KR101912707B1 - Pam 유전자 다형성을 이용한 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 바이오마커에 기반하여 고혈압 관련 위험도를 평가하는 진단 방법에 관한 것으로, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 PAM(peptidylglycine-α-amidating monooxygenase)의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

Description

PAM 유전자 다형성을 이용한 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트{A METHOD AND KIT FOR ASSESSING RISK OF HYPERTENSION USING PAM GENETIC POLYMORPHISM}

본 발명은 신규 바이오마커에 기반하여 고혈압 관련 위험도를 평가하는 진단 방법 및 키트에 관한 것이다.

고혈압은 혈압이 만성적으로 높은 상태를 말하며, 구체적인 고혈압 상태는 수축기 혈압이 140 mmHg 이상이거나, 이완기 혈압이 90 mmHg 이상인 경우를 말한다.

고혈압 상태가 지속되면, 심장질환, 뇌졸중, 신부전증 등과 같은 합병증을 일으키고, 이러한 합병증은 건강 상태를 악화하여 조기 사망과 장애의 원인이 된다. 특히, 고혈압에 의해 유발되는 죽상동맥경화증은 세계적으로 높은 사망률을 가지는 질환으로 알려졌으며, 국내에서도 사망원인 2, 3위를 차지할 정도로 위험한 질환이다. 따라서 고혈압을 진단하는 것은 사망률이 높은 합병증을 예방하는데 중요하며, 고혈압의 예방은 사회적·공중 위생학적으로 중요한 일이다.

고혈압과 관련된 연구 중 잘 알려진 시스템으로 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템(Renin-Angiotensin- Aldosterone System; RAAS)이 있다. RAAS는 혈압과 세포 외액의 부피를 조절하는 내분비계 경로로, 신장으로 가는 혈액량이 적을 때 네프론의 수입세동맥에 있는 사구체 인접 세포에서 레닌을 혈액으로 분비하면서 시작된다.

단백질 분해 효소인 레닌은 간에서 생산된 안지오텐시노겐을 안지오텐신Ⅰ으로 전환하고, 안지오텐신Ⅰ은 안지오텐신 전환효소에 의해 안지오텐신Ⅱ로 전환된다. 안지오텐신Ⅱ는 혈관을 수축시키고 혈압을 증가시키며, 부신피질에서 알도스테론을 분비한다. 알도스테론은 신장에서 나트륨과 물의 재흡수를 증가시키고 혈중 나트륨과 물이 증가하면 체액 총량과 혈압이 증가하는데, 이러한 현상이 만성적으로 일어나면 고혈압으로 이어진다.

RAAS가 만성적으로 일어나지 않게 길항적으로 작용하는 호르몬으로 심방성 나트륨이뇨 펩타이드(ANP)가 있다. ANP는 증가된 체액으로 인해 심방의 평활근세포가 물리적 확장 정도가 커지면, 심방에서 분비되는 펩타이드 호르몬이다. ANP는 신장에서 나트륨 재흡수 억제, 레닌 분비 억제, 알도스테론 분비 억제와 같은 작용으로 혈중 나트륨 농도를 낮추고, 신장의 이뇨를 촉진하여 혈압을 낮추고 혈압의 항상성을 유지하는데 기여한다. 즉 ANP가 제대로 분비되지 않으면 RAAS가 길항적으로 작용하지 않아 고혈압이 발병될 수 있다.

최근 심방에서 ANP가 분비될 때 펩티딜글리신-알파-아미데이팅 모노옥시지네이즈(Peptidylglycine-α-amidating monooxygenase; PAM)와 관련이 있다는 보고가 있다(O'Donnell PJ, et al., J Mol Cell Cardiol., 35:915-922(2003), Thibault G, et al., Annu Rev Physiol, 61:193-217(1999), Sagnella GA., Cardiovasc Res, 51:416-428(2001)). 혈압의 항상성을 조절하는 ANP를 분비하는데 PAM이 밀접하게 관련되어 있기 때문에, PAM을 암호화하는 PAM 유전자형이 혈압 변화와 연관될 수 있다. 따라서 본 발명자들은 PAM이 고혈압의 새로운 후보 유전자인지 여부를 규명하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 PAM 유전자상의 특정 SNP를 검출하고 이를 통해 고혈압의 위험성 또는 예후를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 PAM(peptidylglycine-α-amidating monooxygenase)의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 PAM rs13175330 부위의 유전적 다형성이 검출된 경우 상기 대상체의 고혈압 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 PAM rs13175330 부위에서 G 대립 유전자의 존부를 판단할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 PAM rs13175330 부위의 유전적 다형성이 상기 대상체의 인슐린 저항성을 증가시킬 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 PAM rs13175330 부위의 유전적 다형성이 산화-LDL(ox-LDL)의 수준을 증가시키고, 저밀도 지질단백질-콜레스테롤(LDL-cholesterol)의 수준 및 LDL 입자 크기를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, PAM rs13175330 부위의 G 대립 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 고혈압 발병 위험도 진단용 키트가 제공된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 특정 유전자의 다형성(polymorphism)에 기반하여 고혈압의 발병 가능성을 효과적으로 예측할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정한 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하에서는 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 PAM(peptidylglycine-α-amidating monooxygenase)의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

상기 대상체(subject)는 진단 대상으로서 인간일 수 있고, 상기 생물학적 시료는 고혈압 관련 질환의 위험성을 평가하고자 하는 상기 대상체에서 분리된 시료로써, 조직, 세포, 혈액, 혈장, 복막액, 활막액, 타액, 소변, 대변 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 상기 생물학적 시료는 혈액일 수 있으며, 구체적으로 혈액에서 분리된 혈장일 수 있다.

상기 PAM(peptidylglycine-α-amidating monooxygenase) 유전자는 펩티딜글리신-알파-아미데이팅 모노옥시지네이즈(peptidylglycine-α-amidating monooxygenase; PAM)를 암호화 하는 유전자이다. 상기 PAM은 생체 내에서 비활성 단백질이 활성을 가지기 위해 카르복실기 말단을 알파-아미드화 시키는 효소이다.

상기 효소는 혈압 유지에 관여하는 호르몬인 심방성 나트륨이뇨펩타이드(atrial natriuretic peptide; ANP) 분비에 중요한 역할을 한다. 상기 효소는 ANP을 보관하기 위해 심방 분비 과립에서 중요한 기능을 하고, ANP의 생리 활성형인 pro-ANP의 존재시 ANP의 단백질을 가공하는 기능을 한다. 따라서 혈압 유지에 관여하는 ANP의 분비와 상기 효소인 PAM이 연관되어 있기 때문에, 사람의 특정 PAM 유전자의 SNP 유전자형은 ANP 분비 장애와 관련되어 고혈압의 발병과 연관될 수 있다.

상기 “단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다.

예컨대, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)과 같이 단일염기에서 차이가 있을 때, 이를 두 개의 대립 유전자(A 또는 G)라고 부르며 대다수의 SNP는 두 개의 대립 유전자를 포함한다.

상기 SNP는 한 집단(population)내에서 소수 대립형질 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립형질 빈도)로 할당될 수 있다. 인간 집단 내에서 일부 변이성(variations)이 존재하며, 지질학적 또는 민족적 군에서 공통적인 하나의 SNP 대립 유전자는 매우 희귀하다. 상기 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있으므로, 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.

상기 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열의 변화를 수반하는 것은 아니다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고, 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 상기 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 상기 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시킬 수 있고 상기 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성할 수 있다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

인간의 DNA 서열 상의 변이는 질병의 발병 또는 병원체, 화학물질, 약물, 백신 및 다른 시약에 대한 인체의 반응에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 상기 SNP는 맞춤형 의약의 중요한 도구(key enabler)로 활용될 수 있다. 특히, 상기 SNP는 질병군 또는 비질병군 간의 게놈 부위를 비교하는 방식으로 질병을 진단하는 생의학적 연구에서 고려될 수 있다. 상기 SNP는 인간 게놈의 가장 많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다(Sachidanandam et al., 2001). 상기 SNP는 매우 안정된 유전적 마커이고, 표현형에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 자동화된 유전자형 규명 시스템에 매우 적합하다(Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000).

한편, 상기 (b) 단계에서 상기 PAM rs13175330 부위의 유전적 다형성이 검출된 경우 상기 대상체의 고혈압 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

상기 PAM rs13175330 부위는 AA, AG, 및 GG 형태가 존재한다. 정상인 대조군과 고혈압 환자의 PAM rs13175330 부위의 유전자형을 분석한 결과 고혈압 환자인 경우 PAM rs13175330 부위에서 G 대립형질이 대조군에 비해 상대적으로 많이 확인되었다.

따라서, 상기 (b) 단계에서 상기 PAM rs13175330 부위에서 G 대립 유전자의 존부를 판단할 수 있고, PAM rs13175330 부위가 G 대립형질로 판단될 때 고혈압 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

상기 PAM rs13175330 부위의 유전적 다형성은 상기 대상체의 인슐린 저항성을 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 PAM rs13175330 부위의 유전적 다형성이 산화-LDL(ox-LDL)의 수준을 증가시키고, 저밀도 지질단백질-콜레스테롤(LDL-cholesterol)의 수준 및 LDL 입자 크기를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, PAM rs13175330 부위의 G 대립 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 고혈압 발병 위험도 진단용 키트가 제공된다.

상기 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.

상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 바람직하게는 단쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(Deoxyribonucleotide)일 수 있다. 상기 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조 릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지할 수 있다.

상기 연장 프라이머는 타겟 핵산의 특정 위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길수 있다. 상기 프라이머의 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정될 수 있고 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 상대적으로 낮은 온도가 요구될 수 있다. 상기 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성할 수 있다.

상기 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 상기 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다(Scheit, NucleotideAnalogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).

상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예컨대, 형광 핵산 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.AcidsRes., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR이 사용될 수 있다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여 이동성이 다른 밴드가 형성될 수 있으며, 상기 SSCA는 상기 밴드를 검출할 수 있다. 상기 DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 상이한 이동성을 나타내는 서열을 검출할 수 있다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용할 수 있다.

상기 RNase 보호 분석에서, 상기 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용될 수 있다. 상기 분석에서 상기 리보프로브와 인간으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단할 수 있다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우 상대적으로 작은 밴드가 관찰될 수 있다.

상기 혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용될 수 있다. 상기 분석에서 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 고혈압 가능성을 판단할 수 있다.

상기 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미할 수 있다. 상기 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥일 수 있고, 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드일 수 있다.

상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 상기 프로브로서 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

상기 프로브는 상기 SNP를 포함하는 10 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열 일치에 의해 결정될 수 있으므로, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 상기 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., MolecularCloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic AcidHybridization, A PracticalApproach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 상기 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 상기 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 상이하게 결정될 수 있다.

상기 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 질병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)를 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 유전적 다형성(polymorphism)은 마이크로어레이 또는 유전자 증폭에 의해 식별될 수 있다.

상기 “증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미할 수 있다. 다양한 증폭 반응이 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 상기 증폭 반응은 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, MolecularCloning. A LaboratoryManual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 수행될 수도 있다. 상기 마이크로어레이는 고상표면에 고정화된 프로브를 이용할 수 있다. 상기 프로브는 상기 SNP를 포함하는 각 유전자상의 10 내지 100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.

상기 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용될 수 있고 기체(substrate) 상에 고정화될 수 있다. 상기 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화될 수 있다.

상기 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수도 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

상기 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화될 수 있다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있고, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수도 있다.

상기 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다.

상기 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methodsin Enzymology, 65:499(1986))에 의해 라벨링될 수 있다. 상기 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공할 수 있다.

상기 분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

상기 프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킬 수 있다. 상기 적절한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 상기 절차는 연구실에서의 사용을 위한 프로토콜을 수립하고자 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시될 수 있다. 예컨대, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 상기 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., MolecularCloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)을 참조할 수 있다.

예컨대, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있다. 또는 상기 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있고, 저 엄격조건은 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있다.

상기 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출할 수 있다. 예컨대, 상기 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 상기 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다.

상기 효소 및 기질은 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코오스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)가 사용될 수 있다.

상기 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수도 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.

실험방법

실험대상

국민 건강 보험 일산 병원(National Health Insurance Corporation Ilsan Hospital)에서 2010년 1월 내지 2015년 3월의 기간 동안 정기적으로 검진을 받고 있는 검진자 중에서 혈액 및 소변 샘플의 제공을 동의한 지원자를 대상으로 하였다.

건강 검진 센터(HSC)에 의해 정상 혈압(수축기 혈압 140 mmHg미만 그래고 이완기 혈압 90 mmHg 미만) 및 고혈압(수축기 혈압 140 mmHg이상 또는 이완기 혈압 90 mmHg 이상)이 있는 2,153명의 대상자를 선발하였다. 선발된 대상자는 가정의학과 또는 내과에 의뢰하여 재검토 하였다.

i) 현재 심혈관 질환, 간 질환, 신장 질환, 췌장염 또는 암 진단을 받았거나 기록이 있는 대상자, ii) 임신 또는 수유 중인 자, iii) 고혈압 약물 복용자는 실험 대상에서 제외하였다.

실험에 착수하기 전에 모든 참가자들에게 실험의 목적을 상세히 설명한 후 동의서를 받았다. 수행된 실험의 프로토콜은 일산병원 및 연세대학교의 승인을 받았으며 헬싱키 선언(Helsinki Declaration)에 따라 수행되었다.

인체측정

의류와 신발을 착용하지 않은 채로 아침에 실험 대상자들의 체중(kg)과 신장(m²)을 측정하고 체질량 지수(BMI, kg/m²)를 계산하였다.

허리둘레는 대상자가 평균적으로 숨을 내쉰 상태에서 배꼽 선의 피부 위로 측정하였다. 엉덩이둘레는 대상자의 튀어나온 엉덩이 부분으로 측정하였다. 허리둘레를 엉덩이둘레에 나눔으로써 허리-엉덩이 비율(waist to hip ratio; WHR) 값을 계산하였다.

수축기 혈압과 이완기 혈압은 랜덤 제로 혈압계(HM-1101, Hico Medical Co., Ltd., Chiba, Japan)를 사용하여 대상자가 착석 위치에서 적어도 20분의 휴식 기간 후에 적절한 크기의 커프가 있는 것으로 측정되었다. 혈압은 대상자의 양 팔에서 세 번 측정되었다. 세 번에 걸쳐 측정된 혈압들 간의 차이는 2 mmHg 미만 이었고, 수축기 혈압과 이완기 혈압의 평균값으로 사용하였다. 대상자들은 혈압을 측정하기 전에 최소 30분 동안은 술과 담배를 하지 않을 것을 지시 받았다.

샘플 수집

혈액 샘플은 대상자가 12시간 이상 하루 밤 동안 단식한 후 EDTA가 처리된 튜브와 혈청 튜브(BD Vacutainer; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)에 수집되었다. 수집한 혈액 샘플들은 약 30분 이내에 빛이 차단된 아이스 박스에 넣은 후 채집한지 3시간 이내에 상기 혈액 샘플들을 4℃에서 20분간 1,200 rpm으로 원심 분리하여 상기 혈액 샘플들로부터 혈장 및 혈청을 얻었다. 수집된 혈장 및 혈청은 분석 때까지 -80°C에서 보관하였다.

공복 혈중 지질 프로파일

공복 혈중 트리글리세라이드(TG)와 총 콜레스테롤(TC)의 수준은 TG 및 CHOL 키트(Roche, Mannheim, Germany)로 각각 효소 분석법을 통해 측정하였다. 공복 혈중 고밀도 지질단백질-콜레스테롤(HDL-cholesterol)은 HDL-C Plus Kit(Roche, Mannheim, Germany)로 선택적 저해 방법을 통해 측정되었다. 측정 결과에 따른 반응 색상은 Hitachi 7600 Autoanalyzer(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 통하여 모니터링 하였다.

저밀도 지질단백질-콜레스테롤(LDL-cholesterol)은 하기 Friedewald공식을 통해 계산하였다: LDL 콜레스테롤 = 총 콜레스테롤 - [HDL 콜레스테롤 + (트리글리세라이드 / 5)].

공복 혈당, 공복 인슐린 및 인슐린 저항성

공복 혈당은 GLU 키트(Roche, Mannheim, Germany)로 헥소키나아제 방법을 통해 측정되고, 측정 결과에 따른 반응 색상은 Hitachi 7600 Autoanalyzer(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 통하여 모니터링 하였다.

공복 인슐린은 IRMA 키트(DIAsource, Louvain, Belgium)로 측정되고, 측정 결과에 따른 반응 색상은 SR-300 system(Stratec, Birkenfeld, Germany)을 통하여 모니터링 하였다.

인슐린 저항성(IR: Insulin resistance)은 하기 방정식을 이용하여 항상성 모델 평가(HOMA: homeostasis-model assessment)에 의하여 계산하였다: HOMA-IR = [공복 인슐린(μIU/mL) × 공복 혈당(mmol/L)] / 22.5.

혈장 LDL 입자 크기 및 산화-LDL(ox-LDL) 수준

혈장 LDL 입자는 순차 부양 초원심분리기로 분리하고, 입자 크기 분포(1.019-1.063 g/mL)를 직쇄상 2 내지 16% 아크릴아마이드 구배(CBS Scientific Company)를 함유하는 상업적으로 이용 가능한 비-변성 겔(non-denaturing gels) 상에서 공극-구배 리포프로틴 시스템(CBS Scientific Company)을 이용하여 측정하였다. 티로글로불린(thyroglobulin)(17 nm), 페리틴(ferritin)(12.2 nm), 및 카탈라아제(catalase)(10.4 nm) 표준과 컨쥬게이션된 라텍스-비드(30 nm)를 상대적인 밴드 이동률(migrationrates)을 측정하는데 이용하였다. 겔은 GS-800 Calibrated Imaging Densitometer(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 스캔하였다.

ox-LDL는 효소 면역 분석법(Mercodia AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 측정하고, 측정 결과에 따른 반응 색상은 Wallac Victor² 다중표지 계수기(Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA)의 450 nm에서 측정하였다.

SNP 선별

총 2,167개의 샘플을 Axiom®2.0 Reagent Kit(Affymetrix Axiom®2.0 Assay User Guide) 제조업체의 방법에 따라 유전자형을 결정하였다. 약 200 ng의 gDNA가 증폭되었고 25~125 bp의 단편으로 무작위로 절편화 하였다.

gDNA 초기 증폭은 10 ng/μL 농도의 gDNA 20 μL 와 변성 마스터 믹스 20 μL 를 포함하는 총 40 μL 반응 부피에서 실시하였다. 초기 증폭 반응은 초기 증폭을 위한 상온에서 10분 배양을 포함하고, 배양 생성물은 Axiom 2.0 Neutral Soln 130 μL, Axiom 2.0 Amp Soln 225 μL 및 Axiom 2.0 Amp Enzyme 5 μL로 증폭되었다. 증폭 반응은 23±1 시간 동안 37℃에서 수행 하였다. 200 내지 1,100 bp 길이의 절편을 증폭하기 위해 최적화된 반응으로 증폭 산물을 분석하였다. 절편화 단계는 증폭 산물을 약 25-50 bp 길이의 단편으로 감소시키고, 바이오티닐화 뉴클레오타이드를 사용하여 말단 표지 하였다.

혼성화 후, 비특이적 배경을 제거하고, 랜덤 결찰에 의한 배경 잡음을 최소화하기 위해 엄격한 조건 하에서 타겟 밴드를 세척하였다. 다형성 뉴클레오타이드는 어레이 표면상에서 수행된 다색 라이게이션을 통해 조사되었다. 어레이는 GeneTitan MC Instrument(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 염색하고 이미지화 하였다. 이미지는 Genotyping Console ™ 소프트웨어(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 분석되었다.

유전자형 데이터는 K-CHIP을 통해 얻었다. K-CHIP은 국립보건연구원 유전체과학센터에서 설계되었다.

통계적 분석

HWE 및 SNP와 혈압 간의 연관성을 PLINK 버전 1.07(http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)으로 분석하였다. 연관성은 선형 회귀 분석 방법으로 평가하였다. 통계적 분석은 SPSS v. 23.0(IBM, Chicago, IL, USA)을 이용하여 수행되었다. PAM rs13175330 다형성에 대한 통계적 검증력을 뒷받침 하고자 이형접합체 G 대립형질(AG)과 동형접합체 G 대립형질(GG)을 합쳤다.

왜곡된 변수들은 통계적 분석을 위하여 대수적으로(logarithmically) 변형하였다. 결과값은 평균±표준오차(SE)로 표현하였으며, 양측 P-검정값(two-tailed P-value)<0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 대응표본 독립 t-검정을 이용하여 실험군 및 대조군 간의 파라미터를 비교하였다. 빈도는 카이 제곱(χ²) 테스트로 평가하였다. 고혈압과 PAM rs13175330 유전자형의 연관성은 교란 요인에 대한 보정과 함께 로지스틱 회귀모델(Logistic Regression Model)의 95% 신뢰구간 오즈비(ORs)를 통해 산출하였다.

실험결과

실험예 1 : 고혈압 여부에 따른 임상 및 생화학적 특성

실험을 위하여 참가자를 정상 혈압인 대조군(n=1,610)과 고혈압인 HTN 군 (n=543)으로 나누었다. 그리고 HTN 군은 다시 항고혈압 치료를 실시하지 않은 HTN 군(HTN w/o 군, n=377)과 항고혈압 치료를 실시한 HTN 군(HTN w/ 군, n=166)으로 나누었다. 각 군의 임상적 및 생화학적 특성은 하기 표 1과 같다.

모든 HTN 군은 확연하게 나이가 많고, 체중이 많이 나갔으며, 수축기 및 이완기 혈압, 트리글리세라이드, 글루코오스, 인슐린, 및 HOMA-IR이 대조군보다 높게 관찰되었다(표 1). 반면, HTN 군의 HDL-콜레스테롤의 수치는 대조군보다 낮게 관찰되었다. ox-LDL 수준은 확연하게 HTN w/o 군에서 높았으나, HTN w/ 군에서는 대조군과 비슷하였다.

구분	대조군 (n=1,610)	HTN 군(n=543)
		총 HTN 군 (n=543)	HTN w/o 군 (n=377)	HTN w/ 군 (n=166)
연령(년)	48.0±0.27	54.4±0.50 ‡	53.0±0.61 ‡	57.70.83 ‡
체중(kg)	63.0±0.25	68.1±0.51 ‡	68.9±0.64 ‡	66.3±0.81 ‡
BMI(kg/m2)	23.7±0.07	25.4±0.14 ‡	25.4±0.17 ‡	25.2±0.22 ‡
키(cm)	83.5±0.19	87.9±0.37 ‡	87.9±0.46 ‡	88.0±0.63 ‡
허리 엉덩이 비율	0.88±0.00	0.90±0.00 ‡	0.90±0.00 ‡	0.91±0.00 ‡
수축기혈압(mmHg)	116.4±0.29	138.5±0.66 ‡	145.2±0.62 ‡	123.2±0.79 ‡
이완기혈압(mmHg)	72.7±0.22	87.4±0.46 ‡	91.8±0.42 ‡	77.4±0.66 ‡
트리글리세라이드(mg/dL)∮	119.6±1.84	148.6±3.76 ‡	151.2±4.79	142.8±5.72 ‡
총 콜레스테롤(mg/dL)∮	198.1±0.90	198.3±1.54	200.2±1.87	193.9±2.68
HDL-콜레스테롤(mg/dL)∮	53.9±0.34	50.4±0.55 ‡	50.3±0.65 ‡	50.5±1.03 †
LDL-콜레스테롤(mg/dL)∮	121.1±0.82	119.1±1.42	120.7±1.77	115.4±2.31
글루코오스(mg/dL)∮	95.6±0.51	103.9±1.11 ‡	103.9±1.40 ‡	103.9±1.73 ‡
인슐린(μIU/dL))∮	9.09±0.12	9.84±0.25 *	10.1±0.33 *	9.730.35 *
HOMA-IR∮	2.15±0.03	2.55±0.09 ‡	2.65±0.12 ‡	2.44±0.09 ‡
LDL 입자 크기(nm)∮	23.9±0.03	24.0±0.05	23.9±0.06	24.0±0.08
ox-LDL(U/L)∮	46.1±0.53	48.3±0.97 *	50.8±1.15 ‡	43.7±1.75

각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ^∮은 로그 변환으로 검사한 값이다. 독립적 t-test로 P-value에 따라 대조군과 비교했을때 *P<0.05, ^† P<0.01, ^‡ P<0.001로 계산되었다. HTN은 고혈압 군이고, HTN w/o 군은 HTN 군에서 항고혈압 치료를 하지 않은 HTN 군이고, HTN w/ 군은 HTN 군에서 항고혈압 치료를 한 HTN 군이다.

실험예 2 : 대조군 및 HTN군의 PAM rs13175330 A>G 유전적 다형성

PAM rs13175330 A>G 유전자형 분포는 하디-바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)에서 현저히 벗어나지 않았다.

1,610명의 대조군 중 PAM rs13175330 A>G 유전형 분포는 다음과 같다: 1,377명의 참가자가 AA 유전자형(85.5%), 228명의 참가자가 AG 유전자형(14.2%), 5명의 참가자가 GG 유전자형(0.3%). 대조군에서 G 대립형질의 빈도는 0.074로 확인되었다.

543명의 HTN 군 중 PAM rs13175330 A>G 유전형 분포는 다음과 같다: 434명의 참가자가 AA 유전자형(79.9%), 102명의 참가자가 AG 유전자형(18.8%), 7명의 참가자가 GG 유전자형(1.29%). HTN 군에서 G 대립형질의 빈도는 0.107로 확인되었다.

실험예 3 : PAM rs13175330 A>G 유전자형 및 고혈압 위험성의 연관성

표 2는 HTN 군에서 PAM rs13175330 유전자형에 따른 미보정 및 보정된 OR을 나타낸 것이다.

PAM rs13175330 A>G SNP의 GG 유전자형의 존재가 고혈압의 높은 위험성과 연관되었다[OR : 4.192 (95% CI : 1.325-13.263), P=0.015](표 2). 상기 연관성은 나이, 성별, 체질량 지수, 흡연 및 음주 보정 후에도 유지되었다[OR : 7.826 (95% CI : 2.228-27.484), P=0.001].

또한, rs13175330 G 대립형질은 보정 전[OR : 1.484 (95% CI : 1.154-1.909), P=0.002]과 보정 후[OR : 1.607 (95% CI : 1.220-2.116), P=0.001]에 고혈압의 높은 위험성과 연관되었다(표 2).

PAM rs13175330	HTN 군(n=543)	P -값
	OR(95% CI)
모델1
A” 대비 G	1.498(1.186, 1.892)	0.001
AA+AG” 대비 GG	4.192(1.325, 13.263)	0.015
AA” 대비 AG+GG	1.484(1.154, 1.909)	0.002
모델2
A” 대비 G	1.498(1.186, 1.892)	<0.001
AA+AG” 대비 GG	4.192(1.325, 13.263)	0.001
AA” 대비 AG+GG	1.484(1.154, 1.909)	0.001

“ 비교군. CI; 신뢰구간(Confidence interval). 모델 1: 미보정값; 모델 2: 나이, 성별, 체질량 지수, 흡연 및 음주 보정값.

실험예 4 : PAM rs13175330 A>G 유전자형 및 혈압의 연관성

대조군에서 PAM rs13175330 G 대립형질은 AA 유전자형과 비교하여 수축기 혈압(P=0.056)이 더 높았다(표 3). HTN w/o 군에서 rs13175330 G 대립형질은 AA 유전자형과 비교하여 수축기 혈압(P=0.036)과 이완기 혈압(P=0.048)이 더 높았다. 또한, HTN w/ 군에서 rs13175330 G 대립형질은 AA 유전자형과 비교하여 이완기 혈압(P<0.001)이 더 높았다.

PAM rs13175330	대조군(n=1,610)		HTN 군(n=543)
			HTN w/o 군(n=377)		HTN w/ 군(n=166)
	AA (n=1377)	G 대립형질 (n=233)	AA (n=1377)	G 대립형질 (n=233)	AA (n=1377)	G 대립형질 (n=233)
수축기혈압 (mmHg)	116.2±0.31	117.7±0.74 ¶	144.6±0.68	147.9±1.46 *	123.2±0.90	123.4±1.70
이완기혈압 (mmHg)	72.6±0.23	73.3±0.58	91.4±0.45	93.8±1.11 *	75.7±0.63	83.3±1.67 ‡
트리글리세라이드 (mg/dL)∮	119.4±2.02	121.1±4.29	148.2±5.10	163.9±12.7	141.3±6.79	148.4±9.93
총 콜레스테롤 (mg/dL)∮	198.0±0.96	198.6±2.53	201.7±2.06	194.1±4.43	193.8±3.01	194.5±5.97
HDL-콜레스테롤 (mg/dL)∮	54.0±0.37	53.5±0.84	50.3±0.73	50.4±1.45	50.7±1.20	49.7±1.98
LDL-콜레스테롤 (mg/dL)∮	121.1±0.88	121.1±2.20	122.7±1.99	112.0±3.71 *	115.5±2.66	115.1±4.63
글루코오스 (mg/dL)∮	95.5±0.55	96.5±1.47	103.7±1.49	104.8±3.76	105.7±2.08	97.5±2.56 *
인슐린 (μIU/dL))∮	9.07±0.13	9.26±0.28	9.60±0.33	12.1±0.99 †	9.56±0.38	10.4±0.79
HOMA-IR∮	2.14±0.04	2.21±0.08	2.50±0.11	3.29±0.41 †	2.45±0.11	2.40±0.17
LDL 입자 크기 (nm)∮	23.9±0.04	24.0±0.06	24.0±0.07	23.5±0.12 †	24.0±0.09	23.9±0.17
ox-LDL (U/L)∮	45.9±0.56	47.4±1.53	49.8±1.27	55.0±2.70 *	43.7±2.09	43.7±2.85

각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ^∮은 로그 변환으로 검사한 값이다. 독립적 t-test로 P-value에 따라 대조군과 비교했을 때 *P<0.05, ^† P<0.01, ^‡ P<0.001 및 ^¶ P<0.1로 계산되었다. HTN은 고혈압 군이고, HTN w/o 군은 HTN 군에서 항고혈압 치료를 하지 않은 HTN 군이고, HTN w/ 군은 HTN 군에서 항고혈압 치료를 한 HTN 군이다.

실험예 5 : PAM rs13175330 A>G 유전자형에 따른 지질 프로파일, 인슐린 수준, HOMA - IR 지수, LDL 입자 크기 및 ox-LDL 수준

HTN w/o 군에서 rs13175330 G 대립형질은 AA 유전자형과 비교하여 인슐린 수준(P=0.001), HOMA-IR 지수(P=0.002), 및 ox-LDL 수준(P=0.046)이 더 높았고, LDL-콜레스테롤의 수준(P=0.039)은 더 낮았으며, LDL 입자 크기(P=0.003)는 더 작았다.

PAM rs13175330 A>G의 G 대립형질 빈도는 대조군보다 HTN 군에서 더 높았다.

대조군에서 PAM rs13175330 G 대립형질은 AA 유전자형과 비교하여 수축기 혈압이 더 높았다 HTN w/o 군에서 PAM rs13175330 G 대립형질은 AA 유전자형과 비교하여 수축기 혈압과 이완기 혈압이 더 높았다. HTN w/ 군에서 PAM rs13175330 G 대립형질은 AA 유전자형과 비교하여 이완기 혈압이 높았다.

또한, HTN w/o 군에서 PAM rs13175330 G 대립형질은 AA 유전자형과 비교하여 인슐린 수준과 HOMA-IR 수치가 높았다. HTN w/o 군에서 PAM rs13175330 G 대립형질은 AA 유전자형과 비교하여 LDL 입자 크기가 더 작았고, ox-LDL 수준이 더 높았지만, LDL 콜레스테롤 수준은 낮았다.

상기 결과는 PAM rs13175330 A>G 유전자형과 고혈압 사이의 연관성이 있음을 시사한다. 또한, rs13175330 G 대립형질은 LDL-콜레스테롤의 죽종형성성(atherogenicity)과 관련이 있음을 시사한다.

HTN w/o 군에서 수축기 및 이완기 혈압, 인슐린 수준, HOMA-IR 지수, LDL 입자 크기 및 ox-LDL 수준에 대한 PAM rs13175330 A>G SNP의 유전자형이 영향을 준다는 것을 시사한다. 작은 LDL 입자 크기, 높은 ox-LDL 수준은 고혈압과 관련된 잘 알려진 죽종형성적 특성이며, 상기 데이터는 PAM 유전자 다형성이 포도당 내성 및 LDL 콜레스테롤의 죽종형성성 변화를 포함한 복잡한 기전을 통해 고혈압 발병에 관여했음을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

1. (a) 대상체(subject)에서 분리된 생물학적 시료를 제공하는 단계; 및
   (b) 상기 생물학적 시료에서 PAM(peptidylglycine-α-amidating monooxygenase) rs13175330의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계에서 상기 PAM rs13175330 부위의 유전자형이 GG인 경우 검출된 경우 상기 대상체의 고혈압 위험도가 높은 것으로 판단하는 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
3. 삭제
4. 제2항에 있어서,
   상기 PAM rs13175330 부위의 GG 유전자형이 상기 대상체의 인슐린 저항성을 증가시키는 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
5. 제2항에 있어서,
   상기 PAM rs13175330 부위의 GG 유전자형이 산화-LDL(ox-LDL)의 수준을 증가시키고, 저밀도 지질단백질-콜레스테롤(LDL-cholesterol)의 수준 및 LDL 입자 크기를 감소시키는 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
6. PAM rs13175330 부위의 G 대립 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 고혈압 발병 위험도 진단용 키트.