KR102562955B1

KR102562955B1 - 폐 기능 저하 위험 예측용 단일염기다형성 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102562955B1
Application number: KR1020210090027A
Authority: KR
Inventors: 원성호; 이동혁
Original assignee: 렉스소프트 주식회사
Priority date: 2021-07-08
Filing date: 2021-07-08
Publication date: 2023-08-03
Also published as: KR20230009242A

Abstract

본 출원은 폐 기능 저하 위험을 예측할 수 있는 단일염기다형성 마커, 이를 이용한 조성물, 키트, 마이크로어레이에 관한 것이다. 본 출원의 단일염기다형성 마커를 이용하면 나이가 들어가면서 폐 기능이 저하될 수 있는 위험을 예측할 수 있는 장점이 있다.

Description

폐 기능 저하 위험 예측용 단일염기다형성 및 이의 용도{SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM FOR PREDICTING THE RISK FACTOR OF LUNG FUNCTION DEPRESSION AND THE USE THEREOF}

본 발명은 폐 기능 저하 위험을 예측하는 단일염기다형성 마커에 관한 것이다.

폐 기능 검사는 폐활량 측정(spirometric measurments)을 기본으로 하고, 폐용적(volume)과 폐용량(capacity)를 측정한다. 폐활량 측정을 통해 1초 노력성 호기량(forced expiratory volume in 1 second; FEV1)과 노력성 폐활량(forced vital capacity; FVC)을 측정한다. FEV1은 최대한 들이쉰 다음 내쉬는 1초간의 부피를 말하고, FVC는 개체가 인위적으로 할 수 있는 최대한의 폐활량을 말한다. FEV1 대 FVC의 비율, 즉 1초율(% forced expiratory volume in one second)이 COPD를 진단하기 위한 지표로서 사용된다.

인간 지놈 기반 연구를 통해 FEV1 또는 FVC와 관련되는 유전적 인자들이 확인되고 있다. 그러나, 폐 기능 저하와 관련된 유전적 인자가 아직 확인되지 않았다.

따라서, 민감도 및 정확도가 우수하고, 유전적 분석을 통해 간편하게 나이에 따라 폐 기능이 저하되는지를 진단하기 위한 유전적 인자와 이를 이용한 조성물, 키트, 마이크로어레이, 및 이를 이용한 진단 방법을 개발할 필요가 있다.

한국 공개특허공보 제10-2014-0042792호(2014.04.07 공개)

본 출원이 해결하고자 하는 과제는 단일염기다형성 마커를 이용하여 폐 기능 저하 위험을 예측하는 조성물, 이를 이용하는 키트 및 이를 이용하는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는 단일염기다형성의 유전자형을 확인하여 폐 기능 저하 위험 예측 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 일 실시예는 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 T인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드가 T 또는 C인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하고, 폐 기능 저하 위험을 예측하며, 상기 폐 기능 저하가 나이가 들면서 현저하게 진행되는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측용 조성물.을 제공한다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 서열번호 1의 SNP는 CASC17 유전자와 LOC102723505 사이에 포함된 것이고, 상기 서열번호 2의 SNP는 FAM13A 유전자에 포함될 수 있다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 조성물은, 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드가 A 또는 G인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드가 G 또는 C인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 T인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 서열번호 3의 SNP는 SPHKAP 유전자와 PID1 사이에 포함된 것이고, 상기 서열번호 4의 SNP는 TNXB 유전자에 포함된 것이고, 상기 서열번호 5의 SNP는 CEP164 유전자에 포함될 수 있다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 폐 기능 저하는, 나이가 들면서 현저하게 진행될 수 있다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는, 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 출원의 일 실시예는 상기 조성물을 포함하는 폐 기능 저하 위험 예측용 키트를 제공한다.

본 출원의 일 실시예는 상기 조성물을 포함하는 폐 기능 저하 위험 예측용 마이크로어레이를 제공한다.

본 출원의 일 실시예는 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드, 및 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전자형으로 폐 기능 저하 위험을 예측하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 유전자형을 확인하는 단계에서, 상기 추출한 DNA로부터 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자형을 확인하는 것을 더 포함할 수 있다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 폐 기능 저하 위험을 예측하는 단계는, 상기 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 상기 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 상기 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 A, 상기 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 또는 상기 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T인 경우, 폐 기능이 저하 위험이 높은 것으로 예측할 수 있다.

본 출원의 일 실시예는 인간 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 생물학적 샘플 내에 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드, 및 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 SNP가 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 를 포함하며, 상기 검출은, 상기 서열번호 1의 SNP에서 C 대립유전자 또는 T 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 2의 SNP에서 T 대립유전자 또는 C 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 폐 기능 저하 위험을 가진 인간 대상체에서 SNP 유전자 서열을 검출하는 방법을 제공한다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 검출하는 단계는, 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 SNP가 존재하는지 여부를 더 검출하고, 상기 검출은, 상기 서열번호 3의 SNP에서 A 대립유전자 또는 G 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 4의 SNP에서 G 대립유전자 또는 C 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 5의 SNP에서 C 대립유전자 또는 T 대립유전자를 검출하는 것을 포함할 수 있다.

본 출원의 폐 기능 저하 위험 예측용 조성물, 폐 기능 저하 위험 예측용 키트, 폐 기능 저하 위험 예측용 마이크로어레이 및 폐 기능 저하 위험 예측을 위한 정보 제공 방법에 따르면, 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 단일염기다형성(SNP)을 한국인 또는 아시아인에서 폐 기능 저하 위험 예측을 위한 마커로서 이용할 수 있다.

또한, 상기 단일염기다형성을 이용하면 나이가 들어감에 따른 폐 기능 저하 위험을 예측할 수 있는 장점이 있다.

도 1 (A)는 각 기간에서 12개의 폐 기능에 대해 관찰된 측정 수를 나타내며, (B) 및 (C)은 각 기간의 12개 폐 기능의 평균 프로필 플롯과 모든 폐 기능에 대한 감소 추세를 나타낸 것이다.
도 2는 와 로 표현된 유전성 추정치를 나타낸 것이다.
도 3은 와 를 나타낸 것이다
도 4는 Cross-sectional 유전적 추정치를 나타낸 것이다.
도 5의 (A)는 피험자별 평균()과 연간 변화율()의 scatter plot을 나타낸 것이고, (B)는 연간 변화율()과 raw 값 사이의 scatter plot을 나타낸 것이다.
도 6은 흡연자와 비흡연자로 구분한 와 를 나타낸 것이다.
도 7 내지 12는 맨해튼 플롯 및 Q-Q 플롯을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

이하의 특정한 기능적 설명들은 단지 본 발명의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위하여 예시된 것으로, 본 발명의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 발명의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들은 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 출원에서 용어 "다형성(polymorphism)"은 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미하며, '다형성부위(polymorphic site)'란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 '단일염기다형성', 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.

본 출원에서 용어 "단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)"은 개인과 개인간의 DNA에 존재하는 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차이로 DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태(약1개/1kb)를 말한다. SNP 위치는 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 뉴클레오티드를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.

본 출원에서 용어 "대상", "환자", "개체", 등등은 제한적이지 않으며, 일반적으로 호환된다. 즉, "환자"로 설명된 개체는 반드시 주어진 질환을 가지고 있지 않고, 단순히 의학적 조언만을 찾고 있을 수 있다.

본 출원에서 "대조(control)", "대조 시료", "표준 대조", 또는 "대조 값"은 테스트 시료와 비교를 목적으로 기준으로 삼을 수 있는 시료, 보통 공지의 기준을 말한다. 예를 들면, 테스트 시료는 주어진 폐 질환에 걸린 것으로 의심되는 환자에서 취할 수 있으며, 공지의 폐 질환 환자, 공지의 다형성 운반체, 또는 공지의 정상 (비-질환) 개체로부터 취한 시료와 비교될 수 있다. 대조는 유사한 개체들의 집단, 가령, 유사한 의학적 배경, 동일한 나이 및 체중 등등을 가진 폐 질환 환자 또는 건강한 개체들의 집단에서 모집된 평균 값을 또한 나타낼 수 있다. 대조 값은 가령, 조기에-획득된 시료, 질환이 있기 전, 또는 치료 전, 동일한 개체로부터 또한 획득될 수 있다. 당업자는 임의의 수의 매개변수들의 평가를 위하여 대조가 기획될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

본 출원에서 용어 "핵산"은 단일-가닥으로 된 또는 이중-가닥으로 된 형태 및 이의 보체에서 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체를 지칭한다. "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 본 명세서에서 이의 문법적인 등가물은 최소한 2개의 뉴클레오티드가 공유적으로 연결된 것을 의미한다. 올리고뉴클레오티드의 길이는 전형적으로 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 최대 약 100개 뉴클레오티드가 된다. 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 가령, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000개, 등등의 더 긴 것들을 포함하여 임의의 길이의 폴리머들이다. 용어 "뉴클레오티드"는 폴리뉴클레오티드의 단일 단위, 가령, 단량체를 일반적으로 지칭한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 이의 변형된 형태들이 될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 유전자, 유전자 단편, cDNA, 단리된 DNA, mRNA, tRNA, rRNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 플라스미드, 및 벡터들을 포함한다. 자연적으로 또는 중재에 의해 변형된 핵산 중합체가 이 정의 안에 포함된다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, "유전적 변종(variant)"은 돌연변이, 단일 염기다형성 (SNP), 결손변종, 미스센스(missense) 변종, 삽입 변종, 역전(inversion), 또는 복사(copy) 수 변종을 지칭한다. 유전적 변종은 생물표지자로 이용될 수 있으며, 그리고 증가된 또는 감소된 발현 수준, 또는 차등적 변형을 초래할 수 있다.

본 출원에서 용어 "유전자(gene)"는 각각의 형질을 만드는 단위를 의미하고, 형질의 단위에 상응하는 지놈 서열의 영역일 수 있다. 유전자는 조절 영역, 전사 영역, 또는 기타 기능적 서열 영역을 포함할 수 있다. 기능적 서열 영역은 전사되지 않는 인트론(intron)일 수 있다.

상기 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티의 위치는 단일염기다형성 위치일 수 있다.

상기 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 서열은 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다.

본 명세서에서 서열번호 1 내지 5의 염기서열의 각 26번째 염기로 표시되는 본 발명의 SNP는 각각 rs4793538, rs2704589, rs62201158, rs9391733, rs2445936로도 기재한다. 아래 표 1은 본 출원에서 제공하는 SNP 마커에 대한 NCBI의 refSNP ID와 해당 SNP의 서열 및 위치를 나타낸 것이다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통 상의 지식을 가진 자라면 상기 refSNP ID를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다. 다만 NCBI에 등록되어 있는 상기 refSNP ID의 구체적인 서열은 새롭게 보고되는 연구 결과에 따라 일부가 변경될 수 있으며, 이러한 변경 역시 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

NCBI refSNP ID	서열	서열번호
rs4793538	AAACAAATCAAACAATATGAAAGGT[C/T]AGATCTTCCTAGTAGCACTAACTTA	1
rs2704589	GACTTACTCTACTCCAATTTGGATG[T/C]CTTTTTTTTTTTTAATCTTGCTTGA	2
rs62201158	GTGTACTTACACAAACCTAGATTTT[A/G]TAGCCTACTACACACCCAGGCTATA	3
rs9391733	TCTCACCCTCATTGCTGTTTTTAGA[G/C]TAGACCCAAGCAAAAACTTCTCTGA	4
rs2445936	CTGAATTCGCCATCTCTCCCTTTGC[C/T]CCTTCACAGCTCTCCCTCCTACCAG	5

상기 rs4793538 SNP(서열번호 1의 26번째 염기)에서의 "C"염기, rs2704589 SNP(서열번호 2의 26번째 염기)에 서의 "C"염기, rs62201158 SNP(서열번호 3의 26번째 염기)에서의 "A"염기, rs9391733 SNP(서열번호 4의 26번째 염기)에서의 "C"염기, rs2445936 SNP(서열번호 5의 26번째 염기)에서의 "T"염기의 빈도는 정상인에 비해 폐 기능이 저하 위험이 특히 높게 나타나므로, 상기 염기들이 존재하면 폐 기능이 저하 위험이 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한, 나이가 들어감에 따라 폐 기능이 더 현저하게 많이 저하될 위험이 높고, COPD로 발전할 가능성도 높다. 따라서, 상기 SNP에서 상기 지정된 염기가 존재하면 폐 기능이 저하되는 것으로 예상될 수 있다. 또한, 상기 SNP에서 상기 지정된 염기가 존재하면 한국인 및/또는 아시아인에게 나이가 들어감에 따라 폐 기능이 더 현저하게 많이 저하될 위험이 높고, COPD로 발전할 가능성도 높다.

본 출원의 일 실시예는 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 T인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드가 T 또는 C인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 폐 기능 저하 위험 예측용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함할 수 있다.

상기 조성물은, 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드가 A 또는 G인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드가 G 또는 C인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 T인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 서열번호 1 내지 5의 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함할 수도 있다.

본 발명은 상기 서열번호 1 내지 5에서 각 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이 중가닥의 gDNA(genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다.

본 출원에서 용어 "대립유전자(allele)"는 쌍이 될 수 있는 대립형질의 유전자를 말한다. 상기 대립유전자는 동일한 위치에 존재하는 단일 뉴클레오티드일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 또는 40개 이상, 100개 이하, 80개 이하, 60개 이하의 연속 뉴클레오티드와 동일 또는 이에 상보적일 수 있다.

상기 프로브(probe)는 표적 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프로브는 예를 들어 표적 핵산 서열과 같은 특이적인 핵산 서열의 상보적인 영역을 갖는 서열-특이적인 방법으로 혼성화되도록 고안된 특이적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 프로브는 DNA, RNA, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고, 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 검출가능한 표지는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 프로브에 결합된 형광 색소 화합물일 수 있고, 예를 들어 형광 공여체 및 형광 수용체의 FRET(Forter Resonance Energy Transfer) 쌍 일 수 있다.

상기 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 하나의 대립유전자를 포함한 핵산 단편에는 혼성화하지만, 다른 대립유전자를 포함한 핵산 단편에는 혼성화하지 않을 수 있다.

이러한 프로브는 상기 SNP가 포함된 부위를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네 이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오 에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린 (rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'- Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것 이라면 모두 사용할 수 있다.

상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.

용어 "프로브" 또는 "프라이머"는 시료에 특이적으로 혼성화되는 것이 탐지될 수 있는 하나 또는 그 이상의 핵산 단편들을 지칭한다. 프로브 또는 프라이머는 이용되는 특정 기술에 따라 임의의 길이의 것이 될 수 있다.

예를 들면, PCR 프라이머의 길이는 일반적으로 10 내지 40개의 뉴클레오티드이며, 가령, 서든 블랏을 위한 핵산 프로브는 길이가 백개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머(primer)는 중합효소에 의한 중합 반응에서 중합 개시점을 제공하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로, 상기 프라이머는 핵산 증폭 반응에 사용되는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 상기 표적서열에 상보적인 영역과 혼성화된다. 프로브 및 프라이머는 고체 표면 (가령, 니트로셀룰로오스, 유리, 규석, 융합된 규석 슬라이드)상에 고정되거나, 어레이 안에 있을 수도 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화 가능한"이란 상보적 서열과 Watson-Crick 결합을 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 당업자는 혼성화를 위하여 상보성 백분율은 폴리뉴클레오티드의 길이, 상보적 영역의 길이(가령, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 이상의 염기), 그리고 조건의 엄격성(stringency)에 따라 반드시 100%일 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 (가령, 프라이머 또는 프로브)는 상보적 영역의 범위에 걸쳐서 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가지는 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 유전적 변종을 탐지하는 내용에 있어서, 용인되는 상보성 백분율 또는 미스매취(mismatches) 수는 탐지에 이용되는 기술에 따라 가변적일 것이다

본 출원에서 용어 "증폭 (amplification)"은 표적 서열 또는 그의 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것을 나타낸다. 상기 핵산 증폭 반응은 당업계에 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 핵산의 증폭은 증폭 동안 복수의 사이클을 필요로 하는 방법 또는 단일 온도에서 수행되는 방법을 포함한다. 순환방법(cycling techniques)의 예는 열 순환을 필요로 하는 방법을 포함한다. 열 순환을 필요로 하는 방법은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 포함한다. PCR은 당업계에 알려져 있다. 등온 증폭 방법은 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification; SDA), 헬리카제 의존적 증폭(helicase dependant amplification; HDA), 엑소뉴클레아제 의존적 증폭(exonuclease dependant amplification), 리콤비나제 중합효소증폭(recombinase polymerase amplification; RPA), 루프 매개된 증폭(loop mediated amplification; LAMP), 핵산 기반 증폭(nucleic acid based amplification; NASBA 및 TMA), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 프라이머는 선택되는 증폭 방법에 따라 1개, 또는 2개 이상의 세트로 포함될 수 있다. 상기 프라이머는 대립유전자 특이적 프라이머일 수 있다. 증폭에 의하여 산물이 증폭되면, 특정 대립유전자가 존재하는 것일 수 있다.

본 출원에서 용어 "혼성화 가능한"이란 상보적 서열과 Watson-Crick 결합을 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 당업자는 혼성화를 위하여 상보성 백분율은 폴리뉴클레오티드의 길이, 상보적 영역의 길이(가령, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 이상의 염기), 그리고 조건의 엄격성(stringency)에 따라 반드시 100%일 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 (가령, 프라이머 또는 프로브)는 상보적 영역의 범위에 걸쳐서 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가지는 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 유전적 변종을 탐지하는 내용에 있어서, 용인되는 상보성 백분율 또는 미스매취(mismatches) 수는 탐지에 이용되는 기술에 따라 가변적일 것이다

용어 "진단" 또는 "예측"이란 대상에서 폐 질환이 존재할 상대적 가능성을 말한다. 유사하게, 용어 "예후"는 대상에서 미래 특정 결과가 발생하는 상대적 가능성을 말한다. 예를 들면, 본 발명의 문맥에서, 예후는 개체에서 폐 질환의 발생, 또는 질환의 심각성 (가령, 증상의 심각성, 기능 감퇴의 속도, 생존 등등)의 발달 가능성을 지칭할 것이다. 상기 용어들은 의학적 진단 분야에서 당업자가 인지할 수 있는 바와 같이, 절대적인 것으로 의도되지는 않는다.

상기 키트는, 상기 프로브 또는 프라이머; 및 중합 반응에 필요한 시약을 포함할 수 있다.

상기 시약은 dNTP, 중합효소, 완충액, 지시약, 또는 그 조합을 포함할 수 있다.

상기 키트는 PCR 키트, DNA 분석용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인하거 나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 개의 비만 위험성을 예측할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 상기 키 트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 SNP가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클 레오티드에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제 조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있 다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.

상기 마이크로어레이는 기판에 상기 폴리뉴클레오티드가 고정된 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 출원의 일 실시예는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드, 및 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전자형으로 폐 기능 저하 위험을 예측하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 출원의 일 실시예는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전자형으로 폐 기능 저하 위험을 예측하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 폐 기능 저하 위험을 예측하는 단계는, 상기 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 상기 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 상기 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 A, 상기 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 또는 상기 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T인 경우, 폐 기능이 저하 위험이 높은 것으로 예측할 수 있다.

상기 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계를 포함한다.

상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 영장류일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 마우스, 소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 개체로부터 유래된 신선한 또는 보존된 기관 또는 조직 시료 또는 생검(biopsy)와 같은 고체 조직(solid tissue); 혈액 또는 혈액 구성성분; 양수(amniotic fluid), 복수(peritoneal fluid), 또는 세포간질액(interstitial fluid)와 같은 체액(bodily fluid); 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정제(fixatives), 영양성분(nutrients), 항생제 등과 같은 생물학적 물질과 자연적으로 혼합되어 있지 않은 화합물을 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 예를 들어 폐 조직일 수 있다. 폐 조직은 외과 수술에 의해 얻어지거나, 물질적 또는 레이저 등을 통한 광학적 적출에 의해 얻어질 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자의 전사체의 양은 대조군에 비하여 감소할 수 있다. 대조군은 음성 대조군으로서 나이에 따른 폐 기능이 저하되지 않은 정상인으로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 핵산 시료는 핵산을 포함한 시료일 수 있다. 핵산은 상기 생물학적 시료로부터 분리 또는 정제된 핵산일수 있다. 생물학적 시료로부터 핵산을 분리 또는 정제하는 방법은 당업계에 알려진 것일 수 있다.

상기 방법은 수득된 핵산 시료로부터 서열번호 1 내지 5의 폴리뉴클레오티드에서 5' 말단으로부터 26번째 뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 단계을 포함한다.

용어 "유전자형(genotype)"은 유전적 조성을 말하고, 대립유전자 또는 대립유전자의 존재 상태일 수 있다.

상기 유전자형의 결정은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 유전자형의 결정은 예를 들어, 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립유전자 특이적 증폭 방법(allelespecific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis), 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism), 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.

본 출원의 일 실시예는 인간 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 상기 생물학적 샘플 내에 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 SNP가 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 를 포함하며, 상기 검출은, 상기 서열번호 1의 SNP에서 C 대립유전자 또는 T 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 2의 SNP에서 T 대립유전자 또는 C 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 3의 SNP에서 A 대립유전자 또는 G 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 4의 SNP에서 G 대립유전자 또는 C 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 5의 SNP에서 C 대립유전자 또는 T 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는, 폐 기능 저하 위험을 가진 인간 대상체에서 SNP 유전자 서열을 검출하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 실시예 및 비교예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 비교예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

대상자의 선별

대한민국 경기도 안산 (도시)과 안성 (농촌)에 거주하는 40-69 세의 참가자 6,623 명의 참가자 (남성 3,442 명, 여성 3,181 명)를 14년 동안 추적 조사를 하였다. 2년마다 각 참가자로부터 측정 값을 얻었고, 유전자형 및 표현형 정보를 모두 사용하였다. 유전자형으로 3,352,722 개의 SNP를 고려하였고, 모든 참가자는 서면 동의서를 제공했으며, 본 연구는 대한 질병 관리 본부 윤리위원회, 고려 대학교 안산 병원 및 아주 대학교 의과 대학 기관 심의위원회의 승인을 받았다.

연구 대상은 2년마다 추적 조사되었으며, 각 대상은 최대 8 개의 측정 값을 가졌습니다. 도 1 (A)는 각 기간에서 12개의 폐 기능에 대해 관찰된 측정 수를 보여주며, 이는 최대 8개의 기간 동안 추적 조사를받은 4,000 명의 대상을 나타낸다. 특히, post FVC, post FVC1, post FEV1/FVC 등 기관지 확장제 후 검사의 표본 크기는 이러한 검사 결과가 안성 피험자에게만 제공되었기 때문에 작았다. 도 1 (B) 및 (C)은 각 기간의 12개 폐 기능의 평균 프로필 플롯과 모든 폐 기능에 대한 감소 추세를 보여준다.

표 2를 참조하면, 통계 분석에 각 피험자에 대한 평균 및 연간 변화율 추정치가 필요했으며, 이에 대해 3회 이상의 추적 조사를 받은 6,623 명의 참가자를 고려했다. 여기에는 3,009 명의 비 흡연자, 2,095 명의 흡연자 등이 포함되었다.

Characteristic	ALL	Never Smoker	Ever Smoker	P-value
Sample Size, n	6623	3009	2095	-
Female, n (%)	3181 (48.02%)	2588 (86%)	104 (5%)	< 2.2×10^-16
Age, yr (Means ± SD)	51.51 ± 8.52	51.19 ± 8.3	50.54 ± 7.94	0.005
Height, cm (Means ± SD)	160.3 ± 8.57	155.9 ± 7.02	166.6 ± 6.26	< 2.2×10^-16

FVC, FEV1, FVC의 중간 (25-75 %) 부분 동안의 평균 강제 호기 흐름 (FEF 25-75 %) 및 최대 자발적인 것을 포함하는 기관지 확장제 전후 절대 값 및 % 예측값을 고려하였다. 환기(MVV)는 American Thoracic Society의 표준화된 프로토콜에 따라 기술자에 의해 휴대용 폐활량계 (Vmax-2130, Sensor Medics, Yorba Linda, CA, USA)를 사용하여 측정?榮?. 또한 안산 코호트 참가자들에게만 기관지 확장제 후 검사를 수행했다. Fenoterol hydrobromide (400μg, 2001 ~ 2008) 또는 salbutamol (400μg, 2009 년 이후)을 투여하고 15 ~ 30 분 지연 후 각 테스트를 반복했다.

j 시점에서 피험자 i의 특성은 y_ij이고, y_ij는 피험자의 연령 age_ij 피험자 별 기능이라고 가정했다. 우리 데이터의 경우 j는 1에서 8까지의 숫자였다. 개체별 함수는 f _i 이고, 는 측정 오류이다. 그런 다음 아래 수학식 1을 가정했다.

[수학식 1]

이 정의를 기반으로, 본 출원의 발명자들은 개체 별 평균 (폐 기능 특성의 평균을 나타냄)과 특성에 대한 연간 변화율, 두 개의 다른 SNP 기반 유전성 매개 변수인 및 를 추정했다.

가 높으면 단면 평균에 대한 전체적인 유전적 영향이 높은 경향이 있으며 는 지놈 차원의 복합 형질 분석 (GCTA)을 사용하여 추정한 SNP 유전성과 동일하다. 유전적 성분에 의해 영향을 받는 연간 평균 변화는 > 0으로 표시하였다. 도 2는 및 에 대한 실제 개념으로 유전적 추정치를 나타낸 것이다.

먼저 동일한 방문 기간의 피험자에 대해 간단한 선형 회귀 모델을 적용하여 각 폐 기능 특성에 대한 연령을 조정했다. 각 참가자는 최대 8번 측정되었으며 최소 3 번 측정한 참가자를 사용했다. 폐 기능 특성의 차이는 8개의 서로 다른 시점에서 이질적이며, 각 시점에 대한 잔여 분산은 절대 값에 대한 연령, 성별 및 키를 조정하고 % 예측 값에 대한 연령 및 성별을 조정하여 선형 회귀에서 계산했다. 특성 k 및 시점 j에 대한 잔차 분산의 역수를 w_jk 취했으며 각 대상 i에 대해 아래 수학식 2와 같은 가중치 선형 회귀를 수행하였다.

[수학식 2]

여기서 는 관측된 시점의 평균 연령을 나타내고, 은 에서 특성 k에 대한 피험자 i의 개체 별 평균을 나타내고 은 연간 변화율을 나타낸다. 그런 다음 및 에 순위 기반 역정규 변환을 적용하고 보충 텍스트 2의 방정식 (1)에 대한 이변량 선형 혼합 모델을 적용했다. 이 모델은 GCTA의 "--reml-bivar"옵션을 사용하여 추정되었고, 과 사이의 유전적 상관 관계도 이 옵션을 사용하여 생성되었다.

SNP- 흡연 상호 작용에 기인 한 유전 가능성 추정

평균 및 연간 변화율에 대한 SNP- 흡연 상호 작용의 분산을 추정하기 위해 환경 요인의 주 효과를 고정 효과로 포함하고 GxE 상호 작용 효과를 다음과 같이 처리한 유전자형-환경 (GxE) 상호 작용 모델을 적용했다. 임의 효과 (GCTA의 "--gxe"옵션 사용).

지놈 차원의 연관 연구

FEV1, FEV1/FVC, post-FEV1, post-FEV1/FVC에 대해 지놈 차원의 연관성 연구가 수행되었고, 및 에 대한 선형 회귀는 연령과 성별을 조정한 후 수행되었다. 분석은 ONETOOL과 PLINK로 수행되었다.

피험자별 평균 및 연간 변화율의 유전 가능성 추정

12가지 폐 기능 특성의 유전적 결정 요인의 중요성을 추정하기 위해 각 특성의 개체 별 평균 () 및 연간 변화율 ()을 계산했다. 하기 표 2는 개체별 평균 및 연간 변화율의 통계를 보여준다. 둘 다 순위 기반 역정규 변환을 사용하여 변환되었으며 각각 및 를 추정하는 데 사용되었다.

도 2 (A)는 로 표현된 유전성 추정치를 보여준다. 점은 각 시점에서 단면 측정의 상속성을 나타내고, 검은색 직선과 점선은 평균과 중위수를 나타내며, 빨간색 직선은 를 나타낸다.

모든 폐 기능 특성은 FDR (false-discovery rate) 조정 0.05 유의 수준에서 유의했다. 기관지 확장제 후 FVC는 가장 큰 (0.325, P = 1.16 x 10^- ⁵)를 보였고, 그 다음으로 기관지 확장제 후 FEV1/FVC (0.314, P = 1.86 x 10^- ⁵)가 뒤를 이었다. FVC (% pred)는 (0.237, P = 5.36 × 10^- ⁹)도 상대적으로 높았다. 도 3은 각 기간의 단면 SNP 유전성을 와 비교하고, 결과는 각 기간과 의 평균 단면 SNP 유전율이 현저하게 다르지 않음을 보여주었다. 도 2(B)는 를 보여준다. 각 폐 기능 특성에 대해 는 <였다. 기관지 확장제 후 FEV1/FVC는 가장 높은 (0.176, P = 0.0099)를 보였고, FEV1/FVC (0.158 P = 4.91 × 10^-5)가 뒤를 이었다. FEV1 (% pred)도 상당한 (0.105, P = 0.004)를 가졌다.

도 3은 와 를 나타낸 것이다. 연령에 따른 표현형 분포는 분포는 와 로 다를 수 있고, 과 는 피험자 1과 피험자 2이다.

도 4는 Cross-sectional 유전적 추정치를 나타낸 것으로 솔리드 점은 각 시점에서 단면 측정의 유전성을 나타낸 것이고, 검은색 직선과 점선은 평균과 중위값을 나타낸 것이다. 빨간색 직선은 를 나타낸 것이다.

표 3은 개체별 평균이 공변량으로 포함되었을 때의 결과를 보여준다. 여기서는 를 반응 변수로 사용했다. 결과는 기저선 효과를 조정한 후에도 기관지 확장제 후 FEV1/FVC, FEV1/FVC 및 FEV1 (% pred)에 대해 가 여전히 유의한 것으로 나타났다.

Traits	Covariates		s.e( )	P-value
FEV₁ (% pred)	Age, sex	0.102	0.040	3.95×10^-3
	Age, sex,	0.0772	0.039	2.15×10^-2
FEV₁/FVC (%)	Age, sex	0.158	0.042	4.91×10^-5
	Age, sex,	0.123	0.042	1.13×10^-3
post- FEV₁/FVC (%)	Age, sex	0.183	0.075	6.18×10^-3
	Age, sex,	0.152	0.076	2.01×10^-2

연령, 성별 및 개체별 평균()의 효과를 조정한 후 를 추정했으며, 개체별 평균()의 효과를 조정하지 않고 추정치와 비교했다.

유의한 FEV1 (% pred), FEV1/FVC 및 기관지 확장제 후 FEV1/FVC)를 갖는 폐 기능 특성에 대해, 우리는 개체 별 평균 () 및 연간 변화율 ()에 대한 유전 성분 간의 상관 관계 ()를 계산했다.

도 5는 피험자별 평균()과 연간 변화율()의 scatter plot을 나타낸 것이고, (B)는 연간 변화율()과 raw 값 사이의 scatter plot을 나타낸 것이다. 도 5는 FEV1 (% pred), FEV1/FVC 및 기관지 확장제 후 FEV1/FVC의 개체 별 평균과 연간 변화율 간의 표현형 상관 관계를 보여준다. 조정하지 않은 상관 관계는 각각 0.3, 0.24, 0.22였다.

표 4는 및 를 보여준다. 는 개체별 평균과 연간 변화율간에 상대적 비율이 공유되는 유전적 상관관계를 나타낸다. 결과는 50% 이상의 유전적 성분이 개체 별 평균과 연간 변화율간에 유의하게 공유되는 것으로 나타났다 (FEV1의 경우 = 0.587, P = 0.001 (% pred); = 0.628, FEV1의 경우 P = 4.59 × 10⁵). / FVC; = 0.466, P = 0.022 기관지 확장제 후 FEV1/FVC). 표 4는 또한 개체별 평균과 연간 변화율 간의 잔류 표현형 상관 ()을 보여준다. 는 개체별 평균과 연간 변화율간에 공유되는 환경 분산의 상대적 비율을 나타낸다. 잔류 표현형 상관 관계는 (FEV1의 경우 = 0.22 (% pred), FEV1/FVC의 경우 = 0.117, 기관지 확장제 후 FEV1/FVC의 경우 = 0.155)보다 훨씬 작으며, 이는 대상별 평균 및 연간 변화율을 나타내고, 다른 환경 요인의 영향을 받을 수 있다.

Trait					s.e. ( )	P-value ( )		s.e. ( )
FEV₁ (% pred)	0.1954	0.1029	0.0833	0.5873	0.1713	0.0014	0.220	0.0117
FEV₁/FVC (%)	0.1807	0.1538	0.1047	0.6279	0.1466	0.0000459	0.117	0.0121
post-FEV₁/FVC (%)	0.2593	0.1742	0.099	0.466	0.2156	0.0219	0.155	0.0165

(=개체별 평균; =연간 변화율; =유전적 변이; =유전적 공변량; =유전적 상관관계; =잔류표현형 상관관계; FVC, 노력성 폐활량; FEV₁, 1 초 노력성 호기량)

12 가지 폐 기능 특성의 유전 가능성 추정치에 흡연이 미치는 영향 분석

피험자를 흡연자와 비흡연자로 구분하여 하위 그룹 분석을 수행하였다. 표 5는 흡연자와 비흡연자로 구분한 피험자별 평균 및 연간 변화율을 보여준다. MVV (% pred)를 제외하고 피험자 별 평균에서 항상 흡연자와 비흡연자 사이의 유의한 차이가 관찰되었다. 도 6은 흡연자와 비흡연자로 구분한 와 를 나타낸 것이다.

Traits	Never-smoker			Ever-smoker			P-value
Traits	Sample Size	Means of subject-specific means (sd)	Means of subject-specific annual change rates (sd)	Sample Size	Means of subject-specific means (sd)	Means of subject-specific annual change rates (sd)	Means	Annual change rates
FVC (L)	3008	3.045 (0.642)	-0.034 (0.023)	2095	4.051 (0.661)	-0.039 (0.027)	0	1.41e-09
FVC ( % pred )	3008	105.533 (12.978)	-0.158 (0.922)	2095	101.647 (12.066)	-0.287 (0.757)	1.15e-27	4.55e-08
FEV ₁ (L)	3008	2.430 (0.520)	-0.036 (0.019)	2095	3.066 (0.592)	-0.046 (0.022)	1.27e-291	2.28e-57
FEV ₁ ( % pred )	3008	114.953 (16.110)	-0.120 (1.086)	2095	105.474 (14.922)	-0.384 (0.852)	9.74e-99	4.19e-22
FEV ₁ / FVC ( % )	3008	79.815 (5.449)	-0.300 (0.430)	2095	75.540 (7.298)	-0.418 (0.406)	2.78e-107	3.65e-23
FEF25 -75% (L/sec)	3009	2.526 (0.830)	-0.068 (0.047)	2095	2.712 (1.071)	-0.088 (0.051)	2.59e-11	7.10e-46
FEF25 -75% ( % pred)	3009	99.458 (28.106)	-1.359 (1.936)	2095	88.909 (31.089)	-1.606 (1.657)	1.06e-34	1.06e-06
MVV (L/min)	3004	92.488 (24.048)	-2.052 (1.340)	2095	119.465 (27.968)	-2.583 (1.707)	6.62e-245	4.84e-32
MVV ( % pred )	3004	93.298 (17.280)	-1.306 (1.423)	2095	93.209 (17.114)	-1.152 (1.454)	8.56e-01	1.78e-04
post- FVC (L)	1524	3.181 (0.626)	-0.035 (0.018)	1182	4.144 (0.604)	-0.038 (0.023)	3.16e-278	1.11e-05
post- FEV ₁ (L)	1525	2.628 (0.510)	-0.036 (0.014)	1182	3.296 (0.517)	-0.043 (0.018)	3.50e-207	3.31e-26
post- FEV ₁ FVC (%)	1525	82.772 (4.862)	-0.236 (0.312)	1182	79.667 (5.949)	-0.291 (0.331)	5.39e-46	1.01e-05

비흡연군에서 대상별 평균 ()의 추정된 SNP 유전성은 FEV1/FVC, 기관지 확장제 후 FEV1/FVC 및 FVC (% pred)를 제외하고 항상 흡연자보다 높았다. 그러나 비흡연군의 기관지 확장제 후 FEV1/FVC를 제외하고는 연간 변화율의 SNP 유전성은 0.05 수준에서 유의미하지 않았다.

또한 유의한 및 를 갖는 폐 기능 특성에 대한 SNP 흡연 상호 작용 ()의 유전성을 평가했다. 12 개의 폐 기능 특성은 모두 유의한 값을 보였다 (표 5). FEV1/FVC, 기관지 확장제 후 FEV1/FVC 및 FEV1 (% pred)는 및 의 유의미한 추정치를 가졌다. 표 6은 0.05 유의 수준 (FEV1의 경우 P = 0.02, 기관지 확장 후 FEV1/FVC의 경우 P = 0.02)에서 기관지 확장제 후 FEV1/FVC 및 FEV1 (% pred) 및 유의 수준에 가까운 FEV1/FVC (P = 0.08)를 나타낸 것이고, 다른 특성은 표 7에 나타내었다.

Trait	Vge / Vp	s.e	P-value
FEV₁ (% pred)	-0.1926	0.0881	0.0209
FEV₁/FVC (%)	0.1383	0.1009	0.0792
post-FEV₁/FVC (%)	0.4023	0.1988	0.0212

Traits	Sample Size	Subject-specific means			Annual change rates
Traits	Sample Size	Vge / Vp	s.e.	P-val	Vge / Vp	s.e.	P-val
FVC (L)	5103	0.052	0.098	0.29	-0.025	0.101	0.410
FVC (% pred)	5103	-0.018	0.095	0.42	-0.144	0.097	0.090
FEV₁ (L)	5103	-0.007	0.098	0.47	-0.090	0.091	0.162
FEV₁ (% pred)	5103	-0.050	0.095	0.30	-0.193	0.088	0.021
FEV₁/FVC (%)	5103	0.079	0.101	0.22	0.138	0.101	0.079
FEF25-75% (L/sec)	5104	0.097	0.102	0.18	0.117	0.099	0.109
FEF25-75% (% pred)	5104	0.066	0.101	0.26	0.090	0.098	0.172
MVV (L/min)	5099	0.003	0.099	0.49	-0.150	0.094	0.072
MVV (% pred)	5099	0.026	0.102	0.40	-0.154	0.092	0.061
post-FVC (L)	2706	-0.033	0.182	0.43	-0.089	0.189	0.328
post-FEV₁ (L)	2707	-0.074	0.186	0.35	-0.048	0.180	0.395
post-FEV₁/FVC (%)	2707	0.206	0.191	0.14	0.402	0.199	0.021

피험자별 평균 및 연간 변화율에 대한 지놈 차원의 연관 연구

FEV1, FEV1/FVC, post-FEV1/FVC의 질병 감수성 유전자좌(DSL)를 확인하기 위해 피험자별 평균 () 및 연간 변화율 ()을 사용하여 지놈 전반에 걸친 연관 연구를 수행했다. 표 8 및 9는 유의 수준 α = 에서 지놈 전체에 의미 있는 SNP를 나타낸 것이다. 평균은 연간 변화율의 경우, rs2445936은 FEV1/FVC 상당히 관련이 있었다. 도 7 내지 12는 맨해튼 플롯 및 Q-Q 플롯을 보여준다. 도 7 및 도 8은 FEV1에 관한 것이고, 도 9 및 도 10은 FEV1/FVC에 관한 것이며, 도 11 및 도 12는 post-FEV1/FVC에 관한 것이다.

서열

Trait

SNP

CHR

BP

A1

A2

MAF

HWE_P

FUNCTION

GENE

BETA

P

서열번호 1

FEV1 (L)

rs4793538

17

69215928

T

C

0.3812

0.766

intergenic

CASC17(dist=17608), LOC102723505(dist=802064)

-0.06552

2.27×10^-10

서열번호 2

FEV₁/FVC (%)

rs2704589

4

89848583

T

C

0.4707

0.9657

intronic

FAM13A

0.09519

5.16×10^-10

서열번호3

FEV1/FVC (%)

rs62201158

2

229552897

G

A

0.128

0.1737

intergenic

SPHKAP (dist=506536), PID1(dist=335792)

0.1312

2.06×10^-8

서열번호 4

FEV₁/FVC (%)

rs9391733

6

32059674

G

C

0.1638

0.5817

intronic

TNXB

0.1213

3.24×10^-8

서열

Trait

SNP

CHR

BP

A1

A2

MAF

HWE _P

FUNCTION

GENE

BETA

P

서열번호 5

post-FEV1/FVC (%)

rs2445936

11

117284577

C

T

0.2296

0.8071

downstream

CEP164

0.1573

3.20×10^-8

상술한 본 출원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 출원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 출원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

이상으로 본 출원의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 출원의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 출원의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 또한, 청구범위에서 정의하고 있는 본 출원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태도 본 출원의 권리범위에 속하는 것이다.

<110> RexSoft Co., Ltd. <120> SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM FOR PREDICTING THE RISK FACTOR OF LUNG FUNCTION DEPRESSION AND THE USE THEREOF <130> 21P0502 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is c or t <400> 1 aaacaaatca aacaatatga aaggtyagat cttcctagta gcactaactt a 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is t or c <400> 2 gacttactct actccaattt ggatgycttt ttttttttta atcttgcttg a 51 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is a or g <400> 3 gtgtacttac acaaacctag attttytagc ctactacaca cccaggctat a 51 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is g or c <400> 4 tctcaccctc attgctgttt ttagaytaga cccaagcaaa aacttctctg a 51 <210> 5 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (26) <223> y is c or t <400> 5 ctgaattcgc catctctccc tttgcycctt cacagctctc cctcctacca g 51

Claims

서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 T인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 및
서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드가 T 또는 C인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하고
폐 기능 저하 위험을 예측하며,
상기 폐 기능 저하가 나이가 들면서 현저하게 진행되는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 서열번호 1의 SNP는 CASC17 유전자와 LOC102723505 사이에 포함된 것이고,
상기 서열번호 2의 SNP는 FAM13A 유전자에 포함된 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은,
서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드가 A 또는 G인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드;
서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드가 G 또는 C인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 및
서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드가 C 또는 T인 SNP를 포함하는 8개 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 뉴클레오티드; 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측용 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 서열번호 3의 SNP는 SPHKAP 유전자와 PID1 사이에 포함된 것이고,
상기 서열번호 4의 SNP는 TNXB 유전자에 포함된 것이고,
상기 서열번호 5의 SNP는 CEP164 유전자에 포함된 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측용 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 검출 또는 증폭할 수 있는 제제는,
프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측용 조성물.
청구항 1 내지 청구항 4 및 청구항 6 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측용 키트.
청구항 1 내지 청구항 4 및 청구항 6 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측용 마이크로어레이.
분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드, 및 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자형을 확인하는 단계; 및
상기 확인된 유전자형으로 폐 기능 저하 위험을 예측하는 단계; 를 포함하고
상기 폐 기능 저하가 나이가 들면서 현저하게 진행되는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측 정보를 제공하는 방법.
청구항 9에 있어서,
상기 유전자형을 확인하는 단계에서,
상기 추출한 DNA로부터 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자형을 확인하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측 정보를 제공하는 방법.
청구항 10에 있어서,
상기 폐 기능 저하 위험을 예측하는 단계는,
상기 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 상기 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 상기 서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 A, 상기 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C, 또는 상기 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T인 경우, 폐 기능이 저하 위험이 높은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험 예측 정보를 제공하는 방법.
나이가 들면서 현저하게 진행되는 폐 기능 저하 위험을 가진 인간 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및
상기 생물학적 샘플 내에 서열번호 1의 26번째 뉴클레오티드, 및 서열번호 2의 26번째 뉴클레오티드의 SNP가 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 를 포함하며,
상기 검출은
상기 서열번호 1의 SNP에서 C 대립유전자 또는 T 대립유전자를 검출하고, 상기 서열번호 2의 SNP에서 T 대립유전자 또는 C 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험을 가진 인간 대상체에서 SNP 유전자 서열을 검출하는 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 검출하는 단계는,
서열번호 3의 26번째 뉴클레오티드, 서열번호 4의 26번째 뉴클레오티드 및 서열번호 5의 26번째 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 SNP가 존재하는지 여부를 더 검출하고,
상기 검출은,
상기 서열번호 3의 SNP에서 A 대립유전자 또는 G 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 4의 SNP에서 G 대립유전자 또는 C 대립유전자를 검출하거나, 상기 서열번호 5의 SNP에서 C 대립유전자 또는 T 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐 기능 저하 위험을 가진 인간 대상체에서 SNP 유전자 서열을 검출하는 방법.