KR102333953B1

KR102333953B1 - 신규한 황반변성 진단용 유전자 마커

Info

Publication number: KR102333953B1
Application number: KR1020200085222A
Authority: KR
Inventors: 이상섭
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2020-07-10
Filing date: 2020-07-10
Publication date: 2021-12-02

Abstract

본 발명은 신규한 황반변성 진단용 CFHR3 유전자 마커에 관한 것으로, 1 염색체의 CFHR3 유전자의 특정 단일염기다형성(SNP) 변이와 H4 일배체형이 황반변성의 발생 위험과 유의하게 연관되어 있으므로, 이를 황반변성을 효과적으로 진단할 수 있는 신규한 마커로서 황반변성의 조기진단에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

신규한 황반변성 진단용 유전자 마커{NOVEL GENETIC MARKERS FOR THE DIAGNOSIS OF MACULAR DEGENERATION}

본 발명은 신규한 황반변성 진단용 CFHR3 유전자 마커에 관한 것이다.

황반변성이란 안구의 신경 조직인 망막에서 가장 중요한 부위인 황반이 어떤 원인에 의해서 세포의 성질이 변화되어 시력저하, 실명 등의 병변을 일으키는 경우를 말한다. 황반변성은 노화에 의해 가장 흔하게 발생한다. 노화에 의한 황반변성을 나이관련 황반변성(Age-related macular degeneration, AMD 또는 ARMD)이라하며, 노화에 의해 황반의 세포와 혈관의 기능이 떨어지면 망막에서 나오는 노폐물들이 처리되지 않고 망막 아래에 쌓이게 되면서 신생혈관이 생기는 등의 변화가 일어나 시력에 영향을 미치게 된다. 나이관련 황변변성은 서구에서 65세 이상 인구에서 실명을 일으키는 원인 중 가장 흔한 원인이며, 우리나라는 최근 노인 인구의 증가로 발생률이 점점 늘고 있다. 2010년 국민건강영양통계에 따르면 나이관련 황반변성의 유병율은 남성 40대 1.4%, 50대 4.6%, 60대 10.2%, 70대 이상 14.8%로 나타나고 여성 40대 1.1%, 50대 4.7%, 60대 11.8%, 70대 이상 20.2%로 연령의 증가와 함께 유병율도 높아지는 것으로 조사되었다. 이와 같이 황반변성은 60세 이상의 노인들에게서 많이 발생하고 젊은 사람에게서는 잘 나타나지 않기 때문에 나이는 가장 중요한 원인이 된다. 또 다른 중요한 원인은 흡연이다. 그리고 비만, 심혈관계 질환, 고혈압, 고지혈증, 고지방 섭취 등도 발병의 원인이 된다. 환경적 요인으로는 자외선에서의 노출 등이 중요한 원인으로 거론되고 있다. 운동, 레저 등 야외 활동이 활발해서 황반변성의 원인이 될 수 있는 자외선에 많이 노출되는 것도 중장년층에서 황반변성이 증가하고 있는 이유이다. 통계청에 따르면 우리나라 노인인구 비율은 2010년 11%에서 2018년 14%인 고령사회, 2025년 21%로 초고령화사회에 진입할 것으로 예측하고 있으며, 이에 따라 노인관련 질병에 대한 많은 관심이 집중될 것으로 보인다.

황반변성은 금발, 벽안과 같이 뚜렷한 유전적 요인에 의해 결정되는 질병은 아니지만, 특정 유전자 변이가 있는 경우 발생위험도가 매우 높아지는 유전적 연관성을 보인다. 2005년 Science에 발표된 Haines 등의 연구에서 염증반응과 관련된 보체(complement factors)가 나이관련 황반변성의 병리기전에 중요한 역할을 한다는 것이 알려졌다. 보체계 대체경로의 단백질인 H 인자와 B 인자를 코딩하는 유전자(CFH, CFB)가 나이관련 황반변성의 발생을 유발한다는 것이 보고되었고, 뒤이어 보체계의 또 다른 단백질인 C3, C2 유전자의 돌연변이도 황반변성의 발생과 밀접히 연관되어 있다는 결과가 알려졌다. 그 이후로도 유전체 연구를 통해 최근까지 최소 34종의 유전자에서 나이관련 황반변성의 발생위험과 관련된 유전자 돌연변이가 발견되었다. 현재까지의 연구를 통해 종합적으로 이런 유전적 이상이 있는 개인에서 감염, 흡연, 심혈관계 이상 등 유발인자가 작용하여 이 질환의 병리기전을 촉발시키는 것으로 이해되고 있다. 알려진 바로는 진행성 황반변성 발생의 70%가 유전적 특성에 의해 결정되고, 나머지 30%가 흡연, 식습관 등의 환경적 요인에 의해 결정된다고 한다. 나이관련 황반변성의 발생에 가장 중요한 유전자의 하나로 여겨지고 있는 CFH 유전자의 근처에는 CFH 단백질과 구조적으로 공통되는 부분을 가진 CFHR (CFH-related protein) 단백질이 CFHR1, CFHR2, CFHR3, CFHR4, CFHR5의 다섯가지가 존재한다. 이들 유전자는 1번 염색체 상에서 근거리에 위치해 있으며, CFHR3-CFHR1 부분의 동형접합형 소실(ΔCFHR3-CFHR1로 표기함)을 가진 사람은 나이관련 황반변성의 발생위험이 적은 것으로 보고되고 있으나, ΔCFHR3-CFHR1 유전형이 나이관련 황반변성의 낮은 발생위험과 관련된 것이 CFH 유전자에 위치한 기능성 유전자변이와 연관불균형을 이루고 있는지에 대한 뚜렷한 결론이 나지 않았다.

본 발명의 목적은 CFHR3 유전자의 H4 일배체형 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 황반변성 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 황반변성 진단 키트를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 황반변성 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 CFHR3 유전자의 H4 일배체형 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 CFHR3 유전자의 단일염기다형성(SNP) 변이 또는 CFHR3 유전자의 H4 일배체형을 검출하는 제제를 포함하는, 황반변성 진단 또는 예후 예측용 조성물 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 황반변성 진단 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 CFHR3 유전자의 단일염기다형성(SNP) 변이 또는 일배체형을 확인하는 단계를 포함하는 황반변성 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 1 염색체의 CFHR3 유전자의 특정 부위의 단일염기다형성(SNP) 변이와 H4 일배체형이 황반변성의 발생 위험과 유의하게 연관되어 있음을 입증하였으므로, 이를 황반변성을 효과적으로 진단할 수 있는 신규한 마커로서 황반변성의 조기진단에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 나이관련 황반변성의 원인 유전자인 CFH 유전자의 downstream 부분에 위치한 CFHR3 유전자 및 CFHR1 유전자의 위치를 나타낸 모식도이다.
도 2는 1129종의 변이유전자를 나이관련 황반변성 환자 및 정상 대조군과 비교한 결과를 Locuszoom으로 가시화한 도이다.
도 3은 본페로니 교정을 통해 결정한 유의성 컷오프를 넘은 18종의 변이 유전자 간의 연관불균형을 분석한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "유전적 다형성 (genetic polymorphism)"은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말하며, 이 중 DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 이라고 한다.

본 발명에서 용어, "다형성"은 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 이 예에서, CC, CT 또는 TT). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NCBI 웹사이트 상에서 이용가능한 뉴클레오티드 염기 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스(Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation)에서 사용되는 것인, 지정된 독특한 식별자 ("기준 SNP", "refSNP" 또는 "rs#"이다.

본 발명에서 용어, "유전자형"은 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립유전자를 지칭한다.

본 발명에서 용어, "표현형"은 유전형에 의해서 결정되는 개체의 형태학적, 생리학적, 또는 생화학적 특징을 표현형이라 한다. 유전형이란 표현형과 구별되는 것으로, 개인의 유전자 구성을 뜻하며, 보다 좁은 의미로는 한 유전자 위에 존재하는 대립 유전자들(alleles)을 말한다.

본 발명에서 용어, "대립 인자" 또는 "대립 유전자"란 같은 염색체 위치 (same chromosomallocus)를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태 (alternative forms) 중 하나를 뜻한다.

본 발명에서 용어, "대립유전자 빈도"는 대립유전자가 개체 내, 계통 내, 또는 계통의 집단 내에 존재하는 빈도 (비율 또는 백분율)을 지칭한다. 계통 또는 집단 내에서의 대립유전자 빈도를, 계통 또는 집단으로부터의 개체들의 샘플의 대립유전자 빈도를 평균화함으로써 추정할 수 있다.

본 발명에서 용어, "위험"은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다.

본 발명에서 용어, "핵산"은 데옥시리보핵산 (DNA), 및 적절하다면 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체 (예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 서술된 구체예에 적용된 대로, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서는 "핵산"이라는 용어와 "뉴클레오티드"가 병용하여 쓰이고 있다.

본 발명에서 용어, "대상체" 또는 "환자"는 인간, 유인원, 원숭이, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

본 발명에서 용어, "시료(샘플)"는 대상 또는 환자로부터 얻은 생물학적 시료를 의미한다. 생물학적 시료의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

일 측면에서, 본 발명은 H4 일배체형 진단용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 H4 일배체형은 CFHR3 유전자의 H4 일배체형일 수 있다.

일 구현예에서, 1번 염색체의 196743163번 위치, 196743231번 위치, 196743836번 위치, 196744838번 위치, 196745152번 위치, 196745964번 위치, 196746724번 위치, 196747112번 위치, 196747116번 위치, 196747117번 위치, 196747740번 위치, 196749947번 위치, 196751689번 위치, 196749097번 위치, 196754014번 위치, 196754029번 위치, 196754087번 위치, 196754667번 위치, 196757258번 위치, 196757627번 위치, 196758088번 위치, 196759036번 위치, 196759037번 위치, 196759691번 위치, 196759961번 위치 및 196762165번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 위치의 염기를 검출하기 위한 제제를 포함할 수 있으며, 상기 염색체는 인간의 1번 염색체인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, H4 일배체형은 1번 염색체의 196743163번 위치가 티민(T), 196743231번 위치가 구아닌(G), 196743836번 위치가 아데닌(A), 196744838번 위치가 구아닌(G), 196745152번 위치가 아데닌(A), 196745964번 위치가 아데닌(A), 196746724번 위치가 시토신(C), 196747112번 위치가 티민(T), 196747116번 위치가 아데닌(A), 196747117번 위치가 아데닌(A), 196747740번 위치가 아데닌(A), 196749947번 위치가 아데닌(A), 196751689번 위치가 구아닌(G), 196749097번 위치가 시토신(C), 196754014번 위치가 구아닌(G), 196754029번 위치가 시토신(C), 196754087번 위치가 아데닌(A), 196754667번 위치가 구아닌(G), 196757258번 위치가 시토신(C), 196757627번 위치가 구아닌(G), 196758088번 위치가 시토신(C), 196759036번 위치가 구아닌(G), 196759037번 위치가 구아닌(G), 196759691번 위치가 아데닌(A), 196759961번 위치가 구아닌(G) 및 196762165번 위치가 아데닌(A)일 수 있다.

일 구현예에서, 염기를 검출하기 위한 제제는 상기 위치의 염기를 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 피시알-리버스 블랏 교잡 어세이, 노던블랏 또는 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 염색체 상의 유전자 위치정보는 UCSC 게놈브라우저 GRCh37/hg19 에셈블리에 의한 위치이다.

본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "결정"은 대상의 단일염기다형성(SNP) 변이 집합 패턴인 일배체형(하플로타입, Haplotype)을 검출 또는 결정하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시키는 적합한 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate),1mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

일 측면에서, 본 발명은 1번 염색체의 196751689번 위치의 단일염기다형성(SNP) 변이 (rs187315824), 196754014번 위치의 단일염기다형성(SNP) 변이, 196754087번 위치의 단일염기다형성(SNP) 변이, 196754667번 위치의 단일염기다형성(SNP) 변이 (rs7416290) 및 196757258번 위치의 단일염기다형성(SNP) 변이 (rs400642)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 위치에서의 단일염기다형성(SNP) 변이를 검출하는 제제를 포함하는, 황반변성 진단 또는 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 단일염기다형성(SNP) 변이는 CFHR3 유전자의 단일염기다형성(SNP) 변이일 수 있다.

일 구현예에서, 단일염기다형성(SNP) 변이는 1번 염색체의 196751689번 위치가 시토신(C), 196754014번 위치가 아데닌(A), 196754087번 위치가 티민(T), 196754667번 위치가 아데닌(A) (rs7416290) 또는 196757258번 위치가 티민(T) (rs400642)일 수 있다.

일 구현예에서, 황반변성은 나이관련 황반변성(Age-related macular degeneration, AMD 또는 ARMD)일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 H4 일배체형을 검출하는 제제를 포함하는, 황반변성 진단 또는 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 1번 염색체의 196743163번 위치, 196743231번 위치, 196743836번 위치, 196744838번 위치, 196745152번 위치, 196745964번 위치, 196746724번 위치, 196747112번 위치, 196747116번 위치, 196747117번 위치, 196747740번 위치, 196749947번 위치, 196751689번 위치, 196749097번 위치, 196754014번 위치, 196754029번 위치, 196754087번 위치, 196754667번 위치, 196757258번 위치, 196757627번 위치, 196758088번 위치, 196759036번 위치, 196759037번 위치, 196759691번 위치, 196759961번 위치 및 196762165번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 위치의 염기를 검출하기 위한 제제를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 아시아 인종에서 황반변성을 진단 또는 예후 예측하기 위한 조성물일 수 있으며, 한국인에서 황반변성을 진단 또는 예후 예측하기 위한 조성물인 것이 더욱 바람직하다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는, 황반변성 진단 키트에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 키트는 대상체 또는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP), 형광물질 등의 표지 물질을 추가로 더 함유할 수 있다.

본 발명에서 용어 “황반변성 진단 키트”는 본 발명의 황반변성 진단용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “황반변성 진단 키트”는 “황반변성 진단용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다. 본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 황반변성 상태의 동정, 황반변성의 단계 결정 또는 치료에 대한 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 검체 시료로부터 염색체를 분리하는 단계; 및 1번 염색체의 196751689번 위치 (rs187315824), 196754014번 위치, 196754087번 위치, 196754667번 위치 (rs7416290) 및 196757258번 위치 (rs400642)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 위치에서의 단일염기다형성(SNP) 변이를 확인하는 단계를 포함하는, 황반변성 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 방법은 196751689번 위치가 시토신(C), 196754014번 위치가 아데닌(A), 196754087번 위치가 티민(T), 196754667번 위치가 구아닌(G) 또는 196757258번 위치가 시토신(C)이면 황반변성의 발생 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 방법은 196751689번 위치가 구아닌(G), 196754014번 위치가 구아닌(G), 196754087번 위치가 아데닌(A), 196754667번 위치가 아데닌(A) (rs7416290) 또는 196757258번 위치가 티민(T) (rs400642)이면 황반변성의 발생 위험이 낮은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 검체 시료로부터 염색체를 분리하는 단계; 및 일배체형을 결정하는 단계를 포함하는, 황반변성 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 방법은 검사 대상의 CFHR3 유전자의 일배체형이 H4이면 황반변성의 발생 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 검사 대상의 CFHR3 유전자의 일배체형이 H4이면 정상 대조군에 비해 황반변성의 발생 위험이 1 내지 3.5배 높은 것으로 판단할 수 있다.

일 구현예에서, 검사 대상의 CFHR3 유전자의 일배체형이 H4이면 정상 대조군에 비해 황반변성의 발생 위험이 황반변성의 발생 위험이 2.53배 높은 것으로 판단할 수 있다.

일 구현예에서, CFHR3 유전자의 H4 일배체형은 1번 염색체의 196743163번 위치가 티민(T), 196743231번 위치가 구아닌(G), 196743836번 위치가 아데닌(A), 196744838번 위치가 구아닌(G), 196745152번 위치가 아데닌(A), 196745964번 위치가 아데닌(A), 196746724번 위치가 시토신(C), 196747112번 위치가 티민(T), 196747116번 위치가 아데닌(A), 196747117번 위치가 아데닌(A), 196747740번 위치가 아데닌(A), 196749947번 위치가 아데닌(A), 196751689번 위치가 구아닌(G), 196749097번 위치가 시토신(C), 196754014번 위치가 구아닌(G), 196754029번 위치가 시토신(C), 196754087번 위치가 아데닌(A), 196754667번 위치가 구아닌(G), 196757258번 위치가 시토신(C), 196757627번 위치가 구아닌(G), 196758088번 위치가 시토신(C), 196759036번 위치가 구아닌(G), 196759037번 위치가 구아닌(G), 196759691번 위치가 아데닌(A), 196759961번 위치가 구아닌(G) 및 196762165번 위치가 아데닌(A)일 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 나이관련 황반변성 관련 염기서열 분석

부산백병원의 IRB 승인을 받고 진행된 임상시험으로 199명의 나이관련 황반변성 환자 및 188명의 정상 대조군 검체를 다기관 임상시험을 통해 수집한 뒤, 각 대상의 1번 염색체 CFH 유전자, CFHR3 유전자, CFHR1 유전자의 차세대 시퀀싱 분석을 표적 염기서열 분석법으로 수행하였다. 구체적으로, CFH 유전자의 전사조절부위인 프로모터 2.5kb 부분부터 CFHR1 유전자의 downstream 1kb 부위까지의 총 180.7kb 영역에 대하여 표적 차세대 시퀀싱을 의뢰하여 (㈜셀레믹스) 프라이머를 세트 제작하고 (도 1), 시퀀싱 분석을 진행하였다. 시퀀싱의 결과 유전자 커버리지는 20X 기준으로 모든 영역에 99% 이상이었다. 차세대 염기서열 분석 결과, 5700여종의 변이유전자가 검출되었다.

실시예 2. 시퀀싱 결과 가공 및 일배체형 분석

상기 실시예 1의 차세대 염기서열로부터 생산된 로우 데이터를 가장 널리 쓰이는 표준 파이프라인으로 분석하였다. 구체적으로, 시퀀서에서 생산한 Fastq 형식의 파일을 Phred Q-score 분석을 하여 99%수준인 20 미만의 경우 트리밍을 하였다. 또한, 맵핑을 위한 툴로 BWA (http://bio-bwa.sourceforge.net/)를 이용하였으며, 변이유전자의 검출 및 삽입-결실 분석은 GATK (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us)을 이용하여 수행하였다.

상기 실시예 1에서 검출한 5700여종의 변이유전자 중 정도관리 및 빈도를 고려하여 총 1129종의 변이유전자를 환자-대조군 비교분석에 이용하였다. 1129종의 변이의 환자 및 대조군 비교 결과를 Locuszoom으로 가시화한 뒤 (도 2), 본페로니 교정(Bonferroni correction)을 통해 1129종의 변이에 대해 -Log(P)=4.35의 통계학적 유의성 컷오프가 결정되었다. 이 컷오프를 넘은 18종의 변이유전자 간의 연관불균형 분석 결과를 확인하였다 (도 3). 그 결과, 환자-대조군 비교를 통해 질환위험과 관련있을 것으로 예상된 CFHR3 유전자에 위치한 유전자변이들은 CFH 유전자의 변이들과 뚜렷한 연관불균형을 보여주지 않고 있음을 알 수 있었다. 이는 Fritsche 등의 가설에 따라 CFHR3 유전자의 변이가 별개로 나이관련 황반변성의 발생위험과 관련있을 수 있음을 시사한다.

실시예 3. CFHR3 유전자의 일배체형 분석

CFHR3 유전자의 일배체형의 분석은 PLINK (http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/)를 이용하여 변이유전자 빈도, 유전자변이간 연관불균형, 일배체형 블록 등의 분석을 수행하였고, Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/haploview)를 이용해 변이간 연관불균형을 시각화하여 제시하였다. 아울러, 환자군과 대조군간의 변이유전자 빈도 및 일배체형의 빈도 비교을 위한 통계분석은 Fisher’exact test, Chi-square test, Odds ratio, 순열 검정 등의 방법으로 수행하였다.

Chr 위치	SNP rs	야생형	변이형	기능	아미노산변화	빈도 (%)		p-value
Chr 위치	SNP rs	야생형	변이형	기능	아미노산변화	환자군	대조군	p-value
196743163	rs76026104	T	C	upstream		3.27	2.93	0.798
196743231	-	G	T	upstream		1.51	1.06	0.507
196743836	-	A	-	upstream		2.51	1.86	0.549
196744838	-	G	C	intronic		1.51	0.80	0.245
196745152	-	A	G	intronic		2.81	1.96	0.369
196745964	-	AT	-	intronic		3.27	4.52	0.516
196746724	rs425524	C	G	intronic		54.52	51.60	0.383
196747112	-	T	TA	intronic		0.75	1.86	0.184
196747116	-	A	T	intronic		11.22	7.14	0.068
196747117	-	A	T	intronic		1.76	1.09	0.478
196747740	rs182316837	A	C	intronic		3.02	4.01	0.682
196749097	rs61737525	C	T	exonic	R142C	2.51	1.86	0.549
196749947	-	A	ATTG	intronic		1.01	1.60	0.422
196751689	rs187315824	G	C	intronic		3.53	0.81	0.015 ^*
196754014	-	G	A	intronic		5.58	1.90	0.010 ^*
196754029	-	C	T	intronic		2.01	2.41	0.961
196754087	-	A	T	intronic		6.06	2.59	0.049 ^*
196754667	rs7416290	G	A	intronic		28.89	36.23	0.025 ^*
196757258	rs400642	C	T	intronic		86.43	92.43	0.009 ^*
196757627		G	A	intronic		1.76	0.71	0.341
196758088	rs141405554	C	A	intronic		6.28	4.79	0.283
196759036	-	G	-	intronic		1.76	0.71	0.163
196759037	rs374905	G	A	intronic		36.62	30.68	0.166
196759691	rs188160886	A	C	intronic		0.75	1.86	0.132
196759961	rs190393418	G	A	intronic		0.50	2.14	0.075
196762165	rs181209129	A	T	intronic		1.51	1.07	0.951

그 결과, CFHR3 유전자의 26종 일배체형 표지 변이유전자를 결정하였고 (표 1), 환자군 및 대조군에서 5종의 변이유전자가 유의미하게 두 그룹간에 차이가 있었으며, 염색체에서 Chr1:196751689 (rs187315824) 위치부터 Chr1:196757258 (rs400642) 위치까지 영역의 5종의 변이이다. 염색체상의 위치는 각각 196751689, 196754014, 196754087, 196754667 및 196757258이고 주로 5.6kb 이하의 부분에 집중되어 있었다. 또한, 상기 26종의 일배체형 표지 변이유전자를 이용하여 빈도가 높은 10종의 CFHR3 일배체형이 나이관련 황반변성 발생위험과 연관이 있는지를 분석한 결과, H4 일배체형의 경우 환자에서는 12.93%, 대조군에서는 5.82%의 빈도로서 환자군에서 발견빈도가 높았으며 (표 2), 이는 이 일배체형을 가지고 있는 경우 그렇지 않은 경우에 비해서 나이관련 황반변성의 발생위험이 2.53배 유의하게 증가하는 것을 의미한다.

일배체형 염기서열

환자군 빈도(%)

대조군 빈도(%)

Odds
Ratio

p-value

H1

T

G

A

G

A

G

T

A

G

C

G

C

A

G

T

G

C

G

A

G

A

11.50

16.56

0.651

0.083

H2

T

G

A

G

A

C

T

A

G

C

G

C

A

T

G

C

G

A

G

A

33.12

36.52

0.836

0.397

H3

T

G

A

G

A

G

T

A

G

C

G

C

A

G

T

G

C

G

A

G

A

25.64

20.77

1.2

0.171

H4

T

G

A

G

A

C

T

A

G

C

G

C

A

G

C

G

C

G

A

G

A

12.93

5.82

2.53

0.004^*

H5

T

G

A

G

A

D

C

T

A

G

C

G

C

A

T

G

C

G

A

G

A

2.48

3.23

0.785

0.590

H6

T

G

A

G

A

G

T

A

G

C

G

C

A

G

T

G

C

G

A

G

A

2.69

3.00

0.998

0.826

H7

T

G

A

G

A

G

T

A

G

C

G

C

A

G

T

G

C

G

A

G

A

4.94

3.90

1.12

0.548

H8

T

G

A

G

A

G

T

A

G

C

G

C

A

G

T

G

A

G

A

G

A

1.97

2.05

1.12

0.947

H9

T

G

A

G

A

G

T

A

G

C

G

C

A

G

T

G

A

G

A

G

A

3.79

2.53

1.48

0.392

H10

T

G

A

G

A

G

T

A

C

A

G

C

G

C

A

G

T

G

C

G

A

G

A

0.94

2.50

0.514

0.153

SNP

rs76026104

196743231_T

196743836_-

196744838_C

196745152_G

196745964_-

rs425524

196747112_TA

196747116_T

196747117_T

rs182316837

196749947_ATTG

rs187315824

196754014_A

196754029_T

196754087_T

rs7416290

rs400642

196757627_A

rs141405554

196759036_-

rs374905

rs188160886

rs190393418

rs181209129

염색체 위치

196743163

196743231

196743836

196744838

196745152

196745964

196746724

196747112

196747116

196747117

196747740

196749947

196751689

196749097

196754014

196754029

196754087

196754667

196757258

196757627

196758088

196759036

196759037

196759691

196759961

196762165

상기 결과들에서, CFHR3의 5종의 변이유전자와 1종의 일배체형이 나이관련 황반변성의 발생 위험과 유의하게 연관이 있음을 밝혔으므로, 상기 변이유전자 및 일배체형의 분석 진단법을 나이관련 황반변성의 발생위험 예측에 활용될 수 있다.

Claims

1번 염색체의 196743163번 위치, 196743231번 위치, 196743836번 위치, 196744838번 위치, 196745152번 위치, 196745964번 위치, 196746724번 위치, 196747112번 위치, 196747116번 위치, 196747117번 위치, 196747740번 위치, 196749947번 위치, 196751689번 위치, 196749097번 위치, 196754014번 위치, 196754029번 위치, 196754087번 위치, 196754667번 위치, 196757258번 위치, 196757627번 위치, 196758088번 위치, 196759036번 위치, 196759037번 위치, 196759691번 위치, 196759961번 위치 및 196762165번 위치의 염기를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 황반변성 발생 위험과 연관된 H4 일배체형(haplotype) 진단용 조성물.

제 1항에 있어서, 상기 H4 일배체형은 CFHR3 유전자의 H4 일배체형인, H4 일배체형 진단용 조성물.

제 1항에 있어서, H4 일배체형은 1번 염색체의 196743163번 위치가 티민(T), 196743231번 위치가 구아닌(G), 196743836번 위치가 아데닌(A), 196744838번 위치가 구아닌(G), 196745152번 위치가 아데닌(A), 196745964번 위치가 아데닌(A), 196746724번 위치가 시토신(C), 196747112번 위치가 티민(T), 196747116번 위치가 아데닌(A), 196747117번 위치가 아데닌(A), 196747740번 위치가 아데닌(A), 196749947번 위치가 아데닌(A), 196751689번 위치가 구아닌(G), 196749097번 위치가 시토신(C), 196754014번 위치가 구아닌(G), 196754029번 위치가 시토신(C), 196754087번 위치가 아데닌(A), 196754667번 위치가 구아닌(G), 196757258번 위치가 시토신(C), 196757627번 위치가 구아닌(G), 196758088번 위치가 시토신(C), 196759036번 위치가 구아닌(G), 196759037번 위치가 구아닌(G), 196759691번 위치가 아데닌(A), 196759961번 위치가 구아닌(G) 및 196762165번 위치가 아데닌(A)인, H4 일배체형 진단용 조성물.

1번 염색체의 196751689번 위치 (rs187315824), 196754014번 위치, 196754087번 위치, 196754667번 위치 (rs7416290) 및 196757258번 위치 (rs400642)에서의 단일염기다형성(SNP) 변이를 검출하는 제제를 포함하는, 황반변성 진단 또는 예후 예측용 조성물.

제 4항에 있어서, 단일염기다형성(SNP) 변이는 1번 염색체의 196751689번 위치가 시토신(C), 196754014번 위치가 아데닌(A), 196754087번 위치가 티민(T), 196754667번 위치가 아데닌(A) (rs7416290) 또는 196757258번 위치가 티민(T) (rs400642)인, 황반변성 진단 또는 예후 예측용 조성물.

H4 일배체형을 검출하는 제제를 포함하고, 상기 제제는 1번 염색체의 196743163번 위치, 196743231번 위치, 196743836번 위치, 196744838번 위치, 196745152번 위치, 196745964번 위치, 196746724번 위치, 196747112번 위치, 196747116번 위치, 196747117번 위치, 196747740번 위치, 196749947번 위치, 196751689번 위치, 196749097번 위치, 196754014번 위치, 196754029번 위치, 196754087번 위치, 196754667번 위치, 196757258번 위치, 196757627번 위치, 196758088번 위치, 196759036번 위치, 196759037번 위치, 196759691번 위치, 196759961번 위치 및 196762165번 위치의 염기를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 황반변성 진단 또는 예후 예측용 조성물.

제 6항에 있어서, 상기 H4 일배체형은 CFHR3 유전자의 H4 일배체형인, 황반변성 진단 또는 예후 예측용 조성물.

제 6항에 있어서, H4 일배체형은 1번 염색체의 196743163번 위치가 티민(T), 196743231번 위치가 구아닌(G), 196743836번 위치가 아데닌(A), 196744838번 위치가 구아닌(G), 196745152번 위치가 아데닌(A), 196745964번 위치가 아데닌(A), 196746724번 위치가 시토신(C), 196747112번 위치가 티민(T), 196747116번 위치가 아데닌(A), 196747117번 위치가 아데닌(A), 196747740번 위치가 아데닌(A), 196749947번 위치가 아데닌(A), 196751689번 위치가 구아닌(G), 196749097번 위치가 시토신(C), 196754014번 위치가 구아닌(G), 196754029번 위치가 시토신(C), 196754087번 위치가 아데닌(A), 196754667번 위치가 구아닌(G), 196757258번 위치가 시토신(C), 196757627번 위치가 구아닌(G), 196758088번 위치가 시토신(C), 196759036번 위치가 구아닌(G), 196759037번 위치가 구아닌(G), 196759691번 위치가 아데닌(A), 196759961번 위치가 구아닌(G) 및 196762165번 위치가 아데닌(A)인, 황반변성 진단 또는 예후 예측용 조성물.

제 4항 또는 제 6항의 조성물을 포함하는, 황반변성 진단 키트.

a) 검체 시료로부터 염색체를 분리하는 단계; 및
b) 1번 염색체의 196751689번 위치 (rs187315824), 196754014번 위치, 196754087번 위치, 196754667번 위치 (rs7416290) 및 196757258번 위치 (rs400642)에서의 단일염기다형성(SNP) 변이를 확인하는 단계를 포함하는, 황반변성 진단을 위한 정보제공방법.

제 10항에 있어서, 단일염기다형성(SNP) 변이는 1번 염색체의 196751689번 위치가 시토신(C), 196754014번 위치가 아데닌(A), 196754087번 위치가 티민(T), 196754667번 위치가 아데닌(A) (rs7416290) 또는 196757258번 위치가 티민(T) (rs400642)인, 황반변성 진단을 위한 정보제공방법.

제 11항에 있어서, 196751689번 위치가 시토신(C), 196754014번 위치가 아데닌(A), 196754087번 위치가 티민(T), 196754667번 위치가 구아닌(G) 또는 196757258번 위치가 시토신(C)이면 황반변성의 발생 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 황반변성 진단을 위한 정보제공방법.

제 11항에 있어서, 196751689번 위치가 구아닌(G), 196754014번 위치가 구아닌(G), 196754087번 위치가 아데닌(A), 196754667번 위치가 아데닌(A) (rs7416290) 또는 196757258번 위치가 티민(T) (rs400642)이면 황반변성의 발생 위험이 낮은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 황반변성 진단을 위한 정보제공방법.

a) 검체 시료로부터 염색체를 분리하는 단계;
b) 일배체형을 결정하는 단계; 및
c) 검사대상이 H4 일배체형이면 황반변성의 발생 위험이 높은 것으로 판단하는 단계;를 포함하고,
상기 일배체형을 결정하는 단계는 1번 염색체의 196743163번 위치, 196743231번 위치, 196743836번 위치, 196744838번 위치, 196745152번 위치, 196745964번 위치, 196746724번 위치, 196747112번 위치, 196747116번 위치, 196747117번 위치, 196747740번 위치, 196749947번 위치, 196751689번 위치, 196749097번 위치, 196754014번 위치, 196754029번 위치, 196754087번 위치, 196754667번 위치, 196757258번 위치, 196757627번 위치, 196758088번 위치, 196759036번 위치, 196759037번 위치, 196759691번 위치, 196759961번 위치 및 196762165번 위치의 염기를 검출하여 일배체형을 결정하는 것인, 황반변성 진단을 위한 정보제공방법.

삭제

제 14항에 있어서, 정상 대조군에 비해 황반변성의 발생 위험이 1 내지 3.5배 높은 것으로 판단하는, 황반변성 진단을 위한 정보제공방법.

제 14항에 있어서, H4 일배체형은 1번 염색체의 196743163번 위치가 티민(T), 196743231번 위치가 구아닌(G), 196743836번 위치가 아데닌(A), 196744838번 위치가 구아닌(G), 196745152번 위치가 아데닌(A), 196745964번 위치가 아데닌(A), 196746724번 위치가 시토신(C), 196747112번 위치가 티민(T), 196747116번 위치가 아데닌(A), 196747117번 위치가 아데닌(A), 196747740번 위치가 아데닌(A), 196749947번 위치가 아데닌(A), 196751689번 위치가 구아닌(G), 196749097번 위치가 시토신(C), 196754014번 위치가 구아닌(G), 196754029번 위치가 시토신(C), 196754087번 위치가 아데닌(A), 196754667번 위치가 구아닌(G), 196757258번 위치가 시토신(C), 196757627번 위치가 구아닌(G), 196758088번 위치가 시토신(C), 196759036번 위치가 구아닌(G), 196759037번 위치가 구아닌(G), 196759691번 위치가 아데닌(A), 196759961번 위치가 구아닌(G) 및 196762165번 위치가 아데닌(A)인, 황반변성 진단을 위한 정보제공방법.