KR101902512B1

KR101902512B1 - Esrrg 유전자 다형성을 이용한 당뇨병의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트

Info

Publication number: KR101902512B1
Application number: KR1020170052587A
Authority: KR
Inventors: 이종호; 채지숙; 김민주
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-24
Filing date: 2017-04-24
Publication date: 2018-10-01

Abstract

본 발명은 특정 바이오마커에 기반하여 당뇨병 관련 위험도를 평가하는 방법에 관한 것으로, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 ESRRG(Estrogen-related receptor γ gene)의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 당뇨병의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

Description

ESRRG 유전자 다형성을 이용한 당뇨병의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트{METHOD AND KIT FOR ASSESSING RISK OF DIABETES USING ESRRG GENETIC POLYMORPHISM}

본 발명은 특정 바이오마커에 기반하여 당뇨병 관련 위험도를 평가하는 방법 및 키트에 관한 것이다.

식생활이 풍요로워지고 의료기술이 발전함에 따라, 평균수명이 길어지는 고령화 시대에 접어들면서 건강에 대한 관심이 점차 증대되고 있다. 경제성장과 더불어 나타난 고지방식이 등의 식습관의 변화로 생체의 균형이 무너지고, 남녀노소에 관계없이 비만 및 당뇨 합병증 환자가 크게 증가하고 있다.

당뇨병은 높은 혈당 수치가 오랜 기간 동안 지속되는 대사 질환의 일종이다. 당뇨병은 크게 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병으로 분류되며, 소아 당뇨병이라 불리는 제1형 당뇨병과 달리, 제2형 당뇨병은 운동부족, 비만 또는 스트레스 등에 의한 후천적 요인으로 인슐린의 분비 조절은 원활하나 인슐린이 제 기능을 하지 못하여 혈당 조절이 실패하는 경우에 발생한다(Stumvoll M, et al., Lancet 365:1333-46(2005)).

2008년 질병관리본부의 통계에 따르면 30세 이상 국민에서 당뇨병의 유병률은 9.1%에 달하며 40세가 넘으면 유병률이 급격히 증가하여 50대에는 20%에 달하였다. 급격한 유병률의 증가는 영양상태의 개선과 운동의 부족 등 환경적 요인의 변화가 가장 주된 원인인 것으로 추정된다. 우리나라의 경우 인슐린 비 의존형의 제2형 당뇨환자가 전체 당뇨환자의 90-95%를 차지하고 있으며 선진국뿐만 아니라 개발도상국의 사람들도 점차 신체활동은 줄고 비만은 늘면서, 제2형 당뇨병의 발생이 급격히 증가하고 있다.

최근 10년간 한국인의 식단에서 지방이 차지하는 비율이 1969년 7.2%에서 2007년 18.5%까지 증가(South Korea Ministry of Health and Social Affairs. The Third Korea National Health & Nutrition 4 Examination Survey(2008))하였으며 당뇨병으로 인한 사망률은 빠르게 증가하여 1988년 7.4%에서 2007년 22.9%(South Korea National Statistical Office. Annual Report on the Cause of Death Statistics (2007))에 이르렀다.

일반적으로 당뇨병을 확정하기 위해서는 요당 측정과 공복혈당측정 등을 실시한다. 요당 측정은 소변으로 배출되는 당을 측정하는 시험으로 요당 측정의 경우, 당뇨병이 경증일 때는 식후에만 요당이 나타나고, 신장의 기능에 이상이 있는 경우 당뇨병이 아니더라도 요당이 나타나므로 당뇨병의 확정 진단이 어려운 문제가 있다. 공복혈당측정은 8~12 시간 금식 상태에서 정맥혈의 혈장 포도당의 농도를 측정하는 시험이다. 그러나, 당뇨병이 경증인 경우 공복혈당이 정상 범위로 측정될 수도 있으므로, 당뇨병으로 확진하기 위해서 공복혈당 측정 이후에 당부하 검사가 추가로 요구될 수 있다.

따라서 기존의 당뇨병 진단방법의 단점을 보완하면서 당뇨병을 조기에 정확하게 진단할 수 있는 기술이 요구되며, 이에 따라 당뇨병 진단을 위한 신규 바이오마커에 대한 개발이 이루어지고 있다.

바이오마커는 일반적으로 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미한다. 최근 연구에 따르면 생체 내에서 산화 스트레스 상태의 바이오마커인 이소프로스탄(isoprostane)이 신뢰를 받고 있다. 이소프로스탄은 지질 과산화의 비효소적 과정을 통해 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생산되고, 이런 과정은 세포막과 저밀도 지질단백질(LDL)의 산소 자유라디칼에 의해 촉매 된다.

8-epi-prostaglandin F_2α(8-epi-PGF_2α)는 혈관 수축을 유도하는 주요 인자로 가장 잘 연구되고 있는 F₂-이소프로스탄이다. 최근 8-epi-PGF_2α가 제2형 당뇨병 환자에서 혈당 조절과 산화 상태의 예측 가능한 바이오마커로 보고된 바 있다. 또한 8-epi-PGF_2α의 수준은 대사 증후군과 무관하게 정상 또는 당뇨병 전기의 혈당수치를 보이는 사람의 인슐린 내성과 관련이 있다고 보고된 바 있다.

한편, 에스트로겐 관련 수용체 γ(Estrogen-related receptor γ, ESRRG)는 고아 핵 수용체의 구성 중 하나이며 항상성 및 대사 과정 조절에 다양한 역할을 한다. 특정 ESRRG의 단일염기다형성(SNP) 유전자형이 혈압의 변화와 관련이 있다고 보고되었다. 최근 연구에서 ESRRG가 간의 포도당신생과정의 조절 인자라는 증거가 밝혀진 바 있다. 그리고 전장유전체연관분석연구(Genome-Wide Association Study, GWAS)에서 ESRRG가 제2형 당뇨병의 새로운 후보 유전자로 보고된 바 있다.

그러나 아직 ESRRG의 SNP에 대한 연구가 미미한 상태이고 아직 8-epi-PGF_2α와 ESRRG의 상관 관계는 밝혀진 바 없다.

따라서 본 발명자들은 ESRRG 및 제2형 당뇨병의 바이오마커인 8-epi-PGF_2α 간의 연관성을 확인함으로써 상기 유전자 및 당뇨병 발병 간의 상관 관계를 규명하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 ESRRG 유전자상의 특정 SNP를 검출하고 이를 통해 당뇨병의 위험성 또는 예후를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 ESRRG(Estrogen-related receptor γ gene)의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 당뇨병의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 ESRRG rs1890552 부위의 유전적 다형성이 검출된 경우 상기 대상체의 당뇨병 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 ESRRG rs1890552 부위에서 G 대립 유전자의 존부를 판단할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 ESRRG rs1890552 부위의 유전적 다형성이 8-epi-PGF_2α(8-epi-prostaglandin F_2α)의 수준을 증가시킬 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 생물학적 시료는 혈액 또는 소변일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, ESRRG rs1890552 부위의 G 대립 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 당뇨병 발병 위험도 진단용 키트가 제공된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 특정 유전자의 다형성(polymorphism)에 기반하여 당뇨병의 발병 가능성을 효과적으로 예측할 수 있다.

특히, 상기 방법은 ESRRG 및 제2당뇨병의 유력한 바이오마커인 8-epi-PGF_2α 간 연관성을 제공한다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정한 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 ESRRG rs1890552의 유전적 다형성에 따른 8-epi-PGF_2α의 수준의 연관성을 나타낸 것이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상기 대상체(subject)는 진단 대상으로서 인간일 수 있고, 상기 생물학적 시료는 당뇨병의 위험성을 평가하고자 하는 상기 대상체에서 분리된 시료로써, 조직, 세포, 혈액, 혈장, 복막액, 활막액, 타액, 소변, 대변 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 소변일 수 있다.

이 때, 상기 대상체는 공복혈당장애(Impaired Fasting Glucose; IFG)를 가질 수 있고, 혹은 당뇨병 환자일 수 있다. 상기 대상체는 공복혈당 수준에 의해 분류되며, 공복혈당이 100mg/dL 미만인 경우 정상, 100~125mg/dL인 경우 공복혈당장애(IFG), 126mg/dL 이상인 경우 당뇨병으로 진단할 수 있다.

또한, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병일 수 있다. 상기 제2형 당뇨병은 인슐린은 정상적으로 분비되나 인슐린의 본래 기능이 상실 또는 저하된 경우에 발병하며, 성인형 당뇨병 또는 인슐린 비의존형 당뇨병으로도 지칭된다. 상기 제2형 당뇨병은 세포가 췌장에서 생성된 인슐린에 효과적으로 반응하지 않을 때 발병할 수 있다.

인슐린 저항성이 높은 환자는 초기에 정상적인 혈당을 유지하기 위해 추가적으로 더 많은 인슐린을 생산하며, 결국에는 인슐린 저항성이 심화되고 췌장이 인슐린 요구량을 감당할 수 없게 되어 혈당이 상승할 수 있다.

상기 당뇨병은 초기 당뇨병 또는 당뇨병 전기(pre-diabetes)를 포함할 수 있다. 초기 당뇨병은 혈당이 정상보다는 높지만 당뇨병의 확진까지 추가적인 정보가 필요한 상태를 의미하며, “당뇨 전단계” 또는 “당뇨병 전기(pre-diabetes)"와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

일반적으로 대다수의 환자들은 제2형 당뇨병으로 확진 전에 초기 당뇨 단계를 거친다. 초기 당뇨병에서 나타나는 혈당의 증가는 인슐린 저항성으로 인해 개시되지만 반드시 당뇨병으로 발전되지는 않으며, 초기 당뇨병은 심장 질환의 위험 요인이 될 수도 있다.

상기 ESRRG(Estrogen-related receptor γ gene) 유전자는 당해 분야에서 일명 NR3B3(핵 수용체 서브 패밀리 3), ERR3, ESRRG(Estrogen-related receptor γ) 또는 ERR-gamma(Estrogen-related receptor gamma)로 알려진 핵 수용체를 암호화한다. 상기 ESRRG는 고아 핵 수용체의 구성 중 하나이며 항상성 및 대사 과정 조절에 다양한 역할을 한다. 최근 상기 ESRRG 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 유전자형이 혈압의 변화와 관련이 있다고 보고되었으나, 전장유전체연관분석연구(genome-wide association study; GWAS)에 따르면 ESRRG가 제2당뇨병의 발병 가능성과 연관되어 있음이 보고된 바 있다.

상기 “단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다.

예컨대, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)과 같이 단일염기에서 차이가 있을 때, 이를 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며 대다수의 SNP는 두 개의 대립 유전자를 포함한다.

상기 SNP는 한 집단(population)내에서 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 인간 집단 내에서 일부 변이성(variations)이 존재하며, 지질학적 또는 민족적 군에서 공통적인 하나의 SNP 대립 유전자는 매우 희귀하다. 상기 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있으므로, 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.

상기 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열의 변화를 수반하는 것은 아니다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고, 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 상기 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 상기 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시킬 수 있고 상기 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성할 수 있다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

인간의 DNA 서열 상의 변이는 질병의 발병 또는 병원체, 화학물질, 약물, 백신 및 다른 시약에 대한 인체의 반응에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 상기 SNP는 맞춤형 의약의 중요한 도구(key enabler)로 활용될 수 있다.

특히, 상기 SNP는 질병군 또는 비질병군 간의 게놈 부위를 비교하는 방식으로 질병을 진단하는 생의학적 연구에서 고려될 수 있다. 상기 SNP는 인간 게놈의 가장 많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다(Sachidanandam et al., 2001). 상기 SNP는 매우 안정된 유전적 마커이고, 표현형에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 자동화된 유전자형규명 시스템에 매우 적합하다(Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000).

상기 “전장유전체연관분석연구(genome-wide association study; GWAS)”는 개체간의 유전자가 어떻게 다른지 알아보기 위해 특정한 종의 다른 개체들의 거의 모든 유전자를 연구하는 것으로 질병의 분자이동경로를 찾거나 질병의 위험을 예측할 수 있는 유전자를 찾을 수 있다.

예컨대, 질병을 가지고 있는 그룹과 질병을 가지고 있지 않은 대조군의 DNA를 비교하고 DNA 변이의 표지인자인 단일염기다형성을 읽는다. 만약 유전적 변이가 질병을 가지고 있는 사람에게 더 많이 있다면 이 변이는 질병과 “연관있다”고 볼 수 있다.

한편, 상기 (b) 단계에서 상기 ESRRG rs1890552 부위의 유전적 다형성이 검출된 경우 상기 대상체의 당뇨병 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

상기 ESRRG rs1890552 부위는 AA, AG, GG 형태가 존재한다. 정상인, 공복혈당장애, 및 제2당뇨병 환자의 ESRRG rs1890552 부위의 유전자형을 분석한 결과 공복혈당장애와 제2당뇨병 환자인 경우 ESRRG rs1890552 부위에서 G 대립 형질의 유전자형이 정상인에 비해 상대적으로 많이 확인되었다.

따라서, 상기 ESRRG rs1890552 부위에서 G 대립 유전자의 존부를 판단할 수 있고, 상기 대상체의 당뇨병의 예후 또는 위험도를 판단할 수 있다.

또한, 상기 8-epi-PGF_2α는 공복 혈당 장애(IFG), 내당능장애, 및 제2형 당뇨병에서 포도당 조절과 밀접한 관련이 있기 때문에 8-epi-PGF_2α와 관련된 SNP는 IFG 또는 제2형 당뇨병의 위험과 연관된 새로운 SNP일 가능성이 있다. 한국인의 질병 및 복합 형질에 관한 유전 연구에 최적화된 Korean Chip(K-CHIP)에 의해 규명된 ESRRG rs1890552 는 8-epi-PGF_2α와 관련된 SNP 중 하나이다.

따라서 상기 ESRRG rs1890552 부위의 유전적 다형성이 8-epi-PGF_2α(8-epi-prostaglandin F_2α)의 수준을 증가시킬 수 있으며, 이는 당뇨병 발명과 밀접하게 연관될 수 있다.

상기 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 상기 표적 미생물의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.

상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 바람직하게는 단쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(Deoxyribonucleotide)일 수 있다. 상기 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조 릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지할 수 있다.

상기 연장 프라이머는 타겟 핵산의 특정 위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길수 있다. 상기 프라이머의 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정될 수 있고 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 상대적으로 낮은 온도가 요구될 수 있다. 상기 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성할 수 있다.

상기 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 상기 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다(Scheit, NucleotideAnalogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).

상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예컨대, 형광 핵산 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.AcidsRes., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR이 사용될 수 있다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여 이동성이 다른 밴드가 형성될 수 있으며, 상기 SSCA는 상기 밴드를 검출할 수 있다. 상기 DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 상이한 이동성을 나타내는 서열을 검출할 수 있다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용할 수 있다.

상기 RNase 보호 분석에서, 상기 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용될 수 있다. 상기 분석에서 상기 리보프로브와 인간으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단할 수 있다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우 상대적으로 작은 밴드가 관찰될 수 있다.

상기 혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용될 수 있다. 상기 분석에서 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 DM 또는 MS 여부를 결정할 수 있다.

상기 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미할 수 있다. 상기 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥일 수 있고, 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드일 수 있다.

상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 상기 프로브로서 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

상기 프로브는 상기 SNP를 포함하는 10 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열 일치에 의해 결정될 수 있으므로, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 상기 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., MolecularCloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic AcidHybridization, A PracticalApproach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 상기 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 상기 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 상이하게 결정될 수 있다.

상기 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 당뇨병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)를 포함할 수 있다.

상기 SNP의 존부로 인해 시간 경과에 따라 체내 8-epi-PGF_2α의 수준이 변화할 수 있고 이로 인해 당뇨병의 발병 가능성이 높은 것으로 판단될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 유전적 다형성(polymorphism)은 마이크로어레이 또는 유전자 증폭에 의해 식별될 수 있다.

상기 “증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미할 수 있다. 다양한 증폭 반응이 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 상기 증폭 반응은 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, MolecularCloning. A LaboratoryManual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 수행될 수도 있다. 상기 마이크로어레이는 고상표면에 고정화된 프로브를 이용할 수 있다. 상기 프로브는 상기 SNP를 포함하는 각 유전자상의 10 내지 100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.

상기 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용될 수 있고 기체(substrate) 상에 고정화될 수 있다. 상기 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화될 수 있다.

상기 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수도 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

상기 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화될 수 있다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있고, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수도 있다.

상기 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다.

상기 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methodsin Enzymology, 65:499(1986))에 의해 라벨링될 수 있다. 상기 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공할 수 있다.

상기 분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

상기 프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킬 수 있다. 상기 적절한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 상기 절차는 연구실에서의 사용을 위한 프로토콜을 수립하고자 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시될 수 있다. 예컨대, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 상기 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., MolecularCloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)을 참조할 수 있다.

예컨대, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있다. 또는 상기 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있고, 저 엄격조건은 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있다.

상기 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출할 수 있다. 예컨대, 상기 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 상기 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다.

상기 효소 및 기질은 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코오스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)가 사용될 수 있다.

상기 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수도 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.

실험방법

실험대상

국민 건강 보험 일산 병원(National Health Insurance Corporation Ilsan Hospital)에서 2010년 1월 내지 2015년 3월의 기간 동안 정기적으로 검진을 받고 있는 검진자 중 혈액 및 소변 샘플의 제공을 동의한 지원자를 대상으로 하였다.

건강 검진 센터(HSC)에 의해 정상 공복 혈당(Normal Fasting Glucose; NFG), 공복혈당장애(Impaired Fasting Glucose; IFG), 및 제2형 당뇨병(type 2 diabetes; T2 D)로 진단 받은 1,933명(30 내지 69세)의 대상자를 선발하였다. 선발된 대상자 중 IFG군 또는 T2D군으로 제시된 대상자는 가정의학과 또는 내과에 의뢰하여 건강 및 혈당 프로파일을 재검토 하였다.

당뇨병은 공복 혈당이 126 mg/dL 이상이거나 헤모글로빈 A1c(HbA1c)가 6.5% 이상인 경우 당뇨병으로 진단하였다. 또한, 공복 혈당이 100 내지 125 mg/dL 이거나 HbA1c가 5.7 내지 6.4%인 경우 IFG로 진단하였다.

i) 현재 심혈관 질환, 간 질환, 신장 질환, 췌장염 또는 암 진단을 받았거나 기록이 있는 대상자, ii) 임신 또는 수유 중인 자, iii) 약물 복용자는 실험 대상에서 제외하였다.

실험에 착수하기 전에 모든 참가자들에게 실험의 목적을 상세히 설명한 후 동의서를 받았다. 수행된 실험의 프로토콜은 일산병원 및 연세대학교의 승인을 받았으며 헬싱키 선언(Helsinki Declaration)에 따라 수행되었다.

인체측정

의류와 신발을 착용하지 않은 채로 아침에 실험 대상자들의 체중(kg)과 신장(m²)을 측정하고 체질량 지수(BMI)를 계산하였다. 최소 20분간 휴식 한 후 자동혈압계(FT-200S; Jawon Medical, Gyeongsan, Korea)를 이용하여 혈압을 2회 측정하였다.

혈액 및 소변 수집

혈액 샘플은 12시간 이상 하루 밤 동안 단식한 후 EDTA가 처리된 튜브와 평범한 튜브에 수집하였다. 수집한 혈액 샘플들은 약 30분 이내에 아이스 박스에 위치시킨 후 혈액을 채집한지 3시간 이내에 혈장 및 혈청을 원심 분리하였다. 수집된 혈청은 분석 때까지 -70 °C에서 보관하였다.

소변 샘플은 12시간 이상 하루 밤 동안 단식한 후 1% 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene; BHT)을 함유한 병에 수집하고 분석 때까지 -20 °C에서 보관하였다.

임상 및 생화학적 분석

혈청의 트리글리세라이드는 Pureauto S TG-N kits, 총 콜레스테롤는 Pureauto S CHO-N kits, 고밀도 지질단백질(HDL)-콜레스테롤은 Cholestest N-HDL kits를 이용하여 측정하였다. 측정 결과에 따른 반응 색상은 Hitachi 7600 Autoanalyzer(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 통하여 모니터링 하였다.

저밀도 지질단백질(LDL)-콜레스테롤은 하기 Friedewald 공식을 통해 계산하였다: LDL 콜레스테롤=총 콜레스테롤 - [HDL 콜레스테롤 + (트리글리세라이드/5)].

혈청의 포도당과 인슐린은 상업적 키트를 이용하여 측정하였다. 측정 결과에 따른 반응 색상은 Hitachi 7600 Autoanalyzer(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 통하여 포도당을 모니터링 하고, SR-300 system(Stratec, Birkenfeld, Germany)을 통하여 인슐린을 모니터링 하였다.

인슐린 저항성(IR: Insulin resistance)은 하기 방정식을 이용하여 항상성 모델 평가(HOMA: homeostasis-model assessment)에 의하여 계산하였다: HOMA-IR=[공복 인슐린(μIU/mL)×공복혈당(mmol/L)]/22.5.

HbA1c는 Tina-quant HbA1c Gen.2 reagent를 이용한 면역 비탁법으로 측정하였다. 측정 결과에 따른 탁도는 COBAS Integra 800(Roche, Rotkreuz, Switzerland)을 통하여 모니터링 하였다.

고감도 C 반응성 단백질(high-sensitive C-reactive protein; hs-CRP)은 CRP-Latex(II) X2 kits(Denka-Seiken, Tokyo, Japan)에 의해 측정되었다. 측정 결과에 따른 반응 색상은 Hitachi 7600 Autoanalyzer(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 통하여 모니터하였다.

혈장 말론다이알데하이드(Plasma malondialdehyde; MDA)는 TBARS assay kit(ZeptoMetrix Co., Buffalo, NY)에 의해 측정되었다.

소변의8-epi-PGF_2α는 Urinary Isoprostane ELISA kit(Oxford Biomedical Research Inc., Rochester Hills, MI)에 의해 측정되었다.

소변 크레아틴 수준은 Jaffe 방법을 통하여 측정하였다.

ba-PWV는 자동 파형 분석기(model VP-1000; Nippon Colin Ltd., Komaki, Japan)를 이용하여 측정하였다.

SNP 선별

총 1,933 개의 샘플을 Axiom®2.0 Reagent Kit(Affymetrix Axiom®2.0 Assay User Guide) 제조업체의 방법에 따라 지노타이핑 하였다. 약 200 ng의 gDNA가 증폭되고 무작위로 25 ~ 125 bp의 단편으로 분열되었다. gDNA 초기 증폭은 10 ng/μL 농도의 gDNA 20 μL 와 변성 마스터 믹스 20 μL 를 포함하는 총 40 μL 반응 부피에서 실시하였다.

증폭 반응과 절편화를 통해 얻어진 단편들을 GeneTitan MC Instrument(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)로 염색하고 이미지화한 다음, Genotyping Console™ Software(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)로 분석하였다. 지노타입 데이터는 K-CHIP을 통해 얻었다. K-CHIP은 국립보건연구원 유전체과학센터에서 설계되었다.

통계적 분석

통계적 분석은 SPSS v. 23.0(IBM, Chicago, IL, USA)을 이용하여 수행하였다. 왜곡된 변수들은 통계적 분석을 위하여 대수적으로(logarithmically) 변형하였다. 결과값은 평균±표준오차(S.E.)로 표현하였으며, 양측 P-검정값(two-tailed P-value)<0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 대응표본 독립 t-검정을 이용하여 실험군 및 대조군 간의 파라미터를 비교하였다.

HWE(Hardy Weinberg Equilibrium) 검사는 PLINK 버전 1.07에 의해 수행되었다.

유전자형(genotype)과 8-epi-PGF_2α의 연관성을 선형 회귀 분석(linear regression analysis)으로 평가하였다. 빈도는 카이 제곱(χ²) 테스트로 평가하였다. 유전자형과 IFG 또는 T2D의 연관성은 교란 요인에 대한 조정하여 95% 신뢰구간의 오즈비(ORs)로 로지스틱 회귀분석을 통해 계산하였다. 실험군과 대조군의 ESRRG rs1890522 유전자형 그룹 간의 차이를 비교하기 위해 일대일 ANOVA 및 Bonferroni post hoc 테스트를 수행하였다.

실험결과

IFG(571명) 또는 T2D(168명)로 진단된 환자(739명)와 대조군(1183명)의 임상 및 생화학적 특성을 표1에 나타내었다. 수축기 및 이완기 혈압, 트리글리세라이드, 글루코오스, HOMA-IR, 및 HbA1c는 대조군보다 높게 나타났다. 단, HDL-콜레스테롤의 수치는 대조군보다 낮게 나타났다. 또한, IFG 또는 T2D군은 대조군보다 혈장 MDA, 8-epi-PGF_2α 및 ba-PWV의 수준이 더 높았다(표1). 607,707개의 SNP와 1,925개의 샘플을 서열 분석에 사용하였다.

8-epi-PGF_2α에 가장 강하게 연관된 10개의 SNP가 발견되었고 그 중 2개의 SNP가 ESRRG 유전자로 확인되었다. 하나의 SNP는 SNP ID가 존재하지 않았으며, 따라서, ESRRG rs1890552에 대한 연관성 분석을 수행하였다.

구분	대조군	IFG 또는T2D 환자(n=739)
구분	대조군	IFG + T2D (n=739)	IFG (n=571)	T2D (n=168)
연령(년)	48.6±0.32	52.5±0.37***	51.8±0.42***	54.9±0.78***
BMI(kg/m²)	23.8±0.09	24.8±0.11***	24.7±0.13***	25.2±0.25***
수축기혈압(mmHg)	119.7±0.44	126.3±0.59***	125.2±0.67***	130.3±1.23***
이완기혈압(mmHg)	75.6±0.33	78.8±0.40***	78.3±0.46***	80.2±0.80***
트리글리세라이드(mg/dL)^∮	119.1±2.01	139.7±3.18***	136.0±3.29***	152.3±8.38***
총 콜레스테롤(mg/dL)^∮	198.8±1.04	199.0±1.35	199.4±1.51	197.5±3.05
HDL-콜레스테롤(mg/dL)^∮	54.4±0.38	51.2±0.49***	51.7±0.55***	49.7±1.08***
LDL-콜레스테롤(mg/dL)^∮	120.8±0.94	121.6±1.24	122.0±1.38	120.5±2.84
글루코오스(mg/dL)^∮	87.6±0.21	117.9±0.92***	108.1±0.29***	151.2±2.65***
인슐린(μIU/dL))^∮	9.39±0.13	9.66±0.23	9.54±0.24	10.1±0.62
HOMA-IR^∮	2.04±0.03	2.82±0.08***	2.55±0.07***	3.82±0.27***
HbA_1c(%)^∮	5.48±0.01	6.44±0.05***	6.15±0.03***	7.10±0.11***
hs-CRP(mg/dL)^∮	1.19±0.09	1.40±0.10	1.28±0.10	1.83±0.27
말론디알데하이드(nmal/mL)^∮	8.16±0.07	10.7±0.23***	10.0±0.18***	12.9±0.78***
8-epi-PGF_2α(pg/mg 크레아틴)^∮	1434.4±21.9	1625.1±36.5***	1596.1±40.7**	1733.1±81.7***
ba-PWV(cm/s)^∮	1276.8±8.74	1392.6±19.7***	1356.0±16.0***	1738.9±110.6***

각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ∮은 로그 변환으로 검사한 값이다. 독립적 t-test로 P-값에 따라 대조군과 비교했을때 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로 계산되었다.

ESRRG rs1890552 A>G 유전자형에 따른 분포

ESRRG rs1890552 A>G유전자형 분포는 하디-바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)에서 현저히 벗어나지 않았다. 모든 환자 및 IFG 또는 T2D 환자에서 상대적인 ESRRG rs1890552 A>G 유전자형 및 대립 형질 빈도는 대조군과 비교하여 현저한 차이가 있었다(표2).

*ESRRG* rs1890552	대조군 (n=1183)	IFG 또는T2D 환자(n=739)			대조군 대비 P -값
*ESRRG* rs1890552	대조군 (n=1183)	IFG + T2D (n=739)	IFG (n=571)	T2D (n=168)	IFG + T2D	IFG	T2D
AA	356(30.1%)	204(27.6%)	160(28%)	44(26.2%)	<0.001	0.001	0.018
AG	600(50.7%)	334(45.2%)	258(45.2%)	76(45.2%)
GG	227(19.2%)	201(27.2%)	153(26.8%)	48(28.6%)
G 대립 형질 빈도	1054(44.5%)	736(49.8%)	564(49.4%)	172(51.2%)	0.002	0.007	0.022

P-값을 산출하고자 카이-제곱 검증(chi-squared test)을 사용하였다. NFG; 정상공복혈당(공복혈당 < 100 mg/dL). IFG; 공복혈당장애(100 mg/dL ≤ 공복혈당 < 126 mg/dL). T2D; 2형 당뇨병(공복혈당 ≥ 126 mg/dL).

한편, ESRRG rs1890552 A>G SNP의 GG 유전자형의 존재가 IFG+T2D의 높은 위험성과 연관되었다[OR : 1.573(95 % CI : 1.266-1.955), P <0.001] (표 3).

유의한 차이는 나이, 체질량 지수, 흡연, 음주, 수축기 및 이완기 혈압 보정 후에도 유지되었다[OR : 1.593(95 % CI : 1.269-2.001), P <0.001].

또한, 상기 연관성은 IFG및 T2D에서 각각 별개로 관찰되었다.

*ESRRG* rs1890552	IFG 또는T2D 환자(n=739)
	IFG + T2D (n=739)	P -값	IFG (n=571)	P -값	T2D (n=168)	P -값
	OR(95% CI)	P -값	OR(95% CI)	P -값	OR(95% CI)	P -값
모델1
G 대비 A‡	1.235 (1.084-1.407)	0.002	1.215 (1.054-1.399)	0.007	1.306 (1.039-1.641)	0.022
GG 대비 AA+AG‡	1.573 (1.266-1.955)	<0.001	1.542 (1.219-1.950)	<0.001	1.685 (1.170-2.426)	0.005
AG+GG 대비 AA‡	1.129 (0.921-1.384)	0.243	1.106 (0.887-1.379)	0.372	1.213 (0.842-1.749)	0.300
모델2
G 대비 A‡	1.259 (1.099-1.443)	0.001	1.228 (1.061-1.421)	0.006	1.275 (1.000-1.626)	0.049
GG 대비 AA+AG‡	1.593 (1.269-2.001)	<0.001	1.547 (1.213-1.972)	<0.001	1.682 (1.135-2.493)	0.010
AG+GG 대비 AA‡	1.173 (0.948-1.452)	0.142	1.133 (0.902-1.424)	0.282	1.154 (0.784-1.698)	0.468

‡ 참고. CI; 신뢰구간(Confidence interval). 모델 1: 미보정값; 모델 2: 나이, 체질량 지수, 흡연, 음주, 수축기 및 이완기 혈압에 따른 보정값. IFG; 공복혈당장애(100 mg/dL ≤ 공복혈당 < 126 mg/dL). T2D; 2형 당뇨병(공복혈당 ≥ 126 mg/dL).

ESRRG rs1890552 A>G 유전자형과 8- epi - PGF _2α , 혈당, 및 ba - PWV의 연관성

대조군(P=0.032), IFG+T2D(P<0.001), IFG(P<0.001) 및 T2D(P=0.032)에서 8-epi-PGF_2α와 ESRRG rs1890552 A>G 유전자형 사이의 유의한 연관성이 관찰되었다(도 1).

대조군, IFG+T2D, IFG, 및 T2D에서 GG 대상자가 AA 대상자보다 8-epi-PGF_2α 와 더 높은 연관성을 보였다. 대조군에서 혈당과 ESRRG rs1890552 A>G 유전자형의 연관성이 관찰되었다(AA: 86.8±0.4 mg/dL, AG: 87.1±0.29 mg/dL, GG: 90.2±0.44 mg/dL; P<0.001). 대조군 내에서 GG 대상자가 AA대상자보다 높은 혈당수치를 보였다.

또한, IFG+T2D 군에서 ba-PWV와 ESRRG rs1890552 A>G 유전자형 사이에 연관성이 관찰되었다(AA : 1302 ± 26 cm / s, AG : 1369 ± 28 cm / s, GG : 1499 ± 42 cm / s; P <0.001). IFG + T2D 군에서 GG 대상자가 AA 대상자보다 높은 ba-PWV 값을 보였다.

상기 결과는 ESRRG rs1890552 GG 유전자형의 빈도가 대조군보다 IFG 또는 T2D 환자에서 높게 관찰되었으며, 이는 ESRRG rs1890552 A>G SNP와 IFG 또는 T2D 사이의 연관성을 시사한다. 상기 결과는 T2D에 대한 GWAS 데이터와 일치하며 ESRRG 변종과의 연관성을 보여준다.

또한, 대조군에서 ESRRG rs1890552 GG 유전자형을 가진 피험자는 AA 유전자형을 가진 피험자보다 혈당이 높게 측정되었다. 또한 IFG 또는 T2D 환자는 대조군보다 8-epi-PGF_2α 수준이 높게 측정되었다. 또한, 대조군, IFG+T2D, IFG, 및 T2D에서 ESRRG rs1890552 GG 유전자형은 AA유전자형에 비해 8-epi-PGF_2α 의 수준이 높았다.

상기 ESRRG는 고아 핵 수용체의 구성 중 하나이며 항상성 및 대사 과정 조절에 다양한 역할을 한다. 최근 ESRRG가 혈관의 석회화에 있어서 중요한 역할을 하는 것을 보고된 바 있다. 산화 스트레스 과정에서, 8-epi-PGF_2α는 체내에서 인슐린 저항성, 당뇨병 위험 표현형 및 혈관의 석회화를 야기할 수 있다.

본 연구에서, IFG 또는 T2D 군의 ESRRG rs1890552 GG 유전자형 대상자는 AA 유전자형 대상자와 비교하여 높은 소변의 8-epi-PGF_2α 농도 및 ba-PWV 값을 나타냈다. 본 연구에서 ESRRG rs1890552 GG 유전자형은, 나이, 성별, 음주, 흡연, 혈압과 독립적으로 IFG 또는 T2D 발병 위험도와 연관되었으며, 상기 결과는 ESRRG가 혈당 및 산화 스트레스에 긍정적인 영향을 미치는 중대한 유전자자리(locus)에 해당함을 시사한다.

본 발명자들은 실험적 측면의 여러 제한에도 불구하고, ESRRG rs1890552 GG 유전자형과 IFG 또는 T2D의 발병 위험 간의 상호 관련성이 있음을 규명하였을 뿐만 아니라, 증가된 산화 스트레스 간의 상관 관계도 규명하였다.

상기 결과는 ESRRG와 산화 스트레스, IFG 또는 T2D에 대한 신뢰도 높은 바이오마커인 8-epi-PGF_2α 간의 연관성으로 인해 ESRRG rs1890552 A>G SNP가 IFG 또는 T2D를 진단하는 새로운 후보 유전자임을 뒷받침한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(a) 대상체(subject)에서 분리된 생물학적 시료를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 생물학적 시료에서 ESRRG(Estrogen-related receptor γ gene) rs1890552의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 당뇨병의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 상기 ESRRG rs1890552 부위의 유전자형이 GG인 경우 상기 대상체의 당뇨병 위험도가 높은 것으로 판단하는 당뇨병의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 상기 ESRRG rs1890552 부위에서 G 대립 유전자의 존부를 판단하는 당뇨병의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 ESRRG rs1890552 부위의 GG 유전자형이 8-epi-PGF_2α(8-epi-prostaglandin F_2α)의 수준을 증가시키는 당뇨병의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 생물학적 시료는 혈액 또는 소변인 당뇨병의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
ESRRG rs1890552 부위의 G 대립 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 당뇨병 발병 위험도 진단용 키트.