KR20160148807A - 장 베체트병 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장 베체트병 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 생물학적 시료가 NAALADL2 유전자의 단일염기다형성 부위, YIPF7 유전자의 단일염기다형성 부위, DCAF12 유전자의 단일염기다형성 부위, PLCB1 유전자의 단일염기다형성 부위, SCHIP1 유전자의 단일염기다형성 부위 및 PRKCH 유전자의 단일염기다형성 부위로 구성된 군으로부터 선택된 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함할 경우, 상기 생물학적 시료는 장 베체트병의 위험도가 매우 높다. 따라서, 본 발명의 키트 및 방법은 매우 효과적이고 용이하게 장 베체트병의 진단 또는 위험도를 예측하는데 이용될 수 있다.

Description

장 베체트병 진단용 바이오마커 및 이의 용도{Biomarkers for Diagnosing Intestinal Behcet's Disease and Uses Thereof}

본 발명은 장 베체트병 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

베체트병(Behcet's disease: BD)은 환경 및 유전자의 알려지지 않은 요소와 연관되어 중동 및 지중해 연안에 극동 아시아에서 옛 실크로드를 아우르는 국가들에서 일반적으로 드문 만성, 염증, 다중시스템 질환 이다.^1-3 이러한 유전적 변이의 특성은 대부분 알려져 있지 않지만, 수많은 유전자 위험 인자가 질병 민감성에 기여할 것으로 생각된다. GWAS(Genome Wide Association Study)는 B^*51(HLA-B ^* 51)을 코딩하는 인간 백혈구 항원 유전자 및 터키, 한국 및 일본인 집단에 BD와 관련된 주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC) 클레스 I, 인터루킨(IL) 10, 및 IL23 수용체(IL23R)-IL12 수용체 베타 2(IL12RB2)를 포함하는 변이를 확인하였다. 최근, GWAS 연구들은 또한 몇 개의 다른 비-HLA 유전자 위치 및 C-C 케모카인 수용체 1 유전자(CCR1), 신호 변환 및 전사 활성자(STAT4), 유전자 인코딩 킬러 세포 렉틴-유사 수용체 패밀리 멤버(KLRC4-KLRK1), 및 소포체 아미노펩티다아제 유전자 1(ERAP1)을 포함하는, BD에 일반적인 유전자를 보고하고 있다.^2-6

장 BD(장을 포함하는 BD)는 일반적으로 위장관의 전형적인 형태의 궤양 및 BD에 대한 임상적 진단 기준으로 진단된다.⁷ 흥미롭게, 장을 포함하는 BD는 지중해의 BD 환자에서는 드물게 나타나지만(0-3%),^8,9 동 아시아의 BD 환자에서는 상대적으로 자주 발생한다(5-25%).^10-12

장을 포함하지 않는 BD 및 장 BD의 발생률이 지역 및 인종적 차이를 감안할 때, 장 BD는 장을 포함하지 않는 BD로부터 구별될 수 있는 발병 경로 및 특이적으로 장 BD와 관련된 독특한 유전적 민감성 위치가 있을 것으로 유추된다. 최근 여러 BD 환자를 연구하는 GWAS 연구들을 통해, 현재 BD와 관련된 유전적 민감성 위치에 대해 많이 알려져 있다.^2-6 그러나 이러한 모든 연구는 BD 자체에 초점을 두고 있으며, 장 BD는 매우 드문 질환으로 장BD 관련 유전적 인자를 평가하는 연구는 없다. 또한, 일부 표현형 중복(눈, 피부 및 장에 염증), MHC class I 영역, IL10, 및 IL23R과 관련된 유전자 및 종양 사멸 인자(TNF)-α차단 요법의 효과은 BD 및 염증성 장질환(IBD) 사이에 공유하는 병원성 경로에 포함된다.^13,14 특히, IBD 및 장 BD는 장 증상, 치료 적용, 및 임상 과정의 관점에서 임상적 표현형의 수를 공유하여,¹⁴ 장 BD 및 IBD 사이에 유전 민감성을 공유할 수도 있다. 그렇지 않으면, 장 IBD에 대한 것은 아니고 장 BD에 대한 특이적 유전자 마커로 인해 두 개의 다른 질병으로 간주될 수도 있다.

현재의 연구에서, 본 발명자는 장이 포함된 BD에 대해 한정된 유전자 마커라 할 수 있는 것을 한국인 집단에 GWAS를 사용하여, 장 BD에 따른 특이적 유전자 민감성 위치를 확인하였다. 본 발명자는 또한 장을 포함하지 않는 BD 및 장 BD의 질환 민감성 및 표현형에 영향을 미치는 유전 인자의 기능적 결과를 연구하였다.

본 발명자들은 장 베체트병(Intestinal Behcet's Disease)의 신속한 진단 및 예후 예측을 위한 바이오마커를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 장 베체트병 환자로부터 얻어진 생물학적 시료에 대한 GWAS(Genome Wide Association Study)를 통해 장 베체트병에 특이적인 단일염기다형성 부위(single nucleotide polymorphism: SNP)를 확인하고 이러한 부위가 장 베체트병 진단에 효과적으로 이용될 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 장 베체트병 진단 및 위험도 예측용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 장 베체트병의 진단 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 NAALADL2(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 2) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열 제 1 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs3914501) 및 서열목록 제 2 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16848171), YIPF7(Yip1 domain family, member 7) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 3 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6838327), DCAF12(DDB1 and CUL4 associated factor 12 ) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 4 서열의 201 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs10441723), PLCB1(phospholipase C, beta 1) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 5 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6086653), SCHIP1(schwannomin interacting protein 1) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 6 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16830581) 및 PRKCH(protein kinase C, eta) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 7 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs12433533)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 장 베체트병의 진단 및 위험도 예측용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 장 베체트병(장 Behcet's disease: 장 BD)을 신속하고 정확하게 분자 진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 NAALADL2를 포함하는 유전좌위에서 장 BD에 연관된 일련의 SNP를 발견하였다.

장 BD은 여러 장기를 침범할 수 있는 만성 염증성 질환인 베체트병(Behcet's disease: BD)에서 동반되는 위장관 질환으로 지중해의 BD 환자에서는 드물게 나타나지만, 동 아시아의 베체트병 환자에서는 상대적으로 자주 발생한다. 이러한 장 BD는 전형적인 형태의 궤양을 확인하는 내시경 검사 및 BD의 임상적 진단을 기준으로 진단된다.

본 발명자들은 총 756명의 GWAS(Genome Wide Association Study) 대상자 및 724명의 반복 연구 대상자 샘플의 유전자형을 분석한 결과, 몇몇 SNP들이 장 BD와 연관되어있다는 강력한 증거를 발견하였다. 본 발명에 따르면, NAALADL2(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 2) 유전자에 위치하는 2개의 SNP, YIPF7(Yip1 domain family, member 7) 유전자에 위치하는 1개의 SNP, DCAF12(DDB1 and CUL4 associated factor 12 ) 유전자에 위치하는 1개의 SNP, PLCB1(phospholipase C, beta 1) 유전자에 위치하는 1개의 SNP, SCHIP1(schwannomin interacting protein 1) 유전자에 위치하는 1개의 SNP 및 PRKCH(protein kinase C, eta) 유전자에 위치하는 1개의 SNP가 장 BD와 연관 되어있다는 사실을 발견하였다. 본 발명의 키트는 상기의 SNP들을 포함하는 각 유전자 서열의 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 인간의 장 베체트병의 진단 및 위험도를 예측할 수 있다.

추가적으로 상기 NAALADL2(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 2) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제 2 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16848171) 또는 상기 YIPF7(Yip1 domain family, member 7) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 3 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6838327)의 단일염기다형성 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 장 베체트병과 구강 궤양 위험도를 동시에 예측할 수 있다. 또한 상기 PRKCH(protein kinase C, eta) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 7 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs12433533)의 단일염기다형성 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 장 베체트병과 눈 베체트병 위험도를 동시에 예측할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “연관(association)"은 특정한 유전자의 다형성과 당해 유전자를 가진 개체의 표현형 간의 관계가 통계학적으로 유의한 경우를 의미하며, 보다 구체적으로는 특정한 SNP의 존재와 대장 내시경(colonoscopy) 검사 및 임상적 특성을 통해 진단된 장 BD 간의 관계를 나타내는 통계학적 결과의 p-값(p-value)의 크기가 5 × 10^-4 이하인 경우를 말한다. 상기에서 나열한 총 7개의 SNP들은 GWAS 결과, 5 × 10^-4 이하의 작은 p-값을 보임으로서 장 BD와 연관되어 있음을 보여주고(표 1 내지 표 4), 특히 연관도가 강한 2개의 rs3914501 및 rs6838327 의 p-값은 3.5 × 10^-4 및 3.4 × 10^-4 이었다.

본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 용어“단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG,AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단(population)내에서, SNP는 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 인간 집단 내에서 변이성(variations)이 존재하며, 지질학적 또는 민족적 군에서 공통적인 하나의 SNP 대립 유전자는 매우 희귀하다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다. 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다. 인간의 DNA 서열상의 변이성은 병의 발병 및 인간이 어떻게 병원체, 화학물질, 약물, 백신 및 다른 시약에 반응하는 가에 영향을 미칠 수 있다. 또한, SNP는 맞춤형 의약의 개념을 실현하기 위한 중요한 도구(key enabler)로 생각된다. 무엇보다도, 최근에 마커로서 활발하게 개발되고 있는 SNP는 질병을 가지거나 또는 가지지 않는 군들 간에 게놈 부위를 비교함으로써 질병을 진단하는 생의학적 연구에서 가장 중요하다. SNP는 인간 게놈의 가장 많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다(Sachidanandam et al., 2001). SNP는 매우 안정된 유전적 마커이고, 때때로 표현형에 직접적인 영향을 미치며, 자동화된 유전자형 규명 시스템에 매우 적합하다(Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000). 또한, SNP 연구는 곡식 및 가축 육성 프로그램에서도 중요하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉,dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍 시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오타이드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 발명의 키트에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)).

출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J.et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 인간(예컨대, 비만 또는 당뇨 환자)으로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 키트에 있어서, 상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질WartE. coli의 mutS 단백질ucl.Ac는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 인간으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화 시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 DM 또는 MS 여부를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다.

구체적으로는, 프로브는 혼성화의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 보다 구체적으로, 프로브는 디옥시리보뉴클레오타이드 이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 프로브의 3’-말단 또는 5’-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 당뇨병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 SNP들을 다중 마커로 하여 이들의 존재가 상술한 방법을 통해 확인되면 장 BD 위험도가 높은 것으로 판단된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단일염기다형성 부위를 가진 인간은 증가된 장 베체트병 위험도를 갖는다.

본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 장 BD는 대장 내시경 검사 및 임상적 특성(표 5)을 통해 진단되었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 장 베체트병의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 NAALADL2(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 2) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열 제 1 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs3914501) 및 서열목록 제 2 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16848171), YIPF7(Yip1 domain family, member 7) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 3 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6838327), DCAF12(DDB1 and CUL4 associated factor 12 ) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 4 서열의 201 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs10441723), PLCB1(phospholipase C, beta 1) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 5 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6086653), SCHIP1(schwannomin interacting protein 1) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 6 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16830581) 및 PRKCH(protein kinase C, eta) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 7 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs12433533)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자의 단일염기다형성 부위의 존재를 검출하는 단계를 통해 장 베체트병 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상술한 프라이머를 필수 구성요소로 하는 바, 프라이머에 대한 상세한 설명은 본 발명의 방법에 이용되는 프라이머에도 적용된다. 따라서, 반복적인 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

장 BD는 그 진단에 결정적인 도움이 되는 증상 및 검사 결과가 없기 때문에, 내시경 검사 또는 BD의 여러 임상 증상 중 진단적 가치가 높은 것들로 이루어진 분류 기준이 이용된다. 특히 장 BD는 우리나라 및 일본을 포함한 동 아시아 지역에서 위장관의 궤양으로 흔하게 발생하며, 복통, 설사 및 혈변 등의 증상이 나타나지만, 각종 혈관염, 중추 신경계 질환이 다른 증상들보다 먼저 나타날 수 있어서 진단이 매우 어렵다.

이에 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위해, 특이적 유전자 검사만으로 편리하고 정확하게 초기에 장 BD를 검출 할 수 있는 방법을 발견하였다.

본 명세서에서, 용어 “생물학적 시료”는 핵산을 포함한 생물의 모든 물질을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 인간으로부터 분리된 생물학적 시료로 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프, 골수액, 타액, 안구액, 복수액, 세포 조직액 또는 세포 배양액을 포함하고, 보다 구체적으로는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 세포 조직액 및 세포 배양액을 포함하며, 보다 더 구체적으로는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액 및 세포 배양액을 포함하고, 보다 더욱 더 구체적으로는 혈액, 혈장, 혈청, 조직 및 림프액을 포함하며, 가장 구체적으로는 혈액, 혈장 및 혈청을 포함한다.

본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 장 베체트병 검출을 위한 상기 단일염기다형성 부위들은 본 발명의 장 BD 진단용 키트에 사용한 단일염기다형성 부위와 같다. 따라서, 반복적인 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 방법은 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명의 방법은 유전자 증폭 반응 또는 마이크로어레이를 통해 실시된다. 구체적으로는, 본 발명의 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)에 따라 실시된다.

상기 증폭 반응은 은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기 서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chainreaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제 6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있다.

본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오타이드 서열을 분석하여 진단한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 게놈 DNA)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오타이드 서열을 결정함으로써 조사하여 결정할 수 있다.

본 발명의 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시될 수도 있다. 본 발명의 방법이 마이크로어레이 방식에 의하는 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다.

본 발명의 방법에서 이용되는 프로브는 상기 나열한 본 발명의 SNP들을 포함하는 각 유전자상의 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다.

*프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 마커 중 하나인 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드는 GenBank SNP 데이터베이스 rs3914501, 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드는 GenBank SNP 데이터베이스 rs16848171에 뉴클레오타이드 서열이 개시되어 있으며, 이 서열을 참조하여 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 구체적인 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌 및 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시표에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화 시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노 벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등 이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오타이드 서열에 대한 혼성화 시그널이 대조군보다 강하게 나오는 경우에는 장 BD의 위험도가 높은 것으로 진단된다.

본 발명에 따르면, 장 BD에 특이적인 유전자 단일염기다형성 부위를 이용한 장 BD 진단 및 검출 키트 및 방법을 통해 특이적 유전자 검사만으로 편리하고 정확하게 초기에 장 BD의 진단 및 검출을 가능하게 한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 장 베체트병 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

(b) 본 발명에 따르면, 생물학적 시료가 NAALADL2(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 2) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제 1 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs3914501) 및 서열목록 제 2 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16848171), YIPF7(Yip1 domain family, member 7) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 3 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6838327), DCAF12(DDB1 and CUL4 associated factor 12 ) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 4 서열의 201 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs10441723), PLCB1(phospholipase C, beta 1) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 5 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6086653), SCHIP1(schwannomin interacting protein 1) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 6 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16830581) 및 PRKCH(protein kinase C, eta) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 7 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs12433533)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함할 경우, 상기 생물학적 시료는 장 베체트병의 위험도가 매우 높다.

(c) 따라서, 본 발명의 키트 및 방법은 매우 효과적으로 용이하게 장 베체트병을 진단하는 데 이용될 수 있다.

도 1은 장 베체트병 환자에 SNP 유전자형에 따른 수술의 누적확률을 결과를 보여준다. 파란색은 위험 대립유전자를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2b는 질병 및 SNP 유전자형에 따른 결장 조직에 유전자 발현 결과를 보여준다. 결장 조직의 면역조직화학은 NAALADL2, YIPF7, 및 GSTT1에 대하여 실시하였다. (A) NAALADL2(rs3914501), (B) YIPF7(rs6838327), (C) GSTT1(rs17856199). 오른쪽 은 염색 강도를 보여준다. * P < 0.05 대. CTL, *** P < 0.005 대 CTL. CTL, 대조군 CD, 결장 질병 BD, 베체트 병.
도 3은 HT-29 세포에 LPS 자극에 의한 유전자 발현 결과를 보여준다. (A) NAALADL2, (B) YIPF7, (C) GSTT1.
도 4는 연구 작업의 흐름을 보여준다.
도5a 내지 도 5b는 주요 구성 요소 분석(PCA) 결과를 보여준다. 도 5a는 1000 게놈 프로젝트에 참조된 시료를 포함한 전체 대상자 시료(199 BD 케이스 및 597 대조군)의 PCA 결과를 보여준다. BD 케이스는 빨간색, 대조군은 녹색, 보라색에 북부 및 서부 유럽 계통의 유타주 거주자, 및 어두운 파란색은 이바단, 나이지리아에 유루바족을 표시하였다. 도 5b는 1000 게놈 프로젝트 시료에 없는 199 BD 케이스 및 597 대조군 시료의 PCA 결과를 보여준다. BD 케이스는 빨간색으로 대조군은 녹색으로 표시하였다.
도 6a 내지 도 6c는 장 BD 환자에 SNP 유전자형에 따른 누적 확률 결과를 보여준다. 도 6a는 장 BD 환자에 SNP 유전자형에 따른 입원의 누적 확률 결과를 보여준다. 도 6b는 장 BD 환자에 SNP 유전자형에 따른 코르티코스테로이드 사용의 누적 확률 결과를 보여준다. 도 6c는 장 BD 환자에 SNP 유전자형에 따른 면역억제제 사용의 누적 확률 결과를 보여준다. 위험 대립유전자는 파란색 선으로 표시하였다.
도 7a 내지 도 7k는 관련된 SNPs의 Cis 발현 양적 특성 위치 분석 결과를 보여준다. 도 7a는 NAALADL2에 rs3914501. 도 7b는 YIPF7에 rs6838327. 도 7c는 ERAP1에 rs17482078. 도 7d는 ERAP1에 rs2927615. 도 7e는 IL10에 rs1554286. 도 7f는 IL10에 rs1518111. 도 7g는 TGFBR3에 rs1805110. 도 7h는 COG7에 rs430208. 도 7i는 DCAF12에 rs10441723. 도 7j는 SCHIP1에 rs16830581. 도 7h는 STAT4에 rs7574070. 결과를 HapMap3(CEU, CHB, GIH, JPT, LWK, MEX, MKK, YRI)(Stranger et al., 2012), Geneva Gencord(Dimas et al., 2009), and MuTHER pilot(Nica et al., 2011)의 각 SNP의 cis-프로브(probes) 위치한 ±1,000 kbp 로부터 획득하였다. Chr., 염색체; eQTL, 발현 양적 특성 위치; LD, 연결 불균형; Position, 염색체 위치(hg19); rSNP, 조절 SNP; F, 섬유아세포; T, T-세포; S, 피부; F, 지방; L, 림프아구성 세포주.

재료 및 방법

연구 대상 및 DNA 추출

장 포함하지 않는 BD 대상자 238명 및 장 BD 대상자 295명을 포함하는, 총 533명의 한국계 BD 대상자가 2006년 6월 및 2013년 8월 사이에, 한국, 서울, 연세의과대학교, 세브란스 병원 BD 진료소에 등록되었다. 장 BD는 대장 내시경 검사 특성 및 임상적 특성을 기초로 설립된 기준에 따라 진단하였다.⁷ “명확한” 또는 “확실한”유형으로서 최종적으로 분류된 환자만을 연구에 포함하였다. 연구 대상의 통계학 및 임상적 특성을 표 5에 요약하였다. 우리는 같은 플랫폼을 사용한 한국 협회 자원 프로젝트에 속한 건강한 한국인 10,000명으로부터 임의의 선택된 대상자로 개인적으로 일치하는 성 600명에서 표현형 결과를 획득하였다. 이 연구는 연세대학교, 세브란스 병원의 제도적 검토 보드 및 모든 환자 및 대조군으로부터 제공된 서면 동의로 승인되었다. 게놈 DNA는 Qiagen(Hilden, Germany) DNA 혈액 맥시 키트를 사용하여 전체 혈액 샘플로부터 추출하였다.

GWAS에 유전자형 및 질적 관리

총 199명의 BD 환자(장을 포함하지 않는 BD 환자 100명 및 장 BD 환자 99명)에 대해 모든 시료에서 케이스-대조군 분석에 들어가는 최종 > 95%의 콜 레이트(call rates)를 보는, Affymetrix Whole-Genome-Wide Human SNP Array 6.0. (Affymetrix, Santa Clara, CA)을 사용하여 유전형을 실시하였다. > 95%의 콜 레이트에서 제외된 대조군, 일치하는 성, 및 잠재적 관련 있는 대상자, 600명의 한국인의 총 557 대조군 시료로 케이스-대조군 분석을 실시하였다.

질적 관리, 케이스 또는 대조군에 상염색체에, <1% 소수 대립유전자 빈도 또는 대조군에 P 값(value) < 1 × 10^-7 Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)으로 맵핑(mapping)되지 않았다면, SNPs는 P 값 < 1×10^-4 으로 표시된 것을 제외하였다. quantilequantile plot(Q-Q plot)는 지놈-전체(wide) 연관성의 종합적인 중요성 및 인구집단 층화의 잠재적 의미를 평가하기위해 획득하였다. 질적 관리 및 필터링 진행, 모든 BD 환자에 651.605 SNPs 대 건강한 대조군, 장 BD 환자에 652,294 SNPs 대 건강한 대조군, 장을 포함하지 않는 BD 환자 646,355 SNPs 대 건강한 대조군, 장 BD 환자 637,816 SNPs 대 장을 포함하지 않는 BD 환자를 마지막 GWAS　분석을 위해 사용하였다.

주성분 분석(PCA)은 기본 매개 변수와 파라미터 소프트웨어 패키지 EIGENSTRAT v.5.0.1¹⁵을 사용하여 주교란 인자인 인구집단 층화를 확인하기 위해 사용하였다. 개시 PCA의 경우, 199 BD 케이스를 597 대조군과 분석하였다. 또한, 한국인 시료(199 케이스 및 597 대조군)은 > 95% 콜 레이트, > 5% MAF, 및 콜레이트 > 95%, 및 0.05 HWE p 값으로 표시된 391.001 마커를 사용하여 1000 게놈 프로젝트(phase1_release_v3.20101123)에 개인적인 European(CEU) 및 African(YRI)과 관련 없는 것으로 분석하였다.

대치(imputation)

본 발명의 연구에 변이 연관성을 알아내기 위한 분석 및 대치 방법의 신뢰도 평가를 목적으로, 누락된 유전자형을 1000 게놈 파지 I 통합 변이 세트 및 IMPUTE(v.2.0)(https://mathgen.stats.ox.ac.uk/impute/impute_ v2.html) 및 유전자형 검증이 포함된 GWAS 시료로 대치하였다. 질적 관리을 위해, 낮은 대치 질에 31 SNPs(< 0.90 의 사후 확률 점수) 또는 < 5%의 소수 대립유전자 빈도(MAF)는 하디-바인베이크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium: HWE) < 0.0001의 P 값 또는 콜 레이트 < 95% 인 것을 제외한 것에서 벗어났다. Rsq < 3.0에 SNPs는 관련 분석에서 제외하였다. 총 779,465의 대치된 SNPs는 게놈-전체 관련 분석에 포함하였다. 총 5,093,113의 대치된 SNPs가 질적 관리 시험을 통과하였고 관련 분석을 위해서 571,238 유전자형 SNPs를 조합하였다.

SNP 선택 및 반복 연구

게놈 전체 검색 분석에 따라, P < 1 × 10^-4 SNPs 및 종래에 보고된 SNPs를 포함하는 70개의 SNPs(39 loci) DNA를 이용할 수 있는 장 BD 295개 및 장을 포함하지 않는 BD 237개 및 대조군 391개의 비-중복 세트를 반복 연구를 위하여 선택하였다. 제조사의 프로토콜 및 권장 질적 관리 측정에 따라, rs17856199, rs1800871, and rs4500591의 확인은 TaqMan 유전자형 분석(Applied Biosystems, CA, USA)을 사용하였고, 다른 것의 확인은 BioMark TM HD 시스템(Fluidigm, CA, USA)을 사용하였다. 44 SNPs에서 중복된 시료 중 Affymetrix Whole-Genome-Wide Human SNP Array 6.0 및 TaqMan genotyping assays 또는 BioMark TM HD systemj에 의해 결정된 유전자형 사이의 일치율은 >99.9%로 유전자형 오류의 무시 가능성을 나타냈다.

일배체형(haplotypic) 분석

민감성 영역을 명확히 하고, 후보 영역을 좁히기 위해, 일배체형 연관성을 Lake et al에 의해 개발된 방법을 사용하여 분석하고, R(http://www.r-project.org)을 실시하여, 표준선 일배체형의 효과와 비교한 형질에 일배체형의 관련 효과의 추정치 및 중요성을 제공하였다. 본 연구에서, 각각의 유전자 위치에서 주 대립 유전자의 조합으로 이루어진 일배체형을 표준으로 사용하였다.

Cis-발현 양적 형질 유전자 위치( cis-eQTL )

유전자 발현에 특이적 변화의 대조군에 유전자 위치를 공개하기 위한 cis-eQTL 분석을 위해, eQTL Browser (http://www.sanger.ac.uk/ resources/software/genevar/)로부터 3개의 다른 자료를 찾았다. 각 SNP의 cis 연관성 및 근처 유전자의 발현과 그것의 프록시(proxies)를 1차 섬유아세포, T-세포, 피부, 지방 및 림프 아구성(lymphoblastoid) 세포주에서 찾았다.^17,18

조절 SNPs

조절 SNPs는 RegulomeDB (http://regulomedb.org)에서 조사하였다. 변이는 추정한 기능을 나타내는 1-6까지의 점수 범위와 4개의 RegulomeDB 범주 중 하나로 분류할 수 있다.

GWAS 분석 위주의 네트워크 및 경로

우리는 알려진 KEGG 경로와 구성 유전자 비교를 통해 생물학적으로 의미 있는 서브네트워크를 평가하기 위해 Ingenuity pathway analysis를 사용한 생물학적 경로를 분석하였다.

면역염색

면역조직화학적 분석을 위해, 포르말린-고정된 파라핀-내장(embedded)(FFPE) 조직 조각(21명의 암 환자 정상 조직 및 29명의 장 BD 환자 염증조직을 탈 파라핀하고, 멸균수로 세척 하고, 항원 회수를 위해 10 분 동안 10 mM 구연산염 완충액(pH 6.0)에서 가열하였다. 조직 조각을 멸균수로 세척하고 5 분 동안 3% H₂O₂로 처리하였다. 0.1% Tween-20이 포함된 Tris-완충 식염수(saline)(TBST)로 세척한 후에 조각을 한 시간 동안 TBST안에 2.5% 정상 말 혈청으로 블로킹하고 4℃에서 하룻밤동안 1% 정상 말 혈청으로 희석한 NAALADL2 항체(1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), GSTT1(1:100, Santa Cruz), 및 YIPF7(1:100, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) 로 반응시켰다. 세척 후, 조각을 바이오틴(Biotin)-결합된 IgG(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA, 1:500)으로 반응시키고 나서 색 발색을 위한 벤지딘 물질을 포함한 벡타-엘리트 스트렙타비딘(streptavidin)-퍼옥시다제(peroxidase) 키트(Vector Laboratories)에 시약을 처리하였다. 조각을 희석된 헤마토실린(hematoxylin)으로 대비 염색하고 광학 현미경(올림푸스 BX41: Olympus Optical, Tokyo, Japan)으로 실험하였다. 유전자 발현을 정량하기 위해, 100 × 확대 및 0-3 범위 점수의 각 시료에 대해 무작위로 선택된 필드(fields)를 실험하였다.

세포 배양 및 처리

HT-29 세포주(한국 세포주 은행, 서울, 한국)는 5% CO₂의 습한 상태에 10% 열-불활성 소태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)내 37℃에서 유지하였다. 세포는 배양하는 시간 동안 LPS(1 ㎍/ml)과 함께 배양하였다.

녹다운은 6웰 플레이트에 웰 당 HT-29세포에 short interfering RNA 또는 비-타겟팅 대조군을 24시간 트랜스펙션(transfection)하여 실시하였다. 염증 반응을 평가하기 위해, 세포 배양 배양액을 트랜스펙션 24 시간 후에 LPS가 포함된 배양액으로 대체하였다. 모든 시료는 LPS 처리 후 3-72 시간 후에 수득하였다. 전사 수준은 정량적 PCR 및 GAPDH, β-ACTIN으로 표준화하여 정량하였다.

정량적 실시간 역-전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)

전체 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 정제하고 1 g의 RNA를 제조사-추천 프로토콜에 따라 SuperScript First-Strand 합성 키트(Invitrogen)를 사용하여 역-전사 하였다. cDNAs는 SYBR Green 마스터 믹스(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 프라이머 쌍(4 pmol의 각 프라이머)를 사용하여 각 세 개로 혼합하였다. PCR은 NAALADL2, YIPF7, TNF-α, IL12BIL22 및 β-actin에 대한 프라이머(AccuTarget qRT-PCR primer)를 사용하여 실시하였다. 시료를 95℃에서 30초, 6063℃에서 30초, 그리고 72℃에서 40초 PCR 조건에서 40-45 사이클을 StepOne Plus 실시간 PCR(Applied Biosystems)에서 증폭하였다. 마지막으로, 정량적 분석은 상대적 비교곡선법을 사용하여 실시하고 그 결과를 상대적 발현 또는 내성의 대조군, GAPDH 또는 β-actin에 전사 수준의 표준화 후 눈금 측정기를 비교한 폴드(fold)값을 변화를 기록하였다.

통계 분석

질병 또는 질병의 서브세트에서 선택된 SNPs의 연관성은 SAS 9.1.3 버전 (SAS institute Inc. Cary NC, USA)을 사용하여 chi-square 시험(우성, 열성, 및 대립유전자 모델), Cohchran-Amitage Trend 시험(공우성 모델) 파라메릭(parametric) 방법, 및 비-파라메릭 방법인 Jonckheere-Terpstra 시험(결과 첨부하지 않음)에 의해 결정된 통계학적 유의성 및 케이스 및 대조군 사이에 소수 대립유전자를 비교하여 분석하였다. 또한, 로지스덕 회기 분석은 네 개의 다른 모델(우성, 열성, 공우성, 및 대립유전자)에서 선택된 SNP에 대한 오즈비(odds ratio: OR), OR에 대한 95% 신뢰구간(CI), 및 케이스 및 대조군을 비교한 상대적 P 값을 얻기 위해 사용하였다. 우리는 Haploview(V.4.2) (http://www.broadinstitute.org/haploview)를 사용하여 -log10 P의 맨해튼 플롯(Manhattan plot)을 생성하였다. 연관성 분석에 의미있는 P 값은 Cochran-Mantel-Haenszel 시험(70개의 시험에 대해 본페로니(Bonferroni) 정정은 통계학적으로 의미 있는 수준 P < 7.1 × 10⁴으로 적용)을 이용한 조합한 시료 뿐만 아니라 CochranArmitage trend 시험을 이용하여 반복된 시료에 대해 산출하였다. 0.4%의 소수 대립유전자 빈도의 경우, 우리의 연구는 Quanto(version 1.2.4)에 의해 추정된 1.56%에 낮은 OR을 검출하는 힘을 80% 획득하였다. 각 기록된 SNP의 경우, 0.05의 P 값에 검출을 위한 힘은 보고된 OR 및 한국인 대립 유전자 빈도를 기초로 계산하였다. 하나의 유전자(GSTT1)는 Nexus copy number version 7.0(Biodiscovery, El Segundo, CA, USA)을 사용하여 장 BD 및 장을 포함하지 않는 BD를 비교하여 선택하였다.

파인(fine)-맵핑 단계를 위한 연관성 분석은 Haploview, version 4.1.으로 수행된 타겟 영역의 Haploview 4.1. Linkage disequilibrium analysis (LD)을 사용하여 실시하였다.

단백질 기능에 아미노산 치환의 예측 가능한 영향은 SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant, http://siftdna.org/www/SIFT_dbSNP.html) 또는 PolyPhen-2 algorithms (polymorphism phenotyping v2) (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)을 사용하여 실시하고, “손상” 또는 “아마도/가능한 손상”은 각 단백질 기능에 효과를 예측하기 위해 고려하였다.

맨-휘트니(Mann-Whitney)시험은 P < 0.05 유의성을 고려하여 면역염색에 대한 의미있는 차이를 시험하기 위해 사용하였다.

장 BD의 예후( 진단 후 수술, 입원, 코르티코스테로이드(corticosteroid) 사용 및 면역억제 사용의 누적 확률)는 차이가 로그-범위 시험을 사용하여 결정되는, 케플랜-메이어(KaplanMeier) 방법을 사용하여 분석하였다.

결과

장 BD 환자 및 장을 포함하지 않는 BD 환자에 GWAS 및 SNP 선택

BD 시료의 특징적 개요는 표 1에 제공하였다. 총 199 명 BD 환자(100 명의 장을 포함하지 않는 BD 환자, 99명의 장 BD 환자) 및 GWAS > 95%의 콜 레이트(call rates)에 총 577명의 대조군으로 케이스-대조군 분석을 시작하였다. PCA는 기존 한국 IBD GWAS 데이터와의 비교를 통해 혼합 집단으로부터 거짓 양성 연관성의 낮은 가능성을 제시한다(도 4)^20,21. 이것은 고유 벡터 2 데이터 세트에 BD 케이스 및 대조군 대상자 사이에 중간 변화량은 질병으로 인한 유전적 이질성을 제시한다(도 5).

SNP 질적 관리 후, 로지스틱 회귀의 경향성 시험을 사용하여 케이스 및 대조군 사이에 연관성을 추가로 분석하였다. GWAS 분석은 질병 서브타입의 더 많은 포괄적인 분석을 할 수 있게 하고 질병의 서브타입에 따라 다양한 SNP를 나타내는 지원 정보 2에 요약된 게놈-전체 수준 (P < 1×10^-4)에 7개 비교군: 장 BD 대 건강한 대조군 399 SNPs, 장 BD 대 장을 포함하지 않는 BD와 비교하여 의미 없는 건강한 대조군 대 건강한 대조군(장 포함 특이적으로 위험한 SNPs가 아닌 BD를 제외) 사이를 비교한 319 SNPs, 장을 포함하지 않는 BD 대 건강한 대조군 사이를 비교한 342 SNPs, 장을 포함하지 않는 BD 대 장 BD와 비교하여 의미 없는 건강한 대조군 대 건강한 대조군(장 BD에 특이적으로 위험한 것 제외) 사이를 비교한 279 SNPs, 장 BD 대 장을 포함하지 않는 BD(검출 위험 단독 작용하지 않음) 사이를 비교한 108 SNPs, 장 BD 대 BD와 비교하여 의미있는 장을 포함하지 않는 BD 대 건강한 대조군 사이를 비교한 32 SNPs, 및 모든 BD(장 BD + 장을 포함하지 않는 BD) 대 건강한 대조군(총 BD 위험을 추측하기 위한)사이를 비교한 218 SNPs 로 나누었다.

장 BD와 관련있는 특이적인 변이의 범위를 개선하기 위해, 염색체 17에 장 BD 발병과 중요한 연관성을 나타내는 CD300C/CD300LB(P < 2.0 × 10^-6) 및 TNFRSF13B(P < 2.5 × 10^-6)에 변이 세트를 통합한 1000 Genomes Phase I을 사용하여, 장 BD 케이스 99개 및 대조군 557개의 GWAS 무리에 상염색체 SNPs의 누락된 유전자형을 다시 확인하였다(표 6). 또한, 다른 수단(Nexus 카피 수)은 의미있는 전체 BD-, 장을 포함하지 않은 BD-, 장 BD-관련 유전자로 선택된 GSTT1로부터 분석 수단 가운데 예측하는 힘을 비교하는데 사용하였다.

유전자형 확인을 위한 반복 연구

게놈-전체 연관 스크리닝 다음에 선택된 70 SNPs는 게놈-전체 연관 스크리닝을 평가하는 196명의 독립된 장 BD 환자, 137명의 장을 포함하지 않는 BD 환자 및 391명의 대조군을 추가적으로 사용한 반복 연구를 실시했다. 이러한 분석으로, 가장 강한 연관 신호 또는 다른 분석 소프트웨어를 사용한 GWAS 분석으로부터 하나의 SNP(GSTT1), BD GWAS 연구에 의해 종래에 검증된 8 위치(IL23R-IL12RB2에 rs12119179 및 rs1495965, IL10에 rs1554286, rs1518111 및 rs1800871, CCR1-CCR3에 rs5742906, ERAP1에 rs17482078 및 rs2927615, HLA-F-AS1HLA-A에 rs4713242, KLRC4-KLRK1에 rs2255336, PSORS1C1에 rs12525170, STAT4에 rs7574070)^{2-6, 22} 로부터 12 SNPs, 및 다시 확인한 데이터의 하나의 위치(CD300C/CD300LB에 rs61730133)으로 분리된 분석 중 최소 한 영역에서의 하나 이상의 의미 있는 연관성을 보이는 37 위치로부터 56 SNPs를 선택하였다.

GWAS의 조합한 분석 및 반복 연구는 본페로니(Bonferroni) 교정(P < 2.0 × 10³, 0.05/25 총 시험수로 계산) 후에 획득된, 염색체 3에 NAALADL2 유전자(rs3914501, OR = 1.914, P = 3.5 × 10⁴, 열성유전자 모델) 근처 위치에 단지 하나의 장 BD-특이적 연관성 및 염색체 6에 PSORS1C1 유전자(rs12525170, OR = 2.210, P = 1.1 × 10⁵ 우성유전자 모델) 위치에 하나의 장을 포함하지 않는 BD-특이적 연관성을 보였다. 이러한 서로 다른 유전적 위험은 장 포함 존재하는 특이적 생물학적 중요성을 보여 준다(표1 및 2). 장 BD 및 장을 포함하지 않는 BD에 비교는 본페로니(Bonferroni) 교정 후 장 포함하는 염색체 4에 YIPF7 유전자(rs6838327, OR = 1.567, P = 3.4 × 10⁴, 대립 유전자 모델) 위치에 의미 있는 연관성을 보였다. 다시 확인된 SNPs로부터 선택된 CD300C/CD300LB에 rs61730133은 본 연구에서 유전적 변이를 보이지 않았다(표 3). 추가적으로, GSTT1에 rs17856199은 장 BD(OR = 1.918, P = 1.7 × 10^-4, 대립유전자 모델) 및 장을 포함하지 않는 BD(OR = 1.630, P = 3.7 × 10^-3 대립유전자 모델)에 연관성을 보였고, 이는 GSTT1이 장 포함에 상관없는 BD(OR = 1.730, P = 5.2 × 10⁵, 대립 유전자 모델)의 새로운 후보 유전자임을 제시한다.

GWAS 연구에서 종래에 입증된 위치 중, CCR1-CCR3(rs5742906), IL23R-IL12RB2(rs12119179, rs1495965)^4,5, HLA-F-AS1HLA-A(rs4713242), 및 KLRC4-KLRK1(rs2255336)은 본 연구에서 BD 임의의 서브타입에서 의미있는 연관성을 보이지 않았지만, ERAP1(rs2927615)은 장 BD 및 장을 포함하지 않는 BD 사이에서 의미있게 보였고, 이는 장 포함하는 ERAP1의 역할을 증명한다(OR = 2.744, MAF = 0.041, P = 1.6 × 10^-2, 대립유전자 모델). 또한, ELMO1는 건강한 대조군과 비교하여 장을 포함하지 않는 BD(rs10259514, OR = 0.724, MAF =0.256, P = 1.8 × 10^-2 공우성유전자 모델)보다는 장 BD(rs10259514, OR = 0.706, MAF =0.249, P = 4.8 × 10^-3, 공우성유전자 모델)강한 연관성 및 HLA-B 근처 PSORS1C1은 본페로니 교정 전 장을 포함하지 않는 BD 및 건강한 대조군 사이에 연관성(rs4959053, OR = 1.892, MAF = 0.203, P = 5.6 × 10^-5, 대립유전자 모델)을 보였다. IL10에 rs1518111(OR = 0.717, MAF = 0.247, P = 7.5 × 10³, 공우성유전자모델), rs1554286(OR = 0.789, MAF = 0.252, P = 7.3 × 10^-3, 공우성유전자 모델), 및 rs1800871 (OR = 0.730, MAF = 0.245, P = 8.9× 10³, 공우성유전자모델) 부취 또한 장 BD 및 장을 포함하지 않는 BD 발병에 연관성을 보였다. STAT4에 rs7574070(OR = 1.355, MAF = 0.490, P = 4.2 × 10^-2, 우성유전자 모델) 또한 전체 BD, 장을 포함하지 않는 BD 및 건강한 대조군 사이에 의미있는 연관성을 보였다. 이러한 결과는 나타낸다.

본 연구의 데이터 세트가 시료 크기에 연구의 제한이 있지만, 이 SNPs에 대한 연관성 결정에 충분한 힘(>80%)을 가짐을 나타낸다.

게다가, YIPF7 뿐만 아니라 AFF1(rs4536897, OR = 1.478, MAF = 0.151, P = 4.0 × 10^-2, 대립유전자 모델), RPL13AP25 및 HNF4GP1사이의 유전자간 위치(rs11839457, OR = 1.775, MAF = 0.235, P = 2.0 × 10^-3, 우성유전자 모델), NAALADL2(rs16848171, OR = 3.208, MAF = 0.248, P = 5.0 × 10^-3, 열성유전자 모델), PEX1(rs32019, OR =1.723, MAF =0.548, P = 9.9 × 10^-3, 열성유전자 모델), PLCB1(rs6086653, OR = 2.141, MAF = 0.293, P = 1.5 × 10², 열성유전자 모델), PRKCH(rs12433533, OR = 1.614, MAF =0.178, P = 1.6 × 10², 우성유전자 모델), PSORS1C1(rs12525170, OR = 0.595, MAF = 0.151, P = 5.9 × 10³, 우성유전자 모델), 및 TGFBR3(rs284148, OR = 0.638, MAF = 0.381, P = 1.6 × 10², 우성유전자 모델)에 장 BD 및 장을 포함하지 않는 BD 사이에 비교는 연관성(본페로니 교정 전)의 적당한 증거를 보여준다.

일배체형(Haplotype) 분석

더 나은 유전적 연관성을 평가하기 위해, 본 연구에서는 GWAS 결과로부터 11개의 유전자 위치를 선택하고 GWAS로부터 다중 신호를 보이는 위치의 CAF12, ERAP1, IL10, IL23R-IL12RB2, SCHIP1, KCNJ16, NAALADL2, PLCB1, PRKCH, PSORS1C1, 및 TGFBR3 추가적인 위치로부터 대체(proxy) SNPs과 일배체형 분석을 실시하였다. IL23R-IL12RB2, SCHIP1, KCN은 BD의 임의의 서브타입과 연관성을 보이지 않지만, IL10, NAALADL2, PLCB1, PRKCH, 및 TGFBR3은 일배체형 분석에서 반복 결과에서 일관되게 장 BD 발병에 연관성을 보였다: DCAF12(C-A, OR = 0.619, P = 2.4 × 10³ ,장 BD 대 건강한 대조군), IL10(G-C-C, OR = 0.712, P = 7.3 × 10³, 장 BD 대 건강한 대조군), NAALADL2(T-G, OR = 0.473, P = 1.7 × 10², 장 BD 대 건강한 대조군 ; T-G, OR = 0.347, P = 7.3 × 10³, 장 BD 대 장을 포함하지 않는 BD), PLCB1(C-C-T-T-G, OR = 1.465, P = 1.5 × 10², 장 BD 대 건강한 대조군), SCHIP1(G-C, OR = 1.613, P = 3.2 × 10³, 장 BD 대 건강한 대조군), PRKCH(T-G, OR = 1.587, P = 1.8 × 10², 장 BD 대 장을 포함하지 않는 BD), 및 TGFBR3(C-C-G, OR = 1.481, P = 2.2 × 10², 장 BD 대 건강한 대조군), 이러한 유전자는 장 BD 발병에 영향을 주는 잠재적 원인이 되는 변이임을 제시한다(표 4). 다른 한편으로, PSORS1C1은 장을 포함하지 않는 BD(G-G-G, OR = 0.511, P = 1.5 × 10⁵, 장을 포함하지 않는 BD 대 건강한 대조군; G-G-G, OR = 1.619, P = 9.4 × 10³, 장 BD 대 장을 포함하지 않는 BD)에 강한 연관성을 보여, 장을 포함하는 것에 부정적인 조절자일 수 도 있다.

유전자형에 따른 임상 표현형 및 결과

본 연구는 발견된 SNPs가 장 BD 환자에 수술, 입원, 코르티코스테로이드 사용 및 면역 역제 사용과 같은 전신 장기 침범, 장 합병증, 및 예후를 포함하는 임상적 징후에 영향이 있는지 평가하였다. 장 BD에서, NAALADL2(rs16848171), PRKCH(rs1957895), PEX1(rs32019), 및 YIPF7(rs6838327)은 구강 궤양의 발병에 연관이 있으며, TGFBR3(rs1805110 and rs284148)는 음부 궤양의 발병과 연관이 있다. PRKCH(rs12433533) 및 IL10(rs1518111, rs1554286, and rs1800871)은 눈을 포함하는 것, IL23R-IL12RB2(rs12119179 and rs1495965)은 피부를 포함하는 것 및 HLA-F-AS1HLA-A(rs4713242)은 관절통/관절염에 연관성이 있다. 장 합병증과 관련하여, ERAP1(rs17482078 및 rs2927615) 및 HLA-F-AS1HLA-A(rs4713242)은 장천공과 연관이 있다. ELMO1(rs10259514) 및 DCAF12(rs10758242)은 장 협착과 연관이 있다(표 6). 임상 결과 측면에서, AFF1(rs4536897), NAALADL2(rs3914501), 및 TGFBR3(rs1805110 및 rs17882828)은 수술의 높은 누적 확률과 연관이 있고, 반면에 PSORS1C1(rs12525170) 및 STAT4(rs7574070)은 수술의 낮은 누적확률과 관련이 있다(도 1). KCNJ16(rs1013996 및 rs2108440), NAALADL2(rs16848171 및 rs3914501), 및 COG7(rs430208)은 입원의 높은 누적 확률과 연관이 있다. NAALADL2(rs16848171 및 rs3914501), PTPRD(rs12003392), PRKCH(rs12433533 및 rs1957895), COG7(rs430208), 및 IL23R(rs1495965)은 코르티코스테로이드 사용의 높은 누적 확률과 연관이 있고 PTPRD(rs12003392) 및 RPL13AP25 및 HNF4GP1 사이에 유전자간 위치(rs11839457)는 면역억제제 사용의 높은 누적 확률과 연관이 있으며(도 6), 더 나쁜 예후를 제시한다.

본 연구는 또한 발견한 SNPs가 장을 포함하지 않는 BD에 임상 징후에 영향이 있는지를 평가하였다. PSORS1C1(rs12525170 및 rs4959053) 및 IL10(rs1554286)은 HLA-B51 양성과 관련있고, AFF1(rs4536897) 및 YIPF7(rs6838327)은 음부 궤양의 발병과 관련있다. IL10(rs1554286 및 rs1957895)은 피부를 포함하는 것 및 HLA-F-AS1HLA-A (rs4713242)은 혈관 포함하는 것과 연관이 있다. PSORS1C1 (rs12525170 and rs4959053)은 중추 신경계를 포함하는 것과 관련 있다(표 7).

유전자 기능 분석

질병-관련 SNPs의 기능적 결과를 확인하기 위해, 본 연구는 eQTLs 및 미스센스(missense)를 중심으로, 선택된 70 SNPs의 가능한 기능적 결과를 탐구하였다. 림프 아구성 세포주(LCLs)은 유전자 발현의 유전적 조절 연구를 위한 유용한 모델 시스템으로 입증하였다²³. eQTL 분석은 본페로니 교정 후 mRNA 발현과 의미있게 연관된 위치를 나타 낸다: COG7을 포함한 DCTN5, EARS2 및 GGA2과 COG7에 rs430208; ERAP1을 포함한 CAST 와 ERAP1에 rs17482078 및 rs2927615; SCHIP1에 rs16830581; STAT4와 STAT4에 rs7574070; NUDT2 및 C9orf131와 DCAF12에 rs10441723 및 rs10758242; IL19, C1orf186, 및 MAPKAPK2와 IL10에 rs1554286 및rs1518111; TGFBR3와 KIAA1107에 rs1805110; GUF1 및 GNPDA2 와 YIPF7에 rs6838327(도 7). 더욱이, 후보자 SNPs를 실험적으로 지원된 조절 요소를 참고로 주석을 달은 Regulome DB를 사용하여 잠재적 조절 기능을 위해 실험하였다. 점수 및 일치하는 기능적 증거는 지원한 정보 6에 기록하였다. 잠재적 조절 기능에 대한 비교적 높은 수준의 증거(낮은 RegulomeDB 점수)를 나타내는 3 SNPs의 2는 게놈-전체 의미 있는 SNPs(ERAP1-ERAP2에 rs2927615, 점수 = 1f; IL10에 rs1518111 , 점수 = 3a) 및 본 연구의 다른 하나(TGFBR3에 rs17882828 , 점수 = 2b)를 보고한다.

미스센스 돌연변이를 발생시키는 YIPF7(p.Gln92*)에 rs192398919 뿐만 아니라 염색체 5에 ERAP1에 rs17482078(p.Arg725Gln) 및 NAALADL2에 rs9866564(p.Pro622Arg) 및 염색체 9에 PTPRD에 rs144202170(p.Arg52Gly)은 실리코(silico) 분석에 손상 가능성을 예측하였다. 게다가, 염색체 22에 GSTT1에 rs17856199(p.Phe45Cys)은 종래 연구에서 매우 유해하고 단백질 구조를 손상시킴을 발견하였다²⁴.

질병 민감성에 대해 반응하는 유전자에 생물학적 경로를 확인하기 위해, PANOGA에 의미있는 SNPs를 적용하였다.

추가적인 발견을 위해, 장 BD 환자의 결장 조직 및 장 수술한 암 환자에 정상 조직을 가지고 실시한 면역조직화학 분석에서 3개의 단백질(NAALADL2, YIPF7, 및 GSTT1)이 한 가지 이상의 방법에 의한 장 BD 발병과 의미 있는 관련이 있었다. NAALADL2, YIPF7, 및 GSTT1의 단백질 발현은 대조군 조직과 비교한 IBD 및 BD 환자의 결장 조직에서 감소하였다(도 2). 발견한 위치에 높은 LD에 영역에 다른 알려지지 않은 변이는 단백질 발현, 또는 단백질 번역 및 분해의 조절을 변화할 가능성이 있다^25,26.

건강한 대조군 및 장 베체트병 환자 사이를 비교한 결과

SNP	MA	위치 (Locus)	Nearby genes	GWAS P 모델	복제된 aP 값 모델	결합된 (combined) aP 값 모델	OR (95% CI)	결합된 P 모델	MAF 건강한 컨트롤	MAF 장 BD
rs3914501	G	Chr.3: 174564668	NAALADL2	5.7×10-5 열성	1.6×10-2 열성	3.8×10-4 열성	1.914(1.338-2.738)	3.5×10-4 열성	0.459	0.537
rs16848171	C	Chr.3: 175181067	NAALADL2	1.4×10-5 열성	9.2×10-2 열성	7.0×10-3 열성	2.462(1.279-4.739)	5.6×10-3 열성	0.219	0.248
rs32019	C	Chr.5: 66702373	CD180	1.8×10-3 공우성	4.4×10-2 공우성	4.0×10-3 공우성	1.265(1.023-1.563)	3.8×10-3 공우성	0.487	0.548
rs6086653	A	Chr.20: 8838343	PLCB1	3.5×10-5 우성	6.2×10-1 우성	4.3×10-2 우성	0.729(0.537-0.99)	4.3×10-2 우성	0.312	0.293
rs284148	T	Chr.1: 92277843	TGFBR3	4.8×10-5 우성	3.5×10-1 우성	1.2×10-2 우성	0.667(0.486-0.916)	1.2×10-2 우성	0.425	0.381
rs12525170*	A	Chr.22: 31099761	PSORS1C1	4.7×10-2 대립	4.7×10-2 대립	8.5×10-2 대립	1.318(0.962-1.805)	8.5×10-2 대립	0.119	0.151
rs121917820	T	Chr.6: 31084794	PSORS1C1	변이없음	변이없음	변이없음		변이없음
rs7742033	G	Chr.6: 31085226	PSORS1C1	6.4×10-1 공우성	6.4×10-1 공우성	8.4×10-1 공우성	1.323(0.082-21.241)	8.4×10-1 공우성	0.001	0.002
rs4959053*	A	Chr.6: 31099577	PSORS1C1	7.6×10-2 대립	7.7×10-1 대립	1.2×10-1 대립	1.285(0.937-1.760)	1.2×10-1 대립	0.119	0.148
rs5742906*	T	Chr.3: 46306765	CCR-CCR3	변이없음	변이없음	변이없음		변이없음
rs10259514	G	Chr.3: 36829705	ELMO1	7.7×10-6 대립	1.4×10-1 대립	4.8×10-3 대립	0.706(0.554-0.899)	4.8×10-3 대립	0.320	0.249
rs17482078*	T	Chr.5: 96118866	ERAP1	1.6×10-1 열성	9.9×10-1 열성	9.9×10-1 열성	∞ (0-∞)	2.5×10-1 열성	0.046	0.048
rs2927615*	A	Chr.5: 96198202	ERAP1-ERAP2	1.6×10-1 열성	9.9×10-1 열성	9.9×10-1 열성	∞ (0-∞)	2.5×10-1 열성	0.032	0.041
rs4713242*	A	Chr.6: 29718220	HLA-F-AS1-HLA-A	9.2×10-1 열성	9.2×10-1 열성	5.3×10-1 열성	1.141(0.757-1.720)	5.3×10-1 열성	0.391	0.399
rs1554286*	G	Chr.1: 206944233	IL10	4.7×10-1 우성	4.0×10-3 공우성	2.1×10-1 공우성	0.717(0.562-0.915)	7.3×10-3 공우성	0.318	0.252
rs1800871*	C	Chr.1: 206946634	IL10		5.8×10-3 공우성	2.1×10-1 공우성	0.730(0.563-0.948)	8.9×10-3 공우성	0.309	0.245
rs1518111*	C	Chr.1: 206944645	IL10	1.4×10-5 공우성	5.6×10-3 공우성	7.8×10-3 공우성	0.717(0.562-0.916)	7.5×10-3 공우성	0.313	0.247
rs12119179*	C	Chr.1: 67747415	IL23R-IL12RB2	8.8×10-3 열성	9.5×10-1 열성	3.3×10-1 열성	1.196(0.832-1.722)	3.3×10-1 열성	0.478	0.489
rs1495965*	C	Chr.1: 67753508	IL23R-IL12RB2		4.0×10-1 열성	1.7×10-1 열성	1.283(0.901-1.828)	1.7×10-1 열성	0.494	0.514
rs2255336*	T	Chr.12: 10532326	KLRC4-KLRK1	4.2×10-1 우성	2.7×10-1 공우성	1.8×10-1 공우성	0.828(0.630-1.088)	1.8×10-1 공우성	0.214	0.185
rs7574070*	A	Chr.2: 192010488	STAT4	3.6×10-1 우성	8.0×10-2 우성	7.3×10-2 우성	1.370(0.971-1.934)	7.3×10-2 우성	0.459	0.491
rs6838327	A	Chr.4: 44626846	YIPF4	4.5×10-3 우성	1.2×10-1 열성	6.4×10-3 열성	1.654(1.152-2.376)	6.2×10-3 열성	0.468	0.519
rs7245731	A	Chr.19: 29975118	LOC284395	6.6×10-1 우성	9.9×10-1 열성	9.9×10-1 열성	-	2.5×10-1 열성	0.133	0.127

건강한 대조군 및 장을 포함하지 않는 베체트병 환자 사이를 비교한 결과

SNP	MA	위치 (Locus)	Nearby genes	GWAS P 모델	복제된 aP 값 모델	결합된 (combined) aP 값 모델	OR (95% CI)	결합된 P 모델	MAF 건강한 컨트롤	MAF 장을 포함하지 않는 BD
rs3914501	G	Chr.3: 174564668	NAALADL2	8.7×10-5 공우성	7.8×10-2 공우성	3.4×10-1 공우성	1.122(0.886-1.422)	3.4×10-1 공우성	0.459	0.487
rs16848171	C	Chr.3: 175181067	NAALADL2	6.2×10-1 열성	4.1×10-1 열성	5.7×10-1 열성	0.768(0.308-1.911)	5.7×10-1 열성	0.219	0.217
rs32019	C	Chr.5: 66702373	CD180	2.4×10-1 열성	3.3×10-1 열성	3.9×10-2 열성	0.658(0.442-0.98)	3.9×10-2 열성	0.487	0.483
rs6086653	A	Chr.20: 8838343	PLCB1	2.8×10-1 공우성	1.9×10-1 공우성	7.9×10-2 공우성	0.792(0.610-1.028)	7.9×10-2 공우성	0.312	0.266
rs284148	T	Chr.1: 92277843	TGFBR3	4.4×10-1 열성	8.4×10-1 열성	3.0×10-1 열성	1.25(0.823-1.897)	3.0×10-1 열성	0.425	0.446
rs12525170*	A	Chr.6: 31207740	PSORS1C1		1.1×10-3 우성	1.3×10-5 우성	2.210(1.546-3.157)	1.0×10-5 우성	0.119	0.212
rs121917820	T	Chr.6: 31084794	PSORS1C1		변이없음	변이없음		변이없음
rs7742033	G	Chr.6: 31085226	PSORS1C1		2.0×10-1 공우성	7.2×10-1 공우성	1.648(0.103-26.477)	7.2×10-1 공우성	0.001	0.002
rs4959053*	A	Chr.6: 31099577	PSORS1C1	2.2×10-5 대립	7.7×10-2 대립	5.6×10-5 대립	1.892(1.383-2.589)	5.6×10-5 대립	0.119	0.203
rs5742906*	T	Chr.3: 46306765	CCR-CCR3	변이없음	변이없음	변이없음		변이없음
rs10259514	G	Chr.3: 36829705	ELMO1	6.8×10-2 공우성	1.7×10-2 공우성	1.7×10-2 공우성	0.724(0.556-0.944)	1.7×10-2 공우성	0.320	0.256
rs17482078*	T	Chr.5: 96118866	ERAP1		5.3×10-2 공우성	2.1×10-1 공우성	0.669(0.358-1.251)	2.1×10-1 공우성	0.046	0.032
rs2927615*	A	Chr.5: 96198202	ERAP1-ERAP2		5.0×10-2 공우성	7.5×10-2 공우성	0.468(0.199-1.100)	7.5×10-2 공우성	0.032	0.016
rs4713242*	A	Chr.6: 29718220	HLA-F-AS1-HLA-A		6.4×10-1 우성	5.7×10-1 우성	1.104(0.788-1.548)	5.7×10-1 우성	0.391	0.397
rs1554286*	G	Chr.1: 206944233	IL10	1.4×10-1 공우성	5.7×10-1 공우성	8.5×10-2 공우성	0.801(0.621-1.032)	8.5×10-2 공우성	0.318	0.272
rs1800871*	C	Chr.1: 206946634	IL10		4.6×10-3 우성	1.0×10-1 우성	0.806(0.622-1.044)	1.0×10-1 우성	0.309	0.266
rs1518111*	C	Chr.1: 206944645	IL10		3.2×10-3 우성	1.0×10-1 우성	0.758(0.545-1.055)	1.0×10-1 우성	0.313	0.278
rs12119179*	C	Chr.1: 67747415	IL23R-IL12RB2	1.1×10-1 열성	2.2×10-1 열성	1.0×10-1 열성	1.369(0.938-2.000)	1.0×10-1 열성	0.478	0.515
rs1495965*	C	Chr.1: 67753508	IL23R-IL12RB2		8.2×10-1 열성	2.0×10-1 열성	1.276(0.877-1.855)	2.0×10-1 열성	0.494	0.523
rs2255336*	T	Chr.12: 10532326	KLRC4-KLRK1	3.3×10-1 대립	1.2×10-1 대립	2.7×10-1 대립	0.85(0.637-1.134)	2.7×10-1 대립	0.214	0.188
rs7574070*	A	Chr.2: 192010488	STAT4	4.0×10-1 우성	8.7×10-2 우성	1.2×10-1 우성	1.337(0.924-1.933)	1.2×10-1 우성	0.459	0.487
rs6838327	A	Chr.4: 44626846	YIPF4	3.9×10-4 우성	3.6×10-1 우성	1.0×10-2 우성	0.630(0.442-0.897)	1.0×10-2 우성	0.468	0.408
rs7245731	A	Chr.19: 29975118	LOC284395	1.9×10-9 열성	9.9×10-1 열성	6.3×10-4 열성	-	6.3×10-4 열성	0.133	0.1399

장 베체트병 및 장을 포함하지 않는 베체트병 환자 사이를 비교한 결과

SNP	MA	위치 (Locus)	Nearby genes	GWAS P 모델	복제된 aP 값 모델	결합된 (combined) aP 값 모델	OR (95% CI)	결합된 P 모델	MAF 장을 포함하지 않는 BD	MAF 장 BD
rs3914501	G	Chr.3: 174564668	NAALADL2	1.1×10-1 대립	1.1×10-1 대립	1.1×10-1 대립	1.303(0.88-1.928)	1.1×10-1 대립	0.487	0.537
rs16848171	C	Chr.3: 175181067	NAALADL2	5.0×10-3 열성	5.0×10-3 열성	5.0×10-3 열성	3.208(1.367-7.529)	5.0×10-3 열성	0.217	0.248
rs32019	C	Chr.5: 66702373	CD180	9.9×10-3 열성	9.9×10-3 열성	9.9×10-3 열성	1.723(1.137-2.610)	9.9×10-3 열성	0.483	0.548
rs6086653	A	Chr.20: 8838343	PLCB1	1.5×10-2 열성	1.5×10-2 열성	1.5×10-2 열성	2.141(1.144-4.007)	1.5×10-2 열성	0.266	0.293
rs284148	T	Chr.1: 92277843	TGFBR3	1.6×10-2 우성	1.6×10-2 우성	1.6×10-2 우성	0.638(0.442-0.921)	1.6×10-2 우성	0.446	0.381
rs12525170*	A	Chr.22: 31099761	PSORS1C1	5.8×10-3 우성	5.8×10-3 우성	5.8×10-3 우성	0.595(0.410-0.862)	5.8×10-3 우성	0.212	0.151
rs121917820	T	Chr.6: 31084794	PSORS1C1	변이없음	변이없음	변이없음		변이없음
rs7742033	G	Chr.6: 31085226	PSORS1C1	8.8×10-1 공우성	8.8×10-1 공우성	8.8×10-1 공우성	0.801(0.050-12.879)	8.8×10-1 공우성	0.002	0.002
rs4959053*	A	Chr.6: 31099577	PSORS1C1	1.1×10-2 우성	1.1×10-2 우성	1.1×10-2 우성	0.619(0.425-0.9)	1.1×10-2 우성	0.204	0.148
rs5742906*	T	Chr.3: 46306765	CCR-CCR3	변이없음	변이없음	변이없음		변이없음
rs10259514	G	Chr.3: 36829705	ELMO1	5.5×10-1 열성	5.5×10-1 열성	5.5×10-1 열성	1.256(0.596-2.645)	5.5×10-1 열성	0.256	0.250
rs17482078*	T	Chr.5: 96118866	ERAP1	1.9×10-1 공우성	1.9×10-1 공우성	1.9×10-1 공우성	1.529(0.807-2.897)	1.9×10-1 공우성	0.032	0.048
rs2927615*	A	Chr.5: 96198202	ERAP1-ERAP2	1.6×10-2 대립	1.6×10-2 대립	1.6×10-2 대립	2.744(1.172-6.427)	1.6×10-2 대립	0.016	0.041
rs4713242*	A	Chr.6: 29718220	HLA-F-AS1-HLA-A	4.0×10-1 열성	4.0×10-1 열성	4.0×10-1 열성	1.227(0.763-1.971)	4.0×10-1 열성	0.398	0.399
rs1554286*	G	Chr.1: 206944233	IL10	4.2×10-1 열성	4.2×10-1 열성	4.2×10-1 열성	0.758(0.381-1.505)	4.2×10-1 열성	0.272	0.252
rs1800871*	C	Chr.1: 206946634	IL10	4.1×10-1 우성	4.1×10-1 우성	4.1×10-1 우성	0.865(0.611-1.223)	4.1×10-1 우성	0.266	0.245
rs1518111*	C	Chr.1: 206944645	IL10	4.1×10-1대립	4.1×10-1대립	4.1×10-1 대립	0.889(0.669-1.18)	4.1×10-1대립	0.269	0.247
rs12119179*	C	Chr.1: 67747415	IL23R-IL12RB2	4.1×10-1 공우성	4.1×10-1 공우성	4.1×10-1 공우성	0.902(0.705-1.154)	4.1×10-1 공우성	0.5150	0.489
rs1495965*	C	Chr.1: 67753508	IL23R-IL12RB2	5.9×10-1 우성	5.9×10-1 우성	5.9×10-1 우성	0.894(0.593-1.347)	5.9×10-1 우성	0.521	0.514
rs2255336*	T	Chr.12: 10532326	KLRC4-KLRK1	6.6×10-1 열성	6.6×10-1 열성	6.6×10-1 열성	0.801(0.296-2.169)	6.6×10-1 열성	0.188	0.185
rs7574070*	A	Chr.2: 192010488	STAT4	8.9×10-1 공우성	8.9×10-1 공우성	8.9×10-1 공우성	1.025(0.685-1.535)	8.9×10-1 공우성	0.491	0.487
rs6838327	A	Chr.4: 44626846	YIPF4	3.4×10-4 대립	3.4×10-4 대립	3.4×10-4 대립	1.567(1.225-2.005)	3.4×10-4 대립	0.408	0.519
rs7245731	A	Chr.19: 29975118	LOC284395	1.4×10-2 열성	1.4×10-2 열성	1.4×10-2 열성	0.113(0.014-0.925	1.4×10-2 열성	0.139	0.127

장 베체트병 및 장을 포함하지 않는 베체트병에 대한 민감성 유전자의 일배체형 분석

Closest 유전자	일배체형	결합된 P 모델	OR(95% CI)
장 BD(n=295) 대 건강한 컨트롤(n=391)
DCAF12	C-A T-G	2.4×10-3 우성 5.4×10-3 열성	0.619(0.454-0.843) 1.55(1.138-2.111)
IL10	A-T-T G-C-C	1.2×10-2 공우성 7.3×10-3 공우성	1.374(1.073-1.76) 0.712(0.555-0.913)
NAALADL2	C-G T-C T-G	5.5×10-2 열성 6.4×10-1 우성 1.7×10-2 우성	2.079(0.985-4.388) 1.137(0.66-1.961) 0.473(0.255-0.876)
PLCB1	C-C-T-T-G G-T-C-C-A	1.5×10-3 열성 9.1×10-2 우성	1.465(1.077-1.993) 0.768(0.565-1.044)
SCHIP1	C-T G-C	7.3×10-3 열성 3.2×10-3 우성	0.649(0.473-0.890) 1.613(1.174-2.217)
TGFBR3	C-C-G C-T-A	2.2×10-3 열성 1.4×10-3 우성	1.481(1.059-2.070) 0.793(0.582-1.080)
장을 포함하지 않는 bd(n=264) 대 건강한 컨트롤(n=391)
PSORS1C1	G-A-A G-G-G A-A G-G	2.4×10-5 대립 1.5×10-5 대립 3.7×10-5 대립 2.1×10-5 대립	1.935(1.424-2.628) 0.511(0.377-0.693) 1.917(1.412-2.602) 0.515(0.380-0.699)
장 BD(n=295) 대 장을 포함하지 않는 BD(n=264)
NAALADL2	C-G T-C T-G	1.7×10-2 열성 4.1×10-1 우성 7.3×10-3 우성	3.401(1.245-9.296) 0.791(0.453-1.382) 0.347(0.16-0.751)
PSORS1C1	G-A-A G-G-G A-A G-G	9.7×10-3 우성 9.4×10-3 열성 9.7×10-3 우성 9.6×10-3 열성	0.617(0.428-0.889) 1.619(1.125-2.329) 0.617(0.428-0.889) 1.62(1.125-2.333)

장 베체트병 및 장을 포함하지 않는 베체트병 환자의 임상 및 인구 통계학적 특성

	장을 포함하지 않는 BD (n=238)	장 BD (n=295)
남성(%) 평균연령(년) 평균 진단연령(년) 평균 질병지속기간(년) HLA-B51 양성(%) 임상적 특성(%) 경구궤양 음부궤양 눈 장애 피부 장애 관절염/관절통 혈관장애 중추신경계 장애 부고환염 장내 합병증 천공 누공 협착 종기 약물사용 5-아미노살리실산/설파살라진 코르티코스테로이드 아자티오퓨린/6-메프캅토퓨린 항-TNF 제제	62(26.1) 41.8±11.8 NA NA 83(36.7) 238(100) 212(89.1) 76(31.9) 219(92.0) 134(56.3) 10(4.2) 5(2.1) 3(1.3) NA NA NA NA NA NA NA NA	135(45.8) 44.3±12.3 40.1±11.8 7.5±5.7 NA 273(92.5) 154(52.2) 52(17.6) 192(65.1) 158(53.6) 11(3.7) 5(1.7) 0 28(9.5) 26(8.8) 25(8.5) 13(4.4) 288(97.6) 136(46.1) 107(36.3) 8(2.7)

장 베체트병 환자의 SNP 유전자형에 따른 장내 합병증

표현형	유전자 및 rs 번호		유전형 또는 대립	표현형이 있는 환자	표현형이 없는 환자	aOR(95% CI)	P 값
천공 누공 협착	ERAP1 rs17482078 ERAP1 rs2927615 HLA-F-AS1-HLA-A rs4713242 ELMO1 rs10259514 DCAF12 rs10758242 TGFBR3 rs1805110 TGFBR3 rs284148	우성 우성 대립 대립 우성 우성 대립	CC CT/TT GG GA/AA A G G A GG AG/AA GG GA/AA T C	20(76.9) 6(23.1) 20(76.9) 6(23.1) 14(26.9) 38(73.1) 19(39.58) 29(60.42) 19(79.2) 5(20.8) 4(16.0) 21(84.0) 26(59.1) 18(40.9)	244(92.1) 21(7.9) 246(93.5) 17(6.5) 218(41.3) 310(58.7) 123(23.65) 397(76.35) 142(55.7) 113(44.3) 101(37.7) 167(62.3) 192(36.5) 334(63.5)	3.49(1.26-9.62) 4.34(1.54-12.24) 0.52(0.28-0.99) 2.12(1.15-3.90) 0.33(0.12-0.91) 3.17(1.06-9.51) 2.51(1.34-4.70)	0.016 0.05 0.047 0.017 0.033 0.039 0.004

장을 포함하지 않는 베체트병 환자의 SNP 유전자형에 따른 임상 증상

표현형	유전자 및 rs 번호		유전형 또는 대립	표현형이 있는 환자	표현형이 없는 환자	aOR(95% CI)	P 값
HLA-B51 양성 음부궤양 피부 장애 중추신경계 장애	PSORS1C1 rs12525170 PSORS1C1 rs4959053 IL10 rs1554286 AFF1 rs4536897 YIPF7 rs6838327 IL10 rs1554286 IL10 rs1957895 PSORS1C1 rs12525170 PSORS1C1 rs4959053	우성 우성 우성 대립 대립 공우성 우성 열성 열성	GG AG/AA GG AG/AA AA GA/GG G A A G AA GA GG TT GT/GG GG/AG AA GG/AG AA	11(13.6) 70(86.4) 11(11.9) 68(86.1) 37(44.6) 46(55.4) 40(9.8) 370(90.2) 177(42.6) 239(57.5) 120(54.8) 84(38.4) 15(6.9) 79(36.1) 140(63.9) 3(60.0) 2(40.0) 3(60.0) 2(40.0)	127(90.1) 14(9.9) 128(90.8) 13(9.2) 81(57.0) 61(43.0) 9(19.6) 37(80.4) 13(56.0) 37(74.0) 6(33.3) 9(50.0) 3(16.7) 13(72.2) 5(27.8) 221(96.5) 8(3.5) 218(96.5) 8(3.5)	56.39(24.22-131.32) 59.53(25.26-140.30) 1.75(1.00-3.05) 0.42(0.19-0.96) 2.11(1.08-4.11) 0.47(0.23-0.99) 4.82(1.63-14.23) 23.23(3.05-176.79) 22.91(3.02-174.09)	<0.0O1 <0.001 0.048 0.039 0.029 0.049 0.004 0.002 0.002

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taactcattt 660 aactcctctg taaaggcttc tctgatgtcc ccaagtgtac ttaatattag aaatctaaga 720 atatatcata catacataat catatttatt tttctatatg tttgtttttt aaaagtcaaa 780 aaaacattga ggcctactca gaactttgca ctgggattga caaaagtatc ctgtagatac 840 tactaactaa acttttaatt ctcttattac ttttttatta tgtggcatac aaaattttaa 900 gaaaattgac attgttagag aacaaggaaa ataactgttt cagagagcta gagtgatgtc 960 agcaagaggc taactagact tatttggctc tcatcccctg a 1001 <210> 2 <211> 1001 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 2 ataaacagaa aaattcaaaa aggtagagcg attagtacag atttagaata gaggtaaggg 60 acctacaaac tcagaaataa aaactctaat atatgaaaac atgtacagct ttaagaatat 120 ttatcctttt atgttgtata atgctttatt tatcattttt aaagtgttaa taaaatagtg 180 agtcatactg gaaaggttat tgtccacatg ttctttatct gaaaatagaa aagcattcaa 240 tattctttgg aaatatttta atctattttt ttctgttttt aaaaatatga gttccccaca 300 tctcctgaag gtcttctcaa tgctctcatg atgaacactc attgtagaac tcaatgtaag 360 gtttagaagt gtctatttat ggctctgagg ttcaaagagg ctagcaattg tatcttagtc 420 atcactgcgt aacaaacacc taaaatagaa tctgtacaaa gtattgaata aatatttgtc 480 ggaaaaagta taactggcta yctgagaaca ttcaattctg tggaattctt ttgctgatga 540 tattggataa aataaatttt aaggtttaaa aaatacaata aaatataaag aagcaaaagt 600 ctttaaattt ttattttttc agaaataaga gtcgtcagca tgcaagttca gacagtcaca 660 aaattgaaaa cagttactaa tgttgttgga tttgtaatgg gcttgacatc tccaggtaag 720 tagggttgaa aatttataat ctacacttta tatgaaacta tacaaggaaa tgctctgtaa 780 taatttaata ttatacttaa atatcctact tgagatataa ctagaaattt gtcccactct 840 tagagtagat aaatttgaaa ctaagaagtg ggtcttcctt ctctttccta ccgtatctct 900 tctaaaataa atcttagtcg ggggagagag agagagagag agagagagag agagagaggt 960 ggggatctct caggaggaga tgaaacaaga aacagagttt a 1001 <210> 3 <211> 1001 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 gctgggatta caagcatgag ccactgcgcc tggccaaaaa gtgtcagttt taaagataac 60 ttggattaat ttatttttta agtaattgaa gtaagaacag cacctgggcc aaaactaacc 120 tacttttctt aatctatgag tagcttttaa tagccatggt tttcccagtt ccactaccaa 180 aacaatcagg aagggctcaa ctttttcatg gctgtggcaa accttggcta tgattgtgca 240 tgtggggtca 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gttcttctca gaacaaaatg ataggttact 840 ctcagaataa attccatttt acatgctaga atggatagac tgcttgcaac cttcagaatg 900 accattgtag tctttcaatc gtctacacat tctacctcta ccaggcaccc tctgcgtgta 960 ttggtatctc ctctggcagg agtgcggaga atggattgtg c 1001 <210> 7 <211> 1001 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 7 tgagtggatt tatattttac ttttacgtgc gggtgggggg catggcatgt gtggacatac 60 ccatggtaag cagcagccag gttgcaaggg agaggttcat tttgaggcag ttgcagagtt 120 ccaagtaaca agataatgag gacctgaact aagacagtga tggtagggct gatgagaaag 180 gcataagaga taatagcaag taaagctgat aggacttagt atttgggtgg attcagggta 240 aaaaagaaac cggaaatcat ttccaggtgt ttagctagaa ggttgagtgg atggcagtgc 300 cattagctag gagagatcat gtgcctagga agaagtctag gcaaaagagg aagaagtttt 360 agaaaggttg tatgacaggt gcctgaggta tactccagtg gagatgctcc atggataggg 420 gcataggagt ctgaagctca gtaaagagga tgggctgaat taaatatttg gaagtcatca 480 ggacatagct attagttgag rccacgagac tgaatgagat cacccaatag gagtctctta 540 aatggaacag tgtgagtcaa ggacagaacc ctggggaacc agactccatt agaaatctgc 600 ctaaatttgg ctccagggtt atagaaacaa ttggtatgtt catcatttag agtaagtatc 660 cccaaagtgc cagtgtatta aaaatataat tccataaaag tatagaaaaa gatcacttac 720 tttagagtat gtgtgtgacg ctacatatat tcttcctact gaaagaatgc tggacatggt 780 tttcagaagc cctgcatgct agacccagcc ctggtcctgg ggatgtgggc aggttgctga 840 atgcccctag ccctttggcc catctgtaca gtggaggtgc cattgacaca gcttcccagc 900 agggtccttg taaaactcaa atcagatgga agtggaaatg cgaatgcttt ttggaacatg 960 ccgtgtcaat ataagaggtt atctttgcat atgtgctgtc a 1001

Claims (6)

1. NAALADL2(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 2) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열 제 1 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs3914501) 및 서열목록 제 2 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16848171), YIPF7(Yip1 domain family, member 7) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 3 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6838327), DCAF12(DDB1 and CUL4 associated factor 12 ) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 4 서열의 201 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs10441723), PLCB1(phospholipase C, beta 1) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 5 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6086653), SCHIP1(schwannomin interacting protein 1) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 6 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16830581) 및 PRKCH(protein kinase C, eta) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 7 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs12433533)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자의 단일염기다형성 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 장 베체트병의 진단또는 위험도 예측용 키트.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 NAALADL2(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 2) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제 2 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16848171) 또는 상기 YIPF7(Yip1 domain family, member 7) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 3 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6838327)의 단일염기다형성 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 장 베체트병과 구강 궤양 위험도를 동시 예측하는데 이용되는 특징으로 하는 키트.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 PRKCH(protein kinase C, eta) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 7 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs12433533)의 단일염기다형성 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 장 베체트병과 눈 베체트병의 위험도를 동시 예측하는데 이용되는 특징으로 하는 키트.
   
4. 장 베체트병의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 NAALADL2(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase-like 2) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열 제 1 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs3914501) 및 서열목록 제 2 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16848171), YIPF7(Yip1 domain family, member 7) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 3 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6838327), DCAF12(DDB1 and CUL4 associated factor 12 ) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 4 서열의 201 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs10441723), PLCB1(phospholipase C, beta 1) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 5 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs6086653), SCHIP1(schwannomin interacting protein 1) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 6 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs16830581) 및 PRKCH(protein kinase C, eta) 유전자의 단일염기다형성 부위로서 서열목록 제 7 서열의 501 번째 위치(GenBank SNP 데이터베이스 rs12433533)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자의 단일염기다형성 부위의 존재를 검출하는 단계를 통해 장 베체트병 마커를 검출하는 방법.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프, 골수액, 타액, 안구액, 복수액, 세포 조직액 또는 세포 배양액인 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 4 항에 있어서, 상기 단일염기다형성 부위의 존재의 검출은 유전자 증폭 반응, 마이크로어레이 또는 서열결정(sequencing)를 통해 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   

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