KR101046341B1 - 뇌졸중 예측용 ｔｍｅｍ５ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법 - Google Patents

뇌졸중 예측용 ｔｍｅｍ５ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101046341B1
KR101046341B1 KR1020090117035A KR20090117035A KR101046341B1 KR 101046341 B1 KR101046341 B1 KR 101046341B1 KR 1020090117035 A KR1020090117035 A KR 1020090117035A KR 20090117035 A KR20090117035 A KR 20090117035A KR 101046341 B1 KR101046341 B1 KR 101046341B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
stroke
frequency
analysis
polynucleotide
stroke risk
Prior art date
Application number
KR1020090117035A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110060446A (ko
Inventor
김노수
고미미
차민호
방옥선
Original Assignee
한국 한의학 연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국 한의학 연구원 filed Critical 한국 한의학 연구원
Priority to KR1020090117035A priority Critical patent/KR101046341B1/ko
Publication of KR20110060446A publication Critical patent/KR20110060446A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101046341B1 publication Critical patent/KR101046341B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 뇌졸중 예측용 유전자 다형성 마커, 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 TMEM5(Transmembrane 5) 5'-조절 부위(5'-regulatory region)의 단일염기다형성인 rs11175166의 소수 대립유전자 C 또는 TC/CC 유전자형의 빈도가 정상인에 비해 뇌졸중 환자에서 유의적으로 감소하는 것을 확인함으로써 상기 유전자 다형성을 뇌졸중에 대한 마커로 이용하여 뇌졸중의 위험을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 뇌졸중의 위험을 예측할 수 있으며, 뇌졸중을 위한 치료 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
TMEM5, rs11175166, 뇌졸중, 유전자 다형성, 단일염기다형성, 연관성.

Description

뇌졸중 예측용 ＴＭＥＭ５ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법{A genetic polymorphic marker of TMEM５ for prediction of ischemic Stroke and the prediction method of ischemic Stroke using the same}
본 발명은 뇌졸중 위험 예측용 유전자 다형성 마커, 및 상기 유전자 다형성 마커를 이용한 뇌졸중 위험 예측 방법에 관한 것이다.
뇌졸중과 관련된 유전 인자의 동정은 뇌졸중의 위험을 줄이거나 뇌졸중 예방 또는 치료를 위한 맞춤의학 개발에 중요하다. 최근 10년 동안, 유전체 관련성 연구(genome-wide association study, GWAS) 및 대조군 관련성 연구(control-case association study)로부터 5-리폭시게나제 활성 단백질 유전자(5-lipoxygenase activating protein gene, ALOX5AP) 및 포스포디에스테라제 4D 유전자(phosphodiesterase 4D gene, PDE4D) 등의 뇌졸중의 유전적 위험 인자를 동정하였다[Gretarsdottir et al., 2003; Helgadottir et al., 2004]. 그러나, PDE4와 뇌졸중의 유전적 관련성은 아일랜드인을 포함하는 유럽인에서는 관찰되었으 나[Gretarsdottir et al., 2003], 일본인[Matsushita et al., 2009]과 한국인[Kim et al., 2009] 등의 아시아인 또는 중앙 유럽인[Lohmussaar et al., 2005]에서는 관찰되지 않았다. 이는 뇌졸중에 대한 유전적 효과가 인종 및 지역에 따라 매우 다양하게 나타나는 것을 제시하는 것이다. 따라서, 상기 유전적 위험 인자는 특정 인종 및 지역을 기초로 하여 평가되어야 한다.
인간 TMEM5(Transmembrane 5) 유전자는 유전자좌 12q14.2에 위치한다. 수치요법(hydropathy) 분석에 따르면 TMEM5 유전자는 443개의 아미노산으로 구성된 단일 통과 제2형 막통과 단백질(single pass type II transmembrane protein)을 암호화한다. 제2형 TMEM 단백질의 세포적 위상(topology)은 하기와 같은 특징이 있다: N-말단 신호 서열(signal sequence)은 잘려있지 않은 상태로 세포질과 직면한 막에 존재하나, C-말단 도메인은 세포외 기질에 노출되어 있다. TMEM5 cDNA의 클로닝은 일본 연구 기관에 의해 최초로 수행되었는데[Yokoyama-Kobayashi et al., 1999], 이들은 제2형 신호 앵커 서열(type II signal anchor sequence)을 암호화하는 cDNA를 통정하기 위해, N-말단 분비 신호 서열(N-terminal secretory signal sequence)을 검출하는 신규 시스템을 이용하였다. 이들은 이러한 신규 시스템을 사용하여 포르볼 에스테르(phorbol ester)에 의해 자극된 U937 단핵구 cDNA 라이브러리로부터 유래된 HP10481로 불리는 TMEM5를 암호화하는 cDNA를 분리하였다. TMEM5 클로닝이 1999년에 최초로 보고된 이래로, 지금까지 TMEM5에 대한 구체적인 기능 연구가 보고된 바 없다.
이에, 본 발명에서는 유전체 관련성 연구(GWAS)와 맞춤칩(customized chip) 분석을 통해 뇌졸중 발병과 연관되어 있는 것으로 나타난 TMEM5의 5'-조절 부위(regulatory region)의 단일염기다형성인 rs11175166에 대해, 뇌졸중 환자군-대조군의 확증적 연관성 분석을 통해 rs11175166의 소수 대립유전자 C의 빈도와 TC/CC 유전자형의 빈도가 정상인에 비해 뇌졸중 환자에서 유의적으로 감소하여 상기 다형성이 한국인의 뇌졸중에 대한 민감도에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 이를 통해 상기 다형성을 뇌졸중에 대한 위험 인자로 사용할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TMEM5 5'-조절 부위의 단일염기다형성인 rs11175166를 이용하여 뇌졸중의 위험을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TMEM5의 5'-조절부위(5'-regulatory region)를 구성하는, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 rs11175166에 있어서, 27번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 TMEM5의 5'-조절부위를 구성하는, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 rs11175166에 있어서, 27번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드, 또는 그의 cDNA를 포함하는 마이크로어레이를 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 상기 폴리뉴클레오티드의 소수 대립유전자 C의 빈도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 소수 대립유전자 C의 빈도에 비해 낮은 피검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 상기 폴리뉴클레오티드의 유전자형 TC+CC의 빈도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 유전자형 TC+CC의 빈도에 비해 낮은 피검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 인간 TMEM5 5'-조절 부위의 단일염기다형성인 rs11175166의 소수 대립유전자 C 또는 TC/CC 유전자형의 빈도가 정상인에 비해 뇌졸중 환자, 특히 한국인에서 유의적으로 감소하며, 이런 rs11175166과 허혈성 뇌졸중의 연관성이 다중 인자에 대한 적용 후에도 여전히 유효함을 확인함으로써, 상기 유전자 다형성을 마커로 이용하여 뇌졸중의 위험을 신속하고 용이하게 예측할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TMEM5(Transmembrane 5)의 5'-조절부위(5'-regulatory region)를 구성하는, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 rs11175166에 있어서, 27번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진 뇌졸중 위험 예측용 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 마커를 제공한다.
본 발명에서는 허혈성 뇌졸중 환자와 정상인을 대상으로 정맥혈을 채취한 후, 게놈 DNA를 정제한 다음, 정제된 게놈 DNA로부터 단일-염기 연장 반응(single-base extension reaction)을 수행하여 rs11175166의 유전자형을 결정하였다.
본 발명에서는 rs11175166 다형성과 뇌졸중의 연관성을 알아보기 위해, 허혈성 뇌졸중 환자와 정상인을 대상으로 다중 로지스틱 회귀분석(Multiple logistic regression)을 이용하여 연관성을 분석하였다. 그 결과, rs11175166의 소수 대립유전자(C)가 뇌졸중 환자에서 유의적으로 보다 더 낮은 빈도를 나타내었다. 또한, 우성 모형(dominant model)에서 TC/CC 유전자형을 갖는 대상의 수가 뇌졸중 환자군에서 유의적으로 감소하였다.
본 발명에서는 rs11175166 다형성과 뇌졸중의 연관성이 여러 임상적 인자에 의해 영향을 받는지 알아보기 위해, 여러 임상적 인자를 적용한 후 상기와 같이 다중 로지스틱 회귀분석을 수행하였다. 그 결과, rs11175166과 허혈성 뇌졸중의 유 전적 연관성은 성(sex), 연령(age), 고혈압, 고지혈증, 허혈성 심질환, 흡연, 음주, 허리, 총콜레스테롤(TC), HDL 등의 다중 인자를 적용한 후에도 여전히 유효하였다.
즉, TMEM5 5'-조절 부위의 단일염기다형성인 rs11175166의 소수 대립유전자 C 또는 유전자형 TC/CC의 빈도가 대조군과 허혈성 뇌졸중 환자 사이에 통계학적으로 유의적인 차이가 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 rs11175166 단일염기다형성이 뇌졸중에 대한 민감도에 영향을 주는 것을 알 수 있으며, 이를 뇌졸중의 위험을 예측하는 다형성 마커로 이용할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다형성 마커를 구성하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드, 또는 그의 cDNA를 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 rs11175166에 있어서, 27번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그들과 혼성화 하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조 일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다형성 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트를 제공한다.
상기 프라이머쌍은 상기 다형성 부위를 증폭할 수만 있다면 크기 및 주형에 결합하는 위치가 제한되지 않으며, 당업자라면 통상의 프라이머 선정용 소프트웨어를 이용하여 용이하게 프라이머의 고안이 가능하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 마이크로어레이를 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트는 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(streptavidin-like phosphatase conjugate), 화학형광물질(chemifluorescence) 및 화학발광물질(chemiluminescence)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키트는 추가적으로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 반응 시 약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니다.
또한, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 본 발명의 다형성 마커의 소수 대립유전자 (C)의 빈도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 소수 대립유전자 (C)의 빈도에 비해 낮은 피검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 대립유전자의 빈도 측정은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립 유전자 혼성화 방법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 및 실시간 PCR로 구성된 군으로부터 선택되는 것에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 개체는 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
아울러, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 본 발명의 다형성 마커의 유전자형 TC+CC의 빈도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 유전자형 TC+CC의 빈도에 비해 낮은 피검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 유전자형의 빈도 측정은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, PCR 연장 분석, 실시간 PCR 분석, FRET 분석 및 MALDI-TOF를 이용한 서열 분석(MALDI-TOF based mini-sequencing assay)로 구성된 군으로부터 선택되는 것에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 개체는 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서는 rs11175166 다형성과 뇌졸중의 연관성을 다중 로지스틱 회귀분석을 이용하여 연관성을 분석한 결과, rs11175166의 소수 대립유전자 (C)의 빈도가 뇌졸중 환자에서 정상인에 비해 유의적으로 낮은 수치를 나타내었고, TC/CC 유전자형의 빈도가 뇌졸중 환자에서 정상인에 비해 유의적으로 낮은 수치를 나타내었으며, 이런 결과는 성(sex), 연령(age), 고혈압, 고지혈증, 허혈성 심질환, 흡연, 음주, 허리, TC, HDL 등의 다중 인자에 대한 적용 후에도 여전히 유효하였다.
따라서, rs11175166의 소수 대립유전자 (C)의 빈도 또는 유전자형 TC/CC의 빈도를 측정함으로써 뇌졸중의 위험을 예측할 수 있음을 알 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
<실시예 1> 실험 대상의 선정
본 발명자들은 실험 대상으로 유전적으로 관련이 없는 뇌경색(cerebral infarction, CI) 환자군(n=656) 및 대조군(n=488)을 대한민국 12개의 병원으로부터 모집하였다. 모든 환자들은 기본적인 건강검진 및 CT/MRI 검사를 받았다. 뇌졸중(stroke) 징후를 가진 사람들은 대조군에서 제외시켰다. 또한, 당뇨병을 가진 환자들은 위험인자의 효과와 혼동하는 것을 최소화하기 위해, 대조군과 뇌경색 환자군 모두에서 제외시켰다. 성별에 따른 차이는 존재하지 않았으며, 모든 환자들로부터 서면 동의서를 받았다. 실험 프로토콜은 한국한의학연구원의 기관감사위원회(Institutional Review Board)와 환자들을 모집한 지역 병원에 의해 승인받았다.
<실시예 2> 실험 대상의 임상적 특성 분석
본 발명자들은 실험 대상의 임상적 특성을 통계학적으로 분석하였다. 구체적으로, 임상적 분석에 있어서, 공복혈당(fasting blood sugar, FBS) 및 혈청 지질[예를 들면, 총 콜레스테롤(TC), 트리글리세라이드(triglyceride, TG) 및 HDL]은 자동화된 생화학 분석기(biochemical analyzer)를 이용하여 획득하였다. LDL을 계산하는 Friedwald 공식[LDL-C = TC-(HDL-C + TG/5)]은 대상의 트리글리세라이드 수준이 400 mg/dL 이하인 경우에만 적용하였다.
통계학적 분석은 SAS 소프트웨어 버전 9.1.3(SAS Institute Inc, NC, U.S.A)을 이용하였다. 범주형 변수(categorical variable)는 카이스퀘어 테스트(Chi-square test)로 비교하였다. 모든 연속변수(continuous variable)는 Kolmogorov-Smirnov 정규분포성 테스트(normality test)를 수행하였다. 연속변수의 차이는 모수적 테스트(Parametric test)(Student's t-test 및 분산분석법[ANOVA]) 또는 비모수적 테스트(non-parametric test)(Wilcoxon rank-sum test 및 Kruskal-Wallis test)를 이용하여 결정하였다. 이하, 실험에서 통계학적 분석은 이와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 하기 표 1에 기재된 바와 같이, 뇌졸중 환자군이 대조군에 비해 남성과 연장자를 더 많이 포함하였다. 전형적인 뇌졸중 위험인자인 고혈압, 고지혈증, 허혈성 심질환, 흡연 및 음주 상태는 뇌졸중 환자군이 대조군에 비해 더 높았다. 또한, 비만지표인 허리둘레는 뇌졸중 환자군이 대조군에 비해 유의성 있게 더 높았다. 또한, 뇌경색 환자군은 대조군에 비해 더 낮은 TC 및 HDL 수준을 보여주었다. 그러나 대조군과 뇌경색 환자군의 모든 지질 수준은, 지질학 및 동맥경화증에 대한 한국인 권장 지질 수준 지침에 따른 정상 혈중 지질 범위(TC=200 mg/dL 이하, TG=150 mg/dL 이하, HDL-C=40 mg/dL 이상, LDL-C=130 mg/dL 이하) 내에 있었다.
실험대상의 통계학적 및 임상적 특성
특성 대조군 (N=488) 환자 (N=656) P P*
성 (M/F) 213/275 350/306 0.0012
나이 62 (55, 68) 68 (59, 74) <.0001 <.0001
HT (Y/N)a 68/418 366/284 <.0001
HL (Y/N)a 24/460 52/589 0.0369
IHD (Y/N)a 9/475 37/605 0.0011
Smoking(1/2/3)b 28/266/191 195/104/355 <.0001
Drinking(1/2/3)b 154/31/299 241/56/357 0.0447
Waist(cm) 83.88±8.39 86.0 (80.0, 92.0) 0.0003 0.0002
FBS 98.0 (92.0, 105.0) 98.0 (89.0, 109.5) 0.4284 0.8887
TC 198.0 (177.0, 224.0) 187.0 (163.0, 212.0) <.0001 <.0001
TG 129.0 (89.0, 180.0) 121.0 (88.0, 179.0) 0.7947 0.7063
HDL 51.5 (43.2, 59.9) 41.0 (33.7, 49.0) <.0001 <.0001
LDL 117.1 (98.8, 141.6) 117.6 (95.4, 138.6) 0.4301 0.4376
통계적으로 유의성 있는 p값을 굵은 글씨로 표시하였다.
*Wilcoxon Two-sample Test.
a1HT(hypertension): 고혈압; HL(hyperlipidemia): 고지혈증; IHD(ischemic heart disease): 허혈성 심질환.
b1=현재 흡연중, 2=금연중, 3=흡연한적 없음.
<실시예 3> DNA 정제 및 유전자형(genotyping) 분석
본 발명자들은 하룻밤 동안 금식시킨 실험 대상으로부터 EDTA(BD Biosciences, FranklinLakes, NJ, U.S.A.)가 포함된 정맥혈 검체 용기(Venous Blood Collection Tube)를 이용하여 정맥 전혈을 채취하였다. 상기 전혈로부터 15분 동안 1,500 g에서 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 그런 다음, 제조사의 지시에 따라 GeneAll genomic isolation kit(GeneAll co., Seoul, Korea)를 이용하여 림프구를 포함하는 연막(buffy coat)으로부터 게놈 DNA를 정제하였다. 상기 정제된 게놈 DNA로부터 MassARRAYTM(Sequenom, San Diego, CA, USA)와 하기 표 2에 기재된 증폭/연장 PCR 프라이머를 이용한 단일-염기 연장 반응(single-base extension reaction)에 의해 rs11175166의 유전자형을 결정하였다(rs11175166의 염기서열: AGCAGCACTGTTGACAATATTTTGCA[C/T]AGTTAGTGGATACCATACCAGCAAT; 서열번호 1). 유전자형 정확도의 검사는 대상 검체의 5%를 차지하는 52개의 DNA 샘플 중, rs11175166을 포함하는 게놈 부위의 전장 서열에 의해 수행되었다.
rs11175166 유전자형에 사용되는 프라이머
SNP 프라이머 ID 서열
rs11175166 PCR 5'-ACGTTGGATGTGCCACTGCCAATATTGCTG-3' (서열번호 2)
5'-ACGTTGGATGTGAGCAGAGGATAAAGGAGC-3' (서열번호 3)
genotyping 5'-TGGTATGGTATCCACTAACT-3' (서열번호 4)
또한, 대조군에서 rs11175166의 빈도가 하디-바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)을 만족하는지 여부는 P 값이 0.01 이상을 갖는 것으로 판단하였고, HapAnalyzer 소프트웨어 버전.1.0.1(http://hap.ngri.go.kr/)을 이용하여 결정하였다.
그 결과, 대조군에서 rs11175166의 소수 대립유전자 (C)의 빈도는 0.371이었으며, 이는 HWE(chi square value=0.899, P-value=0.3433)을 만족하였다.
<실시예 4> rs11175166과 임상 인자와의 연관성 조사
본 발명자들은 뇌졸중 발병과 rs11175166에 대한 연관성을 알아보기 위해 다중 로지스틱 회귀분석(Multiple logistic regression)을 이용하여 분석하였다. 다중 로지스틱 회귀분석에 있어서, rs11175166과 뇌졸중 질환 상태 및 위험률(odds ratio, OR)은 95% 신뢰구간(confidence intervals, CI)으로 산출하였으며, 통계학적 유의성은 p<0.05로 판정하였다.
그 결과, 하기 표 3에서 보는 바와 같이, 성(sex) 및 연령(age)이 적용된 다중 회귀 모형에서 rs11175166의 소수 대립유전자 (C)가 뇌졸중 환자에서 유의적으로 더 낮은 빈도(OR[95% CI], 0.803[0.673-0.958], p=0.0147)를 나타내었다. 또한, 우성 모형(dominant model)에서 TC/CC 유전자형을 갖는 대상의 수가 뇌졸중 환자군에서 감소하였다(OR[95% CI], 0.758[0.591-0.971], p=0.0284).
대립유전자 빈도
대립 유전자 대조군 CI *OR [95% CI] P
T 587 (60.14) 852 (64.94) 0.803
[0.673-0.958]		 0.0147
C 389 (39.86) 460 (35.06)
유전자형 빈도
모형 유전자형 대조군 CI *OR [95% CI] p
*Do TT 179 (36.68) 281 (42.84) 0.758
[0.591-0.971]		 0.0284
TC+CC 309 (63.32) 375 (57.16)
*R TT+TC 408(83.61) 571 (87.04) 0.747
[0.532-1.049]		 0.0921
CC 80 (16.39) 85 (12.96)
데이타는 빈도(%)로 나타내었다.
*OR은 성(sex) 및 연령(age)을 적용한 후의 데이타이다.
*DO 및 R은 각각 우성(dominant) 및 열성(recessive)를 나타낸다.
통계적으로 유의성 있는 P 값을 굵은 글씨로 표시하였다.
또한, 하기 표 4에서 보는 바와 같이 rs11175166과 허혈성 뇌졸중의 유전적 연관성은 성(sex), 연령(age), 고혈압, 고지혈증, 허혈성 심질환, 흡연, 음주, 허리, TC, HDL 등의 다중 인자에 대한 적용 후에도 여전히 유효하였다.
대립유전자 빈도
대립 유전자 대조군 CI *OR [95% CI] P
T 587 (60.14) 852 (64.94) 0.759
[0.558-0.994]		 0.0448
C 389 (39.86) 460 (35.06)
유전자형 빈도
모형 유전자형 대조군 CI *OR [95% CI] p
*Do TT 179 (36.68) 281 (42.84) 0.758
[0.591-0.971]		 0.0419
TC+CC 309 (63.32) 375 (57.16)
*R TT+TC 408(83.61) 571 (87.04) 0.747
[0.532-1.049]		 0.2587
CC 80 (16.39) 85 (12.96)
데이타는 빈도(%)로 나타내었다.
*OR은 성(sex), 연령(age), 고혈압, 고지혈증, 허혈성 심질환, 흡연, 음주, 허리, TC 및 HDL을 적용한 후의 데이타이다.
*DO 및 R은 각각 우성(dominant) 및 열성(recessive)를 나타낸다.
통계적으로 유의성 있는 P 값을 굵은 글씨로 표시하였다.
이와 같이, 뇌졸중 발병과 rs11175166 다형성과의 연관성 분석 결과, TMEM5 5'-조절 부위의 단일염기다형성(rs11175166)의 대립유전자 및 유전자형 분포가 대조군과 허혈성 뇌졸중 환자 사이에 통계학적으로 유의적인 차이가 있음을 확인하였다. 따라서, TMEM5 rs11175166 유전자 단일염기다형성이 허혈성 뇌졸중에 대한 민감도에 영향을 주는 것을 알 수 있다.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 뇌졸중의 위험을 예측 또는 진단하는 칩 또는 키트 개발, 및 뇌졸중의 위험을 예측 또는 진단하는 방법을 개발하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (10)

  1. TMEM5(Transmembrane 5)의 5'-조절부위(5'-regulatory region)를 구성하는, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 rs11175166에 있어서, 27번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  2. 제 1항에 있어서, 형광물질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  3. 제 1항에 있어서, 반응 시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  4. TMEM5의 5'-조절부위를 구성하는, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 rs11175166에 있어서, 27번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드, 또는 그의 cDNA를 포함하는 마이크로어레이를 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  5. 제 4항에 있어서, 형광물질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  6. 제 4항에 있어서, 반응 시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  7. 1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 상기 청구항 제 1항의 폴리뉴클레오티드의 소수 대립유전자 C의 빈도를 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 소수 대립유전자 C의 빈도에 비해 낮은 피검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 단계 2)의 대립유전자의 빈도는 시퀀싱 분석, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립 유전자 혼성화 방법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 및 실시간 PCR 분석으로 구성된 군으로부터 선택되는 것에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측 방법.
  9. 1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 상기 청구항 제 1항의 폴리뉴클레오티드의 유전자형 TC+CC의 빈도를 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 유전자형 TC+CC의 빈도에 비해 낮은 피검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 단계 2)의 유전자형의 빈도는 시퀀싱 분석, 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR 연장 분석, 실시간 PCR 분석, FRET 분석 및 MALDI-TOF를 이용한 서열 분석(MALDI-TOF based mini-sequencing assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측 방법.
KR1020090117035A 2009-11-30 2009-11-30 뇌졸중 예측용 ｔｍｅｍ５ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법 KR101046341B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090117035A KR101046341B1 (ko) 2009-11-30 2009-11-30 뇌졸중 예측용 ｔｍｅｍ５ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090117035A KR101046341B1 (ko) 2009-11-30 2009-11-30 뇌졸중 예측용 ｔｍｅｍ５ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110060446A KR20110060446A (ko) 2011-06-08
KR101046341B1 true KR101046341B1 (ko) 2011-07-05

Family

ID=44395219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090117035A KR101046341B1 (ko) 2009-11-30 2009-11-30 뇌졸중 예측용 ｔｍｅｍ５ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101046341B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101523769B1 (ko) * 2013-11-13 2015-05-27 한국생명공학연구원 허혈성 뇌졸중 진단용 다중 snp 및 이의 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Brain Nerve. 2008 Nov;60(11):1339-46. *
Stroke. 2009 Mar;40(3):683-95. Epub 2009 Jan 8. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101523769B1 (ko) * 2013-11-13 2015-05-27 한국생명공학연구원 허혈성 뇌졸중 진단용 다중 snp 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110060446A (ko) 2011-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101723357B1 (ko) 민감성 피부 타입 유전자 다형성 마커 및 이의 용도
JP6997709B2 (ja) 全身性炎症反応症候群（ｓｉｒｓ）患者における合併症リスクを評価する方法
KR101646189B1 (ko) 내인성 아토피 피부염 진단용 마커 및 그의 용도
KR101046341B1 (ko) 뇌졸중 예측용 ｔｍｅｍ５ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법
KR100754398B1 (ko) 심혈관 질환 진단용 다중 ｓｎｐ, 그를 포함하는마이크로어레이 및 키트 및 그를 이용한 심혈관 질환 진단방법
KR101100437B1 (ko) 단일염기 다형을 포함하는 대장암과 관련된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 진단 키트 및 그를 이용한 대장암의 진단방법
KR101023194B1 (ko) 아토피 피부염 진단용 마커 및 그의 용도
KR102010899B1 (ko) 차세대서열분석 스크리닝을 통해 발굴한 단일염기다형성에 의한 염증성 장질환의 예측 또는 진단에 관한 정보 제공 방법
KR101902512B1 (ko) Esrrg 유전자 다형성을 이용한 당뇨병의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트
JP2007166962A (ja) アルツハイマー病の予測または診断の方法
KR101046342B1 (ko) 뇌졸중 예측용 ｌｉｐｇ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법
KR101046344B1 (ko) Ｓｎｔｇ２의 다형성 및 이의 일배체를 바이오마커로 이용한 뇌졸중 진단방법
KR100851971B1 (ko) 심근 경색에 관련된 유전자 다형성 및 그의 용도
KR102409336B1 (ko) 면역글로불린 a 신병증 및 혈관염 진단용 snp 마커 및 이를 이용한 진단 방법
KR101213173B1 (ko) 유방암과 연관된 단일염기다형성 및 그의 용도
KR100790871B1 (ko) 심근 경색에 관련된 유전자 다형성 및 그의 용도
KR102010897B1 (ko) 차세대서열분석 스크리닝을 통해 발굴한 단일염기다형성에 의한 염증성 장질환의 예측 또는 진단에 관한 정보 제공 방법
KR101912707B1 (ko) Pam 유전자 다형성을 이용한 고혈압의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트
WO2009070764A1 (en) Variation in the chi3l1 gene influences serum ykl-40 levels, asthma risk, and lung function
JP2007274986A (ja) ２型糖尿病に対する感受性の判定方法
KR20230036926A (ko) 비타민 d 결핍증 진단용 단일염기다형성 및 이의 용도
JP4649163B2 (ja) 気管支喘息の遺伝的素因検査方法
KR101346476B1 (ko) 천식 위험도와 연관된 단일염기다형성 마커 및 이의 용도
KR101402919B1 (ko) 중풍 분류용 뉴로펩타이드 ｙ 유전자 다형성 마커 및 이의 용도
KR101345909B1 (ko) 위암 감수성 진단용 ｅｒｋ 신호전달 관련 폴리뉴클레오티드

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140625

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150612

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160602

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170412

Year of fee payment: 7

LAPS Lapse due to unpaid annual fee