WO2015163462A1 - がん免疫療法の治療効果予測に有用な遺伝子多型 - Google Patents

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WO2015163462A1
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cancer
gene
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human
cancer immunotherapy
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哲朗 笹田
伊東　恭悟
悟 本山
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学校法人 久留米大学
国立大学法人秋田大学
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons

Definitions

  • the present invention relates to gene polymorphisms useful for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy and use thereof.
  • Cancer immunotherapy including cancer vaccine therapy is awaited as a fourth treatment method.
  • cancer immunotherapy there is no method for predicting the therapeutic effect in advance, and there is no method for selecting patients who can expect the therapeutic effect.
  • IL-6 receptor gene (hereinafter also referred to as IL-6R gene), (1) IL-6 gene polymorphism has been shown to be prognostic in patients with esophageal cancer (after surgery). IL-6 receptor gene polymorphism IL-6R 48892A> C does not correlate with prognosis, although correlated, (2) IL-6 gene polymorphism also correlates with prognosis in patients with brain tumors, but IL-6 receptor It has been reported that the somatic gene polymorphism IL-6R 48892A> C does not correlate with prognosis (Non-patent Documents 1 and 2).
  • One of the problems of the present invention is to identify a gene polymorphism useful for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy, and to provide a method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy using this.
  • the present invention provides a therapeutic effect of cancer immunotherapy comprising a polynucleotide capable of detecting the 48892nd gene polymorphism of the human IL-6R gene (Reference SNP ID: rs8192284).
  • a predictive composition or kit is provided.
  • the present invention includes a reagent for measuring the amount of human IL-6, human IP-10 (interferonfergamma-induced-protein 10) and / or human BAFF (B-cell activating factor) protein.
  • a composition or kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy is provided.
  • the present invention relates to a therapeutic effect of cancer immunotherapy, comprising a step of detecting a 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of a human IL-6R gene from a sample derived from a subject. Provide a prediction method.
  • the amount of human IL-6, human IP-10 (interferon gamma-induced protein 10) and / or human BAFF (B-cell activating factor) protein is determined from a blood sample derived from a subject.
  • a method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy including a measuring step is provided.
  • the present invention provides a cancer immunotherapy enhancer or a cancer immunotherapy treatment kit containing an IL-6 inhibitor.
  • the present invention provides a genetic marker for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy, including the 48892nd gene polymorphism of the human IL-6R gene (Reference SNP ID: rs8192284).
  • cancer immunotherapy is effective for a subject is predicted by the method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention.
  • the immunohistological analysis result of the cancer vaccine antigen which expresses in a colorectal cancer (colorectal cancer) tissue is shown. Immunohistochemistry was used to examine the expression of vaccine antigens in cancer tissues of colorectal cancer patients who had not been administered the vaccine. Representative data is shown. All photos are x200.
  • Kaplan-Meier survival analysis is shown.
  • Kaplan-Meier method shows the survival curves of patients who had a history of more than one chemotherapy and were not well tolerated with irinotecan, oxaliplatin and fluoropyrimidine.
  • 488892 gene polymorphism of human IL-6R gene indicates that Reference SNP ID used in SNP data bank of NCBI (National Center for Biotechnology Information) is indicated as rs8192284. Genetic polymorphism. This gene polymorphism is related to the difference that the 358th amino acid residue is Asp or Ala in the amino acid sequence of IL-6R represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the 48892nd genotype (Reference SNP ID: rs8192284) of the human IL-6 receptor gene includes C / C, A / C and A / A.
  • cancer immunotherapy refers to non-specific immunotherapy (eg, treatment by administration of an immunostimulant, treatment with an immune checkpoint inhibitor), active specific immunotherapy (eg, peptide vaccine therapy, Includes autologous cancer cell vaccine therapy, dendritic cell vaccine therapy) and passive specific immunotherapy (eg, lymphokine-activated killer (LAK) cell therapy, tumor infiltrating lymphocyte (TIL) therapy, genetically modified T cell therapy) .
  • active specific immunotherapy eg, peptide vaccine therapy, Includes autologous cancer cell vaccine therapy, dendritic cell vaccine therapy
  • passive specific immunotherapy eg, lymphokine-activated killer (LAK) cell therapy, tumor infiltrating lymphocyte (TIL) therapy, genetically modified T cell therapy
  • LAK lymphokine-activated killer
  • TIL tumor infiltrating lymphocyte
  • cancer immunotherapy is peptide vaccine therapy, dendritic cell vaccine therapy, or treatment with an immune checkpoint inhibitor, preferably peptide vaccine therapy.
  • cancer can be a subject of cancer immunotherapy, and examples of cancer include, but are not limited to, prostate cancer, pancreatic cancer, lung cancer, and cervix. Cancer, endometrial cancer, stomach cancer, melanoma, thyroid cancer, brain tumor, hematopoietic species, esophageal cancer, liver cancer, colon cancer (colorectal cancer), biliary tract cancer, breast cancer, bladder cancer, kidney Examples include cancer, bone and soft tissue tumors, testicular cancer, head and neck cancer, and ovarian cancer. Cancer can also be advanced cancer.
  • the composition or kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy relates to the 48892nd gene polymorphism of the human IL-6 receptor gene (human IL-6R gene) (Reference SNP ID: A composition or kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy comprising a polynucleotide capable of detecting rs8192284) is provided.
  • the polynucleotide capable of detecting the 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of the human IL-6R gene used in the present invention may be a primer or a probe.
  • it may be a polynucleotide comprising its complementary strand sequence.
  • the probe may be a probe that specifically hybridizes with the human IL-6R gene represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof.
  • the primer may be a primer capable of amplifying the human IL-6R gene represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof by PCR.
  • the probe or primer that hybridizes specifically may be a probe or primer that is 100% complementary to the oligonucleotide to which the probe or primer hybridizes, and the oligonucleotide or the probe to which the probe or primer hybridizes. Probes and primers that hybridize under stringent conditions may be used. Hybridization can be performed according to the method described in, for example, Sambrook J., etc., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA 2nd edition, 1989.
  • hybridization solutions (50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 ⁇ Denhardt are used. Liquid, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / mL denatured sheared salmon sperm DNA) followed by overnight washing at 42 ° C. followed by washing the filter in 0.1 ⁇ SSC at about 65 ° C. Including hybridization. By appropriately adjusting the salt concentration and temperature in the washing step, high stringency conditions (low salt concentration, high temperature) and low stringency conditions (high salt concentration, low temperature) can be achieved.
  • washing is performed at 65 ° C. in 0.5 ⁇ SSC containing 0.1% SDS (for example, 15 minutes ⁇ 2 times), and under washing conditions with low stringency, For example, washing in 2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS at room temperature (for example, 5 minutes ⁇ 2 times) is performed.
  • Probes and / or primers may contain additional sequences consisting of sequences that are not identical or low (eg, 0-10%) to the human IL-6R gene, and are radioactive isotopes (eg, 125 I, 3 H 14 C), enzymes (for example, ⁇ -galactosidase, peroxidase), fluorescent materials (for example, fluorescein, SYBR (registered trademark) Green), luminescent materials (for example, luminol, luciferin, aequorin), avidin, biotin, etc. It may be labeled with.
  • the label may be a single substance label or a multiple substance label.
  • a quencher that absorbs fluorescence energy emitted by the fluorescent substance is bound in the vicinity of the fluorescent substance (for example, FAM, VIC). May be.
  • a primer or probe that is a polynucleotide capable of detecting the 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of the human IL-6R gene suitable for it is used.
  • a method for detecting a gene polymorphism is not limited, but a real-time PCR detection method (for example, TaqMan (registered trademark) probe method), Invader probe method, SNP typing method using a DNA chip, PCR-RFLP method, PCR- Examples include the SSCP method.
  • a real-time PCR detection method can be adopted as a method for detecting a gene polymorphism.
  • a forward primer and a reverse primer which are oligonucleotides capable of amplifying a human IL-6R gene fragment containing the 48892th base of the human IL-6R gene, can be used, and 48892 of the human IL-6R gene
  • a probe containing a second base and binding to a human IL-6R gene fragment amplified with the forward primer and the reverse primer and having a reporter fluorescent dye and a quencher fluorescent dye bound thereto can be used.
  • Primers and probes are, for example, oligonucleotides of 10 to 50 bases, 15 to 40 bases, and 15 to 35 bases.
  • a fluorescein fluorescent dye such as FAM (6-carboxy-fluorescein) can be used as the reporter fluorescent dye
  • a rhodamine system such as TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine)
  • Fluorescent dyes can be used.
  • a method using a TaqMan (registered trademark) probe can be used, and necessary reagents can be obtained from Applied Biosystems.
  • the Invader probe method can be employed as a method for detecting a gene polymorphism.
  • genetic polymorphism can be detected using three types of probes: an allele probe, an invader probe, and a detection probe.
  • the allele probe contains a base that is different from the 48892th type of the human IL-6R gene to be detected, and a 5'-side from the flap sequence that consists of a sequence complementary to the detection probe that consists of a different sequence from the human IL-6R gene
  • the 3 ′ side of the nucleotide different from the 48892nd polymorphism of the human IL-6R gene to be detected may be an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence of the human IL-6R gene.
  • the base length of the allyl probe is, for example, 15 to several hundred bases, 15 to 50 bases, or 15 to 40 bases.
  • the invader probe may be an oligonucleotide comprising the human IL-6R gene sequence 48892 and desired upstream from the human IL-6R gene sequence to be detected.
  • the base length of the invader probe is, for example, 15 to 50 bases or 15 to 40 bases.
  • the detection probe is a probe partially including a base sequence complementary to the flap sequence, and is a probe to which an oligonucleotide composed of a flap sequence generated by cleavage of an allele probe by an endonuclease called Cleavase binds.
  • the detection probe is, for example, an oligonucleotide having 15 to several hundred bases, 15 to 100 bases, 15 to 50 bases, and 15 to 40 bases.
  • a SNP typing method using a DNA chip can be employed as a method for detecting a genetic polymorphism.
  • a polynucleotide comprising a partial sequence of the human IL-6R gene containing the 48892nd base of the human IL-6R gene to be detected can be employed as a probe.
  • the base length of the probe may be, for example, 10 to 100 bases, 15 to 50 bases, or 15 to 35 bases.
  • gene polymorphism can be detected by the recommended method.
  • a PCR-RFLP method or a PCR-SSCP method can be used as a method for detecting a genetic polymorphism.
  • a forward primer that can amplify a human IL-6R gene fragment containing the 48892nd base of the human IL-6R gene, for example, an oligonucleotide of 10 to 50 bases, 15 to 40 bases, or 15 to 35 bases
  • reverse primers can be used.
  • Polynucleotides for example, probes, primers that can detect the 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of the human IL-6R gene used in the present invention are separately or mixed.
  • the composition can be provided as a composition in a lyophilized state, dissolved in an appropriate buffer (eg, TE buffer) at an appropriate concentration (eg, 1 to 50 ⁇ M) and frozen at ⁇ 20 ° C.
  • an appropriate buffer eg, TE buffer
  • concentration eg, 1 to 50 ⁇ M
  • the polynucleotide capable of detecting the 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of the human IL-6R gene those skilled in the art will recognize reagents, equipment, etc.
  • kits for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy can be included in the kit.
  • a 10X PCR reaction solution a 10X MgCl 2 aqueous solution, Taq DNA polymerase, and the like can be included in the kit.
  • Cleavase an electron-reactive polymerase
  • a polymorphism capable of detecting the 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of the human IL-6R gene.
  • a DNA chip containing nucleotides and a washing solution for hybridization (for example, 1XTBS containing 0.1% Tween 20) can be included in the kit.
  • a restriction enzyme or electrophoresis gel can be included in the kit.
  • the present invention measures the amount of human IL-6, human IP-10 (interferon gamma-induced protein 10) and / or human BAFF (B-cell activating factor) in a blood sample of a subject.
  • a composition or kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy is provided.
  • the blood sample can be serum or plasma.
  • Reagents for detecting IL-6, IP-10 (interferon gamma-induced protein 10) and / or BAFF (B-cell activating factor) in the blood of a subject are, for example, anti-human IL-6 antibody, anti-human It can be an IP-10 antibody and / or an anti-human BAFF antibody.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the amount of IL-6, IP-10 and / or BAFF protein in the blood of a subject before the start of cancer immunotherapy treatment is measured by a kit provided by the present invention.
  • the kit provided by the present invention contains, for example, anti-human IL-6 antibody, anti-human IP-10 antibody and / or anti-human BAFF antibody, as well as EDTA, citrate or heparin used for preparing serum from blood.
  • a solution containing Anti-human IL-6 antibody, anti-human IP-10 antibody and anti-human BAFF antibody can be provided in a lyophilized state or dissolved in a buffer solution such as PBS at a concentration of 1 to 10 mg / ml.
  • the kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy is an ELISA kit containing reagents, equipment, etc. for measuring the protein amount of IL-6, IP-10 and / or BAFF. Also good.
  • a plate for example, a 96-well plate
  • a blocking solution for example, a BSA solution, a milk protein solution
  • a washing solution a phosphate buffer containing a surfactant (for example, Tween 20) PBS
  • a phosphate buffer containing a surfactant for example, Tween 20
  • the composition or kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention in the first aspect is the composition or kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention in the second aspect.
  • the present invention provides a cancer immunotherapy treatment provided in the second aspect in addition to the composition or kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided in the first aspect.
  • a kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy comprising a composition or kit for predicting the effect.
  • the kit for predicting the therapeutic effect of the cancer immunotherapy further determines the level of an antibody against the peptide administered by the peptide vaccine immunotherapy in the blood of a subject.
  • Reagents for measurement eg, peptides administered by peptide vaccine immunotherapy
  • the level of IgG antibody against the peptide administered by peptide vaccine immunotherapy in the blood of the subject after administration of the peptide vaccine may be measured.
  • the level of anti-peptide antibody (IgG) can be measured as previously reported by the Luminex TM method ( Komatsu (NKoet al, Scand J Clin Invest 2004; 64: 1-11).
  • the kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention further includes color-coded beads (Luminex Corp., Austin, TX, USA) and a biotinylated goat. Anti-human IgG may be included.
  • the present invention provides a cancer treatment kit comprising a cancer immunotherapeutic agent and a composition or kit for predicting the therapeutic effect of the cancer immunotherapy provided by the present invention.
  • active ingredients contained in cancer immunotherapeutic agents include, but are not limited to, cytokines (eg, interferon, interleukin 2), immunostimulants (eg, BCG, OK-432, lentinan), lymphocytes (eg, , Cytotoxic T cells (CTL), NK cells), dendritic cells, and peptide vaccines.
  • MRP3-503 LYAWEPSFL (SEQ ID NO: 18), MRP3-1293: NYSVRYRPGL (SEQ ID NO: 19), PAP-213: LYCESVHNF (SEQ ID NO: 20), PAP-248: GIHKQKEKSR (SEQ ID NO: 21), PSA- 248: HYRKWIKDTI (SEQ ID NO: 22), PSMA-624: TYSVSFDSL (SEQ ID NO: 23), PTHrP-102: RYLTQETNKV (SEQ ID NO: 24) SART2-93: DYSARWNEI (SEQ ID NO: 25), SART2-161: AYDFLYNYL (SEQ ID NO: 26), SART3-109: VYDYNCHVDL (SEQ ID NO: 27), SART3-302: LLQAEAPRL (SEQ ID NO: 28), SART3-309: RLAEYQAYI ( SEQ ID NO: 29), SART3-511: WLEYYNLER (SEQ ID
  • peptide derivatives include HLA molecules consisting of an amino acid sequence in which one or two amino acid substitutions, deletions and / or additions have been introduced in the amino acid sequence of the peptide and matched to the patient (eg, HLA-A24 And a peptide having the ability to induce peptide-specific CTLs. Whether or not it has the ability to induce peptide-specific CTL, such as interferon (IFN) - ⁇ in response to peptide-stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in response to antigen-presenting cells pulsed with the corresponding peptide. It is possible to determine whether or not to produce various cytokines by measuring by ELISA or the like.
  • IFN interferon
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the cytotoxic activity of the induced CTL can be confirmed by a 51 Cr release test or the like.
  • the number of amino acid residues of the peptide derivative is preferably within the range of 8 to 14, more preferably 8 to 11, particularly preferably 9 or 10.
  • the peptide vaccine may contain one type of peptide or derivative, or may contain a combination of two or more types (for example, 2, 3 or 4 types) of peptides and / or derivatives. Since CTL of a cancer patient is a collection of cells that recognize different cancer antigen peptides, a plurality of types of peptides and / or derivatives may be used in combination. Moreover, you may select the peptide in which the antibody couple
  • Cancer immunotherapeutic agents can be formulated with an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers include excipients (eg, dextrin, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.), disintegrants (eg, carboxymethylcellulose, etc.), lubricants (eg, magnesium stearate, etc.), interfaces
  • active agents eg, sodium lauryl sulfate
  • solvents eg, water, saline, soybean oil
  • preservatives eg, p-hydroxybenzoate
  • the dose of the active ingredient contained in the cancer immunotherapeutic agent can be appropriately adjusted depending on the disease state, the age, weight, etc. of each individual patient.
  • the amount of peptide or derivative in a pharmaceutical composition administered to a cancer patient is 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 100 mg, more preferably 0.01 mg to 10 mg, even more preferably 0.00. 1-5 mg or 0.5-3 mg.
  • the administration method can also be appropriately selected.
  • oral administration, intravenous administration, intramuscular administration, intradermal administration, or subcutaneous administration can be used. If it is a peptide vaccine, it is preferably administered by intradermal or subcutaneous administration.
  • a cancer immunotherapy can be performed by preparing a vector containing a gene encoding them and administering it to a patient. Therefore, such a vector can be included in a kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention.
  • a vector may be introduced into a patient-derived dendritic cell outside the patient's body, and the cell expressing the desired peptide may be returned to the patient.
  • the vector examples include various plasmids and viral vectors such as adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus, vaccinia virus (Liu M, Acres B, Balloul JM, Bizouarne N, Paul S, Slos P, Squiban P. Gene- based vaccines and immunotherapeutics. Proc Natl Acad Sci USA 101 Suppl, 14567-71, 2004). Vector preparation methods are well known in the art (Molecular Cloning: A laboraroy manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory).
  • the dosage varies depending on the disease state, the age, weight, etc. of each patient.
  • the amount of DNA administered to a cancer patient is 0.1 ⁇ g to 100 mg, preferably 1 ⁇ g to 50 mg. It is.
  • the administration method include intravenous injection, subcutaneous administration, intradermal administration and the like.
  • a peptide that can be used in a peptide vaccine may be used to induce CTL in vitro.
  • CTL can be induced by culturing PBMC collected from a patient in vitro in the presence of a peptide or a derivative thereof.
  • the CTL may be included in a kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention.
  • a peptide that can be used in a peptide vaccine is cultured in vitro with dendritic cells, and the obtained dendritic cells presenting the peptide are included in the kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention. Also good.
  • the present invention comprises a step of detecting a 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of human IL-6R gene from a sample derived from a subject.
  • a method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy is provided.
  • the subject can be a cancer patient, for example, a cancer patient before receiving cancer immunotherapy or a cancer patient who has already received cancer immunotherapy.
  • the subject may also be a cancer patient who has received chemotherapy (for example, chemotherapy with irinotecan, oxaliplatin and / or fluoropyrimidine) and has not been effective, and is used for peptide vaccine therapy.
  • the cancer immunotherapy may be active immunotherapy or passive immunotherapy, and includes, but is not limited to, peptide vaccine therapy, dendritic cell vaccine therapy and treatment with immune checkpoint inhibitors, preferably Peptide vaccine therapy.
  • cancer examples include, but are not limited to, prostate cancer, pancreatic cancer, lung cancer, cervical cancer, endometrial cancer, stomach cancer, melanoma, thyroid cancer, brain tumor, hematopoietic species, esophageal cancer, Liver cancer, colon cancer (colorectal cancer), biliary tract cancer, breast cancer, bladder cancer, kidney cancer, bone and soft tissue tumor, testicular cancer, head and neck cancer, ovarian cancer, for example, Examples include early or advanced colorectal cancer.
  • the sample derived from the subject can be a gene sample (eg, genomic DNA, RNA) derived from a cancer patient.
  • gene samples derived from cancer patient tissues include, but are not limited to, gene samples obtained from blood and gene samples obtained from oral mucosa.
  • the sample derived from the subject may be, for example, DNA extracted from peripheral blood mononuclear cells of the subject.
  • Detection of 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of human IL-6R gene is performed by real-time PCR detection method (for example, TaqMan (registered trademark) probe method), Invader probe method, SNP typing using DNA chip It can be achieved by methods well known to those skilled in the art such as the PCR method, PCR-RFLP method, and PCR-SSCP method.
  • real-time PCR detection method for example, TaqMan (registered trademark) probe method
  • Invader probe method SNP typing using DNA chip It can be achieved by methods well known to those skilled in the art such as the PCR method, PCR-RFLP method, and PCR-SSCP method.
  • a real-time PCR detection method for example, TaqMan (registered trademark) probe method
  • TaqMan probe method can be adopted as a method for detecting the 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of the human IL-6R gene.
  • Real-time PCR detection includes, for example, the following steps: (I) preparing a forward primer, a reverse primer and a probe (wherein the forward primer and the reverse primer can amplify a human IL-6R gene fragment containing the 48892 base of the human IL-6R gene, for example, 10-50 base, 15-40 base, 15-35 base oligonucleotide; probe contains 48892 base of human IL-6R gene, amplified with the forward primer and the reverse primer A 10-50 base, 15-40 base, 15-35 base oligonucleotide that binds to the 6R gene fragment and a reporter fluorescent dye (eg, a fluorescein-based fluorescent dye such as FAM (6-carboxy-fluorescein)); Quencher fluorescent dyes (e.g., AMRA rhodamine-based fluorescent dyes) are attached, such as (6-carboxy - rhodamine - tetramethyl)), (Ii) PCR is performed using the primer and
  • the 48892nd gene polymorphism of the human IL-6R gene can be detected.
  • the TaqMan (registered trademark) probe method a kit provided by Applied Biosystems can be used. By performing PCR using an appropriate forward primer, an appropriate reverse primer, and an appropriate TaqMan probe, the 48892nd gene polymorphism of the human IL-6R gene can be detected.
  • the Invader probe method can be employed as a method for detecting the 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of the human IL-6R gene.
  • the Invader probe method can be performed, for example, according to the method described in J Hum Genet 2001; 46: 471-477, Nature Biotechnology 17, 292-296 (1999) and WO9823774. For example, including the following steps: (I) An allele probe, an invader probe, and a detection probe are prepared (here, the allele probe contains a base different from the 48892th type of the human IL-6R gene to be detected, and the human IL-6R is located on the 5 ′ side thereof.
  • a flap sequence consisting of a sequence complementary to a detection probe consisting of a sequence different from that of the gene, and 3 'from the base different from the 48892th polymorphism of the human IL-6R gene consists of the base sequence of the human IL-6R gene
  • An oligonucleotide (base length can be, for example, 15 to several hundred bases, 15 to 50 bases, 15 to 40 bases), and the invader probe contains the 48892th type of human IL-6R gene to be detected;
  • An oligonucleotide consisting of a human IL-6R gene sequence upstream thereof base length is, for example, 15-50
  • a detection probe is an oligonucleotide having a single stranded portion and a double stranded portion, where the single stranded portion is complementary to the flap sequence (eg, 15-50 bases).
  • Base 15 to 35 bases, 20 to 30 residues
  • the double-stranded part is a sequence of several residues (eg, 1 to 10 residues, 3 to 5 residues) complementary to the flap sequence.
  • An oligonucleotide containing a fluorescent group and a quencher that quenches it in a double-stranded part base length is, for example, 15 to several hundred bases, 15 to 100 bases, 15 to 50 bases, 15-40 bases));
  • subject-derived DNA is mixed with an allele probe and an invader probe, and a double strand forming reaction is performed;
  • Due to the binding, a part of the double strand in the detection probe that has a fluorescent group becomes a single strand, and
  • a SNP typing method using a DNA chip can be employed as a method for detecting the 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of the human IL-6R gene.
  • mRNA is extracted from a sample derived from a subject such as an oral mucosa, blood, etc.
  • cDNA having a fluorescent group bound thereto is prepared from the extracted mRNA, the prepared cDNA is added to a DNA chip, and a human to be detected on the DNA chip
  • the 48892th gene polymorphism of the human IL-6R gene can be detected.
  • the PCR-RFLP method or the PCR-SSCP method can be employed as a method for detecting the 48892nd gene polymorphism (Reference SNP ID: rs8192284) of the human IL-6R gene.
  • a forward primer and a reverse primer that can amplify a human IL-6R gene fragment containing the 48892nd base of the human IL-6R gene (both primers are 10-50 bases, 15-40 bases, 15- PCR is performed using a 35-base oligonucleotide), and the obtained PCR product is digested with an appropriate restriction enzyme in the PCR-RFLP method.
  • heat denaturation heat denaturation
  • -Rapid quenching and electrophoresis can detect the 48892nd gene polymorphism of the human IL-6R gene.
  • the 48892nd gene polymorphism of the human IL-6R gene detected in the method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention may be C / C, A / C and / or A / A.
  • the detected 48892 genotype of the human IL-6R gene is C / C or A / C
  • the subject is predicted to be effective for cancer immunotherapy.
  • the doctor can select treatment by cancer immunotherapy for the subject.
  • the fact that the 48892 genotype of the human IL-6R gene is C / C or A / C can also be used as an indicator that cancer immunotherapy is effective in the subject.
  • the detected 48892 genotype of the human IL-6R gene is A / A
  • the subject is predicted to be ineffective for cancer immunotherapy.
  • the doctor can select a treatment other than cancer immunotherapy.
  • the detected 48892nd genotype of the human IL-6R gene is A / A, and can also be used as an indicator that cancer immunotherapy is not effective in the subject.
  • the present invention provides the amount of human IL-6, human IP-10 (interferon gamma-induced protein 10) and / or human BAFF (B-cell activating factor) protein from a blood sample derived from a subject.
  • a method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy including a measuring step is provided.
  • the subject can be a cancer patient, for example, a cancer patient before receiving cancer immunotherapy or a cancer patient who has already received cancer immunotherapy.
  • the subject may also be a cancer patient who has received chemotherapy (for example, chemotherapy with irinotecan, oxaliplatin and / or fluoropyrimidine) and has not been effective, and is used for peptide vaccine therapy.
  • the cancer immunotherapy may be active immunotherapy or passive immunotherapy, and is not limited, but is preferably peptide vaccine therapy.
  • cancer include, but are not limited to, colorectal cancer (eg, colorectal cancer), for example, early or advanced colorectal cancer.
  • the blood sample is, for example, serum or plasma.
  • the protein mass of human IL-6, human IP-10 and / or human BAFF can be measured using anti-human IL-6 antibody, anti-human IP-10 antibody and / or anti-human BAFF antibody.
  • IL-6 protein mass In the blood sample of the subject before cancer immunotherapy treatment, (I) low IL-6 protein mass; When (ii) IP-10 protein mass is low; and / or (iii) BAFF protein mass is high, a subject is predicted to be a subject for whom cancer immunotherapy is effective. Such a result can also be used as an indicator that cancer immunotherapy is effective in a subject.
  • whether the amount of protein is high or low can be determined by comparing with a reference value. Examples of the reference value include a protein amount in a blood sample of a healthy person or a blood sample of a cancer patient. The median amount of protein in the medium is mentioned.
  • IL-6 when IL-6 is present in plasma or serum before treatment for cancer immunotherapy of 1.0 pg / ml or more, it is determined that the amount of IL-6 protein is high, and the subject is not effective for cancer immunotherapy. If there is less than 1.0 pg / ml in plasma or serum before cancer immunotherapy treatment, the IL-6 protein level is judged to be low and the subject is expected to be effective in cancer immunotherapy.
  • IP-10 for example, if the plasma or serum before treatment for cancer immunotherapy is present at 170 pg / ml or more, it is determined that the amount of IP-10 protein is high, and the subject is not effective for cancer immunotherapy.
  • the IP-10 protein level is judged to be low, and the subject is predicted to be effective in cancer immunotherapy.
  • the For BAFF for example, if the plasma or serum before treatment for cancer immunotherapy is present at 1200 pg / ml or more, it is determined that the amount of BAFF protein is high, and the subject is predicted to be effective for cancer immunotherapy. If there is less than 1200 pg / ml in plasma or serum before cancer immunotherapy treatment, the BAFF protein level is judged to be low and the subject is predicted to be ineffective for cancer immunotherapy.
  • the present invention provides a method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided in the fourth aspect in addition to the method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided in the third aspect.
  • a method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy is provided.
  • high levels of IL-6 in plasma or serum prior to cancer immunotherapy treatment high IP-10 protein mass; and / or low BAFF protein mass and human IL-6R
  • the 48892 genotype of the gene is A / A
  • the subject is predicted to be ineffective in cancer immunotherapy, and the amount of IL-6 in plasma or serum prior to cancer immunotherapy treatment is low
  • IP-10 When the protein mass is low; and / or when the BAFF protein mass is high, and the 48892 genotype of the human IL-6R gene is C / C or A / C, the subject predicts that cancer immunotherapy is effective Is done.
  • the method for predicting the therapeutic effect of the cancer immunotherapy further includes the peptide in a blood sample derived from a subject before and / or after the peptide vaccine administration. It may include measuring the amount of specific IgG.
  • the level of anti-peptide antibody (IgG) can be measured as previously reported by the Luminex TM method ( Komatsu (NKoet al, Scand J Clin Invest 2004; 64: 1-11).
  • the subject has cancer immunotherapy. Expected to be effective.
  • Such a result can also be used as one indicator that cancer immunotherapy with the peptide vaccine is effective in the subject.
  • the amount of the peptide-specific IgG in the blood sample (serum or plasma) after administration of the peptide vaccine is increased by 2 times or more compared to before the administration of the peptide vaccine, the subject is treated with cancer immunotherapy. It is predicted that.
  • the amount of peptide-specific IgG in serum or plasma immediately before peptide vaccine administration is compared with the amount of peptide-specific IgG in serum or plasma after 6 administrations once a week. If increased, the subject is predicted to be effective for cancer immunotherapy.
  • the 48892nd genotype of the human IL-6R gene is C / C or A / C, and (ii) IL-6 in plasma or serum before cancer immunotherapy is low; IP-10 protein is low; and / or BAFF protein is high; and (iii) in blood samples after peptide vaccine administration ( A subject is predicted to be effective for cancer immunotherapy when the amount of the peptide-specific IgG (in serum or plasma) is increased more than 2-fold compared to before peptide vaccine administration.
  • the 48892 genotype of the human IL-6R gene is A / A
  • the amount of IL-6 in plasma or serum before treatment of cancer immunotherapy is high
  • IP-10 protein And / or the amount of the peptide-specific IgG in the blood sample (serum or plasma) after administration of the peptide vaccine is 2
  • the subject is predicted to be ineffective with cancer immunotherapy.
  • the method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention can be carried out in vitro.
  • selecting a cancer patient for whom cancer immunotherapy (eg, peptide vaccine therapy) is expected to be effective based on the method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention.
  • cancer immunotherapy eg, peptide vaccine therapy
  • the doctor can determine whether to select cancer immunotherapy based on the results of the method for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention, and treat the patient. Can do.
  • the present invention provides a cancer immunotherapy enhancer or a cancer immunotherapy treatment kit containing an IL-6 inhibitor.
  • Any IL-6 inhibitor may be used as long as it inhibits the action of IL-6.
  • IL-6 inhibitors include anti-human IL-6 antibody and anti-human IL-6R antibody (for example, tocilizumab).
  • the cancer patient may be a patient with a high amount of plasma IL-6 protein (eg, 1.0 pg / ml or more).
  • the cancer immunotherapy is peptide vaccine therapy.
  • the cancer is, for example, colorectal cancer (colorectal cancer).
  • the composition or kit for predicting the therapeutic effect of cancer immunotherapy provided by the present invention can be provided as a cancer immunotherapy treatment kit containing a cancer peptide vaccine and an IL-6 inhibitor.
  • the cancer immunotherapy enhancer can be formulated together with an IL-6 inhibitor and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers include excipients (eg, dextrin, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.), disintegrants (eg, carboxymethylcellulose, etc.), lubricants (eg, magnesium stearate, etc.), interfaces
  • excipients eg, dextrin, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.
  • disintegrants eg, carboxymethylcellulose, etc.
  • lubricants eg, magnesium stearate, etc.
  • interfaces examples include, but are not limited to, active agents (eg, sodium lauryl sulfate), solvents (eg, water, saline, soybean oil), preservatives (eg, p-hydroxybenzoate). is not.
  • active agents eg, sodium lauryl sulfate
  • solvents e
  • each patient is 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 100 mg, more preferably 0.8. It is 01 mg to 10 mg, more preferably 0.1 to 5 mg or 0.5 to 3 mg.
  • the administration method can be appropriately selected. For example, oral administration, intravenous administration, intramuscular administration, intradermal administration, or subcutaneous administration can be used.
  • the present invention relates to a cancer immunotherapy comprising the 48892nd gene polymorphism of human IL-6R gene (Reference SNP ID: rs8192284).
  • a genetic marker for predicting the therapeutic effect of is provided.
  • the 48892nd gene polymorphism of the human IL-6R gene is useful as a predictive marker for the therapeutic effect of cancer immunotherapy.
  • the 48892nd genotype of the human IL-6R gene is C / C or A / C, a subject having the genotype is likely to be a subject effective for cancer immunotherapy.
  • the gene marker provided by the present invention may consist only of the 48892th genotype of the human IL-6R gene, and comprises a sequence containing the 48892nd genotype of the human IL-6R gene or a complementary sequence thereof.
  • it may be a genetic marker comprising a sequence of 5, 8, 10, 15 or 20 bases including the 48892nd genotype of the human IL-6R gene.
  • aCRC advanced colorectal cancer
  • the other selection criteria for the study subjects were as follows: over 20 years old; Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) general status 0 or 1; HLA-A2, -A3, -A11, -A24, -A26 , -A31, or -A33 positive; life expectancy of at least 12 weeks; adequate hematology, kidney and liver function (white blood cells> 2,500 / ⁇ l, lymphocytes> 1,000 / ⁇ l, platelets > 80,000 / ⁇ l, serum creatinine ⁇ 1.5 mg / dl, and total bilirubin ⁇ 2.5 mg / dl).
  • ECOG Eastern Cooperative Oncology Group
  • Exclusion criteria include pulmonary disease, heart disease, or other systemic illness; acute infection; history of severe allergic reaction; pregnancy or breastfeeding; or medical condition that is deemed inappropriate by the clinician, Etc. are included.
  • the protocol has been approved by the Ethics Committee of Kurume University and has been registered with UMIN as a clinical trial (UMIN000006493). After explaining all protocols, written informed consent was obtained from all patients prior to enrollment.
  • the selected peptide (3 mg / each peptide) was subcutaneously administered together with incomplete Freund's adjuvant (Montanide® ISA51; Seppic, Paris, France) once a week for 6 consecutive weeks. After 6 vaccinations were completed as the first cycle, up to 4 antigenic peptides were selected again according to the peptide-specific IgG titer and administered every 2-4 weeks. Where possible, chemotherapy and / or molecular targeted therapy were combined during the vaccination period. Adverse events were followed according to the National Cancer Institute Adverse Events (NCI-CTCAE) Common Terminology Criteria version 4.0. Complete blood counts and serum biochemistry tests were performed before and after 6 vaccinations.
  • NCI-CTCAE National Cancer Institute Adverse Events
  • Immunohistochemistry The expression of 15 vaccine antigens was examined by IHC using 20 tumor tissues (15 primary tumors and 5 metastatic liver tumors) from non-vaccinated aCRC patients. 4 ⁇ m sections were made from paraffin-embedded tissue samples and analyzed on coated glass slides. Immunostaining using antibodies specific for vaccine antigens was performed on a fully automated Bond-Max system (Leica Microsystems, Newcastle, UK). DAB was used as a chromogen in immunostaining. The antibodies used to detect the vaccine antigen have already been described. Prostate-related vaccine antigens, PSA and PSMA, were not shown because they could not be detected by IHC.
  • CRP C-reactive protein
  • SAA serum amyloid A
  • IL-6 IL-6 levels in plasma prior to vaccination
  • R & D systems Minneapolis, MN
  • Invitrogen Carlsbad, CA
  • eBioscience eBioscience
  • Measurement was performed by ELISA using a kit derived from (San Diego, CA).
  • Luminex 200 system Luminex, Austin, TX
  • cytokines such as IL-4, IL-13, IL-21, IP-10 (interferon gamma-induced protein 10), BAFF ( B-cell activating factor) and TGF- ⁇ were measured.
  • Frozen plasma samples were lysed, diluted and assayed in duplicate according to manufacturer's instructions. The average of duplicate samples was used for statistical analysis.
  • IL-6, and IL-6 receptor (IL-6R) gene polymorphisms Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were centrifugated from peripheral blood prior to vaccination with Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) Separated by. DNA was extracted from PBMC using the QIAamp Blood kit (Qiagen, Hilden, Germany) and stored at ⁇ 80 ° C. until analysis. Using the extracted DNA, IL-6-634G> C (rs1800796) and IL-6R 48892A> C (rs8192284, Asp358Ala) gene polymorphisms were examined. Genotyping was performed as described in Motoyama S, et al., Dig Surg.
  • Oligonucleotide and restriction enzyme used for detection of IL-6R gene polymorphism CCT TTG AGG CTT TTG ACA G (SEQ ID NO: 36) ACC CAT CTC ACC TCA GAA CAA (SEQ ID NO: 37) Restriction enzyme Hind III Oligonucleotide and restriction enzyme used for detection of IL-6 gene polymorphism GAG ACG CCT TGA AGT AAC TG (SEQ ID NO: 38) AAC CAA AGA TGT TCT GAA CTG A (SEQ ID NO: 39) Restriction enzyme Bsr BI
  • OS period was defined as the period from the first day of peptide vaccination or first-line chemotherapy to the date of death. Surviving patients were censored on the last day of contact. Prognostic factors for OS were assessed by univariate and multivariate analysis using Cox proportional hazard regression model. When applying this Cox regression, the distribution of each biomarker was very distorted, so the transformation of log (biomarker + 1) was used. Statistically significant biomarkers (P ⁇ 0.1) in univariate analysis were included in multivariate analysis. Spearman's rank correlation coefficient was used to select variables for inclusion in the multivariate analysis. All statistical analyzes were performed using JMP version 10 or SAS version 9.3 software package (SAS Institute Inc., Cary, NC).
  • the median treatment period before the start of PPV treatment was 552.5 days, ranging from 9-1819 days.
  • the number of peptides used for vaccination during the first cycle was 4 peptides in 36 patients, 3 peptides in 16 patients and 2 peptides in 8 patients.
  • 51 (85%) completed 6 vaccinations in the first cycle, while the remaining 9 patients were not completed due to rapid disease progression.
  • the median number of vaccinations was 12, ranging from 2-33.
  • Immune response to vaccine peptide The IgG titer specific to vaccine peptide was measured in plasma before and after vaccination and the humoral response response was analyzed. Post-vaccination plasma samples were collected from 51 and 35 patients at the end of each of the first cycle (6 vaccinations) and the second cycle (12 vaccinations). The IgG response specific for at least one vaccine peptide was 24 (47%) of 51 patients at the end of the first vaccination cycle and 33 (94% of 35) patients at the end of the second cycle. %) (Tables 6-1 to 6).
  • MST median OS duration
  • Multivariate Cox regression analysis was further performed to evaluate the effect of each factor that was shown to be significantly correlated with OS in univariate analysis (P ⁇ 0.1).
  • IL-6 an inflammatory marker
  • IL-6R 48892A> C polymorphism showed a significant correlation to OS.
  • This genetic polymorphism was further evaluated in patients with positive or negative IL-6 in plasma before vaccination (FIG. 3B).
  • IL-6R 48892A> C showed a significant effect on the survival time after peptide vaccine administration. That is, patients with IL-6R 48892 genotype A / C or C / C tend to have a better prognosis than patients with IL-6R 48892A / A, especially with lower IL-6 in patient plasma prior to vaccine administration In patients with concentrations, the trend was strong.
  • the study also shows that PPV elicited an immune response to vaccine antigens without serious side effects, and was clinically beneficial in aCRC patients with previous treatment history, even if the cancer was at a refractory stage. There was a possibility.

Abstract

　ＩＬ－６受容体遺伝子（ＩＬ－６Ｒ遺伝子）の遺伝子多型を検出することができるポリヌクレオチドを含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを提供する。また、ＩＬ－６Ｒ遺伝子の遺伝子多型を検出することを含むがん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。

Description

がん免疫療法の治療効果予測に有用な遺伝子多型
　本発明は、がん免疫療法の治療効果予測に有用な遺伝子多型とその使用等に関する。
　悪性腫瘍は日本人の死亡原因の第1位を占め年間約33万人が死亡している。また、世界では年間約600万人ががんで死亡している。現在、がん治療法としては外科的切除、抗がん剤、放射線療法などが行われているが、これらの治療法ではＱＯＬが低下することが多い。また、これらの治療法に対して耐性、再発をきたした場合には他に有効な治療法がないため、がんワクチン療法を含むがん免疫療法が第4の治療法として待望されている。しかしながら、がん免疫療法では、あらかじめその治療効果を予測する方法がなく、治療効果が期待できる患者を選別する方法が無いというのが現状である。
　これまで、ＩＬ－６受容体遺伝子（以下、ＩＬ－６Ｒ遺伝子とも称す）の遺伝子多型については、（１）ＩＬ－６の遺伝子多型は食道がん患者（外科的手術後）の予後と相関するが、ＩＬ－６受容体の遺伝子多型IL-6R 48892A>Cは予後と相関しない；（２）脳腫瘍患者においてもＩＬ－６の遺伝子多型は予後と相関するが、IL-6受容体遺伝子多型IL-6R 48892A>Cは予後と相関しない、と報告されている(非特許文献１および２)。
Motoyama S, Nakatsu T, Miura M, Hinai Y, Minamiya Y, Ogawa J. Interleukin-6 -634G>C genetic polymorphism is associated with prognosis following　surgery for　advanced thoracic esophageal squamous cell carcinoma. Dig Surg. 2012;29(3):194-201 Lagmay JP, London WB, Gross TG, Termuhlen A, Sullivan N, Axel A,Mundy B, Ranalli M, Canner J, McGrady P, Hall B. Prognostic significance of interleukin-6 single nucleotide polymorphism genotypes in neuroblastoma:  rs1800795 (promoter) and rs8192284 (receptor). Clin Cancer Res. 2009 Aug15;15(16):5234-9.
　本発明の課題の一つは、がん免疫療法の治療効果予測に有用な遺伝子多型を同定し、これを用いてがん免疫療法の治療効果予測方法を提供することである。
　本発明は、第一の側面（aspect）において、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドを含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを提供する。
　本発明は、第二の側面において、ヒトＩＬ－６、ヒトＩＰ－１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはヒトＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定するための試薬を含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを提供する。
　本発明は、第三の側面において、被験者由来の試料から、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。
　本発明は、第四の側面において、被験者由来の血液試料から、ヒトＩＬ－６、ヒトＩＰ－１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはヒトＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。
　本発明は、第五の側面において、ＩＬ－６阻害剤を含む、がん免疫療法増強剤またはがん免疫療法治療用キットを提供する。
　本発明は、第六の側面において、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を含む、がん免疫療法の治療効果を予測するための遺伝子マーカーを提供する。
　本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法により、被験者にとってがん免疫療法が有効であるか否かが予測される。
結腸直腸がん（colorectal cancer）組織に発現するがんワクチン抗原の免疫組織学的解析結果を示す。ワクチンを投与していない結腸直腸がん患者のがん組織におけるワクチン抗原の発現を免疫組織化学により検討した。代表的なデータを示す。全ての写真はｘ２００である。 Kaplan-Meier survival analysisの結果を示す。（Ａ）６０名の患者のペプチドワクチン投与後の生存カーブをKaplan-Meier methodにより決定した（実線）。（Ｂ）ペプチドワクチン療法の開始前に、２つ以上の化学療法の治療歴があり、そして、イリノテカン、オキサリプラチンおよびフルオロピリミジンの全てに忍容性がなかった患者の生存カーブをKaplan-Meier methodにより決定した（実線）。破線は９５％信頼区間を示す。 ペプチドワクチンを投与した結腸直腸がん患者におけるIL-6R 48892A>C遺伝子多型と予後との関係を示す。（Ａ）IL-6R 48892A>C遺伝子多型（IL-6R 48892A/CまたはC/C（n=40）vs IL-6R 48892A/A（n=20））に基づいて、ペプチドワクチンで治療した患者を２つのサブグループに分けた。生存カーブをKaplan-Meier methodにより決定した。生存カーブ間の違いは、log-rank testを用いて統計的に解析した。（Ｂ）IL-6R 48892A>C遺伝子多型（IL-6R 48892A/CまたはC/C vs IL-6R 48892A/A）およびワクチン投与前血漿のＩＬ－６レベルに基づいて、ペプチドワクチンで治療した患者を４つのサブグループに分けた。生存カーブをKaplan-Meier methodにより決定した。生存カーブ間の違いは、log-rank testを用いて統計的に解析した。ＩＬ－６陰性の患者において、IL-6R 48892A/CまたはC/CおよびIL-6R 48892A/Aの遺伝子多型間で有意差があった（IL-6(-),IL-6R 48892A/CまたはC/C (n=18) vs IL-6(-),IL-6R 48892A/A (n=11)；p=0.0252）が、ＩＬ－６陽性患者においては有意差がなかった（IL-6(+),IL-6R 48892A/CまたはC/C (n=21) vs IL-6(+),IL-6R 48892A/A (n=9)；p=0.1184）。
用語の説明
　本明細書において、「ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型」は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のＳＮＰデータバンクで用いられているReference SNP IDが、rs8192284と表示されている遺伝子多型である。この遺伝子多型は、配列番号１または配列番号２で表されるＩＬ－６Ｒのアミノ酸配列において、３５８番目のアミノ酸残基がＡｓｐまたはＡｌａとなる相違に関係している。ヒトＩＬ－６受容体遺伝子（ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子）の４８８９２番目の遺伝子型（Reference SNP ID：rs8192284）には、Ｃ／Ｃ、Ａ／ＣおよびＡ／Ａが挙げられる。
　本明細書において、「がん免疫療法」とは、非特異的免疫療法（例えば、免疫賦活剤投与による治療、免疫チェックポイント阻害剤による治療）、能動特異的免疫療法（例えば、ペプチドワクチン療法、自家がん細胞ワクチン療法、樹状細胞ワクチン療法）および受動特異的免疫療法（例えば、リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞療法、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）療法、遺伝子改変Ｔ細胞療法）を含む。例えばがん免疫療法は、ペプチドワクチン療法、樹状細胞ワクチン療法、または免疫チェックポイント阻害剤による治療であり、好ましくはペプチドワクチン療法である。
　本明細書において、「がん」は、がん免疫療法の対象となり得るものであり、例えば、がんの例としては、限定はされないが、前立腺がん、すい臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮体がん、胃がん、メラノーマ、甲状腺がん、脳腫瘍、造血器種、食道がん、肝臓がん、大腸がん（結腸直腸がん）、胆道がん、乳がん、膀胱がん、腎がん、骨軟部腫瘍、精巣がん、頭頸部がんおよび卵巣がんが挙げられる。また、がんは進行した（advanced）がんであり得る。
がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキット
　本発明は、第一の側面において、ヒトＩＬ－６受容体遺伝子（ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子）の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドを含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを提供する。
　本発明で使用されるヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドは、プライマーであっても、プローブであってもよく、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を含む、１０～２００塩基、好ましくは１０～５０塩基、より好ましくは１５塩基～３０塩基のヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子配列の部分配列またはその相補鎖配列からなるポリヌクレオチドであり得る。例えば、上記プローブは、配列番号３または配列番号４で表されるヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子またはその断片と特異的にハイブリダイズするプローブであってもよい。また、例えば、上記プライマーは、配列番号３または配列番号４で表されるヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子またはその断片をＰＣＲにて増幅できるプライマーであってもよい。
　特異的にハイブリダイズするプローブやプライマーは、該プローブやプライマーがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと１００％相補的であるプローブやプライマーであってもよく、また、該プローブやプライマーがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブやプライマーであってもよい。ハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., etc., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA 2nd edition, 1989等に記載される方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションには、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する工程を含むハイブリダイゼーションが挙げられる。洗浄ステップにおける塩濃度や温度を適宜調整することにより、高ストリンジェンシーな条件（塩濃度が低く, 高温）や低ストリンジェンシーな条件（塩濃度が高く、低温）とすることができる。高ストリンジェンシーでの洗浄条件では、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃で洗浄（例えば１５分間×２回）が実施され、低ストリンジェンシーでの洗浄条件では、例えば、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中にて室温で洗浄（例えば５分間×２回）が実施される。
　プローブおよび／またはプライマーは、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子と同一性が無い、または低い（例えば、０～１０％）配列からなる付加的配列を含んでもよく、放射性同位元素（例えば、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ）、酵素（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン、SYBR（登録商標）Green）、発光物質（例えば、ルミノール、ルシフェリン、イクオリン）、アビジン、ビオチン等の標識物質で標識されていてもよい。標識は、１物質による標識であっても、複数物質による標識であってもよく、例えば、蛍光物質（例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャーが結合されていてもよい。
　遺伝子多型の検出方法によって、それに適したヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドであるプライマーやプローブが使用される。遺伝子多型の検出方法としては、限定はされないが、リアルタイムＰＣＲ検出法（例えば、TaqMan（登録商標）プローブ法）、Invaderプローブ法、DNAチップを用いたＳＮＰタイピング法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法などが挙げられる。
　一つの実施態様として、遺伝子多型の検出方法としてリアルタイムＰＣＲ検出法を採用することができる。この場合、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含むヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子断片を増幅することができるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーとリバースプライマーが使用され得、そして、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含む、該フォワードプライマーと該リバースプライマーで増幅されるヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子断片に結合するオリゴヌクレオチドであってレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素が結合したプローブが使用され得る。プライマーおよびプローブは、例えば１０～５０塩基、１５～４０塩基、１５～３５塩基のオリゴヌクレオチドである。レポーター蛍光色素としては、例えば、ＦＡＭ（６－カルボキシ－フルオレセイン）のようなフルオレセイン系蛍光色素が使用でき、クエンチャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６－カルボキシ－テトラメチル－ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が使用できる。リアルタイムＰＣＲ法としては、TaqMan（登録商標）プローブを用いた方法を使用でき、アプライドバイオシステムズ社から必要な試薬を入手することができる。
　一つの実施態様として、遺伝子多型の検出方法としてInvaderプローブ法を採用することができる。この場合、３種類のプローブ：アリルプローブ、インベーダープローブおよび検出プローブを使用して、遺伝子多型を検出することができる。アリルプローブは、検出したいヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の型と違う塩基を含み、それより５’側はヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子と異なる配列からなる検出プローブに相補的な配列からなるフラップ配列からなり、検出したいヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の多型と違う塩基より３’側は、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。アリルプローブの塩基長は、例えば、１５～数百塩基、１５～５０塩基、１５～４０塩基である。インベーダープローブは、検出したいヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の型を含み、それより上流のヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。インベーダープローブの塩基長は、例えば、１５～５０塩基、１５～４０塩基である。検出プローブは、フラップ配列と相補的な塩基配列を一部に含むプローブであって、Cleavaseと呼ばれるエンドヌクレアーゼによりアリルプローブが切断されることにより生じるフラップ配列からなるオリゴヌクレオチドが結合するプローブである。該検出プローブは、例えば、１５～数百塩基、１５～１００塩基、１５～５０塩基、１５～４０塩基のオリゴヌクレオチドである。
　一つの実施態様として、遺伝子多型の検出方法としてDNAチップを用いたＳＮＰタイピング法を採用することができる。この場合、検出したいヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含むヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして採用することができる。該プローブの塩基長は、例えば、１０～１００塩基、１５～５０塩基、１５～３５塩基であり得る。Affymetrix,Inc.やIllumina,Inc.から入手できるDNAチップを用い、推奨されている方法で、遺伝子多型を検出することができる。
　一つの実施態様として、遺伝子多型の検出方法として、PCR-RFLP法やPCR-SSCP法を用いることができる。この場合、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含むヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子断片を増幅することができる、例えば１０～５０塩基、１５～４０塩基、１５～３５塩基のオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーとリバースプライマーが使用され得る。
　本発明に使用されるヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチド（例えば、プローブ、プライマー）は、各々別個に、または混合して、凍結乾燥状態で、適切な緩衝液（例えば、TE buffer）中に適当な濃度（例えば、１～５０μＭ）で溶解し、－２０℃で凍結した状態で、組成物として提供することができる。
　ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドの他に、当業者は、採用する遺伝子多型の検出方法に適した試薬、器材等の物質を含めて、がん免疫療法の治療効果の予測用キットとして提供できる。例えば、遺伝子多型の検出方法としてリアルタイムＰＣＲ検出法を採用する場合には、10XPCR反応液、10XMgCl2水溶液、Taq DNAポリメラーゼ等をキットに含めることができる。例えば、遺伝子多型の検出方法としてInvaderプローブ法を採用する場合には、Cleavase（エンドヌクレアーゼ）をキットに含めることができる。例えば、遺伝子多型の検出方法としてDNAチップを用いたＳＮＰタイピング法を採用する場合には、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドを含むDNAチップ、ハイブリダイゼーション用洗浄液（例えば、0.1% Tween 20を含む1XTBS）をキットに含めることができる。例えば、遺伝子多型の検出方法として、PCR-RFLP法やPCR-SSCP法を用いる場合には、制限酵素や電気泳動用ゲルをキットに含めることができる。
　本発明は、第二の側面において、被験者の血液試料中のヒトＩＬ－６、ヒトＩＰ－１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはヒトＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定するための試薬を含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを提供する。
　血液試料は、血清または血漿であり得る。
　被験者の血液中のＩＬ－６、ＩＰ－１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはＢＡＦＦ（B-cell activating factor）を検出するための試薬は、例えば、抗ヒトＩＬ－６抗体、抗ヒトＩＰ－１０抗体および／または抗ヒトＢＡＦＦ抗体であり得る。抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
　一つの実施態様として、がん免疫療法の治療開始前の被験者の血液中のＩＬ－６、ＩＰ－１０および／またはＢＡＦＦの蛋白質量が、本発明が提供するキットにより測定される。
　本発明が提供するキットは、例えば、抗ヒトＩＬ－６抗体、抗ヒトＩＰ－１０抗体および／または抗ヒトＢＡＦＦ抗体を含む他、血液から血清を調製するために使用するEDTA、クエン酸またはヘパリンを含んだ溶液を含んでもよい。抗ヒトＩＬ－６抗体、抗ヒトＩＰ－１０抗体および抗ヒトＢＡＦＦ抗体は、凍結乾燥状態で、または、１～１０mg/mlの濃度でＰＢＳ等の緩衝液に溶解した状態で提供され得る。本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットには、ＩＬ－６、ＩＰ－１０および／またはＢＡＦＦの蛋白質量を測定するための試薬、器材等を含んだＥＬＩＳＡキットであってもよい。このようなＥＬＩＳＡキットには、上記抗体の他、プレート（例えば、９６穴プレート）、ブロッキング溶液（例えば、BSA溶液、乳蛋白質溶液）および洗浄液（界面活性剤を含むリン酸緩衝液（例えば、Tween20を含むPBS））が含まれ得る。
　本発明が第一の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを、本発明が第二の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットと組み合わせて使用することにより、がん免疫療法の治療効果をより正確に予測でき得る。よって、一つの実施態様において、本発明は、第一の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットに加え、さらに第二の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを含む、がん免疫療法の治療効果の予測用キットを提供する。
　がん免疫療法がペプチドワクチン療法である場合、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットは、さらに、被験者の血液中のペプチドワクチン免疫療法で投与したペプチドに対する抗体のレベルを測定するための試薬（例えば、ペプチドワクチン免疫療法で投与したペプチド）を含んでもよい。一つの実施態様として、ペプチドワクチン投与後の被験者の血液中における、ペプチドワクチン免疫療法で投与したペプチドに対するIgG抗体のレベルを測定してもよい。例えば、抗ペプチド抗体（IgG）のレベルは、Luminex（商標）法により既報のように測定できる（Komatsu N et al, Scand J Clin Invest 2004;64:1-11）。Luminex（商標）法を採用する場合、例えば、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットは、さらに、カラーコードビーズ（Luminex Corp., Austin, TX, USA)およびビオチン化ヤギ抗ヒトIgGを含んでもよい。
　本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットは、がん免疫療法剤とあわせて提供すれば、予測に基づいたがん治療ができる。よって、一つの実施態様として、本発明は、がん免疫療法剤および本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットを含む、がん治療用キットを提供する。
　がん免疫療法剤に含まれる活性成分の例としては、限定はされないが、サイトカイン（例えば、インターフェロン、インターロイキン２）、免疫賦活剤（例えば、BCG、OK-432、レンチナン）、リンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）、ＮＫ細胞）、樹状細胞、ペプチドワクチンが挙げられる。
　ペプチドワクチンに使用できるペプチドの例としては、CypB-129：KLKHYGPGWV（配列番号５）、EGFR-800：DYVREHKDNI（配列番号６）、EZH2-735：KYVGIEREM（配列番号７）、HNRPL-140：ALVEFEDVL（配列番号８）、HNRPL-501：NVLHFFNAPL（配列番号９）、Lck-90：ILEQSGEWWK（配列番号１０）、Lck-208：HYTNASDGL（配列番号１１）、Lck-246：KLVERLGAA（配列番号１２）、Lck-422：DVWSFGILL（配列番号１３）、Lck-449：VIQNLERGYR（配列番号１４）、Lck-486：TFDYLRSVL（配列番号１５）、Lck-488：DYLRSVLEDF（配列番号１６）、MAP-432：DLLSHAFFA（配列番号１７）、MRP3-503：LYAWEPSFL（配列番号１８）、MRP3-1293：NYSVRYRPGL（配列番号１９）、PAP-213：LYCESVHNF（配列番号２０）、PAP-248：GIHKQKEKSR（配列番号２１）、PSA-248：HYRKWIKDTI（配列番号２２）、PSMA-624：TYSVSFDSL（配列番号２３）、PTHrP-102：RYLTQETNKV（配列番号２４）、SART2-93：DYSARWNEI（配列番号２５）、SART2-161：AYDFLYNYL（配列番号２６）、SART3-109：VYDYNCHVDL（配列番号２７）、SART3-302：LLQAEAPRL（配列番号２８）、SART3-309：RLAEYQAYI（配列番号２９）、SART3-511：WLEYYNLER（配列番号３０）、SART3-734：QIRPIFSNR（配列番号３１）、UBE-43：RLQEWCSVI（配列番号３２）、UBE-85：LIADFLSGL（配列番号３３）、WHSC2-103：ASLDSDPWV（配列番号３４）、WHSC2-141：ILGELREKV（配列番号３５）およびこれらの誘導体が挙げられる。
　ペプチドの誘導体の例としては、ペプチドのアミノ酸配列において１または２個のアミノ酸の置換、欠失および／または付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつ患者にマッチしたHLA分子（例えば、HLA-A24分子）に結合でき、ペプチド特異的CTLを誘導する能力を有するペプチドが挙げられる。ペプチド特異的CTLを誘導する能力を有するか否かは、例えば、ペプチドで刺激した末梢血単核細胞（PBMC）が対応ペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してインターフェロン（IFN）-γのようなサイトカインを産生するか否かをELISA法等で測定して調べることができる。また、誘導されたCTLの細胞傷害活性は、51Cr放出試験等により確認することができる。CTLによる認識性を考慮すると、ペプチドの誘導体のアミノ酸残基数は８～１４個の範囲内であることが好ましく、より好ましくは８～１１個、特に好ましくは９または１０個である。
　ペプチドワクチンは、１種類のペプチドまたは誘導体を含むものであってもよく、２種類以上（例えば、２種、３種または４種）のペプチドおよび／または誘導体を組み合わせて含んでも良い。がん患者のCTLは相異なる癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合なので、複数種類のペプチドおよび／また誘導体を組み合わせて使用してもよい。また、ペプチドワクチンに使用するペプチドは、投与対象となる患者の血中に結合する抗体が見いだされるペプチドを選択してもよい。
　がん免疫療法剤は、活性成分と、医薬として許容できる担体と共に製剤化され得る。医薬として許容できる担体としては、例えば、賦形剤（例えば、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル等）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　がん免疫療法剤に含まれる活性成分の投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができる。例えば、がん患者に投与される医薬組成物中のペプチドまたは誘導体の量は、０．０００１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ～１００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ～１０ｍｇ、より一層好ましくは０．１～５ｍｇまたは０．５～３ｍｇである。投与方法も適宜選択することができ、例えば、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与または皮下投与により投与することができる。ペプチドワクチンであれば、好ましくは、皮内投与または皮下投与で投与される。
　活性成分が蛋白質またはペプチドの場合、それらをコードする遺伝子を含むベクターを調製し、それを患者に投与することにより、がん免疫療法を行うこともできる。よって、このようなベクターは、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットに含まれ得る。また、患者体外において例えば患者由来の樹状細胞にベクターを導入し、所望のペプチドを発現させた細胞を患者に戻しても良い。これら方法は当業界において周知である（Hrouda D, Dalgleish AG. Gene therapy for prostate cancer. Gene Ther 3: 845-52, 1996）。
　ベクターとしては、各種プラスミドおよびウィルスベクター、例えばアデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等が挙げられる（Liu M, Acres B, Balloul JM, Bizouarne N, Paul S, Slos P, Squiban P.  Gene-based vaccines and immunotherapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A 101 Suppl, 14567-71, 2004）。ベクターの調製方法は当業界にて周知である（Molecular Cloning: A laboraroy manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory）。
　ベクターを患者に投与する場合、投与量は疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により変化するが、例えばがん患者に投与されるDNA量として、0.1μg～100mg、好ましくは1μg～50mgである。投与方法には、静脈注射、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。
　ペプチドワクチンに使用できるペプチドをin vitroでCTLを誘導するために用いてもよい。例えば、患者から採取されたPBMCを、in vitroでペプチドまたはその誘導体の存在下培養することによりCTLを誘導することができる。当該CTLを、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットに含ませてもよい。また、ペプチドワクチンに使用できるペプチドをin vitroで樹状細胞と培養し、得られたペプチドを提示した樹状細胞を本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用キットに含ませてもよい。
がん免疫療法の治療効果の予測方法
　本発明は、第三の側面において、被験者由来の試料から、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。
　被験者は、がん患者であり得、例えば、がん免疫療法を受ける前のがん患者または既にがん免疫療法を受けているがん患者であり得る。また、被験者は、化学療法（例えば、イリノテカン、オキサリプラチンおよび／またはフルオロピリミジンによる化学療法）を受けており、当該化学療法が有効でなかったがん患者であってもよく、ペプチドワクチン療法に用いる予定のペプチドに対する抗体を血中に有するがん患者であってもよい。がん免疫療法は、能動免疫療法であっても受動免疫療法であってもよく、限定はされないが、ペプチドワクチン療法、樹状細胞ワクチン療法および免疫チェックポイント阻害剤による治療が例示され、好ましくは、ペプチドワクチン療法である。がんの例としては、限定はされないが、前立腺がん、すい臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮体がん、胃がん、メラノーマ、甲状腺がん、脳腫瘍、造血器種、食道がん、肝臓がん、大腸がん（結腸直腸がん）、胆道がん、乳がん、膀胱がん、腎がん、骨軟部腫瘍、精巣がん、頭頸部がん、卵巣がんが挙げられ、例えば、初期または進行した大腸がんが挙げられる。
　被験者由来の試料は、がん患者由来の遺伝子サンプル（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ）であり得る。がん患者の組織由来の遺伝子サンプルの例には、限定はされないが、血液から得られた遺伝子サンプル、口腔粘膜から得られた遺伝子サンプルが挙げられる。被験者由来の試料は、例えば、被験者の末梢血単核球（Peripheral blood mononuclear cells）から抽出されたＤＮＡであってもよい。
　ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）の検出は、リアルタイムＰＣＲ検出法（例えば、TaqMan（登録商標）プローブ法）、Invaderプローブ法、DNAチップを用いたＳＮＰタイピング法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法等の当業者に周知の方法により達成することができる。
　一つの実施態様では、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）の検出法としてリアルタイムＰＣＲ検出法（例えば、TaqMan（登録商標）プローブ法）を採用することができる。リアルタイムＰＣＲ検出は、例えば以下の工程を含む：
（ｉ）フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブを用意する（ここで、フォワードプライマーとリバースプライマーは、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含むヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子断片を増幅することができる、例えば１０～５０塩基、１５～４０塩基、１５～３５塩基のオリゴヌクレオチドである；プローブは、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含む、該フォワードプライマーと該リバースプライマーで増幅されるヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子断片に結合する例えば１０～５０塩基、１５～４０塩基、１５～３５塩基のオリゴヌクレオチドであってレポーター蛍光色素（例えば、ＦＡＭ（６－カルボキシ－フルオレセイン）のようなフルオレセイン系蛍光色素）とクエンチャー蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ（６－カルボキシ－テトラメチル－ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素）が結合する）、
（ｉｉ）（ｉ）で用意したプライマーとプローブを用い、被験者由来のＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行う。
　上記（ｉ）～（ｉｉ）の工程を行うことにより、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型を検出することができる。
　TaqMan（登録商標）プローブ法を採用する場合は、アプライドバイオシステムズ社が提供するキットを用いることができる。適切なフォワードプライマー、適切なリバースプライマーおよび適切なTaqManプローブを用いたＰＣＲを行うことにより、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型を検出することができる。
　一つの実施態様では、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）の検出法としてInvaderプローブ法を採用することができる。Invaderプローブ法は、例えば、J Hum Genet 2001;46:471-477、Nature Biotechnology 17, 292 - 296 (1999)およびWO9823774号公報に記載の方法に準じて実施することができる。例えば、以下の工程を含む：
（ｉ）アリルプローブ、インベーダープローブおよび検出プローブを用意する（ここで、アリルプローブは、検出したいヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の型と違う塩基を含み、それより５’側はヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子と異なる配列からなる検出プローブに相補的な配列からなるフラップ配列からなり、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の多型と違う塩基より３’側は、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり（塩基長は、例えば、１５～数百塩基、１５～５０塩基、１５～４０塩基であり得る）、インベーダープローブは、検出したいヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の型を含み、それより上流のヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子配列からなるオリゴヌクレオチドであり（塩基長は、例えば、１５～５０塩基、１５～４０塩基であり得る）、検出プローブは、一本鎖部分と二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであって、一本鎖部分はフラップ配列と相補的な配列（例えば、１５～５０塩基、１５～３５塩基、２０～３０残基）からなり、二本鎖部分はフラップ配列と相補的な数残基（例えば、１～１０残基、３～５残基）の配列を５’側に含み、二本鎖部分に蛍光基とそれを消光するクエンチャーが結合しているオリゴヌクレオチドである（塩基長は、例えば、１５～数百塩基、１５～１００塩基、１５～５０塩基、１５～４０塩基））；
（ｉｉ）被験者由来のＤＮＡをアリルプローブとインベーダープローブを混合し、二本鎖形成反応を行う；
（ｉｉｉ）アリルプローブの二本鎖を形成していないフラップ配列部分をエンドヌクレアーゼ：Cleavaseで切断する；
（ｉｖ）切断されたフラップ配列からなるオリゴヌクレオチドを検出プローブと結合させる；
（ｖ）結合により、検出プローブ内の二本鎖の一部であって蛍光基を有する部分が一本鎖となり、生じた一本鎖部分がCleavaseで切断され、蛍光基がクエンチャーから乖離する；および
（ｖｉ）乖離の結果生じた蛍光を検出する。
　一つの実施態様では、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）の検出法としてDNAチップを用いたＳＮＰタイピング法を採用することができる。例えば、口腔粘膜、血液等の被験者由来の試料よりｍＲＮＡを抽出し、抽出したｍＲＮＡより蛍光基を結合させたｃＤＮＡを調製し、調製したｃＤＮＡをＤＮＡチップに添加し、ＤＮＡチップ上の検出したいヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型を含むプローブとハイブリダイズさせ、洗浄後蛍光を測定することにより、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型を検出することができる。
　一つの実施態様では、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）の検出法としてPCR-RFLP法またはPCR-SSCP法を採用することができる。例えば、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の塩基を含むヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子断片を増幅することができるフォワードプライマーとリバースプライマー（両プライマーは、例えば、１０～５０塩基、１５～４０塩基、１５～３５塩基のオリゴヌクレオチドである）を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を、PCR-RFLP法では適切な制限酵素で分解し、PCR-SSCP法では、ホルムアミドの存在下で熱変性（加熱・急冷）させて、電気泳動（アガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動）することにより、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型を検出することができる。
　本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法において検出されるヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型は、Ｃ／Ｃ、Ａ／Ｃおよび／またはＡ／Ａであり得る。
　検出されたヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型が、Ｃ／ＣまたはＡ／Ｃであるとき、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。この場合、医師は被験者にがん免疫療法による治療を選択することができる。ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＣ／ＣまたはＡ／Ｃであることはまた、被験者においてがん免疫療法が有効であることのひとつの指標として用いることができる。検出されたヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型が、Ａ／Ａであるとき、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測される。この場合、医師は、がん免疫療法以外の治療法を選択できる。検出されたヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＡ／Ａであることはまた、被験者においてがん免疫療法が有効でないことのひとつの指標として用いることができる。
　本発明は、第四の側面において、被験者由来の血液試料から、ヒトＩＬ－６、ヒトＩＰ－１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはヒトＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。
　被験者は、がん患者であり得、例えば、がん免疫療法を受ける前のがん患者または既にがん免疫療法を受けているがん患者であり得る。また、被験者は、化学療法（例えば、イリノテカン、オキサリプラチンおよび／またはフルオロピリミジンによる化学療法）を受けており、当該化学療法が有効でなかったがん患者であってもよく、ペプチドワクチン療法に用いる予定のペプチドに対する抗体を血中に有するがん患者であってもよい。がん免疫療法は、能動免疫療法であっても受動免疫療法であってもよく、限定はされないが、好ましくは、ペプチドワクチン療法である。がんの例としては、限定はされないが、大腸がん（例えば、結腸直腸がん）、例えば、初期または進行した大腸がんが挙げられる。
血液試料は、例えば血清または血漿である。
ヒトＩＬ－６、ヒトＩＰ－１０および／またはヒトＢＡＦＦの蛋白質量は、抗ヒトＩＬ－６抗体、抗ヒトＩＰ－１０抗体および／または抗ヒトＢＡＦＦ抗体を用いて測定できる。
　被験者由来の血液試料から、ヒトＩＬ－６、ヒトＩＰ－１０およびヒトＢＡＦＦからなる群から少なくとも１つの蛋白質量を測定した結果、がん免疫療法治療前の被験者の血液試料において、
（ｉ）ＩＬ－６蛋白質量が高い；
（ｉｉ）ＩＰ－１０蛋白質量が高い；および／または
（ｉｉｉ）ＢＡＦＦ蛋白質量が低いとき、被験者が、がん免疫療法が有効でない被験者であると予測される。かかる結果はまた、被験者においてがん免疫療法が有効でないことのひとつの指標として用いることができる。
　また、がん免疫療法治療前の被験者の血液試料において、
（ｉ）ＩＬ－６蛋白質量が低い；
（ｉｉ）ＩＰ－１０蛋白質量が低い；および／または
（ｉｉｉ）ＢＡＦＦ蛋白質量が高いとき、被験者が、がん免疫療法が有効である被験者であると予測される。かかる結果はまた、被験者においてがん免疫療法が有効であることのひとつの指標として用いることができる。
　一つの実施態様として、蛋白質量が高いまたは低いか否かは、基準値と比較して判定され得、基準値の例としては、健常人の血液試料中の蛋白質量またはがん患者の血液試料中の蛋白質量の中央値が挙げられる。例えば、ＩＬ－６については、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中1.0 pg/ml以上存在すれば、ＩＬ－６蛋白質量が高いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測され、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中1.0 pg/ml未満存在すれば、ＩＬ－６蛋白質量は低いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。ＩＰ－１０については、例えば、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中170 pg/ml以上存在すれば、ＩＰ－１０蛋白質量が高いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測され、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中170 pg/ml未満存在すれば、ＩＰ－１０蛋白質量は低いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。ＢＡＦＦについては、例えば、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中1200 pg/ml以上存在すれば、ＢＡＦＦ蛋白質量が高いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効であると予測され、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中1200 pg/ml未満存在すれば、ＢＡＦＦ蛋白質量は低いと判定されて、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測される。
　本発明が第三の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法を、本発明が第四の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法と組み合わせて使用することにより、がん免疫療法の治療効果をより正確に予測でき得る。よって、一つの実施態様において、本発明は、第三の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法に加え、さらに第四の側面において提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法を提供する。この実施態様において、例えば、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中のＩＬ－６量が高い；ＩＰ－１０蛋白質量が高い；および／またはＢＡＦＦ蛋白質量が低く、そして、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＡ／Ａのとき、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測され、がん免疫療法の治療前の血漿または血清中のＩＬ－６量が低い；ＩＰ－１０蛋白質量が低い；および／またはＢＡＦＦ蛋白質量が高く、そして、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＣ／ＣまたはＡ／Ｃのとき、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。
がん免疫療法が、ペプチドワクチン療法の場合、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法は、さらに、ペプチドワクチン投与前および／または投与後の被験者由来の血液試料中の該ペプチド特異的ＩｇＧの量を測定することを含んでもよい。例えば、抗ペプチド抗体（IgG）のレベルは、Luminex（商標）法により既報のように測定できる（Komatsu N et al, Scand J Clin Invest 2004;64:1-11）。一つの実施態様において、ペプチドワクチン投与後の血液試料中（血清または血漿中）の該ペプチド特異的ＩｇＧの量が、ペプチドワクチン投与前に比較し増加した場合には、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。かかる結果はまた、被験者において当該ペプチドワクチンによるがん免疫療法が有効であることのひとつの指標として用いることができる。例えば、ペプチドワクチン投与後の血液試料中（血清または血漿中）の該ペプチド特異的ＩｇＧの量が、ペプチドワクチン投与前に比較し２倍以上増加した場合には、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。一つの実施態様において、ペプチドワクチン投与直前の血清または血漿のペプチド特異的ＩｇＧの量と、１週間１回投与で６回投与後の血清または血漿のペプチド特異的ＩｇＧの量を比較し、２倍以上増加した場合には、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。
　よって、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法により、例えば、（ｉ）ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＣ／ＣまたはＡ／Ｃであり、（ｉｉ）がん免疫療法の治療前の血漿または血清中のＩＬ－６量が低い；ＩＰ－１０蛋白質量が低い；および／またはＢＡＦＦ蛋白質量が高い、そして、（ｉｉｉ）ペプチドワクチン投与後の血液試料中（血清または血漿中）の該ペプチド特異的ＩｇＧの量が、ペプチドワクチン投与前に比較し２倍以上増加したとき、被験者はがん免疫療法が有効であると予測される。一方、（ｉ）ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＡ／Ａであり、（ｉｉ）がん免疫療法の治療前の血漿または血清中のＩＬ－６量が高い；ＩＰ－１０蛋白質量が高い；および／またはＢＡＦＦ蛋白質量が低く、そして、（ｉｉｉ）ペプチドワクチン投与後の血液試料中（血清または血漿中）の該ペプチド特異的ＩｇＧの量が、ペプチドワクチン投与前に比較し２倍以上増加しなかったとき、被験者はがん免疫療法が有効でないと予測される。
　本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法は、in vitroで実施することができる。
　一つの実施態様では、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法に基づき、がん免疫療法（例えば、ペプチドワクチン療法）が有効であると予想されるがん患者を選択することができる。
　また、一つの実施態様では、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測方法の結果に基づき、医師は、がん免疫療法を選択するか否かを決定でき、患者を治療することができる。
がん免疫療法増強剤またはがん免疫療法治療用キット　
本発明は、第五の側面において、ＩＬ－６阻害剤を含む、がん免疫療法増強剤またはがん免疫療法治療用キットを提供する。
　ＩＬ－６阻害剤は、ＩＬ－６の作用を阻害するものであればよい。ＩＬ－６阻害剤の例としては、抗ヒトＩＬ－６抗体、抗ヒトＩＬ－６Ｒ抗体（例えば、tocilizumab）が挙げられる。
　ＩＬ－６阻害剤をがん患者に投与することにより、好ましくは、がん免疫療法の効果が増強される。がん患者は、血漿のＩＬ－６蛋白質量が多い（例えば、1.0pg/ml以上）患者であってもよい。がん免疫療法の治療前に血漿のＩＬ－６蛋白質量を測定し、血漿のＩＬ－６蛋白質量が多い（例えば、1.0pg/ml以上）患者であることが判定されれば、がん免疫療法剤とあわせてＩＬ－６阻害剤を投与してもよい。
　一つの実施態様において、がん免疫療法はペプチドワクチン療法である。がんは、例えば、大腸がん（結腸直腸がん）である。
　また、本発明が提供するがん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキットに、癌ペプチドワクチンおよびＩＬ－６阻害剤を含めて、がん免疫療法治療用キットとして提供することができる。
　がん免疫療法増強剤は、ＩＬ－６阻害剤と、医薬として許容できる担体と共に製剤化され得る。医薬として許容できる担体としては、例えば、賦形剤（例えば、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル等）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＩＬ－６阻害剤のがん患者への投与量は疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により変化するが、０．０００１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ～１００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ～１０ｍｇ、より一層好ましくは０．１～５ｍｇまたは０．５～３ｍｇである。投与方法は適宜選択することができ、例えば、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与または皮下投与により投与することができる。
がん免疫療法の治療効果を予測するための遺伝子マーカー
　本発明は、第六の側面において、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を含む、がん免疫療法の治療効果を予測するための遺伝子マーカーを提供する。
　ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型は、がん免疫療法の治療効果の予測マーカーとして有用である。
　ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型が、Ｃ／ＣまたはＡ／Ｃであるとき、当該遺伝子型を有する被験者は、がん免疫療法が有効な被験者である可能性が高い。ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型が、Ａ／Ａであるとき、当該遺伝子型を有する被験者は、がん免疫療法が有効でない被験者である可能性が高い。
　本発明が提供する遺伝子マーカーは、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型のみからなっていてもよく、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型を含む配列またはその相補的な配列からなっていてもよく、例えば、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型を含む、５、８、１０、１５または２０塩基の配列からなる遺伝子マーカーであってもよい。
　以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
進行した結腸直腸がん（advanced colorectal cancer）患者においてペプチドワクチン治療の臨床的実用性を明らかにし、治療前に治療効果を予測するために有用なバイオマーカーを特定するために、以下のphase II試験を実施した。
　材料および方法
患者
　標準的な化学療法および／または分子標的療法の少なくとも１つのレジメンが成功しなかった前治療歴のある進行した結腸直腸がん（以下ａＣＲＣと称す）患者のうち、３１種の候補ワクチンペプチド(表１)の中で少なくとも２つに対して液性応答反応を有する（ペプチド特異的なIgG力価の測定により判定）ならば、本試験における対象として適格である。その他の試験対象者選定基準は、次のとおりであった：２０歳以上；Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG)の一般状態が０または１；ＨＬＡ-Ａ２、－Ａ３、－Ａ１１、－Ａ２４、－Ａ２６、－Ａ３１、または－Ａ３３が陽性；少なくとも１２週間の平均余命；十分な血液学的機能、腎臓機能、および肝機能(白血球細胞＞２,５００/μｌ、リンパ球＞１,０００/μｌ、血小板＞８０,０００/μｌ、血清クレアチニン＜１.５ ｍｇ/ｄｌ、および全ビリルビン＜２.５ ｍｇ/ｄｌ)。排除基準としては、肺疾患、心臓疾患、またはその他の全身性疾患；急性感染；重度のアレルギー反応の既往；妊娠中または授乳中；または臨床医により登録が不適切と判断されるような病状、などが含まれる。プロトコールは、久留米大学の倫理委員会にて承認されており、ＵＭＩＮに臨床試験登録(UMIN000006493)された。全てのプロトコールの説明後に、全ての患者から書面によるインフォームド・コンセントを登録前に得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
臨床プロトコール
　これはオープンラベル第ＩＩ相臨床試験であり、エンドポイントは、個人至適化ペプチドワクチン（以下、ＰＰＶと称す）の臨床的実用性および安全性を分析すること、ならびにａＣＲＣ患者におけるＰＰＶ後の生存期間（以下ＯＳと称す）予測に有用なバイオマーカーを同定することである。以前に実施された臨床試験において安全性および免疫学的効果が確認されている３１種のワクチンペプチドを、ポリペプチド・ラボラトリー(Polypeptide Laboratories)(San Diego, CA)およびアメリカン・ペプチド社(American Peptide Company)(Vista, CA)(表１)により、グッド・マニュファクチュアリング・プラクティス(Good Manufacturing Practice)(ＧＭＰ)の条件下で調製した。既に報告されたとおり、個々の患者において各ペプチドに特異的なＩｇＧの力価を測定し、ワクチン接種前に既存の宿主免疫を評価することにより、３１種のペプチドから２―４種のペプチドを選択した。ＰＳＡおよびＰＳＭＡを含む前立腺関連抗原の発現はaＣＲＣ組織切片において検出できなかったため(表１)、それらから得られた該ペプチドは、他のペプチドに対して既存のＩｇＧ応答がなかった場合にのみ選択した。
　該選択されたペプチド(３ ｍｇ/各ペプチド)を、６週間連続して１週間に１回、不完全フロイントアジュバンド(Montanide ISA51；Seppic, Paris, France)と共に皮下投与した。第一サイクルとして６回のワクチン接種が終了した後には、ペプチド特異的なＩｇＧの力価に従って４つまでの抗原ペプチドを再度選択し、２～４週毎に投与した。可能であれば、化学療法および／または分子標的療法をワクチン接種期間中に併用した。有害事象を、米国国立がん研究所の有害事象(ＮＣＩ-ＣＴＣＡＥ)共通用語規準第４.０版に従って追跡した。全血球計算値および血清生化学試験を、６回のワクチン接種の前後に行った。
液性免疫応答の測定
　ワクチンペプチドに特異的な液性免疫応答を検討するために、既に報告されたように、Luminex 200 system(Luminex, Austin, TX)を用いたビーズベースの多重アッセイを用いて、ペプチド特異的ＩｇＧ力価を測定した。ワクチン接種後の血漿中のペプチド特異的ＩｇＧ力価が、ワクチン接種前の血漿中のものより２倍以上高かった場合には、その変化は有意であると見なした。有意な増加が、少なくとも１つのワクチンペプチドにおいて観察された場合には、抗原特異的液性免疫応答は増大したと見なした。
免疫組織化学(ＩＨＣ)
　１５種のワクチン抗原の発現を、ワクチン接種していないａＣＲＣ患者由来の２０の腫瘍組織(１５の原発性腫瘍および５つの転移性肝臓腫瘍)を用いてＩＨＣにより検討した。パラフィン埋包組織サンプルから４ μｍ切片を作成して、被覆したスライドガラス上で解析した。ワクチン抗原に特異的な抗体を用いる免疫染色を、全自動 Bond-Max system (Leica Microsystems, Newcastle, UK)で実施した。免疫染色における色原体としてＤＡＢを使用した。ワクチン抗原を検出するために使用した抗体は、既に記載されている。前立腺関連ワクチン抗原、即ちＰＳＡおよびＰＳＭＡは、ＩＨＣにより検出できなかったため示さなかった。
検査マーカーの測定
　ワクチン接種前の血漿中のＣ反応性タンパク質(ＣＲＰ)、血清アミロイドＡ(ＳＡＡ)、およびＩＬ－６のレベルを、R&D systems (Minneapolis, MN), Invitrogen (Carlsbad, CA)およびeBioscience (San Diego, CA)由来のキットを用いて、ＥＬＩＳＡにより測定した。Luminex 200 system (Luminex, Austin, TX) によるビーズベースの多重アッセイを用いて、サイトカイン、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－２１、ＩＰ－１０(interferon gamma-induced protein 10)、ＢＡＦＦ(B-cell activating factor)、およびＴＧＦ-βを測定した。一人の患者からのワクチン接種前の血漿が、この分析には利用できなかった(ｎ＝５９)。凍結した血漿サンプルを溶解し、希釈して、製造者の指示書に従って２連でアッセイを行った。２連のサンプルの平均を統計学的分析に使用した。
ＩＬ－６、およびＩＬ－６受容体(ＩＬ-６Ｒ)遺伝子多型
　末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、ワクチン接種前に末梢血からFicoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)密度遠心法により分離した。ＤＮＡを、QIAamp Blood kit(Qiagen, Hilden, Germany)を用いてＰＢＭＣから抽出して、分析まで－８０℃で貯蔵した。抽出したＤＮＡを用いて、ＩＬ－６ －６３４Ｇ＞Ｃ(rs1800796)、ＩＬ－６Ｒ ４８８９２Ａ＞Ｃ(rs8192284, Asp358Ala)遺伝子多型を調べた。遺伝子型判定は、Motoyama S, et al., Dig Surg. 2012;29: 194-201およびMotoyama S, et al., Ann Surg Oncol. 2013;20: 1978-1984に報告されたとおり、ポリメラーゼ連鎖反応-制限酵素断片長多型方法を用いて行った。使用したオリゴヌクレオチドと制限酵素は以下のとおりである。
ＩＬ－６Ｒの遺伝子多型の検出に使用したオリゴヌクレオチドと制限酵素
CCT TTG AGG CTT TTG ACA G（配列番号３６）
ACC CAT CTC ACC TCA GAA CAA（配列番号３７）
制限酵素　Hind III
ＩＬ－６の遺伝子多型の検出に使用したオリゴヌクレオチドと制限酵素
GAG ACG CCT TGA AGT AAC TG（配列番号３８）
AAC CAA AGA TGT TCT GAA CTG A（配列番号３９）
制限酵素　Bsr BI
統計学的分析
　ＯＳ期間を、ペプチドワクチン接種または第一選択の化学療法の初日から死亡日までの期間と規定した。生存している患者では、連絡をとった最終日に打ち切りとした。ＯＳについての予後因子を、コックス比例ハザード回帰モデルを用いる単変量および多変量解析により評価した。このコックス回帰を適用する際に、各バイオマーカーの分布が非常に歪んでいたので、ｌｏｇ(バイオマーカー＋１)の変換を用いた。単変量解析における統計学的に有意なバイオマーカー(Ｐ＜０.１)を、多変量分析に含めた。スピアマンの順位相関係数を用いて、多変量分析に含める変数を選択した。全ての統計学的分析を、JMP version 10 またはSAS version 9.3 software package (SAS Institute Inc., Cary, NC)を用いて行った。
結果
aＣＲＣ組織中のワクチン抗原発現の免疫組織化学分析
　ＰＰＶに用いるワクチン抗原の発現を、１５人のワクチン接種を受けていないａＣＲＣ患者由来の２０の腫瘍組織(１５の原発性腫瘍および５つの転移性肝臓腫瘍)においてＩＨＣにより検討した。ＰＰＶに用いた１５種のワクチン抗原のなかで、２つの前立腺関連ワクチン抗原(ＰＳＡおよびＰＳＭＡ)以外の１３種のワクチン抗原が、aＣＲＣ組織において検出できた。代表的な染色パターンを、図１に示した。それらのうち、１１種は大部分の癌細胞に一様に発現したが、ｐ５６ｌｃｋおよびＰＡＰは局所的に発現していた。詳細な抗原発現の頻度を表１に示した。
患者の特徴
　２００９年１月から２０１２年１１月の期間、６０人のａＣＲＣ患者をこの試験に登録した。登録患者の臨床病理的特徴を表２に要約する。年齢の中央値は６０歳（３５～８３歳）で、男性被験者３３人および女性被験者２７人であった。全ての患者(ステージＩＶ、ｎ＝２６；再発、ｎ＝３４)は、化学療法および／または分子標的療法の少なくとも１つのレジメンに対して抵抗性であった。原発性腫瘍の位置は、右側の結腸(ｎ＝１４)または左側の結腸/直腸(ｎ＝４６)であった。全ての患者は、転移性腫瘍[肝臓(ｎ＝３３)、肺(ｎ＝３１)、腹膜播種(ｎ＝２３)、またはリンパ節(ｎ＝１４)]を有した。登録前に、化学療法、分子標的療法および／またはそれらの組合せの１つ(ｎ＝１７)、２つ(ｎ＝１５)、３つ(ｎ＝９)、４つ(ｎ＝１３)または５つ(ｎ＝６)のレジメンに抵抗性であった。ＰＰＶ治療開始前の治療期間の中央値は５５２.５日であり、９～１８１９日の範囲にわたった。第一サイクル中にワクチン接種に使用したペプチドの数は、３６人の患者にて４つのペプチド、１６人の患者にて３つのペプチド、８人の患者にて２つのペプチドであった。６０人の患者のうち、５１人(８５％)は、第一サイクルの６回のワクチン接種を完了したが、残り９人の患者は、急速な疾患進行により完了しなかった。ワクチン接種回数の中央値は１２であり、２～３３の範囲であった。ＰＰＶの期間に、４９人の患者(８２％)は、化学療法および／または分子標的療法を、例えばＦＯＬＦＯＸ/ＸＥＬＯＸとベバシズマブ(ｎ＝１０)、ＦＯＬＦＩＲＩ＋ベバシズマブ(ｎ＝５)、ＦＯＬＦＩＲＩ(ｎ＝５)、Ｓ－１(ｎ＝５)、イリノテンカン＋セツキシマブ(ｎ＝５)、セツキシマブ(ｎ＝５)、ＦＯＬＦＯＸ/ＸＥＬＯＸ(ｎ＝２)、ＦＯＬＦＩＲＩ＋セツキシマブ(ｎ＝２)、または他のレジメン(ｎ＝１０)を併用した。残り１１人の患者(１８％)は、併用化学療法について選択肢をもたないか、またはそれらを耐容できなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
有害事象
　毒性を表３に示した。最も頻度が高い有害事象は、注射部位での皮膚反応(ｎ＝５５, ９２％)、貧血(ｎ＝２７, ４５％)、リンパ球減少症(ｎ＝２３, ３８％)および低アルブミン血症(ｎ＝２０, ３３％)であった。グレード４の貧血が、２人の患者において見られた。グレード３の重篤な有害事象(ＳＡＥ)として、白血球減少症(ｎ＝３)、リンパ球減少症(ｎ＝２)、γグルタミルトランスペプチダーゼ増加(ｎ＝２)、低ナトリウム血症(ｎ＝２)、腸閉塞(ｎ＝２)、ＡＳＴ増加(ｎ＝１)、高血糖(ｎ＝１)、高コレステロール血症(ｎ＝１)、および発疹(ｎ＝１)を認めた。しかし、独立した安全性評価委員会では、これら全てのグレード３または４のＳＡＥはワクチン接種とは直接関係せず、他の病因、例えば併用した化学療法および／または分子標的療法および癌の進行と関係すると評価された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
ワクチンペプチドに対する免疫応答
　ワクチン接種前およびワクチン接種後の血漿におけるワクチンペプチドに特異的なＩｇＧ力価を測定し、液性応答反応を分析した。ワクチン接種後の血漿サンプルは、第一サイクル(６回のワクチン接種)および第二サイクル(１２回のワクチン接種)各々の終了時に５１人および３５人の患者から採取した。少なくとも１つのワクチンペプチドに特異的なＩｇＧ応答は、ワクチン接種の第一サイクル終了時には５１人の患者の内２４人(４７％)で、第二サイクル終了時には３５人の患者の内３３人(９４％)で増強された(表６－１～６)。
臨床結果
　６０人の患者での最初のワクチン接種からのＯＳ期間中央値(ＭＳＴ)は４９８日(９５％ 信頼区間, ２３３-６５４日数)で、１生存率５３％および２年生存率２２％であった(図２Ａ)。第一選択の化学療法の初日から計算した場合、ＭＳＴは１１７９日(９５％信頼区間、８８５-１２７２日数)で、１年生存率は９７％、２年生存率は７７％、３年生存率は５３％、４年生存率は２４％、５年生存率はであった(データ示さず)。注目すべきは、登録した６０人の患者の中で、２つ以上の標準的な化学療法レジメンでの治療歴を有し、かつ登録前にイリノテカン、オキサリプラチン、およびフルオロピリミジンの全てに対し抵抗性または非寛容であった３２人の患者が、５１％(図２Ｂ)の１年生存率で、最初のワクチン接種から３７５日のＭＳＴ(９５％ 信頼区間, １９１－５６１日数)を示したことである。
臨床的所見または検査値とＯＳとの相関
　コックス比例ハザードモデルを使用して、ワクチン接種前の臨床的知見または検査値から、ＯＳと有意に相関のある因子を同定した。表４に示したとおり、ワクチン接種前の臨床的所見を用いた単変量解析では、PPV治療前の化学療法レジメン数が、予後因子(Ｐ＝０.０４８)である可能性があった。さらに、単変量解析ではワクチン接種前の血中のアルブミン、ＣＥＡ、ＣＲＰ、ＳＡＡ、ＩＬ－６、ＩＰ－１０、およびＢＡＦＦがＯＳと有意に相関した(Ｐ＝０.０２１、Ｐ＝０.００２、Ｐ＜０.００１、Ｐ＜０.００１、Ｐ＜０.００１、Ｐ＝０.００５、およびＰ＝０.００５、各々)。しかし、その他の因子は、ＯＳとの有意な相関はなかった。
　多変量コックス回帰分析をさらに行い、単変量解析においてＯＳと有意に相関することが示された各因子の影響を評価した(Ｐ＜０.１)。ＳＡＡおよびＣＲＰのレベルがＩＬ－６のレベルと高い相関を示したので、ＳＡＡおよびＣＲＰをこの分析には含めなかった(ＳＡＡ ｖｓ ＩＬ－６：スピアマンの順位相関係数＝０.４８１；ＣＲＰ ｖｓ ＩＬ－６：スピアマンの順位相関係数=０.６５１)。表４に示したとおり、ワクチン接種前の血漿中のより高いＩＬ－６およびＩＰ－１０レベルならびにより低いＢＡＦＦレベルが、予後不良の予測因子として有意であった[１ＳＤのユニットに対するハザード比(ＨＲ)＝１.５０３, ９５％信頼区間(ＣＩ)=１.００８-２.２４１, Ｐ＝０.０４５；ＨＲ＝１.５７４, ９５％ＣＩ＝１.０６０－２.３３８, Ｐ＝０.０２５；ＨＲ=０.５１０, ９５％ＣＩ＝０.３３０-０.７８８, Ｐ＝０.００２；各々]。しかし、他の因子は、有意に相関しなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
ＩＬ－６およびＩＬ－６Ｒ遺伝子多型とＯＳとの関係
　ＰＰＶで治療した患者において炎症マーカーであるＩＬ－６が、予後因子である可能性があるため、我々は関連遺伝子であるＩＬ－６　-６３４Ｇ＞ＣおよびＩＬ－６Ｒ ４８８９２Ａ＞Ｃ (表５)の遺伝子多型を検討した（Motoyama S, et al., Dig Surg. 2012;29: 194-201およびMotoyama S, et al., Ann Surg Oncol. 2013;20: 1978-1984参照）。ＩＬ-６　-６３４Ｇ＞Ｃの多形型とＯＳ(各々Ｐ＝０.２５９およびＰ＝０.１１４)と間には有意な相関はなかった(Ｐ＝０.３１９)。しかし、ＩＬ－６Ｒ ４８８９２Ａ＞Ｃの多型は、ＯＳに対して有意な相関を示した。図３Ａに示したように、ＩＬ-６Ｒ ４８８９２Ａ/Ｃまたは４８８９２Ｃ／Ｃ遺伝子型を有する患者は、ＩＬ-６Ｒ ４８８９２Ａ/Ａ遺伝子型を有するものよりも良好な予後を示す傾向があった(Ｐ＝０.０５８３)。この遺伝子多型を、ワクチン接種前の血漿(図３Ｂ)中のＩＬ－６が陽性または陰性の患者においてさらに評価した。その結果、ＩＬ-６Ｒ ４８８９２Ａ/ＣまたはＣ/Ｃ遺伝子型を有する患者とＩＬ-６Ｒ ４８８９２Ａ/Ａ遺伝子型を有する患者との差異は、ＩＬ－６陽性の患者では統計学的に有意ではなかった(Ｐ＝０.１１８４)が、ＩＬ－６陰性の患者においては有意であった(Ｐ＝０.０２５２)。
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結論
　上記研究結果より、ＩＬ－６Ｒ　４８８９２Ａ＞Ｃの遺伝子多型がペプチドワクチン投与後の生存期間に対して有意な効果を示した。すなわち、ＩＬ－６Ｒ　４８８９２の遺伝子型Ａ／ＣまたはＣ／Ｃを有する患者はＩＬ－６Ｒ　４８８９２Ａ／Ａを有する患者より予後が良い傾向にあり、特にワクチン投与前の患者血漿のＩＬ－６が低濃度である患者では、その傾向が強かった。
　また、上記研究は、ＰＰＶが重篤な副作用なしにワクチン抗原に対する免疫応答を惹起したこと、前治療歴を有するａＣＲＣ患者において、たとえがんが難治性ステージであるとしても、臨床的に有益である可能性を示した。さらに、統計学的解析により、ペプチドワクチン投与前の血漿において、低いＩＬ－６と低いＩＰ－１０のレベルおよび高いＢＡＦＦのレベルがＰＰＶのレスポンスを良くする可能性があることを示唆した。ワクチン投与前にこれらの因子を評価することは、ａＣＲＣ患者においてペプチドワクチン療法の効果を期待できる患者を選択するのに有用である。
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Claims (28)

  1.  ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出することができるポリヌクレオチドを含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキット。
  2. 　ポリヌクレオチドが、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を含む、１０～２００塩基のヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子配列の部分配列またはその相補鎖配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物またはキット。
  3. 　ポリヌクレオチドが、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を含む１０～２００塩基の塩基配列またはその相補鎖配列からなるヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子断片と特異的にハイブリダイズするプローブ、および／または該遺伝子断片を増幅できるプライマーである、請求項１または請求項２に記載の組成物またはキット。
  4. 　ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型Ｃ／Ｃ、Ａ／Ｃおよび／またはＡ／Ａを検出する、請求項１－３のいずれかに記載の組成物またはキット。
  5. 　ヒト血液中のＩＬ－６、ＩＰ－１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定するための抗体を含む、がん免疫療法の治療効果の予測用組成物またはキット。
  6. 　ヒト血液中のＩＬ－６、ＩＰ－１０（interferon gamma-induced protein 10）および／またはＢＡＦＦ（B-cell activating factor）の蛋白質量を測定するための抗体をさらに含む、請求項１－４のいずれかに記載のキット。
  7. 　請求項１－６のいずれかに記載の組成物またはキットを含み、さらに、がん免疫療法用組成物を含む、がん治療用キット。
  8. 　がん免疫療法が、ペプチドワクチン免疫療法である、請求項１－７のいずれかに記載の組成物またはキット。
  9. 　ペプチドワクチン免疫療法で投与したペプチドに対する抗体価を測定するための試薬をさらに含む、請求項８に記載の組成物またはキット。
  10. 　がんが大腸がんである、請求項１－９のいずれかに記載の組成物またはキット。
  11. 　被験者由来の試料から、ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子多型（Reference SNP ID：rs8192284）を検出する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法。
  12. 　ヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型Ｃ／Ｃ、Ａ／Ｃおよび／またはＡ／Ａを検出する、請求項１１に記載の方法。
  13. 　被験者由来の試料が、がん免疫療法治療前の被験者由来の試料である、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
  14. 　検出されたヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＣ／Ｃまたは
    Ａ／Ｃであるとき、被験者が、がん免疫療法が有効な被験者であると予測する、請求項１１－１３のいずれかに記載の方法。
  15. 　検出されたヒトＩＬ－６Ｒ遺伝子の４８８９２番目の遺伝子型がＡ／Ａであるとき、被験者が、がん免疫療法が有効でない被験者であると予測する、請求項１１－１３のいずれかに記載の方法。
  16. 　がん免疫療法治療前の被験者の血中のＩＬ－６、ＩＰ－１０および／またはＢＡＦＦの蛋白質量を測定する工程を含む、がん免疫療法の治療効果の予測方法。
  17. 　がん免疫療法治療前の被験者の血中のＩＬ－６、ＩＰ－１０および／またはＢＡＦＦの蛋白質量を測定することをさらに含む、請求項１１－１５のいずれかに記載の方法。
  18. 　がん免疫療法治療前の被験者の血中において、
    （ｉ）ＩＬ－６蛋白質量が高い；
    （ｉｉ）ＩＰ－１０蛋白質量が高い；および／または
    （ｉｉｉ）ＢＡＦＦ蛋白質量が低いとき、被験者が、がん免疫療法が有効でない被験者であると予測する、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
  19. 　がん免疫療法治療前の被験者の血中において、
    （ｉ）ＩＬ－６蛋白質量が低い；
    （ｉｉ）ＩＰ－１０蛋白質量が低い；および／または
    （ｉｉｉ）ＢＡＦＦ蛋白質量が高いとき、被験者が、がん免疫療法が有効である被験者であると予測する、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
  20. 　がん免疫療法が、ペプチドワクチン免疫療法である、請求項１１－１９のいずれかに記載の方法。
  21. 　がんが、大腸がんである、請求項１１－２０のいずれかに記載の方法。
  22. 　がんペプチドワクチン投与前および投与後の被験者由来の血中の該ペプチド特異的ＩｇＧの量を測定することをさらに含む、請求項１１－２１のいずれかに記載の方法。
  23. 　がんペプチドワクチン投与後の被験者由来の血中の該ペプチド特異的ＩｇＧの量が、投与前に比較し増加したとき、被験者が、がん免疫療法が有効な被験者であると予測する、請求項２２に記載の方法。
  24. 　がん免疫療法治療前の被験者の血中においてＩＬ－６蛋白質量が高い患者に投与される、ＩＬ－６阻害剤を含む、がん免疫療法増強剤。
  25. 　ＩＬ－６阻害剤が、ヒト化抗ＩＬ－６Ｒモノクローナル抗体である、請求項２４に記載のがん免疫療法増強剤。
  26. 　がん免疫療法が、ペプチドワクチン免疫療法である、請求項２４または請求項２５に記載の免疫療法増強剤。
  27. 　請求項１－１０のいずれかに記載の組成物またはキット、および請求項２４－２６のいずれかに記載の免疫療法増強剤を含む、がん治療用キット。
  28. 　がんが大腸がんである、請求項２４－２６のいずれかに記載の免疫療法増強剤または請求項２７に記載のキット。
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