JP6470044B2 - がんに対する免疫療法の有効性の予測方法 - Google Patents
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Description
本発明は、がんに対する免疫療法の有効性の予測方法に関する。
がんに対する免疫療法は、腫瘍の縮小効果に加えて、がん患者の生存期間及び無増悪生存期間を延長する延命効果を有することが報告されている。特に、この延命効果は、抗がん剤が効かなくなった末期のがん患者にも有効性が示されており、末期のがん患者の生活の質を向上させる治療法として免疫療法が注目されている。
免疫療法は、個人差の大きい免疫機能を活性化させる治療法なので、一部のがん患者に期待された効果が得られないことがある。このため、がん患者に免疫療法を行う前に、治療効果を予測できれば、がん患者に対する治療法の選択に有用な情報を提供できる。
特許文献１には、がん患者に対する免疫療法の治療効果を、所定の遺伝子の発現量から予測する方法が開示されている。この方法によれば、がん患者に対する免疫療法の治療効果を事前に予測することができる。
しかし、遺伝子の発現量は、服用した抗がん剤等の治療履歴、健康状態、環境等の様々な要因で変化することがある。このため、試料を採取したときの患者の状態によって予測結果が左右され、予測精度がばらつくことがある。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、がんに対する免疫療法の有効性をより高い精度で予測できるがんに対する免疫療法の有効性の予測方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明者は、標準治療抵抗性の再燃前立腺がん患者から免疫療法を受ける前に採取された末梢血を用いて遺伝子多型解析を行った。その結果、ハプトグロビン（以下、単に「ＨＰ」とする）遺伝子の転写開始点から５５塩基上流の塩基に係る一塩基多型（米国バイオテクノロジー情報センター（以下、単に「ＮＣＢＩ」とすることもある）のＳＮＰデータベースにおけるｒｓ５４７２）が免疫療法の有効性に関連することを見出した。免疫療法後の予後が良好だった患者は、予後が不良だった患者と比較して、当該一塩基多型の遺伝子型が統計的に有意に高い頻度でグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体であることが示された。この知見に基づいて、本発明者は本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第１の観点に係るがんに対する免疫療法の有効性の予測方法は、
被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定ステップと、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測ステップと、
を含み、
前記予測ステップでは、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効であると予測し、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効でないと予測する。
被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定ステップと、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測ステップと、
を含み、
前記予測ステップでは、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効であると予測し、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効でないと予測する。
本発明の第２の観点に係るがんに対する免疫療法の有効性の予測方法は、
被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定ステップと、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測ステップと、
を含み、
前記予測ステップでは、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が長いと予測し、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が短いと予測する。
被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定ステップと、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測ステップと、
を含み、
前記予測ステップでは、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が長いと予測し、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が短いと予測する。
また、前記がんは、
前立腺がん又は消化器がんである、
こととしてもよい。
前立腺がん又は消化器がんである、
こととしてもよい。
また、前記試料は、
血液である、
こととしてもよい。
また、前記予測ステップでは、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に対応する、前記ペプチドワクチン療法の統計的に有意な有効性を予測する、
こととしてもよい。
血液である、
こととしてもよい。
また、前記予測ステップでは、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に対応する、前記ペプチドワクチン療法の統計的に有意な有効性を予測する、
こととしてもよい。
また、本発明の第３の観点に係る上記の予測方法に用いるプライマー対は、
ゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を、ＰＣＲ産物の塩基配列中に含むように設計されたものである。
ゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を、ＰＣＲ産物の塩基配列中に含むように設計されたものである。
また、本発明の第４の観点に係る上記の予測方法に用いるプローブは、
ゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸を増幅したＰＣＲ産物に相補的な核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。
ゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸を増幅したＰＣＲ産物に相補的な核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。
この場合、前記一塩基多型の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニン、アデニン又はチミンである、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
また、本発明の第５の観点に係るがんに対する免疫療法の有効性の予測用キットは、
本発明の第３の観点に係るプライマー対及び本発明の第４の観点に係るプローブの少なくとも一つを含む。
本発明の第３の観点に係るプライマー対及び本発明の第４の観点に係るプローブの少なくとも一つを含む。
また、本発明の第６の観点に係るマイクロチップは、
がんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測するために使用されるマイクロチップであって、
被検者から採取されたゲノムＤＮＡを含む試料が注入される注入部と、
前記注入部に注入された試料からゲノムＤＮＡを抽出する抽出部と、
前記抽出部で抽出されたゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の部位を含む領域を増幅する増幅部と、
を備える。
がんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測するために使用されるマイクロチップであって、
被検者から採取されたゲノムＤＮＡを含む試料が注入される注入部と、
前記注入部に注入された試料からゲノムＤＮＡを抽出する抽出部と、
前記抽出部で抽出されたゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の部位を含む領域を増幅する増幅部と、
を備える。
また、本発明の第７の観点に係る解析装置は、
本発明の第６の観点に係るマイクロチップと、
前記マイクロチップで増幅された領域に含まれる前記一塩基多型の遺伝子型を決定する決定部と、
前記決定部で決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測部と、
を備える。
本発明の第６の観点に係るマイクロチップと、
前記マイクロチップで増幅された領域に含まれる前記一塩基多型の遺伝子型を決定する決定部と、
前記決定部で決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測部と、
を備える。
また、本発明の第８の観点に係るがんに対する免疫療法の有効性の予測用キットは、
被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定手段と、
前記決定手段で決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測手段と、
を備える。
この場合、前記予測手段は、
前記決定手段で決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効であると予測し、
前記決定手段で決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効でないと予測する、
こととしてもよい。
また、前記予測手段は、
前記決定手段で決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が長いと予測し、
前記決定手段で決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が短いと予測する、
こととしてもよい。
また、前記がんは、
前立腺がん又は消化器がんである、
こととしてもよい。
また、前記試料は、
血液である、
こととしてもよい。
また、前記予測手段は、
前記決定手段で決定された遺伝子型に対応する、前記ペプチドワクチン療法の統計的に有意な有効性を予測する、
こととしてもよい。
また、本発明の第９の観点に係るがんに対する免疫療法の有効性の予測用キットは、
被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定手段と、
前記決定手段で決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対する免疫療法の有効性を予測する予測手段と、
を備えるがんに対する免疫療法の有効性の予測用キットであって、
前記決定手段は、
前記ゲノムＤＮＡにおける前記一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸に相補的な核酸を増幅したＰＣＲ産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを備え、
前記プローブは、
前記一塩基多型の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニン、アデニン又はチミンである。
また、本発明の第１０の観点に係るプローブは、
被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定ステップと、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対する免疫療法の有効性を予測する予測ステップと、
を含むがんに対する免疫療法の有効性の予測方法に用いるプローブであって、
前記ゲノムＤＮＡにおける前記一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸に相補的な核酸を増幅したＰＣＲ産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
前記一塩基多型の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニン、アデニン又はチミンである。
被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定手段と、
前記決定手段で決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測手段と、
を備える。
この場合、前記予測手段は、
前記決定手段で決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効であると予測し、
前記決定手段で決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効でないと予測する、
こととしてもよい。
また、前記予測手段は、
前記決定手段で決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が長いと予測し、
前記決定手段で決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が短いと予測する、
こととしてもよい。
また、前記がんは、
前立腺がん又は消化器がんである、
こととしてもよい。
また、前記試料は、
血液である、
こととしてもよい。
また、前記予測手段は、
前記決定手段で決定された遺伝子型に対応する、前記ペプチドワクチン療法の統計的に有意な有効性を予測する、
こととしてもよい。
また、本発明の第９の観点に係るがんに対する免疫療法の有効性の予測用キットは、
被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定手段と、
前記決定手段で決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対する免疫療法の有効性を予測する予測手段と、
を備えるがんに対する免疫療法の有効性の予測用キットであって、
前記決定手段は、
前記ゲノムＤＮＡにおける前記一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸に相補的な核酸を増幅したＰＣＲ産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを備え、
前記プローブは、
前記一塩基多型の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニン、アデニン又はチミンである。
また、本発明の第１０の観点に係るプローブは、
被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定ステップと、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対する免疫療法の有効性を予測する予測ステップと、
を含むがんに対する免疫療法の有効性の予測方法に用いるプローブであって、
前記ゲノムＤＮＡにおける前記一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸に相補的な核酸を増幅したＰＣＲ産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
前記一塩基多型の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニン、アデニン又はチミンである。
本発明によれば、ＮＣＢＩのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型に基づいて、がんに対する免疫療法の有効性を予測する。遺伝子型は、試料を採取したときの被検者の状態に影響されないため、がんに対する免疫療法の有効性をより高い精度で予測できる。
（実施の形態１）
まず、本発明の実施の形態１について説明する。
まず、本発明の実施の形態１について説明する。
本発明の実施の形態１に係るがんに対する免疫療法の有効性の予測方法は、被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、ＮＣＢＩのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定ステップと、決定ステップで決定された遺伝子型に基づいて被検者のがんに対する免疫療法の有効性を予測する予測ステップと、を含む。
まず、決定ステップについて詳細に説明する。決定ステップでは、被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおけるｒｓ５４７２の遺伝子型を決定する。被検者とは、ヒトである。人種は限定されないが、本発明は、日本人のがん患者を対象とする遺伝子多型解析に基づいてなされたため、被検者は、アジア人であることが好ましく、より好ましくは、日本人である。
試料とは、任意の生物学的試料であって、ゲノムＤＮＡを含むものであればよい。試料は、例えば、ヒトの血液、血清、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液、肝臓、皮膚等の細胞、毛髪等の体毛等である。ゲノムＤＮＡは、公知の方法によって、試料から抽出し、精製し、調製することができる。
下記実施例に示すように、ＨＰ遺伝子の転写開始点から５５塩基上流の位置には一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下、単に「ＳＮＰ」とする）が存在する。ＨＰ遺伝子の転写開始点を＋１として−６９７から＋１４８までの塩基配列を配列番号１に示す。当該ＳＮＰは、ＮＣＢＩのＳＮＰデータベースにおいて「ｒｓ５４７２」として登録されている。なお、ＨＰ遺伝子の転写開始点は、Nobuyo Maeda, DNA Polymorphisms in the Controlling Region of the Human Haptoglobin Genes: A Molecular Explanation for the Haptoglobin 2-1 Modified Phenotype.,Am. J. Hum. Genet., 1991, 49:158-166に基づく。
ここで、ＳＮＰは、生物の集団において、ゲノムＤＮＡの塩基配列中で１つの塩基の置換、欠失、挿入、転位、逆位等の変異であって、その変異が集団内で１％以上の頻度で現れるものをいう。本明細書においてＳＮＰという場合には、ＨＰ遺伝子のコーディング鎖側の多型および非コーディング鎖側の多型のいずれかまたは両方を意味するが、ＳＮＰを記載する場合には、特に言及する場合を除いてコーディング鎖側の塩基で記載する。
ＨＰ遺伝子は、１６番染色体上に存在する。ＨＰ遺伝子は、肝実質細胞やリンパ節等の成熟顆粒白血球（特に好酸球）で生合成されるＨＰをコードする。ＨＰは、急性期反応タンパク質の特性を有している。感染症、炎症、組織崩壊、悪性腫瘍等において、ＨＰは血清中で著しく増加することが報告されている。
ｒｓ５４７２の遺伝子型の決定では、ＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録されたＳＮＰの部位の塩基（以下、単に「標的塩基」とする）がグアニンであるかアデニンであるかを決定すればよい。標的塩基の決定は、例えば、ダイレクトシークエンス法によって行うことができる。ダイレクトシークエンス法では、ゲノムＤＮＡを鋳型にして標的塩基を含む領域の核酸をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で増幅し、ＰＣＲ法で増幅された核酸の塩基配列を解析する。
ＰＣＲ法では、ＤＮＡポリメラーゼが核酸の断片であるプライマーを伸長することによって目的の核酸を増幅する。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型となるＤＮＡに相補的なデオキシヌクレオチド三リン酸がその３’末端に付加されて、５’末端から３’末端の方向に伸長される。ＰＣＲ法では、反応温度の変化により、２本鎖の鋳型のＤＮＡが１本鎖にほどかれ、プライマーが鋳型のＤＮＡにアニーリングされ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が行われ、伸長されたプライマーと鋳型のＤＮＡとがほどかれる。これを繰り返すことにより、目的の核酸を増幅することができる。
ＰＣＲ法で用いるプライマーは、例えば、標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列の核酸、好ましくは１０塩基から１００塩基の塩基配列の核酸、より好ましくは、１０塩基から５０塩基の塩基配列の核酸、及びそれらに相補的な核酸の少なくとも１つを増幅するように設計される。例えば、増幅の対象となる標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する１０塩基の核酸の塩基配列は、標的塩基がアデニンの場合、５’末端から３’末端に向かって「ggagAagggg」である。なお、「A」は標的塩基を示す。これに対して、標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基の核酸に相補的な核酸の塩基配列は、例えば、５’末端から３’末端に向かって「ccccttctcc」である。より具体的には、プライマーとして、例えば、配列番号２及び配列番号３に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。
ＰＣＲ法で増幅された核酸の塩基配列の解析は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０（アプライドバイオシステムズ社）等の配列解析装置を用いて行うことができる。また、核酸の塩基配列の解析は、例えば、ジデオキシ法、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法等の公知の方法により行うことができる。
ＰＣＲ法で増幅された核酸の標的塩基の種類は、例えば、標的塩基が一の種類の塩基の場合に、特異的にハイブリダイゼーションするプローブを利用して決定してもよい。プローブとは、核酸の相補性に基づいたハイブリダイゼーション等を利用して核酸又はその塩基配列中の特定の部位について解析するための核酸の断片をいう。プローブは、例えば、標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列の核酸、好ましくは１０塩基から１００塩基の塩基配列の核酸、より好ましくは、１０塩基から５０塩基の塩基配列の核酸、又はそれらの核酸に相補的な核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。この場合、プローブのほぼ中心部位の塩基が、標的塩基に相補的であるのが好ましい。プローブは、標的塩基が一の種類である核酸とはハイブリダイズするが、標的塩基が他の種類である核酸とはハイブリダイズしないものであれば、その塩基配列において１又は複数の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等によって標識されたものであってもよい。
ハイブリダイゼーションの条件は、標的塩基を区別するのに十分な条件であればよい。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、プローブが、標的塩基が一の種類である核酸とはハイブリダイズするが、標的塩基が他の種類である核酸とはハイブリダイズしないストリンジェントな条件である。ストリンジェントな条件は、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版（２００１年）等に基づき適宜決定でき、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で保温、である。
より具体的には、プローブを用いた標的塩基の種類の決定は、例えば、インベーダー（登録商標）法で行うことができる。この方法では、試料中の核酸に対して相補的なインベーダープローブと、５’のフラップ構造を有しており、核酸に相補的なシグナルプローブとを使用する。シグナルプローブは、標的塩基の種類それぞれに相補的な塩基を含む。シグナルプローブは、核酸上の標的塩基の部位で、インベーダープローブとオーバーラップするように設計される。
インベーダー（登録商標）法では、まず、試料中の核酸に対してインベーダープローブとシグナルプローブとをハイブリダイズさせる。次に、インベーダープローブとシグナルプローブとがオーバーラップする部位にフラップ・エンドヌクレアーゼを作用させる。標的塩基とその塩基に対応するシグナルプローブの塩基とが相補的である場合には、シグナルプローブのフラップがフラップ・エンドヌクレアーゼによって切断される。切断されたフラップが、蛍光色素で標識された検出用のＤＮＡ基質とハイブリダイズして新たなフラップを形成する。このフラップをフラップ・エンドヌクレアーゼが認識し、切断することで蛍光色素が遊離する。シグナルプローブを異なる蛍光色素で標識しておくことによって、蛍光色素に基づく蛍光シグナルを検出することにより、標的塩基を含む領域の塩基配列情報に基づき、常套的方法で合成することができる。
この他、標的塩基の種類の決定に用いるプローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法に用いられるもの等であってもよい。なお、決定ステップでは、ゲノムＤＮＡと同一又は完全に相補的なｃＤＮＡやｍＲＮＡについて、標的塩基に対応する塩基の種類を決定することで、ゲノムＤＮＡにおける標的塩基の遺伝子型を決定してもよい。
次に、予測ステップについて詳細に説明する。予測ステップでは、決定ステップで決定された遺伝子型に基づいて被検者のがんに対する免疫療法の有効性を予測する。
がんの種類は、特に限定されず、固形がんであっても液性がんであってもよい。例えば、がんの種類は、前立腺がん、消化器がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、乳がん等である。がんの種類としては、特に前立腺がん及び消化器がんが好ましく、消化器がんにおいては、胃がんが特に好ましい。がんの進行度は、特に限定されず、再燃したがんであってもよい。例えば、前立腺がんにおいては、ホルモン療法が効かなくなった状態である再燃前立腺がんであってもよく、標準治療に対して抵抗性を示す標準治療抵抗性であってもよい。
免疫療法とは、がん患者における腫瘍抗原タンパク質に対する免疫応答を活性化することによりがんを治療する方法である。免疫療法として、具体的には、腫瘍抗原ペプチドを接種するペプチドワクチン療法、患者由来の傷害性Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞を利用する活性化自己リンパ球移入療法、腫瘍抗原タンパク質や腫瘍抗原ペプチドを発現するウイルスベクターを投与するＤＮＡワクチン療法、腫瘍抗原ペプチドを提示する樹状細胞を投与する樹状細胞ワクチン療法等が挙げられる。これらの中でも、下記実施例に示すように、免疫療法としてはペプチドワクチン療法が好ましい。
例えば、予測ステップでは、決定ステップで決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、免疫療法が被検者に有効であると予測する。また、決定ステップで決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、免疫療法が被検者に有効でないと予測する。
遺伝子型がグアニンのホモ接合体とは、遺伝子座における対立遺伝子の標的塩基が両方ともグアニン（Ｇ）であるということである。これに対し、遺伝子座における対立遺伝子の標的塩基が両方ともアデニン（Ａ）の場合、遺伝子型がアデニンのホモ接合体であるという。また、遺伝子型がヘテロ接合体とは、遺伝子座における対立遺伝子の標的塩基が相違し、一方がグアニン（Ｇ）、他方がアデニン（Ａ）であるということである。
免疫療法の有効性は、例えば、免疫療法を開始してから死亡するまでの期間である全生存期間、あるいは免疫療法後の生存期間等で評価できる。例えば、予測ステップでは、決定ステップで決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、免疫療法後の被検者の生存期間が長いと予測してもよい。一方、決定ステップで決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、免疫療法後の被検者の生存期間が短いと予測してもよい。
より具体的には、下記実施例１に基づいて、決定ステップで決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体の場合には、免疫療法開始後の被検者の生存期間が９００日以上であると予測し、決定ステップで決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、免疫療法開始後の被検者の生存期間が３００日以下であると予測するようにしてもよい。こうすることで、被検者の生存期間をより具体的に予測できる。この場合、生存期間が９００日以上の被検者は、生存期間が３００日以下の被検者よりも免疫療法が有効であったと言える。なお、生存期間に関する上記閾値は、がんの種類、進行度、既往歴等に応じて決めることができる。
この他、免疫療法の有効性は、手術等でがんがいったん完治した被検者において免疫療法を開始してから再発又は死亡するまでの期間である無病生存期間、所定レベル以上の腫瘍縮小が認められた患者の割合である奏功率、免疫療法を開始してからがんが進行または死亡するまでの期間である無増悪生存期間、免疫療法を開始してからがんが進行するまでの期間である無増悪期間、免疫療法を開始して１年、３年あるいは５年後の生存患者又は再発患者の割合である１年、３年あるいは５年生存率又は再発率、免疫療法後の生活の質（ＱＯＬ）に関する指標等で評価できる。
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るがんに対する免疫療法の有効性の予測方法によれば、ｒｓ５４７２の遺伝子型に基づいて、がんに対する免疫療法の有効性を予測する。遺伝子型は、試料を採取したときの被検者の状態に影響されないため、がんに対する免疫療法の有効性をより高い精度で予測できる。
また、本実施の形態に係るがんに対する免疫療法の有効性の予測方法によれば、１塩基の種類を決定するだけで、被検者に対する免疫療法の有効性が予測できるので、がんに対する免疫療法の有効性を簡便かつ迅速に予測できる。
なお、本実施の形態に係る予測方法によれば、免疫療法の効果が期待できる被検者、免疫療法の効果が期待できない被検者、免疫療法に対して治療抵抗性を示す被検者を予測できる。このため、当該予測方法は、治療方法の選択における意思決定に有用である。
また、本実施の形態では、予測ステップにおいて、決定ステップで決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、免疫療法後の被検者の生存期間が長いと予測し、決定ステップで決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、免疫療法後の被検者の生存期間が短いと予測してもよいこととした。生存期間は、がん治療における重要な評価項目であり、この点でも、治療方法の選択における意思決定に有用である。
また、本実施の形態に係る予測方法において、がんは前立腺がん又は消化器がんであってもよいこととした。前立腺がんには、再燃前立腺がん及び標準治療抵抗性前立腺がん等、いわゆる難治性の前立腺がんが含まれる。また、消化器がんには、標準治療抵抗性消化器がん等の難治性の消化器がんが含まれる。本実施の形態に係る予測方法を、このような難治性の前立腺がん又は消化器がんの患者に適用することで、選択できる治療方法が限られた中での免疫療法の適用または不適用を決定する方法として利用することができる。
なお、本実施の形態に係る予測方法において、免疫療法は、ペプチドワクチン療法であってもよいこととした。ペプチドワクチン療法によって、前立腺がん、胃がん、脳腫瘍、子宮頚がん、大腸がんなどでがんが縮小したり、長期間に渡ってがんの進行が抑えられ、より長い生存期間が得られたりした症例が報告されている。本実施の形態に係る予測方法を適用して患者を選択することによって、がん縮小効果、進行抑制効果、延命効果などのペプチドワクチン療法の効果が得られる確率を高めることができる。
また、本実施の形態に係る予測方法において、被検者から採取される試料は、血液であってもよいこととした。通常、血液はがんの検査、治療、予後観察において採取されるため、容易に入手できる。
なお、下記実施例に示すように、ｒｓ５４７２の部位を含むポリヌクレオチドは、がんに対する免疫療法の有効性の予測用又は診断用マーカーとして有用である。例えば、がんに対する免疫療法の有効性の予測用マーカーは、ｒｓ５４７２の部位の塩基を含むゲノムＤＮＡの１０〜１００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドである。当該ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、６４３番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列からなる。また、下記実施例によれば、被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおけるｒｓ５４７２の遺伝子型を決定し、決定された遺伝子型に基づいて被検者のがんに対する免疫療法の有効性を診断することもできる。
（実施の形態２）
次に、実施の形態２について説明する。本発明の実施の形態２は、標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基を、ＰＣＲ産物の塩基配列中に含むように設計された、上記がんに対する免疫療法の有効性の予測方法に用いるプライマー対である。
次に、実施の形態２について説明する。本発明の実施の形態２は、標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基を、ＰＣＲ産物の塩基配列中に含むように設計された、上記がんに対する免疫療法の有効性の予測方法に用いるプライマー対である。
標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基とは、例えば、塩基配列が上記した「ggagAagggg」で示される１０塩基である。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ法によって増幅された核酸である。ここで、プライマー対とは、例えば、２本鎖の鋳型ＤＮＡのコーディング鎖側を５’末端から３’末端の方向に伸長するためのフォワードプライマーと、非コーディング鎖側を５’末端から３’末端の方向に伸長するためのリバースプライマーとの対をいう。例えば、フォワードプライマーによるＰＣＲ産物の塩基配列に上記「ggagAagggg」が含まれる場合、リバースプライマーによるＰＣＲ産物の塩基配列には、「ccccttctcc」が含まれる。
フォワードプライマーは、例えば、配列番号２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、リバースプライマーは、例えば、配列番号３に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。この他、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせとしては、配列番号４に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドと配列番号５に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、及び配列番号６に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドと配列番号７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドとの組み合わせ等がある。
プライマーとしてのオリゴヌクレオチドは、既知の方法で合成することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、固相ホスホルアミダイト法等を含む任意の核酸合成法により化学的に合成される。オリゴヌクレオチドは、トリエステル法でも合成できる。また、種々の自動オリゴヌクレオチド合成装置が市販されており、オリゴヌクレオチドは、当該自動オリゴヌクレオチド合成装置で合成することもできる。また、マルチヌクレオチド合成法も適宜使用することができる。
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るプライマー対によれば、標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む塩基配列の核酸が増幅されるので、標的塩基の種類を効率よく決定できる。このため、上記がんに対する免疫療法の有効性の予測方法に好適である。
（実施の形態３）
本発明の実施の形態３は、標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸に相補的な核酸にハイブリダイズし、上記がんに対する免疫療法の有効性の予測方法に用いるプローブである。
本発明の実施の形態３は、標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸に相補的な核酸にハイブリダイズし、上記がんに対する免疫療法の有効性の予測方法に用いるプローブである。
プローブは、例えば、上記インベーダー（登録商標）法に用いられるものであってもよい。また、プローブは、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法に用いられるものであってもよい。
また、プローブは、標的塩基を含む核酸とのハイブリダイズを定量することで、標的塩基の遺伝子型の決定に使用することができる。
ハイブリダイゼーションを定量する方法として、例えば、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）法及び金の異常反射を用いる方法等が挙げられる。ＳＰＲ法等を用いることで、ハイブリダイゼーションをリアルタイムに、かつ精度よく定量できる。ＳＰＲ法を用いる場合、例えば、プローブの３’末端にリンカーを付加し、リンカーの３’末端にビオチンをさらに付加することで、表面にアビジンを有するセンサチップに、当該プローブを固定化できる。
公知のＳＰＲ測定装置に上記センサチップをセットし、センサチップに核酸を含む溶液を接触させる前後の共鳴角の差としてハイブリダイゼーションの強さを定量できる。この場合、標的塩基に対応する塩基がチミンであるアデニン検出用プローブは、標的塩基がアデニンである核酸とより強くハイブリダイズする。一方、標的塩基に対応する塩基がシトシンであるグアニン検出用プローブは、標的塩基がグアニンである核酸とより強くハイブリダイズする。ここで、下記実施例４のように、標的塩基に対応する塩基がアデニンであるチミン検出用プローブを用いることで、アデニン検出用プローブ又はグアニン検出用プローブと標的塩基を含む核酸とのハイブリダイゼーションの強さを補正して定量できる。
アデニン検出用プローブ、グアニン検出用プローブ及びチミン検出用プローブの塩基配列は、例えば、それぞれ配列番号８、配列番号９及び配列番号１０で示される。
また、本実施の形態に係るプローブは、標的塩基を含む核酸にハイブリダイズする限り、１又は複数塩基の変異があってもよい。例えば、プローブは、ｒｓ５４７２の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニン、アデニン又はチミンであってもよい。ｒｓ５４７２の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニンの場合、アデニン検出用プローブ、グアニン検出用プローブ及びチミン検出用プローブの塩基配列は、それぞれ配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３で示される。ｒｓ５４７２の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がアデニンの場合、アデニン検出用プローブ、グアニン検出用プローブ及びチミン検出用プローブの塩基配列は、それぞれ配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６で示される。ｒｓ５４７２の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がチミンの場合、アデニン検出用プローブ、グアニン検出用プローブ及びチミン検出用プローブの塩基配列は、それぞれ配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で示される。
プローブとしてのオリゴヌクレオチドは、上記したプライマーの合成等と同様に既知の方法で合成することができる。
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るプローブは、標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸にハイブリダイズするので、標的塩基の種類を効率よく決定できる。このため、上記がんに対する免疫療法の有効性の予測方法に好適である。
また、本実施の形態に係るプローブは、ｒｓ５４７２の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニン、アデニン又はチミンであってもよいこととした。下記実施例４に示すように、当該プローブによれば、ｒｓ５４７２の遺伝子型をより高い精度で決定できる。
（実施の形態４）
本発明の実施の形態４は、上記プライマー対及び上記プローブの少なくとも一方を含む、がんに対する免疫療法の有効性の予測用キットである。
本発明の実施の形態４は、上記プライマー対及び上記プローブの少なくとも一方を含む、がんに対する免疫療法の有効性の予測用キットである。
がんに対する免疫療法の有効性の予測用キットに含まれるプライマー対は、標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基を、ＰＣＲ産物の塩基配列中に含むように設計されたものであればよい。例えば、がんに対する免疫療法の有効性の予測用キットは、プライマー対として、配列番号２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを含むのが好ましい。
また、がんに対する免疫療法の有効性の予測用キットに含まれるプローブは、標的塩基を含むゲノムＤＮＡの連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸に相補的な核酸にハイブリダイズするものであればよい。
がんに対する免疫療法の有効性の予測用キットに含まれるプライマー対及びプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、上記の既知の方法で合成することができる。なお、がんに対する免疫療法の有効性の予測用キットは、上記がんに対する免疫療法の有効性の予測方法における決定ステップで使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識、緩衝液等を含んでもよい。
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るがんに対する免疫療法の有効性の予測用キットによれば、標的塩基の種類をより迅速に決定できるので、上記がんに対する免疫療法の有効性の予測方法に好適である。
なお、上記実施の形態１における標的塩基の種類の決定は、既知の制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析法で行ってもよい。この方法では、標的塩基の種類に応じて核酸を切断するか否かが異なる制限酵素で試料中の核酸を処理する。続いて、処理された核酸の断片の大きさを調べることによって、核酸が切断されたか否かがわかるため、標的塩基の種類を決定することができる。
また、上記実施の形態１における標的塩基の種類の決定は、既知の方法である変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ：ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ：ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）、ＡＳＯ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）によるハイブリダイゼーション法、ミスマッチ部位の化学的切断（ＣＣＭ：ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ法、ＰＥＸ（ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；特許第２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）等を用いて行ってもよい。
また、上記実施の形態１における標的塩基の種類の決定では、標的塩基と連鎖不平衡にある塩基の種類を決定してもよい。ここで「標的塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、標的塩基との連鎖不平衡係数ｒ２＞０．５、好ましくはｒ２＞０．８、さらに好ましくはｒ２＞０．９を満たす塩基をいう。標的塩基と連鎖不平衡にある塩基は、例えば、ＨａｐＭａｐデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。また、標的塩基と連鎖不平衡にある塩基は、複数人（通常は２０−４０人程度）から採取したＤＮＡの配列を解析し、連鎖不平衡にあるＳＮＰを探索することにより同定することもできる。
なお、上記実施の形態１、３、４におけるプローブは、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法による増幅に用いられる一本鎖プローブ（パドロックプローブ）のように、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になることによって上記プローブの条件を満たすものでもよい。また、プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップとして用いてもよい。この場合、ＤＮＡチップには、標的塩基が一の種類である核酸に相補的なプローブのみが固定されていてもよいし、このプローブに加えて、標的塩基が他の種類である核酸に相補的なプローブが固定されていてもよい。
（実施の形態５）
本発明の実施の形態５に係るマイクロチップ１００及び解析装置２００について図面を参照して説明する。
本発明の実施の形態５に係るマイクロチップ１００及び解析装置２００について図面を参照して説明する。
図１は、本実施の形態に係るマイクロチップ１００及び解析装置２００の装置構成を示す斜視図である。マイクロチップ１００は、複数のプレートを積層して構成される多層構造である。マイクロチップ１００の複数のプレートは、その一部を貫通させることで試料槽及び反応槽を形成する。マイクロチップ１００には、ピン穴１０ａ、１０ｂが設けられている。ピン穴１０ａ、１０ｂは、マイクロチップ１００を解析装置２００に配置する際、解析装置２００に対するマイクロチップ１００の位置を決める。
図２を参照して、マイクロチップ１００を詳細に説明する。マイクロチップ１００は、注入部としての試料注入部１０１と、洗浄バッファ注入部１０２と、ＰＣＲ試薬注入部１０３と、抽出部１０４と、排出口１０５と、増幅部としてのＰＣＲ部１０６と、流路１０７とを備える。
試料注入部１０１には、被検者から採取されたゲノムＤＮＡを含む試料が注入される。試料注入部１０１は窪み状に形成されているため、ユーザは、被検者から採取されたゲノムＤＮＡを含む試料を試料注入部１０１に注入できる。試料は、リシスバッファ（例えば、ＳＤＳ／ＬｉＯＡｃ溶液（ドデシル硫酸ナトリウム／酢酸リチウム溶液））に被検者から採取した試料（例えば、口腔内粘膜、血液、体液など）を懸濁した溶液である。
洗浄バッファ注入部１０２は窪み状に形成されているため、ユーザは、洗浄バッファを注入できる。洗浄バッファは、例えば、Ｔｒｉｓバッファであり、ＤＮＡの磁性ビーズ（シリカ）への結合を維持するために高塩濃度に調製される。
ＰＣＲ試薬注入部１０３は窪み状に形成されているため、ユーザは、ＰＣＲ試薬を注入できる。ＰＣＲ試薬は、例えば、ポリメラーゼ、蛍光ラベル化されたｄｄＮＴＰ、マグネシウム等を含む。
なお、リシスバッファ、洗浄バッファ及びＰＣＲ試薬は市販のものを利用できるし、必要に応じて組成を改変して調製することもできる。また、洗浄バッファ及びＰＣＲ試薬は、上記のようにユーザが注入してもよいが、マイクロチップ１００に予め封入しておいてもよい。
抽出部１０４は、試料注入部１０１に注入された試料からゲノムＤＮＡを抽出する。抽出部１０４は、試料からゲノムＤＮＡを抽出するために設けられた反応槽である。抽出部１０４には、ゲノムＤＮＡを抽出するための磁性ビーズが封入されている。以下では、試料から抽出されるゲノムＤＮＡを、テンプレートＤＮＡともいう。
排出口１０５は、抽出部１０４においてテンプレートＤＮＡが抽出された後に残る洗浄バッファ等の排液を排出する。
ＰＣＲ部１０６は、抽出部１０４で抽出されたテンプレートＤＮＡにおける、ＮＣＢＩのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録されたＳＮＰの部位を含む領域を増幅する。ＰＣＲ部１０６は、テンプレートＤＮＡのｒｓ５４７２の部位を含む領域を増幅するための反応槽である。ＰＣＲ部１０６は、ＰＣＲを行うことで当該領域を増幅する。ＰＣＲを行うために、ＰＣＲ部１０６は、解析装置２００によって温度が調整される。ＰＣＲ部１０６には、テンプレートＤＮＡのｒｓ５４７２の部位を含む領域を増幅するように設計されたプライマーが封入される。
流路１０７は、例えば管であって、管内を液体が流れるように形成される。流路１０７は、試料注入部１０１、洗浄バッファ注入部１０２、ＰＣＲ試薬注入部１０３、抽出部１０４、排出口１０５、ＰＣＲ部１０６を図２に示すように連結する。流路１０７内の液体の流れは、解析装置２００によって制御される。
次に、図１に戻って、解析装置２００を詳細に説明する。解析装置２００は、台座１と、テーブル２と、制御部３と、蓋４と、蓄圧器５と、電磁弁６と、チューブ７と、電源部８と、解析部９とを備える。
台座１の上にはテーブル２が配置される。テーブル２は、その上面にピン２１ａ、２１ｂと、温度調整部２２と、測定部２３とが配設される。ピン２１ａ、２１ｂは、マイクロチップ１００に設けられたピン穴１０ａ、１０ｂにそれぞれ挿入されることで、マイクロチップ１００がテーブル２の所定の位置に配置される。マイクロチップ１００がテーブル２の所定の位置に配置されると、マイクロチップ１００のＰＣＲ部１０６が温度調整部２２及び測定部２３と接触する。
制御部３は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）及びメモリ（いずれも不図示）を備え、ＣＰＵがメモリに格納されたプログラムを実行する。制御部３は、温度調整部２２、測定部２３、電磁弁６及び電源部８を制御する。
台座１と蓋４とは、ヒンジ４１を介して開閉可能に接続されている。蓋４には、蓋４を貫通する複数の加圧穴４２が設けられている。蓄圧器５には、圧縮空気等が封入されている。蓄圧器５の内部圧力は、図示しない圧力センサ及びポンプ等により、所定の圧力の大きさを維持するように制御される。
電磁弁６は、加圧穴４２と蓄圧器５との間に介在し、加圧穴４２と蓄圧器５とチューブ７で接続されている。電磁弁６が開閉することで加圧穴４２にかかる圧力が制御される。電磁弁６が開くと、加圧穴４２から圧縮空気が放出される。
マイクロチップ１００をテーブル２の所定の位置に配置した状態で蓋４を閉じると、マイクロチップ１００の所定の領域が加圧穴４２と接触する。加圧穴４２と接触するマイクロチップ１００の領域は、加圧穴４２から放出された圧縮空気で加圧される。このため、マイクロチップ１００の流路１０７は開閉機能を実現する。より詳細には、例えば、抽出部１０４からＰＣＲ部１０６へ液体を移送する場合には、抽出部１０４とＰＣＲ部１０６との間を除く流路１０７に加圧した状態で抽出部１０４に加圧する。こうすることで、抽出部１０４内の液体は、抽出部１０４とＰＣＲ部１０６との間の流路１０７に押し出され、ＰＣＲ部１０６に流入する。なお、図１には、加圧穴４２、チューブ７及び電磁弁６が２組しか記載されていないが、流路１０７の構成に応じて加圧穴４２、チューブ７及び電磁弁６を増減させてもよい。
蓋４の内部には、電磁石４３が配置されている。電磁石４３は、電源部８と接続されている。電源部８は、電磁石４３に電力を供給する。制御部３が電源部８に対して電磁石４３への電力の供給及び供給の停止を指示することで、電磁石４３の励磁が制御される。マイクロチップ１００をテーブル２の所定の位置に配置した状態で蓋４を閉じると、電磁石４３によって発生した磁場がマイクロチップ１００の抽出部１０４に及ぶようになる。
ここで、抽出部１０４におけるテンプレートＤＮＡの抽出について詳細に説明する。解析装置２００は、試料注入部１０１に注入された試料を抽出部１０４に移送する。抽出部１０４に移送された試料に含まれるテンプレートＤＮＡは、抽出部１０４に封入された磁性ビーズに吸着する。試料を抽出部１０４に移送後、解析装置２００は、洗浄バッファ注入部１０２の洗浄バッファを抽出部１０４に移送し、磁性ビーズを洗浄する。抽出部１０４には、電磁石４３によって発生した磁場を及ぼすことができるため、解析装置２００は、電磁石４３に磁性ビーズを吸着させることで抽出部１０４にテンプレートＤＮＡを残し、試料及び洗浄バッファを排出口１０５から排出する。このようにして、抽出部１０４は、テンプレートＤＮＡを抽出することができる。
なお、磁性ビーズを用いたテンプレートＤＮＡの抽出には、例えば、東洋紡社のＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）、タカラバイオ社のＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）等を利用できる。テンプレートＤＮＡの抽出方法は、例えば、洗浄の回数を増やすなど、必要に応じて改変することもできる。また、テンプレートＤＮＡの抽出方法は、磁性ビーズを用いた方法に限定されず、キアゲン社のＱＩＡａｍｐ等のようにシリカビーズカラムを用いてテンプレートＤＮＡを抽出してもよい。
温度調整部２２は、伝熱材等を備え、テーブル２の所定の位置に配置されたマイクロチップ１００のＰＣＲ部１０６の温度を調整する。温度調整部２２による温度の調整によって、ＰＣＲ部１０６は、テンプレートＤＮＡのｒｓ５４７２の部位を含む領域を増幅する。
ＰＣＲ部１０６におけるｒｓ５４７２の部位を含む領域の増幅について詳細に説明する。解析装置２００は、ＰＣＲ試薬注入部１０３からＰＣＲ試薬を、抽出部１０４に移送する。ＰＣＲ試薬は、磁性ビーズからテンプレートＤＮＡを溶出する溶出バッファとしての役割も果たすため、低塩濃度に調製されている。溶出されたテンプレートＤＮＡ及びＰＣＲ試薬は、さらにＰＣＲ部１０６に移送される。温度調整部２２は、伝熱材を介して、制御部３による制御の下、予めプログラムされたようにＰＣＲ部１０６の温度を調整する。ＰＣＲ部１０６の温度は、例えば、９５℃に５分間維持され、９４℃に３０秒→５５℃に３０秒→７２℃に２０秒を３０サイクル繰り返した後、７２℃に３分間を経て４℃に制御される。ＰＣＲの温度条件及びサイクル数等は、Ｔｍ値（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）及びプライマーセットの長さ等に基づいて変更可能である。
ここで、例えば、ＳＮａＰｓｈｏｔ（登録商標）法のように、増幅するためのフォワードプライマーだけがＰＣＲ部１０６にプライマーセットとして封入されてもよい。当該フォワードプライマーの３’末端は、ｒｓ５４７２の部位のすぐ隣の塩基に対応するように設計されている。ＰＣＲ部１０６の溶液中にはｄＮＴＰが含まれないため、当該フォワードプライマーの３’末端は、塩基の種類に対応する蛍光で標識されたｄｄＮＴＰで１塩基のみ伸長される。この結果、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡであるアンプリコンに、蛍光ラベルされたｄｄＮＴＰが取り込まれる。なお、ＳＮａＰｓｈｏｔ（登録商標）法に用いる試薬は、ライフテクノロジーズ社から入手可能である。
測定部２３は、レーザを照射する発光素子と、当該発光素子から照射されたレーザによる励起によって発光した蛍光を受光する受光素子とを備える（いずれも不図示）。測定部２３は、ＰＣＲ部１０６にレーザを照射することで、アンプリコンに取り込まれたｄｄＮＴＰから発光される蛍光を受光する。測定部２３は、受光した蛍光に応じた信号を出力する。
解析部９は、決定部として機能する。解析部９は、マイクロチップ１００で増幅された領域に含まれるｒｓ５４７２の遺伝子型を決定する。より具体的には、例えば、解析部９は、アンプリコンに取り込まれたｄｄＮＴＰから発光される蛍光に応じて出力された信号を受信し、塩基の種類に基づいてｒｓ５４７２の遺伝子型を決定する。
また、解析部９は、予測部として機能する。解析部９は、決定したｒｓ５４７２の遺伝子型に基づいて被検者のがんに対する免疫療法の有効性を予測する。
以上、詳細に説明したように、本実施の形態に係るマイクロチップ１００は、被検者から採取された試料からゲノムＤＮＡを抽出し、抽出されたゲノムＤＮＡにおけるｒｓ５４７２の部位を含む領域を増幅する。このため、増幅した核酸に種々の方法を適用することでｒｓ５４７２の遺伝子型を決定することができる。また、マイクロチップ１００は、小型で軽量なため、取り扱いが容易で簡便にｒｓ５４７２の部位を含む領域を増幅することができる。
なお、本実施の形態におけるｒｓ５４７２の遺伝子型の決定には、ＰＣＲを利用した他の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ部１０６は、インベーダー（登録商標）法や、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法を用いてもよい。各方法に応じたプライマーを合成し、ＰＣＲ部１０６に封入することで、その方法に応じたアンプリコンを得ることができる。
また、本実施の形態におけるｒｓ５４７２の遺伝子型の決定には、電気泳動法を用いることもできる。この場合、マイクロチップ１００に泳動ポリマを充填したキャピラリ内に、ホルムアミドで一本鎖ＤＮＡに変性させたアンプリコンをインジェクションし、キャピラリに接続した電極を用いて直流電圧を印加すればよい。なお、電気泳動法を用いる場合は、ＰＣＲ試薬にｄＮＴＰを加えておき、ＰＣＲ部１０６でｒｓ５４７２の部位を含む領域を増幅させる。こうすることで、分子ふるい効果によってアンプリコンが塩基配列長に応じて分離するため、遺伝子型を識別できるように塩基配列長が異なるプライマーセット等を用いることで、ｒｓ５４７２の遺伝子型を決定できる。
本実施の形態に係る解析装置２００は、マイクロチップ１００で増幅されたｒｓ５４７２の遺伝子型を決定し、決定された遺伝子型に基づいて被検者のがんに対する免疫療法の有効性を予測する。解析装置２００によれば、遺伝子型の決定にピペット等を用いた作業が不要になるため、操作性が向上し、迅速にがんに対する免疫療法の有効性を予測することができる。
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
（実施例１：遺伝子発現プロファイルの解析及びＨＰ遺伝子のＳＮＰ解析）
本実施例では、ペプチドワクチン療法前の患者について、ＤＮＡマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを解析した。次に、各遺伝子の発現量に基づいて遺伝子を選択した。続いて、選択された遺伝子から免疫又はがんに関連する遺伝子として選択されたＨＰ遺伝子に着目し、ＨＰ遺伝子のＳＮＰを解析した。以下実施例について詳細に説明する。
本実施例では、ペプチドワクチン療法前の患者について、ＤＮＡマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを解析した。次に、各遺伝子の発現量に基づいて遺伝子を選択した。続いて、選択された遺伝子から免疫又はがんに関連する遺伝子として選択されたＨＰ遺伝子に着目し、ＨＰ遺伝子のＳＮＰを解析した。以下実施例について詳細に説明する。
標準治療抵抗性の再燃前立腺がん患者から再燃前立腺がんと診断された時点に採取した末梢血を患者試料として用いた。ＤＮＡマイクロアレイ（Ｉｌｕｍｉｎａ社製、ＨｕｍａｎＷＧ−６ ｖ３．０ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ）を用いて、以下の手順に従って、患者試料についてペプチドワクチン療法前の遺伝子発現プロファイルを解析した。
（１）患者試料からのＲＮＡの抽出及び精製
１．患者試料にＴＲＩｚｏｌ（登録商標） ＬＳ（インビトロジェン社製）を３倍量添加し、混濁した。
２．得られた溶液７５０μｌに、２００μｌのクロロホルムを加え、混濁後、遠心分離した。
３．上清を新しいチューブに移し、上清の０．５５倍量のエタノールを添加した。
４．得られた溶液をＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）のカラムにアプライし、フィルターを通した。
５．フィルターを５００μｌのＷａｓｈバッファで洗浄した。
６．８０μｌのヌクレアーゼフリー水でフィルターからＲＮＡを溶出した。
７．分光光度計を用いて、ＲＮＡの濃度を測定した。
８．Ｅｘｐｅｒｉｏｎシステム（バイオラッド社製）を用いて、電気泳動によりＲＮＡの質をチェックした。
上記のようにして、予後良好群（ペプチドワクチン療法後の生存期間が９００日以上）の患者１８名、予後不良群（ペプチドワクチン療法後の生存期間が３００日以下）の患者１９名から遺伝子発現プロファイルの解析が可能なＲＮＡが得られた。
１．患者試料にＴＲＩｚｏｌ（登録商標） ＬＳ（インビトロジェン社製）を３倍量添加し、混濁した。
２．得られた溶液７５０μｌに、２００μｌのクロロホルムを加え、混濁後、遠心分離した。
３．上清を新しいチューブに移し、上清の０．５５倍量のエタノールを添加した。
４．得られた溶液をＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）のカラムにアプライし、フィルターを通した。
５．フィルターを５００μｌのＷａｓｈバッファで洗浄した。
６．８０μｌのヌクレアーゼフリー水でフィルターからＲＮＡを溶出した。
７．分光光度計を用いて、ＲＮＡの濃度を測定した。
８．Ｅｘｐｅｒｉｏｎシステム（バイオラッド社製）を用いて、電気泳動によりＲＮＡの質をチェックした。
上記のようにして、予後良好群（ペプチドワクチン療法後の生存期間が９００日以上）の患者１８名、予後不良群（ペプチドワクチン療法後の生存期間が３００日以下）の患者１９名から遺伝子発現プロファイルの解析が可能なＲＮＡが得られた。
（２）Ｉｌｕｍｉｎａ ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アンビオン社製）を用いたマイクロアレイ用ｃＲＮＡの合成
逆転写による一本鎖ｃＤＮＡの合成
１．各５００μｇのＲＮＡを含むチューブにヌクレアーゼフリー水を加え、１１μｌの溶液を調製した。
２．調製した溶液に９μｌのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを加え、チューブを４２℃で２時間インキュベートした。
逆転写による一本鎖ｃＤＮＡの合成
１．各５００μｇのＲＮＡを含むチューブにヌクレアーゼフリー水を加え、１１μｌの溶液を調製した。
２．調製した溶液に９μｌのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを加え、チューブを４２℃で２時間インキュベートした。
二本鎖ｃＤＮＡの合成
１．インキュベート後、８０μｌのＳｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘをチューブに添加した。
２．チューブを１６℃で２時間インキュベートした。
１．インキュベート後、８０μｌのＳｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘをチューブに添加した。
２．チューブを１６℃で２時間インキュベートした。
ｃＤＮＡの精製
１．インキュベート後、２５０μｌのｃＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇバッファをチューブに添加した。
２．得られた溶液を、ｃＤＮＡ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを用いて、遠心によりフィルターに通した。
３．フィルターを５００μｌのＷａｓｈバッファで洗浄した。
４．ｃＤＮＡを、１９μｌの５０〜５５℃に予熱しておいたヌクレアーゼフリー水でフィルターから溶出した。
１．インキュベート後、２５０μｌのｃＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇバッファをチューブに添加した。
２．得られた溶液を、ｃＤＮＡ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを用いて、遠心によりフィルターに通した。
３．フィルターを５００μｌのＷａｓｈバッファで洗浄した。
４．ｃＤＮＡを、１９μｌの５０〜５５℃に予熱しておいたヌクレアーゼフリー水でフィルターから溶出した。
転写反応によるｃＲＮＡの合成
１．７．５μｌのＩＶＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを、溶出したｃＤＮＡ溶液を含むチューブに添加した。
２．チューブを３７℃で１４時間インキュベートした。
３．インキュベート後、７５μｌのヌクレアーゼフリー水をチューブに添加した。
１．７．５μｌのＩＶＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを、溶出したｃＤＮＡ溶液を含むチューブに添加した。
２．チューブを３７℃で１４時間インキュベートした。
３．インキュベート後、７５μｌのヌクレアーゼフリー水をチューブに添加した。
ｃＲＮＡの精製
１．３５０μｌのｃＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇバッファをチューブに添加した。
２．２５０μｌの１００％エタノールをチューブに加え、混濁した。
３．得られた溶液を、ｃＲＮＡ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを用いて、遠心によりフィルターに通した。
４．フィルターを６５０μｌのＷａｓｈバッファで洗浄した。
５．ｃＲＮＡを、１００μｌの５０〜５５℃に予熱しておいたヌクレアーゼフリー水でフィルターから溶出した。
６．ｃＲＮＡの濃度を吸光度で測定後、ハイブリダイゼーション用試料とした。
１．３５０μｌのｃＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇバッファをチューブに添加した。
２．２５０μｌの１００％エタノールをチューブに加え、混濁した。
３．得られた溶液を、ｃＲＮＡ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを用いて、遠心によりフィルターに通した。
４．フィルターを６５０μｌのＷａｓｈバッファで洗浄した。
５．ｃＲＮＡを、１００μｌの５０〜５５℃に予熱しておいたヌクレアーゼフリー水でフィルターから溶出した。
６．ｃＲＮＡの濃度を吸光度で測定後、ハイブリダイゼーション用試料とした。
（３）ＤＮＡマイクロアレイにおけるハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション用ｃＲＮＡの調製
１．５００μｇのｃＲＮＡを含むハイブリダイゼーション用試料にヌクレアーゼフリー水を加え、１０μｌに調製した。
２．得られた溶液に２０μｌのＧＥＸ‐ＨＹＢを加え、６５℃で５分間インキュベートした。
ハイブリダイゼーション用ｃＲＮＡの調製
１．５００μｇのｃＲＮＡを含むハイブリダイゼーション用試料にヌクレアーゼフリー水を加え、１０μｌに調製した。
２．得られた溶液に２０μｌのＧＥＸ‐ＨＹＢを加え、６５℃で５分間インキュベートした。
ハイブリダイゼーション
１．専用チャンバーにセットしたＨｕｍａｎＷＧ‐６ ｖ３．０ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ（マイクロアレイ）に上記調製済みのｃＲＮＡ溶液をアプライした。
２．専用チャンバーの蓋を閉めて、５５℃で１８時間インキュベートした。
１．専用チャンバーにセットしたＨｕｍａｎＷＧ‐６ ｖ３．０ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ（マイクロアレイ）に上記調製済みのｃＲＮＡ溶液をアプライした。
２．専用チャンバーの蓋を閉めて、５５℃で１８時間インキュベートした。
（４）マイクロアレイの洗浄及び染色
１．Ｗａｓｈ Ｅ１ＢＣ溶液中で、マイクロアレイのカバーを外した。
２．マイクロアレイを速やかにスライドラックにセットし、５５℃に予熱しておいた１×Ｈｉｇｈ‐Ｔｅｍｐ Ｗａｓｈバッファで１０分間洗浄した。
３．マイクロアレイをＷａｓｈ Ｅ１ＢＣ溶液で５分間洗浄した。
４．マイクロアレイをエタノールで５分間洗浄した。
５．マイクロアレイをＷａｓｈ Ｅ１ＢＣ溶液で５分間洗浄した。
６．染色専用トレイに４ｍｌのブロックＥ１バッファを入れ、マイクロアレイを１枚ずつセットし、室温で１０分間ブロッキングを行った。
７．２ｍｌのブロックＥ１バッファに対して２μｌのストレプトアビジン‐Ｃｙ３を、染色専用トレイに加え、マイクロアレイを１枚ずつセットし、室温で１０分間染色を行った。
８．マイクロアレイをＷａｓｈ Ｅ１ＢＣ溶液で５分間洗浄後、遠心により乾燥させた。
１．Ｗａｓｈ Ｅ１ＢＣ溶液中で、マイクロアレイのカバーを外した。
２．マイクロアレイを速やかにスライドラックにセットし、５５℃に予熱しておいた１×Ｈｉｇｈ‐Ｔｅｍｐ Ｗａｓｈバッファで１０分間洗浄した。
３．マイクロアレイをＷａｓｈ Ｅ１ＢＣ溶液で５分間洗浄した。
４．マイクロアレイをエタノールで５分間洗浄した。
５．マイクロアレイをＷａｓｈ Ｅ１ＢＣ溶液で５分間洗浄した。
６．染色専用トレイに４ｍｌのブロックＥ１バッファを入れ、マイクロアレイを１枚ずつセットし、室温で１０分間ブロッキングを行った。
７．２ｍｌのブロックＥ１バッファに対して２μｌのストレプトアビジン‐Ｃｙ３を、染色専用トレイに加え、マイクロアレイを１枚ずつセットし、室温で１０分間染色を行った。
８．マイクロアレイをＷａｓｈ Ｅ１ＢＣ溶液で５分間洗浄後、遠心により乾燥させた。
（５）スキャン及び数値化
１．Ｉｌｕｍｉｎａ社専用スキャナにマイクロアレイをセットし、標準モードでスキャンを行った。
２．スキャン終了後、専用ソフトウェアＢｅａｄＳｔｕｄｉｏを用いて、マイクロアレイ上の各スポットのシグナル強度を数値化した。
１．Ｉｌｕｍｉｎａ社専用スキャナにマイクロアレイをセットし、標準モードでスキャンを行った。
２．スキャン終了後、専用ソフトウェアＢｅａｄＳｔｕｄｉｏを用いて、マイクロアレイ上の各スポットのシグナル強度を数値化した。
得られたデータは、ＶＳＴ（Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及びＲＳＮ（Ｒｏｂｕｓｔ Ｓｐｌｉｎｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を用いて正規化を行った。マイクロアレイ上に存在しない遺伝子に対するプローブにより測定される遺伝子の発現量である陰性対照に対するＰｒｅｓｅｎｃｅ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙが０．０５未満の遺伝子の発現量を有意と判断した。３７名中、７０％以上の患者でＰｒｅｓｅｎｃｅ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙが０．０５未満の遺伝子を以下の解析に用いた。
（６）遺伝子セットの選択
各遺伝子の発現量と生存期間との相関及び予後良好群と予後不良群との間の発現変動を基準として遺伝子を選択した。発現変動は、予後良好群の平均発現量を対照として、予後不良群の平均発現量の増加又は減少を評価した。遺伝子の発現量と生存期間との相関の統計学的解析には、Ｐｅａｒｓｏｎの積率相関係数、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位和係数を用いた。一方、予後良好群と予後不良群との間の発現変動の統計学解析には、３つの方法、Ｌｉｍｍａ（Tusher VG et al. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 5116-5121）、ＳＡＭ（Smyth GK, Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments, Stat Appl. Genet. Mol. Biol., 2004, 3, Article3）、Ｒａｎｋ Ｐｒｏｄ（Breitling R et al. Rank products: a simple, yet powerful,new method to detect differentially regulated genes in replicated microarray experiments, FEBS Lett, 2004, 573, 83-92）を用いた。
上記５つの方法で選択された上位３００個の遺伝子から免疫又はがんに関連する遺伝子として選択した３９個の遺伝子の遺伝子シンボルを表１に示す。
各遺伝子の発現量と生存期間との相関及び予後良好群と予後不良群との間の発現変動を基準として遺伝子を選択した。発現変動は、予後良好群の平均発現量を対照として、予後不良群の平均発現量の増加又は減少を評価した。遺伝子の発現量と生存期間との相関の統計学的解析には、Ｐｅａｒｓｏｎの積率相関係数、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位和係数を用いた。一方、予後良好群と予後不良群との間の発現変動の統計学解析には、３つの方法、Ｌｉｍｍａ（Tusher VG et al. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 5116-5121）、ＳＡＭ（Smyth GK, Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments, Stat Appl. Genet. Mol. Biol., 2004, 3, Article3）、Ｒａｎｋ Ｐｒｏｄ（Breitling R et al. Rank products: a simple, yet powerful,new method to detect differentially regulated genes in replicated microarray experiments, FEBS Lett, 2004, 573, 83-92）を用いた。
上記５つの方法で選択された上位３００個の遺伝子から免疫又はがんに関連する遺伝子として選択した３９個の遺伝子の遺伝子シンボルを表１に示す。
（７）ゲノムＤＮＡの抽出
上記で選択された遺伝子を対象としてＳＮＰ解析を行うために、各患者から採取されたヒト末梢血単核球をＴｒｉｚｏｌ(インビトロジェン社）で処理することで得た有機溶媒層から以下の処理によりゲノムＤＮＡを抽出した。
１．有機溶媒層１００μｌにエタノール１００μｌを加えて混合し、室温で５分間静置した。
２．４℃、２０，０００ｒｐｍで３０分間の遠心後、上清を除去した。
３．沈殿を１５０μｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液に懸濁し、室温で３０分間静置した後、４℃、２０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心後、上清を除去した。
４．上記３の操作を繰り返した。
５．沈殿を２００μｌの７５％エタノールに懸濁し、室温で２０分間静置した後、４℃、２０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心後、上清を除去した。
６．沈殿を完全に乾燥させた後、１５μｌの８ｍＭ水酸化ナトリウム溶液に溶解し、４℃で１５時間静置した後、４℃、１，２００ｒｐｍで１０分間の遠心後、上清を回収してゲノムＤＮＡ溶液とした。
上記処理の結果、予後良好群の患者１７名、予後不良群の患者２１名から配列解析が可能なゲノムＤＮＡが得られ、以下のＤＮＡ塩基配列の決定に用いた。
上記で選択された遺伝子を対象としてＳＮＰ解析を行うために、各患者から採取されたヒト末梢血単核球をＴｒｉｚｏｌ(インビトロジェン社）で処理することで得た有機溶媒層から以下の処理によりゲノムＤＮＡを抽出した。
１．有機溶媒層１００μｌにエタノール１００μｌを加えて混合し、室温で５分間静置した。
２．４℃、２０，０００ｒｐｍで３０分間の遠心後、上清を除去した。
３．沈殿を１５０μｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液に懸濁し、室温で３０分間静置した後、４℃、２０，０００ｒｐｍで２０分間の遠心後、上清を除去した。
４．上記３の操作を繰り返した。
５．沈殿を２００μｌの７５％エタノールに懸濁し、室温で２０分間静置した後、４℃、２０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心後、上清を除去した。
６．沈殿を完全に乾燥させた後、１５μｌの８ｍＭ水酸化ナトリウム溶液に溶解し、４℃で１５時間静置した後、４℃、１，２００ｒｐｍで１０分間の遠心後、上清を回収してゲノムＤＮＡ溶液とした。
上記処理の結果、予後良好群の患者１７名、予後不良群の患者２１名から配列解析が可能なゲノムＤＮＡが得られ、以下のＤＮＡ塩基配列の決定に用いた。
（８）ＨＰのＳＮＰ解析
上記で選択された３９個の遺伝子の内、ＨＰのプロモータ領域に着目し、以下のダイレクトシークエンス法によりＳＮＰを同定した。
１．まず、ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型として、ＰＣＲによる増幅反応を行った。増幅反応は、２μｌのゲノムＤＮＡ溶液を用いて、２５μｌの反応系で行った。増幅反応の条件は、９４℃で３分→９４℃で３０秒→５６℃で４０秒→７２℃で８０秒を３５サイクル繰り返した後、７２℃で３分間とした。反応液の組成を次に示す。
１×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ
２００μＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ
２００ｎＭ ＨＰ‐Ｆ１ ｐｒｉｍｅｒ
２００ｎＭ ＨＰ‐Ｒ１ ｐｒｉｍｅｒ
１Ｕ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）
なお、Ｈｐ‐Ｆ１ ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は、tcagtgtcaccatgattatcca（配列番号２）、Ｈｐ‐Ｒ１ ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は、gatttaacacactaagccctttgg（配列番号３）である。
２．増幅反応後のＤＮＡ溶液９μｌに、１μｌのＥｏ‐ＳＡＰ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を加え、３７℃で３０分間と８０℃で３０分間処理した後、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン社）を用いて配列解析反応を行った。反応系は、当該キットによって提供されたプロトコルに従って調製した。配列解析用のプライマーは、ＨＰ‐Ｒ１ ｐｒｉｍｅｒを用いた。
３．配列解析反応によって得られた溶液を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０によって塩基配列を決定した。
上記で選択された３９個の遺伝子の内、ＨＰのプロモータ領域に着目し、以下のダイレクトシークエンス法によりＳＮＰを同定した。
１．まず、ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型として、ＰＣＲによる増幅反応を行った。増幅反応は、２μｌのゲノムＤＮＡ溶液を用いて、２５μｌの反応系で行った。増幅反応の条件は、９４℃で３分→９４℃で３０秒→５６℃で４０秒→７２℃で８０秒を３５サイクル繰り返した後、７２℃で３分間とした。反応液の組成を次に示す。
１×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ
２００μＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ
２００ｎＭ ＨＰ‐Ｆ１ ｐｒｉｍｅｒ
２００ｎＭ ＨＰ‐Ｒ１ ｐｒｉｍｅｒ
１Ｕ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）
なお、Ｈｐ‐Ｆ１ ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は、tcagtgtcaccatgattatcca（配列番号２）、Ｈｐ‐Ｒ１ ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は、gatttaacacactaagccctttgg（配列番号３）である。
２．増幅反応後のＤＮＡ溶液９μｌに、１μｌのＥｏ‐ＳＡＰ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を加え、３７℃で３０分間と８０℃で３０分間処理した後、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン社）を用いて配列解析反応を行った。反応系は、当該キットによって提供されたプロトコルに従って調製した。配列解析用のプライマーは、ＨＰ‐Ｒ１ ｐｒｉｍｅｒを用いた。
３．配列解析反応によって得られた溶液を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０によって塩基配列を決定した。
（結果）
配列決定の結果、ＨＰ遺伝子の転写開始点から５５塩基上流の塩基にＳＮＰ（ｒｓ５４７２）を同定した。同定したＳＮＰの遺伝子型の分布を表２に示す。なお、以下では、ｒｓ５４７２の遺伝子型として、アデニンのホモ接合体を「ＡＡ」、グアニンのホモ接合体を「ＧＧ」及びアデニンとグアニンのヘテロ接合体を「ＡＧ」と省略することもある。
配列決定の結果、ＨＰ遺伝子の転写開始点から５５塩基上流の塩基にＳＮＰ（ｒｓ５４７２）を同定した。同定したＳＮＰの遺伝子型の分布を表２に示す。なお、以下では、ｒｓ５４７２の遺伝子型として、アデニンのホモ接合体を「ＡＡ」、グアニンのホモ接合体を「ＧＧ」及びアデニンとグアニンのヘテロ接合体を「ＡＧ」と省略することもある。
遺伝子型がＧＧの患者５名全員が予後良好であった。一方、遺伝子型がＡＡの患者１２名の内、１１名が予後不良であった。なお、遺伝子型がＡＧの患者２１名の内、１１名が予後良好、１０名が予後不良であった。
この結果により、当該ＳＮＰの遺伝子型がＧＧの場合には、ＡＧ又はＡＡである場合よりも、ペプチドワクチン療法後の生存期間が長く、ペプチドワクチン療法がより有効であったと言える。その逆に、当該ＳＮＰの遺伝子型がＡＡの場合には、ＡＧ又はＧＧである場合よりも、ペプチドワクチン療法後の生存期間が短く、ペプチドワクチン療法の有効性が乏しい傾向にあると言える。
この結果により、当該ＳＮＰの遺伝子型がＧＧの場合には、ＡＧ又はＡＡである場合よりも、ペプチドワクチン療法後の生存期間が長く、ペプチドワクチン療法がより有効であったと言える。その逆に、当該ＳＮＰの遺伝子型がＡＡの場合には、ＡＧ又はＧＧである場合よりも、ペプチドワクチン療法後の生存期間が短く、ペプチドワクチン療法の有効性が乏しい傾向にあると言える。
（実施例２：ｒｓ５４７２の遺伝子型と再燃前立腺がん患者の生存期間との関係）
上記実施例１における予後良好群の患者及び予後不良群の患者に、さらに３５名を加えた７３名の再燃前立腺がん患者のゲノムＤＮＡにおけるｒｓ５４７２の遺伝子型を上記実施例１と同様に決定した。
上記実施例１における予後良好群の患者及び予後不良群の患者に、さらに３５名を加えた７３名の再燃前立腺がん患者のゲノムＤＮＡにおけるｒｓ５４７２の遺伝子型を上記実施例１と同様に決定した。
（結果）
図３は、ｒｓ５４７２の各遺伝子型におけるペプチドワクチン療法開始後の日数に対する前立腺がん患者の生存率を示す。なお、本実施例でのｐ値は、ログランク検定で算出した。遺伝子型がＧＧの患者群は、ＡＡの患者群と比較して、有意に生存期間が長かった（ｐ＝０．００１１４、ハザード比＝０．４８６１）。また、ＡＧの患者群は、ＡＡの患者群と比較して、有意に生存期間が長かった（ｐ＝０．０２５９、ハザード比＝０．５０７８）。
図３は、ｒｓ５４７２の各遺伝子型におけるペプチドワクチン療法開始後の日数に対する前立腺がん患者の生存率を示す。なお、本実施例でのｐ値は、ログランク検定で算出した。遺伝子型がＧＧの患者群は、ＡＡの患者群と比較して、有意に生存期間が長かった（ｐ＝０．００１１４、ハザード比＝０．４８６１）。また、ＡＧの患者群は、ＡＡの患者群と比較して、有意に生存期間が長かった（ｐ＝０．０２５９、ハザード比＝０．５０７８）。
（実施例３：ｒｓ５４７２の遺伝子型と胃がん患者の生存期間との関係）
ペプチドワクチン療法を受けた胃がん患者４３名について、ペプチドワクチン療法の開始後の生存期間とｒｓ５４７２の遺伝子型との相関について調べた。胃がん患者のヒト末梢血単核球から、上記実施例１と同様にゲノムＤＮＡを抽出し、ｒｓ５４７２の遺伝子型を決定した。
ペプチドワクチン療法を受けた胃がん患者４３名について、ペプチドワクチン療法の開始後の生存期間とｒｓ５４７２の遺伝子型との相関について調べた。胃がん患者のヒト末梢血単核球から、上記実施例１と同様にゲノムＤＮＡを抽出し、ｒｓ５４７２の遺伝子型を決定した。
（結果）
図４は、ｒｓ５４７２の各遺伝子型におけるペプチドワクチン療法開始後の日数に対する胃がん患者の生存率を示す。遺伝子型がＧＧの患者群は、ＡＡの患者群と比較して、有意に生存期間が長かった（ｐ＝０．０４４４、ハザード比＝０．５６８１）。
図４は、ｒｓ５４７２の各遺伝子型におけるペプチドワクチン療法開始後の日数に対する胃がん患者の生存率を示す。遺伝子型がＧＧの患者群は、ＡＡの患者群と比較して、有意に生存期間が長かった（ｐ＝０．０４４４、ハザード比＝０．５６８１）。
（実施例４：表面プラズモン共鳴法によるＳＮＰの遺伝子型の決定）
リアルタイムかつ高感度でｒｓ５４７２の遺伝子型を決定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いた。ＳＰＲ法によるＳＮＰの遺伝子型の決定では、表面にプローブを固定したセンサチップに、標的核酸を含む試料溶液を接触させ、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを計測した。
リアルタイムかつ高感度でｒｓ５４７２の遺伝子型を決定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いた。ＳＰＲ法によるＳＮＰの遺伝子型の決定では、表面にプローブを固定したセンサチップに、標的核酸を含む試料溶液を接触させ、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを計測した。
まず、標的核酸を含む試料溶液として、ＰＣＲ産物と合成核酸の溶液を調製した。ＰＣＲで増幅する対象は、ｒｓ５４７２の遺伝子型がＡＡ、ＧＧ又はＡＧであるゲノムＤＮＡを使用した。
（ＰＣＲサンプルの調製）
１．まず、ｒｓ５４７２の遺伝子型がＡＡ、ＧＧ又はＡＧであるゲノムＤＮＡ溶液（１０ｎｇ／μｌ）を鋳型として、ＰＣＲによる１次増幅反応を行い、７６３塩基のＰＣＲ産物を得た。１次増幅反応は、１μｌのゲノムＤＮＡ溶液を用いて、２０μｌの反応系で行った。増幅反応の条件は、９５℃で５分の後、９４℃で３０秒→５９℃で３０秒→７２℃で２０秒を３５サイクル繰り返した後、７２℃で３分間を経て４℃で終了とした。ＰＣＲの反応液の組成を次に示す。
Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）：１０．０μｌ
５μＭ ＬＥＦＴ Ｐｒｉｍｅｒ：０．４μｌ
５μＭ ＲＩＧＨＴ Ｐｒｉｍｅｒ：０．４μｌ
蒸留水：８．２μｌ
ゲノムＤＮＡ溶液：１．０μｌ
なお、ここでのフォワードプライマーの塩基配列は、agatggccacacacaaggtg（配列番号４）、リバースプライマーの塩基配列は、ccacgggagctgatgacata（配列番号５）である。
１．まず、ｒｓ５４７２の遺伝子型がＡＡ、ＧＧ又はＡＧであるゲノムＤＮＡ溶液（１０ｎｇ／μｌ）を鋳型として、ＰＣＲによる１次増幅反応を行い、７６３塩基のＰＣＲ産物を得た。１次増幅反応は、１μｌのゲノムＤＮＡ溶液を用いて、２０μｌの反応系で行った。増幅反応の条件は、９５℃で５分の後、９４℃で３０秒→５９℃で３０秒→７２℃で２０秒を３５サイクル繰り返した後、７２℃で３分間を経て４℃で終了とした。ＰＣＲの反応液の組成を次に示す。
Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）：１０．０μｌ
５μＭ ＬＥＦＴ Ｐｒｉｍｅｒ：０．４μｌ
５μＭ ＲＩＧＨＴ Ｐｒｉｍｅｒ：０．４μｌ
蒸留水：８．２μｌ
ゲノムＤＮＡ溶液：１．０μｌ
なお、ここでのフォワードプライマーの塩基配列は、agatggccacacacaaggtg（配列番号４）、リバースプライマーの塩基配列は、ccacgggagctgatgacata（配列番号５）である。
２．次に、７６３塩基のＰＣＲ産物の溶液を１００００倍希釈した溶液を用いてＰＣＲによる２次増幅反応を行い、ｒｓ５４７２の部位を含む９０塩基のＰＣＲ産物を得た。２次増幅反応は、６０μｌの反応系で行った。増幅反応の条件は、９５℃で５分の後、９４℃で３０秒→５５℃で３０秒→７２℃で２０秒を３０サイクル繰り返した後、７２℃で３分間を経て４℃で終了とした。ＰＣＲの反応液の組成を次に示す。
Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）：３０．０μｌ
５μＭ ＬＥＦＴ Ｐｒｉｍｅｒ：１２．０μｌ
０．５μＭ ＲＩＧＨＴ Ｐｒｉｍｅｒ：３．０μｌ
蒸留水：１３．５μｌ
７６３塩基のＰＣＲ産物の溶液（１００００倍希釈）：１．５μｌ
なお、ここでのフォワードプライマーの塩基配列は、ccagggccaaagtttgtaga（配列番号６）、リバースプライマーの塩基配列は、gggcatctgctggtcttttt（配列番号７）である。
Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）：３０．０μｌ
５μＭ ＬＥＦＴ Ｐｒｉｍｅｒ：１２．０μｌ
０．５μＭ ＲＩＧＨＴ Ｐｒｉｍｅｒ：３．０μｌ
蒸留水：１３．５μｌ
７６３塩基のＰＣＲ産物の溶液（１００００倍希釈）：１．５μｌ
なお、ここでのフォワードプライマーの塩基配列は、ccagggccaaagtttgtaga（配列番号６）、リバースプライマーの塩基配列は、gggcatctgctggtcttttt（配列番号７）である。
３．そして、９０塩基のＰＣＲ産物の溶液５０μｌに、２倍濃度のランニングバッファ（２倍希釈のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．１％ＴＷ２０、３０００ｍＭの塩化ナトリウム及び２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））５０μｌと、５０μＭのＬブロッカーを１μｌと、５０μＭのＲブロッカーを１μｌとを加え、ＰＣＲサンプルとした。
なお、Ｌブロッカーの塩基配列は、cgtaattcctgtgtctacaa（配列番号２０）であって、Ｒブロッカーの塩基配列は、ttatgctgccactagctcac（配列番号２１）である。
なお、Ｌブロッカーの塩基配列は、cgtaattcctgtgtctacaa（配列番号２０）であって、Ｒブロッカーの塩基配列は、ttatgctgccactagctcac（配列番号２１）である。
（合成核酸サンプルの調製）
１．まず、ｒｓ５４７２の部位がアデニン又はグアニンである９０塩基の核酸を合成した。ｒｓ５４７２の部位がアデニンである合成核酸の塩基配列は、ccagggccaaagtttgtagacacaggaattacgaaatggagaagggggagaagtgagctagtggcagcataaaaagaccagcagatgccc（配列番号２２）である。一方、ｒｓ５４７２の部位がグアニンである合成核酸の塩基配列は、ccagggccaaagtttgtagacacaggaattacgaaatggaggagggggagaagtgagctagtggcagcataaaaagaccagcagatgccc（配列番号２３）である。
１．まず、ｒｓ５４７２の部位がアデニン又はグアニンである９０塩基の核酸を合成した。ｒｓ５４７２の部位がアデニンである合成核酸の塩基配列は、ccagggccaaagtttgtagacacaggaattacgaaatggagaagggggagaagtgagctagtggcagcataaaaagaccagcagatgccc（配列番号２２）である。一方、ｒｓ５４７２の部位がグアニンである合成核酸の塩基配列は、ccagggccaaagtttgtagacacaggaattacgaaatggaggagggggagaagtgagctagtggcagcataaaaagaccagcagatgccc（配列番号２３）である。
２．次に、５μＭの合成核酸溶液に、５０μＭのＬブロッカー及びＲブロッカー（いずれも合成核酸溶液の３倍量）を加え、１２．５、２５、５０又は１００ｎＭになるようにランニングバッファ（１倍希釈のＰＢＳ、０．０５％ＴＷ２０、１５００ｍＭの塩化ナトリウム及び１ｍＭのＥＤＴＡ）で希釈して、ｒｓ５４７２の部位がアデニンである合成核酸を含む合成核酸サンプルＡ及びｒｓ５４７２の部位がグアニンである合成核酸を含む合成核酸サンプルＧを得た。
（プローブの固定化）
ＢｉｏｔｉｎＳＡＭ膜を形成したセンサチップに、５チャンネル構成のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を装着しＳＰＲ装置にセットした。ＰＢＳ−Ｔ溶液（１倍希釈のＰＢＳ及び０．０５％ＴＷ２０）で各チャンネルを十分に洗浄し、各チャンネルにＰＢＳ−Ｔ溶液を１５μｌ入れ、１分間静置した。ＰＢＳ−Ｔ溶液を取り除き、ＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈した０．０２５ｍｇ／ｍｌのＡｖｉｄｉｎ溶液を各チャンネルに１５μｌ入れ、３０分間静置した。途中、１５分間経過後にピペッティングを行った。Ａｖｉｄｉｎ溶液を取り除き、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄を行い、ＰＢＳ−Ｔ溶液を１５μｌ入れ、１分間静置した。各チャンネルのＰＢＳ−Ｔ溶液を取り除き、チャンネルに対応させてアデニン検出用プローブ、グアニン検出用プローブ又はチミン検出用プローブの溶液を１５μｌ入れ、３０分間静置した。途中、１５分間経過後にピペッティングを行った。各チャンネルの溶液を取り除き、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄を行い、ＰＢＳ−Ｔ溶液を１５μｌ入れ、１分間静置した。
ＢｉｏｔｉｎＳＡＭ膜を形成したセンサチップに、５チャンネル構成のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を装着しＳＰＲ装置にセットした。ＰＢＳ−Ｔ溶液（１倍希釈のＰＢＳ及び０．０５％ＴＷ２０）で各チャンネルを十分に洗浄し、各チャンネルにＰＢＳ−Ｔ溶液を１５μｌ入れ、１分間静置した。ＰＢＳ−Ｔ溶液を取り除き、ＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈した０．０２５ｍｇ／ｍｌのＡｖｉｄｉｎ溶液を各チャンネルに１５μｌ入れ、３０分間静置した。途中、１５分間経過後にピペッティングを行った。Ａｖｉｄｉｎ溶液を取り除き、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄を行い、ＰＢＳ−Ｔ溶液を１５μｌ入れ、１分間静置した。各チャンネルのＰＢＳ−Ｔ溶液を取り除き、チャンネルに対応させてアデニン検出用プローブ、グアニン検出用プローブ又はチミン検出用プローブの溶液を１５μｌ入れ、３０分間静置した。途中、１５分間経過後にピペッティングを行った。各チャンネルの溶液を取り除き、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄を行い、ＰＢＳ−Ｔ溶液を１５μｌ入れ、１分間静置した。
アデニン検出用プローブの塩基配列は、ccccttctcca（配列番号８）である。グアニン検出用プローブの塩基配列は、cccctcctcca（配列番号９）である。チミン検出用プローブの塩基配列は、cccctactcca（配列番号１０）である。
また、ハイブリダイズした場合に、ｒｓ５４７２の部位から１塩基５’末端側の部位（Ｇ）に対応する塩基（Ｃ）をグアニン、アデニン又はチミンに変更したプローブを設計した。すなわち、当該塩基をグアニンに変更したアデニン検出用プローブ、グアニン検出用プローブ及びチミン検出用プローブの塩基配列は、ccccttgtcca（配列番号１１）、cccctcgtcca（配列番号１２）及びcccctagtcca（配列番号１３）である。当該塩基をアデニンに変更したアデニン検出用プローブ、グアニン検出用プローブ及びチミン検出用プローブの塩基配列は、ccccttatcca（配列番号１４）、cccctcatcca（配列番号１５）及びcccctaatcca（配列番号１６）である。また、当該塩基をチミンに変更したアデニン検出用プローブ、グアニン検出用プローブ及びチミン検出用プローブの塩基配列は、ccccttttcca（配列番号１７）、cccctcttcca（配列番号１８）及びcccctattcca（配列番号１９）である。
なお、実際には、上記各プローブの３’末端にリンカーとして３つのアデニンを付加し、リンカーの３’末端のアデニンには、センサチップに固定化するためのビオチンをさらに付加した。プローブは、５０μＭのＴＥ溶液をＰＢＳ−Ｔ溶液で１０μＭに希釈して用いた。
（共鳴角の測定）
プローブを固定後、５チャンネル構成のＰＤＭＳを測定用ＰＤＭＳに取り替え、センサチップ上に形成された反応槽を２００μｌのランニングバッファで洗浄し、２００μｌのランニングバッファを反応槽に入れ、ランニングバッファを反応槽に入れて４５秒後の共鳴角を測定し、反応前の共鳴角とした。ランニングバッファを取り除き、上記で調製した１００μｌのＰＣＲサンプル、合成核酸サンプルＡ又は合成核酸サンプルＧを反応槽に入れ、ピペッティングし、５分間静置した。その後、ＰＣＲサンプル等を取り除き、反応槽を２００μｌのランニングバッファで洗浄し、２００μｌのランニングバッファを反応槽に入れ、ランニングバッファを反応槽に入れて４５秒後の共鳴角を測定し、反応後の共鳴角とした。なお、測定後は、ランニングバッファを取り除き、２０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液を反応槽に入れてピペッティングし、ランニングバッファで洗浄して、次のサンプルの測定を行った。
プローブを固定後、５チャンネル構成のＰＤＭＳを測定用ＰＤＭＳに取り替え、センサチップ上に形成された反応槽を２００μｌのランニングバッファで洗浄し、２００μｌのランニングバッファを反応槽に入れ、ランニングバッファを反応槽に入れて４５秒後の共鳴角を測定し、反応前の共鳴角とした。ランニングバッファを取り除き、上記で調製した１００μｌのＰＣＲサンプル、合成核酸サンプルＡ又は合成核酸サンプルＧを反応槽に入れ、ピペッティングし、５分間静置した。その後、ＰＣＲサンプル等を取り除き、反応槽を２００μｌのランニングバッファで洗浄し、２００μｌのランニングバッファを反応槽に入れ、ランニングバッファを反応槽に入れて４５秒後の共鳴角を測定し、反応後の共鳴角とした。なお、測定後は、ランニングバッファを取り除き、２０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液を反応槽に入れてピペッティングし、ランニングバッファで洗浄して、次のサンプルの測定を行った。
（結果）
反応前後の共鳴角の差である共鳴角の変化の大きさ（以下、単に「共鳴角変化量」とする）としてハイブリダイゼーションの強さを定量した。なお、共鳴角変化量は、単位をＲＵとする共鳴信号の強度で表され、１０００ＲＵ＝０．１°である。
反応前後の共鳴角の差である共鳴角の変化の大きさ（以下、単に「共鳴角変化量」とする）としてハイブリダイゼーションの強さを定量した。なお、共鳴角変化量は、単位をＲＵとする共鳴信号の強度で表され、１０００ＲＵ＝０．１°である。
図５は、ｒｓ５４７２の遺伝子型がＡＧ、ＡＡ又はＧＧであるＰＣＲサンプルの結果を示し、左側は補正なしの結果で、右側はチミン検出用プローブにおける共鳴角変化量をアデニン検出用プローブ及びグアニン検出用プローブの変化量それぞれから減じた結果である。（Ａ）に示すように、塩基を変更していないプローブを用いた場合、アデニン検出用プローブのＡＡに対する共鳴角変化量は、ＧＧに対する共鳴角変化量よりも大きいものの、グアニン検出用プローブのＧＧに対する共鳴角変化量は、ＡＡに対する共鳴角変化量よりも小さかった。
一方、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示すように、グアニン、アデニン又はチミンに変更したプローブを用いた場合、アデニン検出用プローブ及びグアニン検出用プローブでは、それぞれＡＡ及びＧＧにおける共鳴角変化量が特異的に大きかった。また、アデニン検出用プローブ及びグアニン検出用プローブでは、ＡＧにおける共鳴角変化量が同程度であった。
図６は、合成核酸サンプルＡの結果を示し、左側は補正なしの結果で、右側はチミン検出用プローブにおける共鳴角変化量をアデニン検出用プローブ及びグアニン検出用プローブの変化量から減じた結果である。（Ａ）に示すように、塩基を変更していないアデニン検出用プローブを用いた場合の共鳴角変化量は、合成核酸サンプルＡの濃度に依存して大きくなった。塩基を変更していないグアニン検出用プローブ及びチミン検出用プローブを用いた場合の共鳴角変化量は、アデニン検出用プローブの共鳴角変化量よりは小さかった。
一方、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示すように、グアニン、アデニン又はチミンに変更したプローブを用いた場合、グアニン検出用プローブ及びチミン検出用プローブにおける共鳴角変化量の上昇が抑制され、アデニン検出用プローブを用いた場合の共鳴角変化量を、より明確に識別できるようになった。
同様に、図７は、合成核酸サンプルＧの結果を示す。（Ａ）に示すように、塩基を変更していないグアニン検出用プローブを用いた場合の共鳴角変化量は、合成核酸サンプルＧの濃度に依存して大きくなった。しかし、グアニン検出用プローブを用いた場合の共鳴角変化量は、アデニン検出用プローブ及びチミン検出用プローブを用いた場合の共鳴角変化量と、１００ｎＭの濃度を除いて同程度であった。
一方、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示すように、グアニン、アデニン又はチミンに変更したプローブを用いた場合、グアニン検出用プローブを用いた場合の共鳴角変化量を、より明確に識別できるようになった。
本実施例の結果より、ｒｓ５４７２の遺伝子型の決定は、ＳＰＲ法を用いて可能である。特に、ハイブリダイズした場合に、ｒｓ５４７２の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニン、アデニン又はチミンに変更されたプローブは、ｒｓ５４７２の遺伝子型をより高い精度で決定できる。
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
本出願は、２０１２年９月３日に出願された日本国特許出願２０１２−１９３６１８号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１２−１９３６１８号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
本発明は、がんに対する免疫療法の有効性の予測に好適である。本発明を適用することにより、臨床現場においてがん患者に対する有効な治療方法としての免疫療法の選択に寄与するとともに、免疫療法の治療成績の向上にも貢献することが期待される。
１ 台座
２ テーブル
３ 制御部
４ 蓋
５ 蓄圧器
６ 電磁弁
７ チューブ
８ 電源部
９ 解析部
１０ａ、１０ｂ ピン穴
２１ａ、２１ｂ ピン
２２ 温度調整部
２３ 測定部
４１ ヒンジ
４２ 加圧穴
４３ 電磁石
１００ マイクロチップ
１０１ 試料注入部
１０２ 洗浄バッファ注入部
１０３ ＰＣＲ試薬注入部
１０４ 抽出部
１０５ 排出口
１０６ ＰＣＲ部
１０７ 流路
２００ 解析装置
２ テーブル
３ 制御部
４ 蓋
５ 蓄圧器
６ 電磁弁
７ チューブ
８ 電源部
９ 解析部
１０ａ、１０ｂ ピン穴
２１ａ、２１ｂ ピン
２２ 温度調整部
２３ 測定部
４１ ヒンジ
４２ 加圧穴
４３ 電磁石
１００ マイクロチップ
１０１ 試料注入部
１０２ 洗浄バッファ注入部
１０３ ＰＣＲ試薬注入部
１０４ 抽出部
１０５ 排出口
１０６ ＰＣＲ部
１０７ 流路
２００ 解析装置
Claims (19)
- 被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定ステップと、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測ステップと、
を含み、
前記予測ステップでは、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効であると予測し、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効でないと予測する、
がんに対する免疫療法の有効性の予測方法。 - 被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定ステップと、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測ステップと、
を含み、
前記予測ステップでは、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が長いと予測し、
前記決定ステップで決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が短いと予測する、
がんに対する免疫療法の有効性の予測方法。 - 前記がんは、
前立腺がん又は消化器がんである、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のがんに対する免疫療法の有効性の予測方法。 - 前記試料は、
血液である、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のがんに対する免疫療法の有効性の予測方法。 - 前記予測ステップでは、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に対応する、前記ペプチドワクチン療法の統計的に有意な有効性を予測する、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のがんに対する免疫療法の有効性の予測方法。 - ゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を、ＰＣＲ産物の塩基配列中に含むように設計された、
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のがんに対する免疫療法の有効性の予測方法に用いるプライマー対。 - ゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸に相補的な核酸を増幅したＰＣＲ産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のがんに対する免疫療法の有効性の予測方法に用いるプローブ。 - 前記一塩基多型の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニン、アデニン又はチミンである、
ことを特徴とする請求項７に記載のプローブ。 - 請求項６に記載のプライマー対、請求項７に記載のプローブ及び請求項８に記載のプローブの少なくとも一つを含む、
がんに対する免疫療法の有効性の予測用キット。 - がんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測するために使用されるマイクロチップであって、
被検者から採取されたゲノムＤＮＡを含む試料が注入される注入部と、
前記注入部に注入された試料からゲノムＤＮＡを抽出する抽出部と、
前記抽出部で抽出されたゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の部位を含む領域を増幅する増幅部と、
を備えるマイクロチップ。 - 請求項１０に記載のマイクロチップと、
前記マイクロチップで増幅された領域に含まれる前記一塩基多型の遺伝子型を決定する決定部と、
前記決定部で決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測部と、
を備える解析装置。 - 被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定手段と、
前記決定手段で決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対するペプチドワクチン療法の有効性を予測する予測手段と、
を備えるがんに対する免疫療法の有効性の予測用キット。 - 前記予測手段では、
前記決定手段で決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効であると予測し、
前記決定手段で決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法が前記被検者に有効でないと予測する、
ことを特徴とする請求項１２に記載のがんに対する免疫療法の有効性の予測用キット。 - 前記予測手段は、
前記決定手段で決定された遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合には、前記遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が長いと予測し、
前記決定手段で決定された遺伝子型がアデニンのホモ接合体の場合には、前記遺伝子型がグアニンのホモ接合体又はヘテロ接合体の場合よりも、前記ペプチドワクチン療法後の前記被検者の生存期間が短いと予測する、
ことを特徴とする請求項１２又は１３に記載のがんに対する免疫療法の有効性の予測用キット。 - 前記がんは、
前立腺がん又は消化器がんである、
ことを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載のがんに対する免疫療法の有効性の予測用キット。 - 前記試料は、
血液である、
ことを特徴とする請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載のがんに対する免疫療法の有効性の予測用キット。 - 前記予測手段は、
前記決定手段で決定された遺伝子型に対応する、前記ペプチドワクチン療法の統計的に有意な有効性を予測する、
ことを特徴とする請求項１２乃至１６のいずれか一項に記載のがんに対する免疫療法の有効性の予測用キット。 - 被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定手段と、
前記決定手段で決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対する免疫療法の有効性を予測する予測手段と、
を備えるがんに対する免疫療法の有効性の予測用キットであって、
前記決定手段は、
前記ゲノムＤＮＡにおける前記一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸に相補的な核酸を増幅したＰＣＲ産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを備え、
前記プローブは、
前記一塩基多型の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニン、アデニン又はチミンである、
がんに対する免疫療法の有効性の予測用キット。 - 被検者から採取された試料に含まれるゲノムＤＮＡにおける、米国バイオテクノロジー情報センターのＳＮＰデータベースにｒｓ５４７２として登録された一塩基多型の遺伝子型を決定する決定ステップと、
前記決定ステップで決定された遺伝子型に基づいて前記被検者のがんに対する免疫療法の有効性を予測する予測ステップと、
を含むがんに対する免疫療法の有効性の予測方法に用いるプローブであって、
前記ゲノムＤＮＡにおける前記一塩基多型の部位を含む連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸に相補的な核酸を増幅したＰＣＲ産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
前記一塩基多型の部位から１塩基５’末端側の部位に対応する塩基がグアニン、アデニン又はチミンである、
プローブ。
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