KR20230036926A

KR20230036926A - 비타민 d 결핍증 진단용 단일염기다형성 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230036926A
Application number: KR1020210120036A
Authority: KR
Inventors: 진희진
Original assignee: 렉스소프트 주식회사
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2023-03-15

Abstract

본 출원은 한국인의 유전적 요인에 의한 비타민 D 결핍증 위험성을 예측, 진단할 수 있는 단일염기다형성 마커, 이를 이용한 조성물, 키트, 마이크로어레이에 관한 것이다. 본 출원의 단일염기다형성 마커를 이용하면 비타민 D 결핍증에 대한 유전적 요인을 진단할 수 있는 장점이 있다.

Description

비타민 D 결핍증 진단용 단일염기다형성 및 이의 용도{SINFLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM FOR PREDICTING OF VITAMIN D DEFIECIENCY AND THE USE THEREOF}

본 발명은 비타민 D 결핍증을 진단하기 위한 단일염기다형성 마커에 관한 것이다.

비타민 D 결핍은 골연화증, 구루병, 뼈 미네랄화의 주요 원인이다. 또한, 비타민 D 결핍은 자가면역질환, 전염병, 심혈관질환, 당뇨병과 같은 다양한 비골격 질환과도 관련이 있다. 최근 연구에 따르면, 비타민 D 결핍증(25-하이드록시-비타민 D(이하, 25(OH)D) ≤20ng/mL)은 전세계 10억 인구에게 존재할 것으로 추정되었다. 미국인의 경우는 약 30%에서 비타민 D 결핍증 유병률을 보여주었다. 특히 아프리카계 미국 성인의 80%, 히스패닉 성인의 60%가 비타민 D 결핍증을 보였다. 동아시아인 중에서는 중국 성인의 32.1~75.2%, 일본 성인의 53.6%가 비타민 D 결핍증을 보이고 있다. 한국인의 경우도 비타민 D 결핍증 유병률은 남성 47.3%, 여성 64.5%에 달하고 있다.

비타민 D 결핍에 영향을 미치는 주요인자는 노화, 비만, 피부색, 식이 섭취, UVB 햇빛 노출, 지리적 위도 등이다. 그러나, 유전적 요인 또한 비타민 D 결핍에 영향을 미친다. 만약 비타민 D 결핍증에 대한 유전적 요인을 사전 분석하게 된다면, 비타민 D 결핍증 발병 고위험군을 위한 비타민 D 보충제 처방에 도움이 될 것이다.

그러나, 동아시아에서 비타민 D의 유전적 요인에 대해서는 알려진 것이 거의 없다. 또한, 한국인의 비타민 D 결핍증의 높은 유병율을 고려할 때, 환자 개개인의 비타민 D 결핍증에 대한 유전적 요인을 파악할 필요가 있다.

따라서, 민감도 및 정확도가 우수하고, 유전적 분석을 통해 비타민 D 결핍증에 대한 유전적 요인을 진단하기 위한 유전적 인자와 이를 이용한 조성물, 키트, 마이크로어레이, 및 이를 이용한 진단 방법을 개발할 필요가 있다.

한국 등록특허공보 제10-1685031호(2016.12.09 공고)

본 출원이 해결하고자 하는 과제는 단일염기다형성 마커를 이용하여 비타민 D 결핍증의 유전적 요인을 진단하는 조성물, 이를 이용하는 키트 및 이를 이용하는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는 단일염기다형성의 유전자형을 확인하여 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 일 실시예는 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 G인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단용 조성물을 제공한다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 서열번호 1의 SNP는 ACTE1P 유전자에 포함될 수 있다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 서열번호 2와 서열번호 3의 SNP는 GC 유전자에 포함될 수 있다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 서열번호 4의 SNP는 PDE3B 유전자에 포함된 것이고, 상기 서열번호 5의 SNP는 NADSYN1 유전자에 포함될 수 있다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 서열번호 6의 SNP는 GC 유전자에 포함될 수 있다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 비타민 D 결핍증은, 아시아인에게 발생하는 것일 수 있고, 비타민 D와 관련한 유전자의 단일염기다형성에 의하여 진행될 수 있다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는, 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 출원의 일 실시예는 상기 조성물을 포함하는 비타민 D 결핍증의 진단용 키트를 제공한다.

본 출원의 일 실시예는 상기 조성물을 포함하는 비타민 D 결핍증의 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 출원의 일 실시예는 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전자형으로 비타민 D 결핍증을 진단하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단 방법을 제공한다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 비타민 D 결핍증을 예측하는 단계는, 상기 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 G, 상기 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 G, 상기 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 상기 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 상기 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 또는 상기 서열번호 6의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T 인 경우, 비타민 D 결핍증에 걸릴 위험이 높은 것으로 예측할 수 있다.

본 출원의 일 실시예는 인간 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 생물학적 샘플 내에 서열번호 1의 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 26번째 뉴클레오티드에서 SNP가 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 를 포함하는, 비타민 D 결핍증을 가진 인간 대상체에서 SNP 유전자 서열을 검출하는 방법을 제공한다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 검출하는 단계는, 서열번호 1의 SNP에서 G 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 2의 SNP에서 G 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하거나, 서열번호 3의 SNP에서 C 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 4의 SNP에서 C 대립유전자 또는 G 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 5의 SNP에서 C 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하는거나, 상기 서열번호 6의 SNP에서 G 대립유전자 또는 T 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증을 가진 인간 대상체에서 SNP 유전자 서열을 검출하는 것을 포함할 수 있다.

본 출원의 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단용 조성물, 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단용 키트, 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단용 마이크로어레이 및 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단 정보를 제공하는 방법에 따르면, 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 단일염기다형성(SNP)을 한국인 또는 아시아인에서 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단 마커로서 이용할 수 있다.

도 1은 25-하이드록시-비타민 D 농도와 관련된 SNP의 전장유전체연관 메타분석 결과 나타나는 맨해튼 플롯(A)과 Q-Q 플롯(B)을 나타낸 것이다.
도 2는 혈청 25-하이드록시-비타민 D 관련 특성과 유의미하게 연관된 전장유전체 감수성 유전자 위치(genome-wide susceptibility loci) 유전자 구조(genetic architecture)를 나타낸 것이다.
도 3은 actin epsilon 1 유사 유전자(ACTE1P)의 rs12803256 SNP가 혈청 25-하이드록시-비타민 D 농도에 미치는 생물학적인 영향을 도식화한 것이다.
도 4는 혈청 25-하이드록시-비타민D 농도에 대해 ACTE1P 유전자의 rs12803256 SNP가 미치는 영향력을 네트워크 분석한 것이다.
도 5는 25-하이드록시-비타민 D 농도와 관련된 SNP 후보들의 전장 유전체 연관 메가분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6(A)는 25-하이드록시-비타민 D 농도에 대한 전장유전체연관 메가분석 결과를 나타내는 맨해튼 플롯과 Q-Q 플롯이며, 도 6(B)는 25-하이드록시-비타민 D 농도에 대한 전장유전체연관 메타분석 및 로지스틱 회귀분석 결과이다.
도 7은 비타민 D 결핍에 대한 SNP 기반 유전성 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

이하의 특정한 기능적 설명들은 단지 본 발명의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위하여 예시된 것으로, 본 발명의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 발명의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들은 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 출원에서 용어 "다형성(polymorphism)"은 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미하며, '다형성부위(polymorphic site)'란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 '단일염기다형성', 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.

본 출원에서 용어 "단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)"은 개인과 개인간의 DNA에 존재하는 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차이로 DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태(약1개/1kb)를 말한다. SNP 위치는 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 뉴클레오티드를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.

본 출원에서 용어 "대상", "환자", "개체", 등등은 제한적이지 않으며, 일반적으로 호환된다. 즉, "환자"로 설명된 개체는 반드시 주어진 질환을 가지고 있지 않고, 단순히 의학적 조언만을 찾고 있을 수 있다.

본 출원에서 대조(control)", "대조 시료", "표준 대조", 또는 "대조 값"은 테스트 시료와 비교를 목적으로 기준으로 삼을 수 있는 시료, 보통 공지의 기준을 말한다. 예를 들면, 테스트 시료는 주어진 비타민 D 결핍증에 걸린 것으로 의심되는 환자에서 취할 수 있으며, 공지의 비타민 D 결핍증 환자, 공지의 다형성 운반체, 또는 공지의 정상 (비-질환) 개체로부터 취한 시료와 비교될 수 있다. 대조는 유사한 개체들의 집단, 가령, 유사한 의학적 배경, 동일한 나이 및 체중 등등을 가진 비타민 D 결핍증 환자 또는 건강한 개체들의 집단에서 모집된 평균 값을 또한 나타낼 수 있다. 대조 값은 가령, 조기에-획득된 시료, 질환이 있기 전, 또는 치료 전, 동일한 개체로부터 또한 획득될 수 있다. 당업자는 임의의 수의 매개변수들의 평가를 위하여 대조가 기획될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

본 출원에서 용어 핵산"은 단일-가닥으로 된 또는 이중-가닥으로 된 형태 및 이의 보체에서 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체를 지칭한다. "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 본 명세서에서 이의 문법적인 등가물은 최소한 2개의 뉴클레오티드가 공유적으로 연결된 것을 의미한다. 올리고뉴클레오티드의 길이는 전형적으로 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 최대 약 100개 뉴클레오티드가 된다. 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 가령, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000개, 등등의 더 긴 것들을 포함하여 임의의 길이의 폴리머들이다. 용어 "뉴클레오티드"는 폴리뉴클레오티드의 단일 단위, 가령, 단량체를 일반적으로 지칭한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 이의 변형된 형태들이 될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 유전자, 유전자 단편, cDNA, 단리된 DNA, mRNA, tRNA, rRNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 플라스미드, 및 벡터들을 포함한다. 자연적으로 또는 중재에 의해 변형된 핵산 중합체가 이 정의 안에 포함된다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, "유전적 변종(variant)"은 돌연변이, 단일 염기다형성 (SNP), 결손변종, 미스센스(missense) 변종, 삽입 변종, 역전(inversion), 또는 복사(copy) 수 변종을 지칭한다. 유전적 변종은 생물표지자로 이용될 수 있으며, 그리고 증가된 또는 감소된 발현 수준, 또는 차등적 변형을 초래할 수 있다.

본 출원에서 용어 "유전자(gene)"는 각각의 형질을 만드는 단위를 의미하고, 형질의 단위에 상응하는 게놈 서열의 영역일 수 있다. 유전자는 조절 영역, 전사 영역, 또는 기타 기능적 서열 영역을 포함할 수 있다. 기능적 서열 영역은 전사되지 않는 인트론(intron)일 수 있다.

상기 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티의 위치는 단일염기다형성 위치일 수 있다.

상기 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 서열은 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다.

본 명세서에서 서열번호 1 내지 6의 염기서열의 각 26번째 염기로 표시되는 본 발명의 SNP는 각각 rs12803256, rs11723621, rs7041, rs11023332, rs3831470로 기재한다. 아래 표 1은 본 출원에서 제공하는 SNP 마커에 대한 NCBI의 refSNP ID와 해당 SNP의 서열 및 위치를 나타낸 것이다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통 상의 지식을 가진 자라면 상기 refSNP ID를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다. 다만 NCBI에 등록되어 있는 상기 refSNP ID의 구체적인 서열은 새롭게 보고되는 연구 결과에 따라 일부가 변경될 수 있으며, 이러한 변경 역시 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

NCBI ref SNP ID	서열	서열 번호
rs12803256	GCACACCCGCATATGATTCTCCAGA[G/A]GGCAGCACCTCTTGGCGTGATTCTC	1
rs11723621	ACAACTTCTATGTAAGGTGATTTTA[G/A]GCAACTTGGTATGAAAAGAAAGAAC	2
rs7041	TGAGTTTATGGAACAGCAGTTGGAG[C/A]TCAGGCAATTTTGCTTTTAGTCGCT	3
rs11023332	ACTTAGCTGGAGGGGAGTGGAGAGG[C/G]AAGTCACTGGAGAGTGTTGAACAAA	4
rs3831470	GCAAGCCCTCCCTGTTTCTCATTTC[C/A]GTGTATACAGGTGTATACAGGTGTA	5
rs4588	AGAGGAGGTGAGTTTATGGAACAGC[T/G]AGTTGGAGGCAAAGTCTGAGTGCTT	6

상기 rs12803256 SNP(서열번호 1의 26번째 염기)에서의 "G"염기, rs11723621 SNP(서열번호 2의 26번째 염기)에서의 "G"염기, rs7041 SNP(서열번호 3의 26번째 염기)에서의 "C"염기, rs11023332 SNP(서열번호 4의 26번째 염기)에서의 "C"염기, rs3831470 SNP(서열번호 5의 26번째 염기)에서의 "C"염기, rs4588 SNP(서열번호 6의 26번째 염기)에서의 "T"염기의 빈도는 비타민 D 결핍증을 보이는 사람에게 높게 나타나므로 상기 염기들이 존재하면 비타민 D 결핍증에 걸릴 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 출원의 일 실시예는 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 G인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함할 수 있다.

상기 조성물은, 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 G인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 서열번호 1 내지 5의 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함할 수도 있다.

본 발명은 상기 서열번호 1 내지 5에서 각 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이 중가닥의 gDNA(genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다.

본 출원에서 용어 "대립유전자(allele)"는 쌍이 될 수 있는 대립형질의 유전자를 말한다. 상기 대립유전자는 동일한 위치에 존재하는 단일 뉴클레오티드일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 또는 40개 이상, 100개 이하, 80개 이하, 60개 이하의 연속 뉴클레오티드와 동일하거나 이에 상보적일 수 있다.

상기 프로브(probe)는 표적 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프로브는 예를 들어 표적 핵산 서열과 같은 특이적인 핵산 서열의 상보적인 영역을 갖는 서열-특이적인 방법으로 혼성화되도록 고안된 특이적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 프로브는 DNA, RNA, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고, 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 검출가능한 표지는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 프로브에 결합된 형광 색소 화합물일 수 있고, 예를 들어 형광 공여체 및 형광 수용체의 FRET(Forter Resonance Energy Transfer) 쌍 일 수 있다.

상기 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 하나의 대립유전자를 포함한 핵산 단편에는 혼성화하지만, 다른 대립유전자를 포함한 핵산 단편에는 혼성화하지 않을 수 있다.

이러한 프로브는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네 이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오 에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린 (rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'- Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것 이라면 모두 사용할 수 있다.

상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.

용어 "프로브" 또는 "프라이머"는 시료에 특이적으로 혼성화되는 것이 탐지될 수 있는 하나 또는 그 이상의 핵산 단편들을 지칭한다. 프로브 또는 프라이머는 이용되는 특정 기술에 따라 임의의 길이의 것이 될 수 있다.

예를 들면, PCR 프라이머의 길이는 일반적으로 10 내지 40개의 뉴클레오티드이며, 가령, 서든 블랏을 위한 핵산 프로브는 길이가 백개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머(primer)는 중합효소에 의한 중합 반응에서 중합 개시점을 제공하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로, 상기 프라이머는 핵산 증폭 반응에 사용되는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 상기 표적서열에 상보적인 영역과 혼성화된다. 프로브 및 프라이머는 고체 표면 (가령, 니트로셀룰로오스, 유리, 규석, 융합된 규석 슬라이드)상에 고정되거나, 어레이 안에 있을 수도 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화 가능한"이란 상보적 서열과 Watson-Crick 결합을 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 당업자는 혼성화를 위하여 상보성 백분율은 폴리뉴클레오티드의 길이, 상보적 영역의 길이(가령, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 이상의 염기), 그리고 조건의 엄격성(stringency)에 따라 반드시 100%일 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 (가령, 프라이머 또는 프로브)는 상보적 영역의 범위에 걸쳐서 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가지는 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 유전적 변종을 탐지하는 내용에 있어서, 용인되는 상보성 백분율 또는 미스매취(mismatches) 수는 탐지에 이용되는 기술에 따라 가변적일 것이다

본 출원에서 용어 "증폭 (amplification)"은 표적 서열 또는 그의 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것을 나타낸다. 상기 핵산 증폭 반응은 당업계에 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 핵산의 증폭은 증폭 동안 복수의 사이클을 필요로 하는 방법 또는 단일 온도에서 수행되는 방법을 포함한다. 순환방법(cycling techniques)의 예는 열 순환을 필요로 하는 방법을 포함한다. 열 순환을 필요로 하는 방법은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 포함한다. PCR은 당업계에 알려져 있다. 등온 증폭 방법은 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification; SDA), 헬리카제 의존적 증폭(helicase dependant amplification; HDA), 엑소뉴클레아제 의존적 증폭(exonuclease dependant amplification), 리콤비나제 중합효소증폭(recombinase polymerase amplification; RPA), 루프 매개된 증폭(loop mediated amplification; LAMP), 핵산 기반 증폭(nucleic acid based amplification; NASBA 및 TMA), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 프라이머는 선택되는 증폭 방법에 따라 1개, 또는 2개 이상의 세트로 포함될 수 있다. 상기 프라이머는 대립유전자 특이적 프라이머일 수 있다. 증폭에 의하여 산물이 증폭되면, 특정 대립유전자가 존재하는 것일 수 있다.

용어 "진단" 또는 예측이란 대상에서 비타민 D 결핍증이 존재할 상대적 가능성을 말한다. 유사하게, 용어 "예후"는 대상에서 미래 특정 결과가 발생하는 상대적 가능성을 말한다. 예를 들면, 본 발명의 문맥에서, 예후는 개체에서 비타민 D 결핍증의 발생, 또는 질환의 심각성 (가령, 증상의 심각성, 기능 감퇴의 속도, 생존 등등)의 발달 가능성을 지칭할 것이다. 상기 용어들은 의학적 진단 분야에서 당업자가 인지할 수 있는 바와 같이, 절대적인 것으로 의도되지는 않는다.

본 출원의 일 실시예는 상기 조성물을 포함하는 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는, 상기 프로브 또는 프라이머; 및 중합 반응에 필요한 시약을 포함할 수 있다.

상기 시약은 dNTP, 중합효소, 완충액, 지시약, 또는 그 조합을 포함할 수 있다.

상기 키트는 PCR 키트, DNA 분석용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 비타민 D 결핍증의 유전적 요인을 예측 또는 진단할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클 레오티드에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.

본 출원의 일 실시예는 상기 조성물을 포함하는 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 기판에 상기 폴리뉴클레오티드가 고정된 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 출원의 일 실시예는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전자형으로 비타민 D 결핍증을 진단하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단 방법을 제공한다.

본 출원의 일 실시예는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전자형으로 비타민 D 결핍증의 유전적 요인을 진단하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증의 유전적 요인 진단 방법을 제공한다.

상기 비타민 D 결핍증의 유전적 요인을 진단하는 단계는, 상기 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 G, 상기 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 G, 상기 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 상기 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 또는 상기 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 또는 상기 서열번호 6의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T인 경우, 비타민 D 결핍증 위험이 높은 것으로 예측할 수 있다.

상기 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계를 포함한다.

상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 영장류일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 마우스, 소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 개체로부터 유래된 신선한 또는 보존된 기관 또는 조직 시료 또는 생검(biopsy)과 같은 고체 조직(solid tissue); 혈액 또는 혈액 구성성분; 양수(amniotic fluid), 복수(peritoneal fluid), 또는 세포간질액(interstitial fluid)와 같은 체액(bodily fluid); 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정제(fixatives), 영양성분(nutrients), 항생제 등과 같은 생물학적 물질과 자연적으로 혼합되어 있지 않은 화합물을 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자의 전사체 양은 대조군에 비하여 감소할 수 있다. 대조군은 비타민 D 결핍 소견을 보이지 않는 정상인으로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 핵산 시료는 핵산을 포함한 시료일 수 있다. 핵산은 상기 생물학적 시료로부터 분리 또는 정제된 핵산일수 있다. 생물학적 시료로부터 핵산을 분리 또는 정제하는 방법은 당업계에 알려진 것일 수 있다.

상기 방법은 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1 내지 5의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 단계을 포함한다.

용어 "유전자형(genotype)"은 유전적 조성을 말하고, 대립유전자 또는 대립유전자의 존재 상태일 수 있다.

상기 유전자형의 결정은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 유전자형의 결정은 예를 들어, 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립유전자 특이적 증폭 방법(allelespecific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis), 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism), 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.

본 출원의 일 실시예는 인간 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 생물학적 샘플 내에 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드, 및 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 SNP가 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 를 포함하며, 상기 검출은, 상기 서열번호 1의 SNP에서 G 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 비타민 D 결핍증 소견을 보이는 인간 대상체에서 SNP 유전자 서열을 검출하는 방법을 제공한다.

본 출원의 일 실시예는 인간 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 생물학적 샘플 내에 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 SNP가 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 를 포함하며, 상기 검출은, 상기 서열번호 1의 SNP에서 G 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 2의 SNP에서 G 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 3의 SNP에서 C 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 4의 SNP에서 C 대립유전자 또는 G 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 5의 SNP에서 C 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 비타민 D 결핍증 소견을 보이는 인간 대상체에서 SNP 유전자 서열을 검출하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 실시예 및 비교예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 비교예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

대상자의 선별

대상자는 총 3개의 코호트(서울대학교병원 헬스케어시스템 강남센터의 GENIE 코호트에서 6,579명, 국립보건연구원 유전체센터의 한국인유전체역학조사사업 KARE 코호트에서 5,493명, 중앙보훈병원 VHSMC 코호트에서 570명)에서 수집되었다. 대상자 수집에 있어서 비타민 D 섭취 이력, 비타민 D 수준에 영향을 미치는 만성 질환의 존재, 비타민 D 수치를 변화시키는 의약품(경련방지제, 글루코코티코이드, 면역억제제, HIV치료제)의 사용 이력이 있는 사람 및 외과 수술 이력이 있는 환자는 대상자 군에서 제외되었다. 중앙보훈병원 VHSMC 코호트는 병원 기반, 노인 기반 코호트로서 건강한 노인 환자만 대상자에 포함시켰다. 상기 각 코호트 연구는 각 기관의 기관윤리위원회(IRB)의 승인을 받아 헬싱키 선언에 따라 수행되었다. 한국국립바이오뱅크(KBN-2019-054)와 VHS바이오뱅크(VBP-2020-02) 위원회는 이 연구를 위한 생물자원 사용을 승인했다.

연구 대상의 평균 연령은 55.81±9.41세였으며, 피험자의 46.75%는 남성이었다(표 2). 평균 혈청 25-하이드록시-비타민 D 농도는 18.65±7.68 ng/mL였고, 전체 코호트에서 비타민 D 결핍 환자(<20 ng/mL)의 비율은 62.31%, 중증 비타민 D 결핍 환자(<10 ng/mL)의 비율은 9.92%였다. 노인 환자로 구성된 VHSMC 코호트는 다른 코호트에 비해 혈청 25-하이드록시-비타민 D 농도 수준이 높았다. KARE 코호트에서 22명의 실험 대상자는 만성 질환의 존재를 보여주었다. 대상자 수의 65%는 여름에서 가을에 혈액 샘플이 채취되었고, 대상자 중 6.8%가 비타민 D 보충제를 복용하고 있었다. 연구 모집단의 기준선 특성(baseline characteristics)을 하기 표 2에 나타내었다.

Participant characteristic	GENIE Cohort (N = 3185)	KARE cohort (N = 3942)	VHSMC cohort (N = 463)	Total (N = 7590)
Age (years)	52.36±8.95	57.18±8.34	67.81±8.22	55.81±9.41
Number of male participants (%)	1710 (53.69)	1888 (47.89)	179 (38.66)	3777 (49.76)
Serum vitamin D level (ng/mL)	19.64±7.25	17.25±7.09	23.85±11.25	18.65±7.68
Participant no. with vitamin D level <20 ng/mL (%)	1824 (57.27)	2710 (68.75)	196 (42.33)	4730 (62.32)
Participant no. with vitamin D level <10 ng/mL (%)	163 (5.12)	565 (14.33)	25 (5.40)	753 (9.92)
Season of blood draw n (%)
Spring (Mar-May)	625 (19.62)	1092 (27.70)	0 (0.00)	1717 (22.62)
Summer (Jun-Aug)	1014 (31.84)	1271 (32.24)	172 (37.15)	2457 (32.37)
Fall (Sep-Nov)	1001 (31.43)	1214 (30.80)	251 (54.21)	2466 (32.49)
Winter (Dec-Feb)	545(17.11)	365 (9.26)	40 (8.64)	950 (12.52)
Presence of chronic disease	0 (0.00)	22 (0.56)	0 (0.00)	22 (0.29)
Vitamin D supplement n (%)	218 (6.84)	283 (7.18)	15 (3.24)	516 (6.80)

생화학 측정

혈청 25-하이드록시-비타민 D 농도 측정은 GENIE 코호트에서는 방사면역측정법(radioimmunology assay, DiaSorin Inc, Stillwater, MN)으로 측정되었으며, KARE 및 VHSMC 코호트에서는 Architect i2000 SR(애보트, 싱가포르)을 사용한 화학발광 미세입자 면역측정법(chemiluminescent microparticle immunoassay, CMIA)에 의해 측정되었다. 혈청 25-하이드록시-비타민 D 농도가 20 ng/mL 이하 일 경우 비타민 D 결핍증, 10 ng/mL 이하 일 경우 심각한 비타민 D 결핍증으로 정의되었다.

유전형 분석

정맥혈액 샘플에서 분리된 100 ng의 유전체 DNA는 한국보건연구원(24)이 설계한 Korea biobank array(KoreanChip), 아피메트릭스 버전 1.0 또는 1.1(Affymetrix, Santa Clara, CA)를 통해 분석되었다. 유전자형은 배치 효과(batch effect)를 제거하기 위해 K-medoid 알고리즘으로 호출되었으며, 데이터 분석 및 품질관리를 위해 PLINK 프로그램(버전 1.9, Boston, MA)과 ONETOOL이 사용되었다. 다음 세 가지 기준에 적합하지 않은 샘플은 제외되었다:(1) 성별 불일치 (0.2 < 동형접합성 chr X < 0.8) 또는 (2) 누락된 유전자형 비율 0.05 이상, (3) 이형접합성의 p값< 1×10^-5. 또한, 다음 3가지 기준에 미치지 못한 SNP들은 제외되었다:(1) Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)(p < 1×10^-5), (2) 중복 SNPs, (3) 3개의 코호트 간의 MAF와 HWE의 높은 이질성.

통계분석

우리는 GCTA 소프트웨어로 비타민 D 결핍증의 유병률에 따라 SNP 유전성을 계산했다. 복제 분석(replication analysis)을 위해 국립인간게놈연구소-유럽생물정보학연구소(NHGRI-EBI) GWAS 카탈로그(https://www.ebi.ac.uk/gwas/home, 2020년 12월)와 CLinVar(clinically relevant variant https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) 데이터베이스)에서 SNP를 검색했다. DNA 서열의 방향과 베타값(beta value)의 방향이 일치하고 p-값이 0.05 미만일 경우, 결과는 통계적으로 유의미한 것으로 정의되었다. 상기 희귀변이연관분석(rare variant association analysis)에는 SNP-Set (Sequence) Kernel Association Test(이하 SKAT)와 Burden test(FARVAT을 사용)가 포함되었다. SNP와 인근 유전자 발현 수준 간의 연관성을 조사하기 위해 GTEx(Genotype-Tissue Expression; https://gtexportal.org)프로젝트 데이터 세트를 사용하여 expression quantitative trait locus (eQTL) 분석을 수행하였다. 또한, STRING v.11 온라인 플랫폼(https://string-db.org/)으로 유전자 상호작용 네트워크를 구축하여 관련 유전자에 주석을 달았다.

전장 유전체 연관 분석: 메타분석 및 메가분석

아래 표 3은 25-하이드록시-비타민 D 농도와 관련된 SNP 후보들의 전장 유전체 연관 메타분석 및 메가분석 결과를 나타낸 것이다. 도 1은 25-하이드록시-비타민 D 농도와 관련된 SNP의 전장유전체연관 메타분석 결과 나타나는 맨해튼 플롯(A)과 Q-Q 플롯(B)이다. 도 1(A) 맨해튼 플롯의 X축은 염색체 위치, Y축은 Log₁₀ p값을 나타내며, 도 1(B) Q-Q 플롯의 X축은 예측된 log₁₀ p값, Y축은 관찰된 log₁₀ p값을 나타낸다. 표 3의 SNP 중 rs11723621 (GC유전자, p = 2.14×10^-24, p = 1.08×10^-32, for mega-analysis and meta-analysis, respectively), rs7041 (GC유전자, p = 1.72×10^-9, p = 1.79×10^-11, for mega-analysis and meta-analysis, respectively), rs11023332 (PDE3B, p = 3.43×10^-11, p = 3.2×10^-11, for mega-analysis and meta-analysis, respectively), rs12803256 (ACTE1P, p = 4.02×10^-8, p = 7.68×10^-11, for mega-analysis and meta-analysis, respectively), 및 rs3831470 (NADSYN1, p = 2.6×10^-9 in meta-analysis)가 비타민 D 농도와 상당한 관련이 있는 것으로 나타났다.

도 5는 25-하이드록시-비타민 D 농도와 관련된 SNP 후보들의 전장 유전체 연관 메가분석 결과를 나타낸다. 도 5에서 rs3831470 (NADSYN1)은 메가 분석 (p = 9.68×10^-7)에서 약간의 유의미한 연관성을 보였다(도 5). rs78359207(NPFFR2)과 rs55715230(PACRG)은 메가분석과 메타분석에서 모두 암시적인 SNP로 나타났다(표 3).

도 6(A)는 25-하이드록시-비타민 D 농도에 대한 전장유전체연관 메가분석 결과를 나타내는 맨해튼 플롯과 Q-Q 플롯이며, 도 6(B)는 25-하이드록시-비타민 D 농도에 대한 전장유전체연관 메타분석 및 로지스틱 회귀분석 결과이다. 도 6(A)에서 비타민 D 농도가 10 ng/mL 이하일 때는 rs4588 p값이 5.33×10^-10으로, 20 ng/mL 이하일 때는 rs4588 p값이 0.00×10^-30으로 나타났다. 도 6(B)에서는 비타민 D 농도가 10 ng/mL 이하 일 때, rs4588의 p값과 Z 스코어가 각각 3.2×10^-10, 6.29를 나타냈고, 비타민 D 농도가 20 ng/mL 이하일 때는 rs4588의 p값과 Z 스코어가 1.9×10^-19, 9.03으로 나타났다. 즉, 비타민 D 농도가 10 ng/mL 이하, 20 ng/mL 이하일 때, rs4588(GC)만이 메가분석과 메타분석에서 유의한 연관성을 보였다(도 6).

번호	CHR	SNPs	BP	Alt /Ref	MAF_all	MAF gnomAD-EA	HWE	Rsq	Genotype	Location	Gene	Mega-analysis			Meta-analysis
번호	CHR	SNPs	BP	Alt /Ref	MAF_all	MAF gnomAD-EA	HWE	Rsq	Genotype	Location		Beta	STAT	P-value	Z-score*	P-value*
1	4	rs11723621	71749645	G/A	0.29	0.2593	0.67	0.96	Imputed	intron_variant	GC	1.28	10.23	2.14E-24	11.90	1.08E-32
2	11	rs11023332	14762564	C/G	0.421	0.3566	0.49	1.00	Genotyped	intron_variant	PDE3B	0.77	6.64	3.43E-11	6.63	3.2E-11
3	4	rs7041	71752617	C/A	0.261	0.2872	1.00	0.99	Genotyped	missense_variant, coding_sequence_variant, intron_variant	GC	0.79	6.03	1.72E-09	6.72	1.79E-11
4	11	rs12803256	71421822	G/A	0.372	0.3885	0.12	0.95	Imputed	non_coding_transcript_variant	ACTE1P	0.65	5.50	4.02E-08	6.51	7.68E-11
5	11	rs3831470	71454898	C/A	0.387	-	0.21	0.96	Imputed	intron_variant	NADSYN1	0.58	4.90	9.68E-07	5.84	2.6E-09
6	4	rs78359207	72032699	C/T	0.319	0.2973	0.84	0.96	Imputed	intron_variant,genic_upstream_transcript_variant	NPFFR2	0.59	4.78	1.74E-06	-4.77	1.9E-06
7	6	rs55715230	162756538	A/C	0.213	0.1849	0.66	0.97	Imputed	intron_variant,genic_upstream_transcript_variant	PACRG	0.66	4.69	2.71E-06	4.62	3.9E-06
8	2	rs306141	6458749	C/T	0.274	0.3318	0.83	0.98	Genotyped	-	-	0.60	4.66	3.19E-06	-4.57	4.9E-06
9	8	rs17382663	128090786	T/C	0.091	0.1418	0.50	0.99	Genotyped	intron_variant	PVT1	-0.91	-4.55	5.32E-06	-3.95	7.9E-05
10	14	rs58788626	70865550	T/C	0.106	0.09395	0.72	0.99	Genotyped	-	-	-0.84	-4.50	7.03E-06	-4.25	2.2E-05
	*: Inverse variance-based meta-analysis

CHR: chromosome,

SNP: single nucleotide polymorphisms,

BP: base position,

Rsq: R-squared,

MAF: minor allele frequency,

gnomAD-EA: The Genome Aggregation Database-East Asian,

HWE: Hardy-Weinberg Equilibrium,

Ref: reference allele,

Alt: alterative allele.

ACTE1P, actin epsilon 1;

GC, group specific component;

NADSYN1, glutamine-dependent NAD(+) synthetase;

NPFFR2, neuropeptide FF receptor 2;

PACRG, parking coregulated;

PDE3B, phosphodiesterase 3B;

PVT1, plasmacytoma variant translocation 1.

Regional plot 및 SNP 기반 유전성 분석

도 2는 혈청 25-하이드록시-비타민 D 관련 특성과 유의미하게 연관된 전장유전체 감수성 유전자 위치(genome-wide susceptibility loci) 유전자 구조(genetic architecture)를 나타낸다. 도 2(A)에서 선두 SNP(lead SNP)는 빨간색 또는 파란색 다이아몬드로 표시되었고, 선두 SNP의 연쇄불평형(Linkage disequilibrium, 이하 LD) 정도는 색깔의 농도로 나타냈다. rs11723621 SNP의 regional plot은 빨간점으로 rs7041 SNP의 regional plot은 파란점으로 나타냈다. GC 유전자에서 regional plot은 rs11723621(BP chr4:71749645, 빨간색 점)과 rs7041(BP chr4:71752617, 파란색 점)에서 각각 다르게 배치되었다(도 2(A)).

도 2(B), 도 2(C) 및 도 2(D)는 각각 rs11023332 (PDE3B), rs12803256 (ACTE1P) 및 rs3831470 (NADSYN1)의 regional plot을 나타낸다. 도면에서 보라색 다이아몬드는 선두 SNP를 나타내고, 각 SNP는 염색체 위치를 따라 원으로 표시되며, 선두 SNP와 다른 SNP 사이의 LD값은 낮을수록 파란색, 높을수록 빨간색을 나타낸다. 회색 원은 LD값이 불분명한 것을 나타낸다. 각각의 다른 SNP들은 각기 다른 색으로 표시되었으며, 이는 아시아 샘플의 1000개 게놈을 사용하여 계산한 상위 관련 SNP와의 LD(r2)을 나타낸다. 파란색 선과 우측 y축은 동아시아 검체 1000개 유전체의 재조합 속도(recombination rate)를 나타내고, x축은 NCBI 인간 게놈 빌드 38 좌표를 기준으로 SNP와 유전자의 염색체 위치를 나타낸다. PDE3B(rs11023332)에 대한 regional plot은 LD 위치와의 연관성을 보여주었다(도 2(B)). ACTE1P(rs12803256)와 NADSYN1(rs3831470)에 대한 regional association plot은 연쇄불평형(LD)에 있어 동아시아 다른 지역과의 강한 연관성을 보여준다(도 2(C) 및 도 2(D)).

도면에 사용된 약어의 설명은 아래와 같다.

ACTE1P, actin epsilon 1;

ALG1L9P, asparagine-linked glycosylation 1-like 9, pseudogene;

CALCA, calcitonin related polypeptide alpha;

CALCB, calcitonin related polypeptide beta;

COPB1, coat complex subunit beta 1;

CYP2R1, cytochrome P450 2R1;

DHCR7, 7-dehydrocholesterol reductase;

DEFB1068;

KRTAP5-7, keratin associated protein 5-7;

KRTAP5-8, keratin associated protein 5-8;

KRTAP5-9, keratin associated protein 5-9;

KRTAP5-10, keratin associated protein 5-10;

KRTAP5-11, keratin associated protein 5-11;

GC, group specific component;

INSC, inscuteable spindle orientation adaptor protein;

FAM86C1, family with sequence similarity 86 Member C1,

pseudogene;

FLJ42102, uncharacterized LOC399923;

MIR6754, microRNA 6754;

NADSYN1, glutamine-dependent NAD(+) synthetase;

NPFFR2, neuropeptide FF receptor 2;

PSMA1, proteasome 20S subunit alpha 1;

PDE3B, phosphodiesterase 3B;

RRAS2, RAS related protein 2;

SHANK2, SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 2;

SLC4A4, solute carrier family 4 member 4;

ZNF 705E, zinc finger protein 705E.

비타민 D 결핍에 대한 SNP 기반 유전성 분석 결과, 심각한 비타민 D 결핍증(< 10 ng/mL)의 유병률이 8.0%일 때 SNP 기반 유전성 추정치(h² _SNP)가 5.37%였고, 비타민 D 결핍증(< 20 ng/mL)일 때는 h² _SNP가 8.59%였다. h²SNP는 한계 유의성이 있는 7.23%였다(p = 0.0611)(도 7).

복제 분석 및 희귀모델

복제 분석(replication analysis)결과, 아래 표 4에서의 27개 SNP가 비타민 D 농도와 연관되어 중요한 SNP들로 밝혀졌다. 혈청 25-하이드록시비타민 D 농도 관련 전장유전체연관분석에서 확인된 단일 뉴클레오티드 다형성을 하기의 표 4에 나타내었다.

표 4의 27개의 SNP는 GWAS 카탈로그와 ClinVar 데이터베이스에서 선택된 407개 SNP 후보군에서 선택된 것들이다. 상기 27개의 SNP는 GC , PDE3B , CYP2R1 , NADSYN1, FLJ42102 , SHANK2 , RRAS2 , COPB1 , NPFFR2 , CPS1 , CYP24A1 , 및 SEC23A.유전자에 위치한 것들이다.

번호	CHR	SNPs	Ref	Alt	BP	Location	Gene	Mega-analysis			Meta-analysis
번호	CHR	SNPs	Ref	Alt	BP	Location	Gene	Beta	SE	P-value	Beta	SE	P-value
1	4	rs11723621	G	A	71749645	intronic	GC	-1.2797	0.1251	2.14E-24	1.401	0.1177	1.08E-32
2	4	rs4588	T	G	71752606	exonic	GC	-1.2776	0.1251	2.48E-24	-1.4022	0.1176	9.13E-33
3	4	rs3755967	T	C	71743681	intronic	GC	-1.2637	0.1249	6.31E-24	-1.3883	0.1174	2.99E-32
4	4	rs17467825	G	A	71739800	intergenic	SLC4A4;GC	-1.2639	0.1252	8.05E-24	1.3844	0.1177	6.50E-32
5	4	rs2282679	G	T	71742666	intronic	GC	-1.2522	0.1248	1.56E-23	1.3773	0.1174	8.86E-32
6	11	rs11023332	C	G	14762564	intronic	PDE3B	-0.7662	0.1155	3.43E-11	-0.7231	0.109	3.20E-11
7	11	rs11023379	T	C	14908414	intergenic	CYP2R1;CALCA	-0.7704	0.1181	7.41E-11	-0.7667	0.1115	6.23E-12
8	4	rs7041	C	A	71752617	exonic	GC	0.7853	0.1302	1.72E-09	-0.8268	0.123	1.79E-11
9	11	rs12803256	G	A	71421822	ncRNA_exonic	FLJ42102	0.6508	0.1184	4.02E-08	-0.727	0.1117	7.69E-11
10	11	rs7938885	C	T	71458997	intronic	NADSYN1	0.5877	0.1179	6.29E-07	-0.6648	0.1111	2.21E-09
11	11	rs12800438	A	G	71459957	intronic	NADSYN1	0.5846	0.1179	7.31E-07	0.6622	0.1112	2.60E-09
12	11	rs4423214	T	C	71462208	intronic	NADSYN1	0.5846	0.1179	7.31E-07	0.6622	0.1112	2.60E-09
13	11	rs12785878	T	G	71456403	intronic	NADSYN1	0.5794	0.1178	8.95E-07	0.6613	0.1111	2.66E-09
14	11	rs1660839	A	G	71383186	intergenic	SHANK2;FLJ42102	0.5456	0.1171	3.22E-06	0.584	0.1106	1.29E-07
15	11	rs12287212	A	C	14428315	intergenic	RRAS2;COPB1	-0.5024	0.1152	1.32E-05	-0.4829	0.1089	9.26E-06
16	11	rs10832254	G	A	14413152	intergenic	RRAS2;COPB1	-0.4980	0.1152	1.56E-05	0.4791	0.1089	1.08E-05
17	11	rs12278461	T	C	71471139	intronic	NADSYN1	0.4841	0.1152	2.65E-05	0.5257	0.1087	1.31E-06
18	4	rs13107347	C	T	72109031	intronic	NPFFR2	0.4338	0.1155	0.000174	-0.433	0.1088	6.90E-05
19	11	rs10741657	A	G	14893332	intergenic	CYP2R1;CALCA	0.4052	0.1173	0.0006	0.4136	0.1108	0.0002
20	11	rs2060793	A	G	14893764	intergenic	CYP2R1;CALCA	0.4052	0.1173	0.0006	0.4136	0.1108	0.0002
21	11	rs3829251	A	G	71483513	intronic	NADSYN1	-0.3990	0.1183	0.0007	-0.3687	0.1116	0.0010
22	2	rs1047891	A	C	210675783	exonic	CPS1	-0.4943	0.1479	0.0008	-0.4266	0.1395	0.0022
23	11	rs11233933	T	C	71499024	intronic	NADSYN1	-0.3791	0.1183	0.0014	-0.3414	0.1116	0.0022
24	19	rs8113404	T	C	52562326	intergenic	ZNF808;ZNF701	0.7612	0.2487	0.0022	0.7056	0.2352	0.0027
25	14	rs8018720	G	C	39086981	exonic	SEC23A	0.3071	0.1184	0.0095	-0.2692	0.1118	0.0161
26	15	rs261291	C	T	58387979	intergenic	AQP9;LIPC	-0.2842	0.1147	0.0132	0.2231	0.1083	0.0394
27	20	rs17216707	C	T	54115823	intergenic	BCAS1;CYP24A1	-0.5312	0.2229	0.0172	0.5626	0.2105	0.0075

SNP-Set (Sequence) Kernel Association test(이하 SKAT 시험)을 통한 희귀변종분석 결과에서는 AGO4 및 ABCG2 유전자가 비타민 D 농도와 관련이 있는 것으로 밝혀졌으며, Burden 시험을 통한 희귀변종분석 결과에서는 AGO4 , ROBO2 , ANTXR1 , 및 ECHDC3 유전자가 비타민 D 농도와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. SKAT 시험 및 Burden 시험을 통한 희귀변종분석 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

FARVAT-SKAT test
CHR	GENE	NVARIANT	MAC	START	END	STAT	P value
1	AGO4	2	34	35828470	35858557	14547400	0.00012
4	ABCG2	25	2338	88099351	88255662	406123000	0.00039
FARVAT-Burden test
CHR	GENE	NVARIANT	MAC	START	END	STAT	P value
10	ECHDC3	11	2368	11750665	11808191	14.9794	0.00011
2	ANTXR1	35	10243	69031924	69315592	14.2803	0.00016
1	AGO4	2	34	35828470	35858557	13.147	0.00029
3	ROBO2	79	9125	77048001	78014395	12.3117	0.00045

ABCG2, ATP binding cassette subfamily G member 2;

AGO4, argonaute RISC component 4;

ANTXR1, anthrax toxin receptor 1;

ECHDC3, enoyl-CoA hydratase domain containing 3;

CHR, chromosome; NVARIANT, number of variant;

MAC, minor allele count;

ROBO2, roundabout guidance receptor 2

eQTL 분석 및 네트워크 분석을 통한 생물학적 주석

도 3은 actin epsilon 1 유사 유전자(ACTE1P)의 rs12803256 SNP가 혈청 25-하이드록시-비타민 D 농도에 미치는 생물학적인 영향을 도식화한 것이다.

도 3(A)는 DHCR7(7-dehydrocholesterol reductase) locus의 업스트림에 위치한 rs12803256 SNP의 위치를 나타내고, 도 3(B)는 피부조직, 전혈, 간 조직의 rs12803256 SNP의 expression quantitative trait locus (이하 eQTL) Box 플롯을 나타낸다.

도 3(A)에 따르면, ACTEP1 유전자는 긴 비코딩 RNA 유전자이며, rs12803256(ACTE1P)은 DHCR7 / NADSYN1 유전자의 업스트림에 위치한다.

도 3(B)에 따르면, rs12803256 SNP가 NADSYN1 유전자를 포함하여 비타민 D 대사에 미치는 영향력은 햇빛에 노출되지 않은 개인의 피부 조직, 햇빛에 노출된 개인의 피부조직, 전혈 및 간 조직에서 각각 서로 다르게 나타났다.

햇빛에 노출되지 않은 피험자들의 피부조직의 NADSYN1과 DHCR7 유전자는 rs12803256 SNP의 대립형에 따라 각각 p = 3.9×10^-27, p = 3.5×10^-11로 다르게 발현되었고, 태양에 노출되는 피험자들의 NADSYN1과 DHCR7 유전자 또한 rs12803256 SNP의 대립형에 따라 각각 각각 p = 9.4×10^-17, p = 2.4×10^-8로 서로 다르게 발현되었다. 이러한 경향은 전혈과 간 조직에서도 관찰되었다.

도 4는 혈청 25-하이드록시비타민D 농도에 대해 ACTE1P 유전자의 rs12803256 SNP가 미치는 영향력을 네트워크 분석한 것이다. 도 4에 따르면, 비타민 D 대사와 관련된 단백질은 NADSYN1, DHCR7, GC, CYP24A1 및 CYP2R1으로 나타났다.

전술한 본 출원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 출원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 출원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

이상으로 본 출원의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 출원의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 출원의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 또한, 청구범위에서 정의하고 있는 본 출원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태도 본 출원의 권리범위에 속하는 것이다.

<110> RexSoft Co., Ltd. <120> SINFLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM FOR PREDICTING OF VITAMIN D DEFIECIENCY AND THE USE THEREOF <130> 21P0501 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is g or a <400> 1 gcacacccgc atatgattct ccagayggca gcacctcttg gcgtgattct c 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is g or a <400> 2 acaacttcta tgtaaggtga ttttaygcaa cttggtatga aaagaaagaa c 51 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is c or a <400> 3 tgagtttatg gaacagcagt tggagytcag gcaattttgc ttttagtcgc t 51 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is c or g <400> 4 acttagctgg aggggagtgg agaggyaagt cactggagag tgttgaacaa a 51 <210> 5 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is c or a <400> 5 gcaagccctc cctgtttctc atttcygtgt atacaggtgt atacaggtgt a 51 <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is t or g <400> 6 gcaagccctc cctgtttctc atttcygtgt atacaggtgt atacaggtgt a 51

Claims

서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드;
서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드;
서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드;
서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 G인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드;
서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 및
서열번호 6의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 A인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 서열번호 1의 SNP는 ACTE1P 유전자에 포함된 것이고,
상기 서열번호 2와 서열번호 3의 SNP는 GC 유전자에 포함된 것이며,
상기 서열번호 4의 SNP는 PDE3B 유전자에 포함된 것이고,
상기 서열번호 5의 SNP는 NADSYN1 유전자에 포함된 것이고,
상기 서열번호 6의 SNP는 GC 유전자에 포함된 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 비타민 D 결핍증은,
아시아인에게 진행되는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는,
프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증 진단용 조성물.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증 진단용 키트.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증 진단용 마이크로어레이.
분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및
상기 확인된 유전자형으로 비타민 D 결핍증을 예측하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 비타민 D 결핍증을 예측하는 단계는,
상기 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 G, 상기 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 G, 상기 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 상기 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 상기 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 또는 상기 서열번호 6의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T인 경우, 비타민 D 결핍증 위험이 높은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
인간 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및
상기 생물학적 샘플 내에 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 26번째 뉴클레오티드에서 SNP가 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증을 가진 인간 대상체에서 SNP 유전자 서열을 검출하는 방법.
청구항 9에 있어서,
상기 검출하는 단계는,
상기 검출은 상기 서열번호 1의 SNP에서 G 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하거나,
상기 서열번호 2의 SNP에서 G 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하거나, 서열번호 3의 SNP에서 C 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하거나,
상기 서열번호 4의 SNP에서 C 대립유전자 또는 G 대립유전자를 검출하거나,
상기 서열번호 5의 SNP에서 C 대립유전자 또는 A 대립유전자를 검출하거나,
상기 서열번호 6의 SNP에서 G 대립유전자 또는 T 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 결핍증을 가진 인간 대상체에서 SNP 유전자 서열을 검출하는 방법.