한 동의한 후에 본 연구에 등록시켰다.

심각한 에피소드(현재 에피소드의 기간 ≤ 4주)를 가진 정신분열증, 정신분열형 장애, 또는 분열 정동장애에 대한 DSM-IV 기준을 만족하는 18 내지 65세의 남성 및 비임신, 비젖분비 여성을 본 연구에 등록되기 위한 요건이었다.

연구에 포함되는 환자들은, APLUS의 약물유전학적 연구에 참여를 동의하였고, 양성 및 음성 증후군 척도(Positive and Negative Syndrome Scale, PANSS)에 총 점수 중 적어도 60점을 받았으며, 4가지 PANSS 항목(환각 행동, 망상, 개념 혼란, 및 불신) 중 적어도 2가지 항목에서 최소 점수 4(중증)을 받았다.

제외 기준은 약물 요법이 요구되는 정신분열증, 정신분열형 장애 또는 분열 정동장애 이외의 정신병 질환; 최근의 자실시도 또는 심각한 자살 상상; 항정신성 약물에 의해 유도되는 지발성 안면 마비(tardive dyskinesia) 또는 추체외 증상(extrapyramidal symptom) 이외의 신경학적 이상; 연구 개시 1달 이내 정신활성 물질 의지 또는 상기 물질 또는 알코올 남용력으로 현재 진단; 카르바마제 핀(carbamazepine), 밸프로산(valproic acid), 리튬(lithium), 또는 사이토크롬 P450 2D6 또는 3A4 효소의 활성을 억제하는 것으로 알려진 약제를 요구하는 환자들; 연구 등록 이전에 장기간 항정신병 약제 투여; 항정신병 약제에 의해 유도되는 정신 증상 또는 부작용으로서 인식장애가 되는 신체 증상을 가지는 환자들; 임상적으로 유의성있는 실험 이상; 연구 개시 이전 4주이내에 조사할 약제의 투여; 아리피프라졸에 대해 임상적 시험에 참여한 경험; 또는 그 외 다른 심각하거나 불안정한 의료 조건을 포함한다.

2) 표적 유전자형(genotype)

인간 도파민 D2 수용체(dopamine D2 receptor, DRD2)에 대한 Taq IA 다형성을 선별하였으며, 본 연구를 위한 상기 Taq IA 다형성은 동형 접합의 야생형(A2/A2), 이형 접합의 변이형(A2/A1) 및 동형 접합의 변이형(A/A) 군을 포함한다.

3) DRD2 Taq1A 유전자형화(genotyping)

게놈 DNA는, 제조사의 지시에 따라 Qiagen DNA 추출 키트(Qiagen, Hilden, Germany)로 각 개체들의 말초 전혈로부터 추출하였다. A1 및 A2 대립 유전자(allele)의 존재는 SnaPshot 분석을 이용한 PCR 및 단일 염기 연장을 통해 결정하였다. 상기 PCR 증폭을 위해 사용되는 프라이머는 하기와 같다:

정방향 프라이머는 서열번호: 4(5'-gctggccaagttgtctaaat-3')로 기재; 및

역방향 프라이머는 서열번호: 5(5'-tggagctgtgaactggact-3')로 기재된다.

SnaPshot 분석을 위해, PCR 산물을 엑소뉴클레아제 Ⅰ(exonuclease Ⅰ) 및 쉬림프 알카라인 포스파타아제(shrimp alkaline phosphatase)(USB, Cleveland, Ohio, USA)를 이용하여 정제한 다음, 제조사의 지시에 따라 ABI PRISM SnaPshot^TMMultiplex Kit(Applied Biosystems)의 AmpliTaq DNA 폴리머라제, 4개의 형광 표지된 디데옥시뉴클레오티드(dideoxynucleotide)들, 단일 염기 연장을 위한 각 프라이머들, 및 반응 완충용액과 혼합하였다. Taq IA 다형성을 위한, 단일 염기 연장을 위해 사용된 프라이머는 서열번호: 3(5'-cacagccatcctcaaagtgctggtc-3')로 기재되었다. 상기 프라이머는 96℃에서 10초 동안, 50℃에서 5초 동안, 및 60℃에서 30초 동안의 25번 사이클(cycle)을 통해 연장하였다. 그런 다음, 상기 앰플리콘(amplicon)을 ABI Prism 3700 Autimated Sequencer(Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다. 다형성 부위에 인접하는 DNA 서열은 직접 시퀀싱(direct sequenceing)을 통해 입증하였다.

4) 평가

치료 효능은 양성 및 음성 증후군 척도(Positive and Negative Syndrome Scale, PANSS)를 이용하여 평가하였다. 효율성 평가는 스크리닝시, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16 및 26주에 각각 수행하였다.

5) 통계적 분석

주요 효능 매개변수(primary efficacy parameter)는 PANSS 총 점수에서 기준선으로부터 감소 비율이었다. 정신분열증 및 정신분열증 관련 질환의 치료에서 아리피프라졸의 효능에 대한 DRD2 TaqIA 다형성의 효과를 결정하기 위해, 본 발명자들은 소수 대립 유전자(A1A1)에 대해 상동적인 환자 유래 데이타를 다른 유전자형(A1A2, A2A2)을 가진 환자들 유래 데이타와 비교하였다.

치료 안정화 후 효능을 비교하기 위하여, 스크리닝시, 8, 12, 16 및 26주에 데이타를 분석하였다.

반복 측정 분석(epeated measures analysis)을 위해, 혼합 효과 모형(mixed effects model)을 적용하였다. 상기 반복 측정의 상관관계는 무작위 개체 인터셉트(random subject intercept) 및 일차 자기회귀 공분산 행렬(first-order autoregressive covariance matrix)를 통해 모델화하였다.

Ⅳ. 유전자 및 임상 반응 사이 관계

최근에, 유전자 및 임상 반응 사이 관계에 대한 연구가 많은 주목을 얻는다.

이런 사실을 감암하여, 환자의 유전자형화는 도파민 D2 수용체 Taq IA 대립 유전자를 이용하여 수행하였으며, 상동 접합의 야생형 A2A2, 이형 접합의 돌연변이형 A1A2, 또는 상동 접합의 돌연변이형 A1A1로 분류하였다. 아리피프라졸에 대한 반응을 PANSS 촘 점수에 의해 분석하였을 때 흥미로운 결과를 획득하였다. 그 결과는 도 1에 보여주는 바와 같다.

상기 결과는 A1A1 대립 유전자를 가지는 환자의 증상이 A1A2 및 A2A2 대립 유전자를 가지는 환자의 증상에 비해 8, 12, 및 16주에 극적으로 개선돠었다. 이는 아리피프라졸에 대한 반응이 도파민 D2 수용체 Taq IA 대립 유전자의 종류에 의해 다양하다는 것을 의미한다. 이런 결과는 다양한 유전자형들 간의 반응의 차이가 임상 테스트에서 일반적으로 인지되기 때문에 매우 놀라운 것이다.

PANSS 점수(0 주 vs 8, 12, 16 및 26주)의 유의적인 개선은, Taq IA 다형성의 소수 대립 유전자(A1A1형)를 가지는 군에서 주요 대립 유전자(A1A2형 및 A2A2형)를 가지는 군과 비교하여 8주 또는 그 후에 관찰되었다. 또한, 두 군 사이 차이는 26주 후에 지속 기간의 말단에서 관찰되었다. 상기 결과는 도 1에 보여준 바와 같다. 게다가, 통계학적 데이타는 하기 표 1에서 보여준 바와 같다.

통계학적 데이타

유전자형	A1A1	A1A2 + A2A2	P 값
개체 (n)	14	76
성별 (%)			p＞0.05
남성	42.9	40.8
여성	57.1	59.2
나이 ± SD (yr)	38.6 ± 11.0	37.8 ± 9.7	p＞0.05
진단 (%)			p＞0.05
정신분열형 장애	7.1	3.9
정신분열증	85.8	96.1
분열 정동장애	7.1	0.0
에피소드 (%)			p＞0.05
원발	50.0	34.2
재발	50.0	65.8
이전 약물 (%)			p＞0.05
타이피칼 AB(typical AB)	57.1	34.0
클로자핀(clozapine)	0.0	2.0
리스페리돈(risperidon)	28.6	30.0
올란자핀(olanzapine)	0.0	14.0
퀘티아핀(quetiapine)	0.0	12.0
아미술피리드(amisulpiride)	14.3	2.0
기타	0.0	6.0
질병 기간 ± SD (month)	116.9 ± 131.5	97.0 ± 94.4	p＞0.05
입원 수	3.3 ± 3.2	2.9 ± 2.7	p＞0.05

이점/적용

항정신병 약물에 대한 약물 반응에서 개체간 변이는 정신분열증을 가진 환자의 치료에 있어서 중요한 의미를 가진다. 본 발명은 정신분열증을 가진 환자에서 아리피프라졸에 대한 임상적 반응을 예측할 수 있으며, 항정신병 약물을 선별함에 있어서 기준을 제공하며, 항정신병 약물의 투여 전에 정신분열증의 치료에 있어서 치료적 효능을 개선시킨다.

<110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Marker for detecting the proposed efficacy of treatment <130> 9fpi-04-03 <150> PCT/JP2007/051748 <151> 2007-01-26 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2625 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcagccgtc cggggccgcc actctcctcg gccggtccct ggctcccgga ggcggccgcg 60 cgtggatgcg gcgggagctg gaagcctcaa gcagccggcg ccgtctctgc cccggggcgc 120 cctatggctt gaagagcctg gccacccagt ggctccaccg ccctgatgga tccactgaat 180 ctgtcctggt atgatgatga tctggagagg cagaactgga gccggccctt caacgggtca 240 gacgggaagg cggacagacc ccactacaac tactatgcca cactgctcac cctgctcatc 300 gctgtcatcg tcttcggcaa cgtgctggtg tgcatggctg tgtcccgcga gaaggcgctg 360 cagaccacca ccaactacct gatcgtcagc ctcgcagtgg ccgacctcct cgtcgccaca 420 ctggtcatgc cctgggttgt ctacctggag gtggtaggtg agtggaaatt cagcaggatt 480 cactgtgaca tcttcgtcac tctggacgtc atgatgtgca cggcgagcat cctgaacttg 540 tgtgccatca gcatcgacag gtacacagct gtggccatgc ccatgctgta caatacgcgc 600 tacagctcca agcgccgggt caccgtcatg atctccatcg 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125 Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Ala Met Pro Met Leu Tyr Asn Thr 130 135 140 Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg Val Thr Val Met Ile Ser Ile Val Trp 145 150 155 160 Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser Cys Pro Leu Leu Phe Gly Leu Asn Asn 165 170 175 Ala Asp Gln Asn Glu Cys Ile Ile Ala Asn Pro Ala Phe Val Val Tyr 180 185 190 Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val Pro Phe Ile Val Thr Leu Leu Val 195 200 205 Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Val Asn 210 215 220 Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg Ala His Leu Arg Ala Pro Leu 225 230 235 240 Lys Gly Asn Cys Thr His Pro Glu Asp Met Lys Leu Cys Thr Val Ile 245 250 255 Met Lys Ser Asn Gly Ser Phe Pro Val Asn Arg Arg Arg Val Glu Ala 260 265 270 Ala Arg Arg Ala Gln Glu Leu Glu Met Glu Met Leu Ser Ser Thr Ser 275 280 285 Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ile Pro Pro Ser His His Gln 290 295 300 Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser His His Gly Leu His Ser Thr Pro Asp 305 310 315 320 Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys Asn Gly His Ala Lys Asp His Pro Lys 325 330 335 Ile Ala Lys Ile Phe Glu Ile Gln Thr Met Pro Asn Gly Lys Thr Arg 340 345 350 Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg Arg Lys Leu Ser Gln Gln Lys Glu 355 360 365 Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala Ile Val Leu Gly Val Phe Ile Ile 370 375 380 Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Thr His Ile Leu Asn Ile His Cys Asp 385 390 395 400 Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Trp Leu Gly Tyr 405 410 415 Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr Phe Asn Ile Glu 420 425 430 Phe Arg Lys Ala Phe Leu Lys Ile Leu His Cys 435 440 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cacagccatc ctcaaagtgc tggtc 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gctggccaag ttgtctaaat 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tggagctgtg aactggact 19

Claims (14)

1. (a) 정신장애(psychiatric disorder)를 가진 환자의 시료(specimen)로부터 게놈 DNA 도파민 D2 수용체(Dopamine D2 Receptor, DRD2) 유전자 또는 이의 상보적인 가닥을 제조하는 단계;

   (b) 상기 게놈 DNA DRD2 유전자 또는 이의 상보적인 가닥의 서열을 분석하여 DRD2 유전자내 TaqIA 다형성의 유전자형이 A1A1, A1A2 또는 A2A2 유전자형을 확인하는 단계; 및

   (c) 상기 DRD2 유전자내 TaqIA 다형성의 유전자형이 A1A1인 경우를 선별하는 단계를 포함하는 정신장애를 가진 환자에 대한 아리피프라졸(aripiprazole)에 의한 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 DRD2 유전자내 TaqIA 다형성(DRD2 TaqIA 다형성)은 dbSNP(Database of Single Nucleotide Polymirphism) 등록번호: rs1800497인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 정신장애는 정신분열증(Schizophrenia), 정신분열형 장애(Schizophreniform disorder) 또는 분열 정동형 장애(Schizoaffective disorder)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 DRD2 유전자내 TaqIA 다형성은

   (a) T/T (유전자형 A1A1)인 다형성;　

   (b) T/C (유전자형 A1A2)인 다형성; 및

   (c) C/C (유전자형 A2A2)인 다형성;

   (여기서, 상기 다형성은 DRD2 유전자를 포함하는 AF050737 내 32806번째에 위치함.)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전적 다형성인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 DRD2 유전자내 TaqIA 다형성은 직접적인 뉴클레오티드 서열분석(direct nucleotide sequencing), 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 도트불랏분석[allele-specific oligonucleotide (ASO)-dot blot analysis], 단일 뉴클레오티드 프라이머 신장 분석(single nucleotide primer extension assay), PCR 단일 가닥 형태 다형성 분석[PCR-single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis], PCR 제한효소 단편 길이 다형성 분석[PCR-restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) analysis], 침입자 분석(Invader assay), 정량적 실시간 PCR 분석(quantative real-time PCR assay), 및 질량분석기를 이용한 유전적 다형성 분석[genetic polymorphism assay employing a mass spectrometer (mass array]으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 기술을 통해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 DRD2 유전자내 TaqIA 다형성은 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장 분석을 이용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 삭제
9. 제 6항에 있어서, 상기 PCR 제한효소 단편 길이 다형성 분석은 AF050737 내 32806번째에 위치하는 T/T, T/C 또는 C/C 검출용 제한효소(Taq I)를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 삭제
11. DRD2 유전자내 TaqIA 다형성의 A1A1 유전자형을 확인하는 검출 시약을 포함하는 정신장애를 가진 환자에 대한 아리피프라졸(aripiprazole)의 치료 효과 예측용 키트.
12. 제 11항에 있어서, 상기 DRD2 유전자내 TaqIA 다형성(DRD2 TaqIA 다형성)은 dbSNP(Database of Single Nucleotide Polymirphism) 등록번호: rs1800497인 것을 특징으로 하는 키트.
13. 제 11항에 있어서, 상기 정신장애는 정신분열증(Schizophrenia), 정신분열형 장애(Schizophreniform disorder) 또는 분열 정동형 장애(Schizoaffective disorder)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
14. 제 11항에 있어서, 상기 DRD2 유전자내 TaqIA 다형성은

    (a) T/T (유전자형 A1A1)인 다형성;　

    (b) T/C (유전자형 A1A2)인 다형성; 및

    (c) C/C (유전자형 A2A2)인 다형성;

    (여기서, 상기 다형성은 DRD2 유전자를 포함하는 AF050737 내 32806번째에 위치함.)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 유전적 다형성인 것을 특징으로 하는 키트.

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