JP4859088B2 - 2型糖尿病に関連するヒトwnt5b遺伝子多型の検出方法及びキット - Google Patents
2型糖尿病に関連するヒトwnt5b遺伝子多型の検出方法及びキット Download PDFInfo
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本明細書において、以下の用語は特記しない限り次のように定義される。「WNT」とは、脂肪生成、筋形成、神経形成及び乳腺発達等の細胞の運命や分化に影響を与えるタンパク質ファミリー及びこれらをコードする遺伝子の名称である。遺伝子とはcDNA、及びゲノム遺伝子を含む。WNT−1遺伝子は最初にマウス乳癌におけるマウス乳癌ウイルス(MMTV)の挿入部位として同定された。今日では、WNTファミリーは、WNT5Bを含む19の遺伝子からなることが知られている(詳細については、http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html参照)。WNTファミリーのほとんどのタンパク質は細胞から分泌され、細胞表面受容体、すなわちFrizzled受容体(7回膜貫通型)及びその共受容体(LRP5及びLRP6)を介して作用すると考えられている。WNT−1遺伝子は、β−カテニン経路を介して脂肪生成を阻害し、WNT10B遺伝子もまた脂肪生成の初期段階で重要な役割を果たすことが示されている。さらに、LRP5は膵ベータ細胞におけるグルコース誘導性インスリン分泌と肝臓でのコレステロール代謝に何らかの役割を果たしていることが報告されている。
本発明の一つの実施形態において、被験者から生物学的な試料を採取し、前記試料についてWNT5B遺伝子の変異を検出することを特徴とするヒト2型糖尿病に関する遺伝的素因の検出方法が提供される。ここで、WNT5B遺伝子とは、WNTファミリーの1つの遺伝子であって、成人の前立腺や胎児の脳において中程度に発現し、成人の肝臓や腎臓でわずかに発現していることが知られている遺伝子である。WNT5B遺伝子は、また、軟骨細胞などのいくつかのタイプの細胞の分化や増殖にも関与していることが報告されており、配列番号1に示された塩基配列のヒト由来cDNAを含む。さらに、配列番号1の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつWNT5Bに特徴的な細胞の分化誘導能を有するポリペプチドをコードするヒト由来の同質遺伝子、及び哺乳動物におけるそれらの相同物も含まれる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という条件は当業者において周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、2つの核酸断片が、サムブルックら(Sambrook,J.)の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現(Expression of cloned genes in E.coli)」(Molecular Cloning:A laboratory manual:2nd. edition(1989))Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA,9.47-9.62および11.45-11.61に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。
本発明の他の実施形態において、上記ヒトWNT5B遺伝子多型を含むポリヌクレオチド、上記多型を含むDNA断片を増幅するためのプライマー対、上記多型を検出するためのポリヌクレオチド、プローブ及びそのためのキットが提供される。
[DNA試料の調製]
滋賀医科大学、東京女子医科大学、順天堂大学、川崎医科大学、又は千葉西総合病院の外来診療室に定期的に通院している2型糖尿病患者の末梢血よりDNA試料を調製した。糖尿病の診断は、世界保健機構(WHO)の診断基準に従って行った。2型糖尿病は、ゆっくりとした成人発症型の病状を示す被験者として臨床的に規定される。抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体陽性の被験者、又はミトコンドリア病(ミトコンドリア筋障害、脳障害、乳酸アシドーシス、及び発作性発症)及びMaturity-onset diabetes of the young(MODY)の患者は除外した。対照被験者は、日本のいくつかの医学研究所において募集された一般集団のメンバー(564人の対照群1と、375人対照群2)から構成された。書面によるインフォームドコンセントを各患者から取得し、実験方法については理化学研究所及び本研究に参加したそれぞれの研究機関における倫理委員会の承認を受けた。DNAの抽出は、標準的なフェノール/クロロホルム法を用いて行った。すなわち、末梢血液約10mlを3000rpm、5分間遠心して血清を除去し、赤血球溶解液を加え室温で20分インキュベートした。3000rpmで5分間遠心し沈殿(白血球成分)を回収し、プロテネースKで37℃、4時間以上処理した。等量のフェノールを加え3000rpmで10分間遠心して水相を回収し、続いて、フェノールクロロホルム処理、クロロホルム処理の後、イソプロパノールでDNAを沈殿させた。沈殿を70%エタノールでリンスした後TE溶液に溶解した。
遺伝子型特定実験のためのSNPはIMS−JST日本SNPデータベース(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp)から選択した。11種類のWNT遺伝子に全部で45個のSNPが見出された。まず最初に、188人の2型糖尿病患者(症例群1)、及び564人の一般集団(対照群1)における各SNPの遺伝子座位における遺伝子型をインベーダーアッセイ又はタックマン法により決定した。インベーダーアッセイを行う前に、マルチプレックスPCRにより標的部位を増幅した。マルチプレックスPCRは、16.6mMの(NH4)2SO4、67mMのTris(pH8.8)、6.7mMのMgCl2、10mMの2−メルカプトエタノール、6.7μMのEDTA、1.5mMのdNTP、10xTaqmix(2.5U/μlのTaqポリメラーゼ、31.25U/μlのTaq抗体)、0%又は10%のDMSO、0.25μM各プライマーの反応液中で、変性95℃、アニーリング60℃、伸長72℃のサイクルを40回繰り返して行った。得られたPCR産物を希釈して。384プレートに分注した後、風乾して、3μlのインベーダー反応液及びプローブミックスを加えた。63℃で20分間反応させた後、蛍光測定し、遺伝子型を判定した。
イントロン3+1016の塩基がCであるものを検出する特異的プローブ:
5'-ATGACGTGGCAGACCGGCATCTCGCATGTCCTTTG-3'(配列番号11)
イントロン3+1016の塩基がTであるものを検出する特異的プローブ:
5'-CGCGCCGAGGT GGCATCTCGCATGTCCTTTG-3'(配列番号12)
イントロン3+1016の塩基がCであるかTであるかを検出するインベーダープローブ:5'-CCAGAGTCTGTCTGGGGCATTN-3'(配列番号13、但しNは任意の塩基)
イントロン4+438の塩基がCであるものを検出するための特異的プローブ:
5'-ATGACGTGGCAGACGAAGTGGAAGAGGCAAAAATC-3'(配列番号14)
イントロン4+438の塩基がGであるものを検出するための特異的プローブ:
5'-CGCGCCGAGGCAAGTGGAAGAGGCAAAAATC-3'(配列番号15)
イントロン4+438の塩基がCであるかGであるかを検出するためのインベーダープローブ:5'-CTATCTCTCTGTCAAAGGTTN-3'(配列番号16、但しNは任意の塩基)
イントロン4+5776の塩基がGであるものを検出するTaqManプローブ:
5'-CCTCTAAATACCCAGATCA-3'(配列番号17)
イントロン4+5776の塩基がCであるものを検出するTaqManプローブ:
5'-CCTCTAAATACGCAGATCA-3'(配列番号18)
次に、WNT5B遺伝子の全領域における遺伝的な多型を検索し、76個の新規SNPを同定した。図2に示したように、この遺伝子全体では合計87個のSNPが存在するが、WNT5B遺伝子のコード領域内には1つの変異も見出すことができなかった。これら87個のSNP部位のうち、45個のSNPについて遺伝子型を特定することができた。第2の患者及び対照者の試料(症例群2及び対照群2)による関連性を解析した結果、下記表4に示したように、いくつかのSNP部位が2型糖尿病と有意な関連性を示し、特に、第3イントロン及び第4イントロンに存在するSNPが2型糖尿病との強い関連性を示した(イントロン3+1016、χ2=14.8、P=0.0001、オッズ比=1.73[95%信頼区間1.31−2.29]、イントロン4+438、χ2=15.6、P=0.00008、オッズ比=1.74[95%信頼区間1.32−2.29]、イントロン4+5776、χ2=15.9、P=0.00007、オッズ比=1.73[95%信頼区間1.32−2.27])。
2型糖尿病の原因におけるWNT5B遺伝子の関与の可能性を調べるために、まず最初にマウスWNT5B遺伝子の脂肪生成中の発現パターンを定量的リアルタイムPCRにより調べた。分化誘導後0、1,2、3、4、5、6、7、及び10日目の3T3−L1細胞から全RNAを抽出し、定量的リアルタイムPCRを行った。その結果、図4に示したように、WNT5B遺伝子の発現は分化誘導2日後に最も大量であり、その後さらに脂肪細胞への分化に伴って急速に減少した。
Arbp用センス鎖:5'-CAACGGCAGCATTTATAACCC-3' (配列番号21);アンチセンス鎖:5'- CCCATTGATGATGGAGTGTGG-3', (配列番号22)
PPARG用センス鎖:5'-TTTGAAAGAAGCGGTGAACCAC-3'(配列番号23);アンチセンス鎖:5'-ACCATTGGGTCAGCTCTTGTG-3', (配列番号24)
CEBPA用センス鎖:5'-AAAGCCAAGAAGTCGGTGGAC-3'(配列番号25);アンチセンス鎖:5'-GGTCATTGTCACTGGTCAACTCC-3', (配列番号26)
APM1用センス鎖:5'-GGGTGAGACAGGAGATGTTGGAATG-3'(配列番号27);アンチセンス鎖:5'-GCCAGTAAATGTAGAGTCGTTGACG-3'(配列番号28),
LEP用センス鎖:5'-TCCAGAAAGTCCAGGATGACACCAA-3'(配列番号29);アンチセンス鎖:5'-TCAGCATTCAGGGCTAACATCCAAC-3'(配列番号30)
Claims (1)
- 被験者から採取された生物学的な試料についてWNT5B遺伝子の変異を検出するヒト2型糖尿病に関する遺伝的素因の検出方法であって、前記WNT5B遺伝子の変異が、第一イントロンのT6974C、第二イントロンのG1079C及びG1636C、第三イントロンのT1016C、第四イントロンのG438C、C5776G及びT6763C、並びに第五イントロンのA4244Cからなる群より選択される1つ以上の一塩基多型を含む場合、前記被験者が2型糖尿病に罹患する可能性の高いことを示すことを特徴とする、ヒト2型糖尿病に関する遺伝的素因の検出方法。
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