JP6762539B2 - Ｏｃｌｎ−ａｒｈｇａｐ２６遺伝子の検出方法 - Google Patents

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Description

本発明は、新規の融合遺伝子の検出方法に関する。
オクルディン（Ｏｃｃｌｕｄｉｎ；ＯＣＬＮ）遺伝子は、ヒト５番染色体長腕に存在し、コードする蛋白質は４回膜貫通型の蛋白質である。ＯＣＬＮは、同様に４回膜貫通型のクローディンファミリー蛋白質と複合体を形成しタイトジャンクションを構成する（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９８；１４３（２）：３９１−４０１．）こと、細胞でのＯＣＬＮの強制発現により細胞間の電気抵抗が亢進する（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １９９６ ；１０９：２２８７−２２９８）ことから、タイトジャンクションのバリア機能の一翼を担うと考えられる。がんとの関連としては、細胞でのＯＣＬＮの強制発現による、アポトーシスシグナル亢進、転移能抑制が報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００６；６６（１８）：９１２５−９１３３．）。
ジーティーピーアーゼ活性化因子であるロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン２６（Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２６；ＡＲＨＧＡＰ２６）遺伝子は、ＯＣＬＮと同じ５番染色体長腕に存在し、コードする蛋白質は、中心部にＲｈｏ−ＧＡＰドメインを有するＧＴＰａｓｅ活性化蛋白質である。機能としては、ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅ蛋白ファミリー、特にはＲｈｏＡとＣＤＣ４２のＧＴＰ加水分解活性を亢進させることが知られている（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０００；２７５（４９）：３８６０５−３８６１０．）。がんとの関連としては、クローディン１８（ｃｌａｕｄｉｎ １８；ＣＬＤＮ１８）遺伝子との融合遺伝子が未分化型胃癌患者の３〜１５％で確認されており（Ｎａｔｕｒｅ ２０１４；５１３（７５１７）：２０２−２０９、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２０１５；１２（２）：２７２−２８５）、また、白血病患者でミックストリニエージロイケミア（ｍｉｘｅｄ−ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＭＬＬ）遺伝子との融合遺伝子が確認されている（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０００；９７（１６）：９１６８−９１７３．、Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；４１（４）：４００−４０４．）。
これまでにＯＣＬＮとＡＲＨＧＡＰ２６が融合している融合遺伝子については、いかなる報告もなされていない。
がんの新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれにコードされるポリペプチドの検出方法、及びそのためのプライマーセット又は検出用キットを提供することを課題とする。
本発明者は胃癌細胞株からＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子の一部とＯＣＬＮ遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し（実施例１）、当該融合遺伝子を内在的に発現する胃癌細胞株に対して、当該融合遺伝子の発現を抑制することにより、当該胃癌細胞株の生存率が低下したことから、当該融合遺伝子ががんの原因遺伝子であることを見出した（実施例２、実施例４）。本発明者は、これらの知見から、当該融合遺伝子の検出方法を構築し、そのためのプライマーセットを提供し、当該融合遺伝子を検出（実施例３）することにより、ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子陽性のがん患者（特には胃癌患者）を選別することを可能とした。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２４］に関する。
［１］被験者から得た試料中の、下記（１）又は（２）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、オクルディン（ＯＣＬＮ）遺伝子とロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン２６（ＡＲＨＧＡＰ２６）遺伝子との融合遺伝子の検出方法：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
［２］前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチドである、［１］に記載の方法。
［３］前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチド、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチドである、［１］に記載の方法。
［４］前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］に記載の方法。
［５］被験者から得た試料中の、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子の検出方法。
［６］検出対象ポリヌクレオチドが検出された場合に、ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに包含する、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］検出対象ポリヌクレオチドを検出するために、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程、又は、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程をさらに包含する、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］以下のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、［７］に記載の方法：
ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、ＯＣＬＮをコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、検出対象ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
［９］センスプライマーが、配列番号１の塩基番号１から８９１からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号１の塩基番号８９２から２０６４からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、［８］に記載の方法。
［１０］以下のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、［７］〜［９］に記載の方法：
ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、センスプライマーが、配列番号１の塩基番号１から８９１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号１の塩基番号８９２から２０６４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
［１１］目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られたか否かを検出する工程をさらに包含する、［７］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られた場合にＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに包含する、［１１］に記載の方法。
［１３］増幅された核酸断片の塩基配列を決定する工程をさらに包含する、［７］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１４］増幅された核酸断片がＯＣＬＮをコードする部分の塩基配列とＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合にＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに包含する、［１３］に記載の方法。
［１５］前記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むプローブを、被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、［７］に記載の方法。
［１６］被験者から得た試料、前記ポリヌクレオチドのＯＣＬＮをコードする部分から設計されるプローブ、及び前記ポリヌクレオチドのＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるプローブを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程を包含する、［１５］に記載の方法。
［１７］ＯＣＬＮをコードする部分から設計される複数種のプローブ、及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計される複数種のプローブを用いる、［１６］に記載の方法。
［１８］被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程において、配列番号１の塩基番号１〜８９１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号１の塩基番号８９２〜２０６４の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種用いる、［７］、［１６］又は［１７］に記載の方法。
［１９］ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる工程をさらに包含する、［１６］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］ＯＣＬＮをコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとのシグナルの重なりを検出する工程をさらに包含する、［１６］〜［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］２つのシグナルが同じ場所にあることが検出された場合にＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに包含する、［２０］に記載の方法。
［２２］被験者から試料を得る工程を包含する、［１］〜［２１］のいずれかに記載の方法。
［２３］被験者ががん患者である、［１］〜［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］がんが胃癌である、［２３］に記載の方法。
また、本発明は、以下の［２５］〜［２７］に関する。
［２５］被験者におけるがんの存在を検出する方法であって、［１］〜［２１］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［２６］被験者から試料を得る工程を包含する、［２５］に記載の方法。
［２７］がんが胃癌である、［２５］又は［２６］に記載の方法。
また、本発明は、以下の［２８］〜［３２］に関する。
［２８］被験者におけるがんを診断する方法であって、［１］〜［２１］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［２９］被験者から試料を得る工程を包含する、［２８］に記載の方法。
［３０］ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子が被験者から得た試料から検出された場合に該被験者ががんに罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［２８］又は［２９］に記載の方法。
［３１］がんが胃癌である、［２８］又は［２９］に記載の方法。
［３２］ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子が被験者から得た試料から検出された場合に該被験者が胃癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［２９］に記載の方法。
また、本発明は、以下の［３３］〜［３６］に関する。
［３３］ＡＲＨＧＡＰ２６機能阻害剤、及び／又はＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者はがん患者であり、［１］〜［２１］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［３４］被験者から試料を得る工程を包含する、［３３］に記載の方法。
［３５］ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子が被験者から得た試料から検出された場合に該被験者がＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、［３３］又は［３４］に記載の方法。
［３６］がんが胃癌である、［３３］〜［３５］のいずれかに記載の方法。
また、本発明は、以下の［３７］〜［４２］に関する。
［３７］被験者から得た試料中のＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、ＯＣＬＮをコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、［１］〜［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
［３８］センスプライマーが、配列番号１の塩基番号１から８９１からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号１の塩基番号８９２から２０６４からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、［３７］に記載のプライマーセット。
［３９］被験者から得た試料中のＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、［１］〜［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドのＯＣＬＮをコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
［４０］センスプライマーが、配列番号１の塩基番号１から８９１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号１の塩基番号８９２から２０６４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる、［３７］〜［３９］のいずれかに記載のプライマーセット。
［４１］被験者ががん患者である、［３７］〜［４０］のいずれかに記載のプライマーセット。
［４２］がんが胃癌である、［４１］に記載のプライマーセット。
また、本発明は、以下の［４３］〜［４８］に関する。
［４３］被験者から得た試料中のＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプローブであって、［１］〜［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、プローブ。
［４４］［４３］に記載のプローブを複数含むプローブセットであって、［１］〜［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドのＯＣＬＮをコードする部分から設計されるプローブ及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるプローブを含む、プローブセット。
［４５］ＯＣＬＮをコードする部分から設計される複数種のプローブ、及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計される複数種のプローブを含む、［４４］に記載のプローブセット。
［４６］配列番号１の塩基番号１〜８９１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号１の塩基番号８９２〜２０６４の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種含む、［４４］又は［４５］のプローブセット。
［４７］被験者ががん患者である、［４３］〜［４６］のいずれかに記載のプローブ又はプローブセット。
［４８］がんが胃癌である、［４７］に記載のプローブ又はプローブセット。
また、本発明は、以下の［４９］〜［５３］に関する。
［４９］被験者から得た試料中のＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するための検出用キットであって、［３７］〜［４０］のいずれかに記載のプライマーセットを含む、融合遺伝子の検出用キット。
［５０］被験者から得た試料中のＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するための検出用キットであって、［４３］〜［４６］のいずれかに記載のプローブ又はプローブセットを含む、検出用キット。
［５１］ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する試薬をさらに含む、［５０］に記載の検出用キット。
［５２］被験者ががん患者である、［４９］〜［５１］のいずれかに記載の検出用キット。
［５３］がんが胃癌である、［５２］に記載の検出用キット。
また、本発明は、以下の［５４］〜［６３］に関する。
［５４］被験者から得た試料中の、下記（１）又は（２）のいずれかに記載のポリペプチドの存在を検出する工程を含む、ＯＣＬＮとＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質の検出方法：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
［５５］前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチドである、［５４］に記載の方法。
［５６］前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチド、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチドである、［５４］に記載の方法。
［５７］前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［５４］に記載の方法。
［５８］被験者から得た試料中の、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの存在を検出する工程を含む、ＯＣＬＮとＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質の検出方法。
［５９］前記ポリペプチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料に該ポリペプチドのＯＣＬＮ遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び該ポリペプチドのＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を接触させる工程を含むことを特徴とする、［５４］〜［５８］のいずれかに記載の方法。
［６０］下記ｉ）〜ｖ）に記載の工程をさらに包含する、［５９］に記載の方法：
ｉ）一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体を添加する工程、ｉｉ）該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲースを含有するライゲーション溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、ｉｉｉ）形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、ｉｖ）伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、及び、ｖ）該標識シグナルを検出する工程。
［６１］被験者から試料を得る工程を包含する、［５４］〜［６０］のいずれかに記載の方法。
［６２］被験者ががん患者である、［５４］〜［６１］のいずれかに記載の方法。
［６３］がんが胃癌である、［６２］に記載の方法。
また、本発明は、以下の［６４］〜［６６］に関する。
［６４］被験者におけるがんの存在を検出する方法であって、［５４］〜［６０］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［６５］被験者から試料を得る工程を包含する、［６４］に記載の方法。
［６６］がんが胃癌である、［６４］又は［６５］に記載の方法。
また、本発明は、以下の［６７］〜［７１］に関する。
［６７］被験者におけるがんを診断する方法であって、［５４］〜［６０］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［６８］被験者から試料を得る工程を包含する、［６７］に記載の方法。
［６９］ＯＣＬＮとＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質が被験者から得た試料から検出された場合に該被験者ががんに罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［６７］又は［６８］に記載の方法。
［７０］がんが胃癌である、［６７］又は［６８］に記載の方法。
［７１］ＯＣＬＮとＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質が被験者から得た試料から検出された場合に該被験者が胃癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［６８］に記載の方法。
また、本発明は、以下の［７２］〜［７５］に関する。
［７２］ＡＲＨＧＡＰ２６機能阻害剤、及び／又はＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者はがん患者であり、［５４］〜［６０］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［７３］被験者から試料を得る工程を包含する、［７２］に記載の方法。
［７４］ＯＣＬＮとＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質が被験者から得た試料から検出された場合に該被験者がＡＲＨＧＡＰ２６阻害剤、及び／又はＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、［７２］又は［７３］に記載の方法。
［７５］がんが胃癌である、［７２］〜［７４］のいずれかに記載の方法。
また、本発明は、以下の［７６］〜［７９］に関する。
［７６］被験者から得た試料中のＯＣＬＮとＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質を検出するための検出用キットであって、［５４］〜［５８］のいずれかに記載のポリペプチドのＯＣＬＮ遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び該ポリペプチドのＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を含む、融合蛋白質の検出用キット。
［７７］一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体、該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド、それらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲース、及び標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、［７６］に記載の検出用キット。
［７８］被験者ががん患者である、［７６］又は［７７］に記載の検出用キット。
［７９］がんが胃癌である、［７８］に記載の検出用キット。
また、本発明は、以下の［８０］及び［８１］に関する。
［８０］下記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；並びに、
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［８１］腫瘍進展能を有する［８０］に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本発明の検出方法は、ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子（以下、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子と称する）陽性のがん（特には胃癌）を検出する方法として利用できる。本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット及び検出用キットは、本発明の検出方法に用いることができる。
ウェスタンブロットの結果を示す。ＡＲＨＧＡＰ２６ ｓｉＲＮＡ処理によるＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質の蛋白質発現量の変化を示す。
ＡＲＨＧＡＰ２６ ｓｉＲＮＡ処理による胃癌細胞株の生細胞数の変化を示す。ｓｉＲＮＡの導入後、０．５％ウシ血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した際のコントロールとの生細胞数の比較を示す。
ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子の融合点を含む領域をＰＣＲ法により増幅した結果を示す。
ＯＣＬＮ ｓｉＲＮＡ処理、ＡＲＨＧＡＰ２６ ｓｉＲＮＡ処理による胃癌細胞株の生細胞数の経時変化を示す。
《本発明の検出方法》
本発明の検出方法には、融合遺伝子の検出方法と、融合遺伝子にコードされる融合蛋白質の検出方法とが含まれる。本発明の融合遺伝子の検出方法又は本発明の融合蛋白質の検出方法は、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドの存在を検出する工程を含む。
被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された細胞、組織、体液（血液、口腔粘液、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ）、エキソソーム等）、生検された試料（原発巣由来試料、腹腔洗浄液中癌細胞、腹水中癌細胞等）等を用いるが、好ましくは、生検された試料を用いる。採取した試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いることができ、又はその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えば、ＲＮＡ、蛋白質）やＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用いることができる。特には、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。また、試料をホルマリン固定してパラフィンに包埋して安定化した標本（Ｆｏｒｍａｌｉｎ‐Ｆｉｘｅｄ Ｐａｒａｆｆｉｎ‐Ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｓａｍｐｌｅ；ＦＦＰＥ標本）を用いることができる。ＦＦＰＥ標本を薄くスライスしたＦＦＰＥ切片を用いてもよい。ＦＦＰＥ切片を用いれば、そこに存在するポリヌクレオチドを直接検出することもできる。
本発明の融合遺伝子の検出方法は、「ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子」を検出する方法であり、当該融合遺伝子は、ＯＣＬＮ遺伝子の一部とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子の一部とを含む融合遺伝子である。例示的なＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＯＣＬＮ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１２０５２５４．１）の塩基番号２０７（コーディングシーケンス（以下、ＣＤＳ）の５’末端に対応）から１０９７と、ＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１１３５６０８．１）の塩基番号１１４３から２３１５（ＣＤＳの３’末端に対応）までの塩基配列のうち、塩基番号１２８０のチミンがグアニンに、塩基番号２２２５のシトシンがチミンに置換された配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号１に示される塩基配列の内、塩基番号１〜８９１の配列はＯＣＬＮ遺伝子に由来し、塩基番号８９２〜２０６４の配列はＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子に由来する。配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを「融合ポリヌクレオチド」とも称する。配列番号１の塩基番号１〜２０６４にコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
本発明の融合遺伝子の検出方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」において、その検出対象となるポリヌクレオチド（本明細書中において「検出対象ポリヌクレオチド」と称する）としては、例えば、以下の（１）又は（２）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチド。
前記ポリペプチドにおいて、「配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性」は、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９８％以上である。
なお、本明細書における「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９７０；４８：４４３−４５３）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２
あるポリペプチドが「腫瘍進展能を有する」ことは、後記実施例２に記載の方法で確認することができる。具体的な方法としては、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を抑制するｓｉＲＮＡを当該ポリペプチドを発現する細胞（胃癌細胞株ＯＫＡＪＩＭＡ）に導入することによって、当該細胞の生存能が低下することを確認する方法が挙げられる。
１つの実施形態において、検出対象ポリヌクレオチドは、下記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチド；
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチド；並びに
（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
前記（１）及び（２）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列に欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸の個数は、好ましくは１〜数個、より好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個である。
「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、「配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が挙げられる。
本発明の融合遺伝子の検出方法は、検出対象ポリヌクレオチドが検出されたか否かによって、前記ポリヌクレオチドが存在するか否かを判定する工程を包含し得る。
本発明の融合遺伝子の検出方法は、検出対象ポリヌクレオチドが検出された場合に、ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに包含し得る。
本発明の融合遺伝子の検出方法は、検出対象ポリヌクレオチドを検出するために、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程、又は、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程を包含し得る。
使用する核酸は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＲＮＡから調製したｃＤＮＡであってもよい。ゲノムＤＮＡの抽出、ＲＮＡの抽出、ＲＮＡからｃＤＮＡの調製の方法は当該分野で公知であり、市販のＤＮＡ抽出キット、ＲＮＡ抽出キット、ｃＤＮＡ合成キットを用いて簡便に行うことができる。
被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程は、公知の核酸増幅方法を用いて実施することができる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、例えば、リアルタイムＰＣＲ）、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、例えば、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ’ｓ ＴＭＡ ｓｙｓｔｅｍ）等が挙げられ、好ましい方法としては、ＰＣＲが挙げられる。
具体的には、被験者から得た試料中の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＲＮＡから調製したｃＤＮＡ等）を、検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計されるプライマーセットを用いて核酸増幅反応に供して増幅させる。使用されるプライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、例えば、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等を利用して、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて当業者に容易に設計され得る。より具体的には、プライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチドのＯＣＬＮをコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）のＯＣＬＮ遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるセンスプライマー（５’−プライマー）と、検出対象ポリヌクレオチドのＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）のＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるアンチセンスプライマー（３’−プライマー）を含み、該アンチセンスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる。あるいは、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方を、検出対象ポリヌクレオチドにおける融合点を含む領域に対応するように設計してもよい。
本明細書中において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、４２℃で一晩」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「高度にストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、４２℃で一晩」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
本明細書において、検出対象ポリヌクレオチドにおける「融合点」とは、検出対象ポリヌクレオチドにおけるＯＣＬＮ遺伝子由来の部分とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来の部分とが融合した点を意味し、検出対象ポリヌクレオチドにおける「融合点を含む領域」とは、例えば、検出対象ポリヌクレオチドが配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである場合、塩基番号８９１及び８９２の塩基を含む領域を意味する。
１つの実施形態において、前記センスプライマーは、配列番号１の塩基番号１から８９１からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、前記アンチセンスプライマーは、配列番号１の塩基番号８９２から２０６４からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる。
１つの実施形態において、前記センスプライマーは、配列番号１の塩基番号１から８９１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、前記アンチセンスプライマーは、配列番号１の塩基番号８９２から２０６４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる。
核酸を増幅させる工程において、増幅させる核酸断片のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、増幅させる核酸断片の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが好ましい。また、使用される各プライマーは、通常、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１６塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、さらに好ましくは少なくとも２０塩基の鎖長を有する。１つの実施形態において、当該プライマーは、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、より好ましくは１８〜２４塩基、さらに好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子の検出方法は、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程に加え、目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られたか否かを検出する工程をさらに包含する。目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られたか否かを検出する工程は、例えば、電気泳動法を用いて実施することができる。電気泳動法では、例えば、核酸断片をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られたか否かを確認できる。
また、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １９９６；６（１０）：９８６−９９４）を実施することにより、増幅された核酸断片について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることができる。
目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。本発明の融合遺伝子の検出方法は、目的とするサイズの増幅された核酸断片が得られた場合にＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに含んでもよい。
別の好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子の検出方法は、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程に加え、増幅された核酸断片の塩基配列を決定する工程をさらに包含する。核酸断片の塩基配列を決定する工程は、例えば、サンガーシーケンス法（例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることができる）、一塩基合成反応法（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法）を含む次世代シーケンス法（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００８；２６：１１３５−１１４５）（例えば、ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いることができる）等の当該分野で公知の配列決定法を用いることができる。
核酸断片の塩基配列を決定する工程には、核酸断片の全長の配列を決定する工程だけでなく、核酸断片の両端の部分配列を決定する工程も含まれる。
配列決定した核酸断片が検出対象ポリヌクレオチドのＯＣＬＮをコードする部分の塩基配列とＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。本発明の融合遺伝子の検出方法は、増幅された核酸断片が検出対象ポリヌクレオチドのＯＣＬＮをコードする部分の塩基配列とＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合にＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに含んでもよい。
被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程は、検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むプローブを用いて、公知のハイブリダイゼーション方法を用いて実施することができる。このような方法としては、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法、インサイチュハイブリダイゼーション等が挙げられ、好ましい方法としては、インサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、公知の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）法、又は、シルバーインサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法で実施することができる。ハイブリダイゼーションに用いるプローブの鎖長は、使用するハイブリダイゼーション方法に応じて当業者に適宜選択され得るが、プローブは、好ましくは少なくとも１６塩基の鎖長を有する。
１つの実施形態において、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、検出対象ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、検出対象ポリヌクレオチドにおける融合点を中心にその上流及び下流のそれぞれ少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチド（具体的な例として、配列番号１の塩基番号８７６〜９０７の配列）又はそれに相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
１つの実施形態において、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程は、公知のＲＮＡ ＦＩＳＨ法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ． ２０１２；１４（１）：２２−２９）に従って実施することができる。より具体的には、被験者から得た試料（例えば、ＦＦＰＥ切片）、検出対象ポリヌクレオチドのＯＣＬＮをコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチドのＯＣＬＮ遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブ、及び検出対象ポリヌクレオチドのＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチドのＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う。各プローブは、検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
１つの実施形態において、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、ＯＣＬＮをコードする部分から設計される複数種の検出プローブ、及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計される複数種の検出プローブを用いる。
１つの実施形態において、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、以下のプローブを用いる：
配列番号１の塩基番号１〜８９１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）、及び配列番号１の塩基番号８９２〜２０６４の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）。
本明細書において「隣接したプローブペア」とは、検出対象ポリヌクレオチドに隣り合ってハイブリダイズする２種のプローブからなる。各プローブは、検出対象ポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドの長さは、通常、少なくとも１６塩基、好ましくは少なくとも１８塩基である。１つの実施形態において、該オリゴヌクレオチドの長さは、１６〜３０塩基、好ましくは１８〜２５塩基である。
好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子の検出方法は、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程に加え、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる工程をさらに包含する。ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる工程は、例えば、試料中の核酸にハイブリダイズしたプローブに、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる試薬をハイブリダイズさせることにより行うことができる。
インサイチュハイブリダイゼーションにおいて使用されるハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる試薬としては、ＰｒｅＡｍｐｌｉｆｉｅｒ Ｍｉｘ ＱＴ、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ Ｍｉｘ ＱＴ、Ｌａｂｅｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘ、及びＬａｂｅｌ Ｐｒｏｂｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ ＱＦがあり、これらはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社より入手できる。
より好ましい実施形態において、本発明の融合遺伝子の検出方法は、ＯＣＬＮをコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとのシグナルの重なりを検出する工程をさらに包含する。ＯＣＬＮをコードする部分から設計されるプローブとＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるプローブを検出する蛍光試薬又は発色試薬を別にすることにより、当該異なる２つのプローブからのシグナルが同じ場所（同一分子内）にあるか否かを観察することができる。当該２つのシグナルが同じ場所（同一分子内）にあることが検出された場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。本発明の融合遺伝子の検出方法は、２つのシグナルが同じ場所（同一分子内）にあることが検出された場合にＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子が存在すると判定する工程をさらに含んでもよい。
各プローブは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
本発明の融合蛋白質の検出方法は、「ＯＣＬＮとＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質」を検出する方法であり、当該融合蛋白質は、ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子にコードされる融合蛋白質である。
本発明の融合蛋白質の検出方法における「ポリペプチドの存在を検出する工程」において、その検出対象となるポリペプチド（本明細書中において「検出対象ポリペプチド」と称する）としては、検出対象ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが挙げられる。
本発明の融合蛋白質の検出方法は、検出対象ポリペプチドが検出されたか否かによって、前記ポリヌクレオチドが存在するか否かを判定する工程を包含し得る。
本発明の融合蛋白質の検出方法は、検出対象ポリペプチドが検出された場合に、ＯＣＬＮとＡＲＨＧＡＰ２６との融合蛋白質が存在すると判定する工程をさらに包含し得る。
例えば、ポリペプチドの存在を検出する工程は、被験者から得た試料（例えば、被験者から得た癌組織や細胞）由来の可溶化液を調製し、その中に含まれる検出対象ポリペプチドを、融合蛋白質を構成する各蛋白質に対する抗体を組み合わせることによる免疫学的測定法又は酵素活性測定法あるいはこれらを組み合わせた検出方法、又は質量分析法により実施することができる。また、本工程は、適宜前処理（例えば、パラフィンの除去）してある被験者から得た試料（例えば、ＦＦＰＥ切片）に含まれる検出対象ポリペプチドを、融合蛋白質を構成する各蛋白質に対する抗体を組み合わせることによる免疫組織染色技術による検出方法により実施してもよい。又は、本工程は、前記の各検出方法において、融合蛋白質を構成する各蛋白質に対する抗体に代えて、融合蛋白質の融合部を認識する抗体を用いて実施してもよい。これらの手法としては、検出対象ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織染色、免疫沈降法と質量分析法を組み合わせた検出法、等の手法が挙げられる。
本明細書において、融合蛋白質の「融合部」とは、検出対象ポリペプチドにおけるＯＣＬＮ遺伝子由来の部分とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来の部分とが融合した部分を意味する。
免疫組織染色技術を利用した検出は、例えば、Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２００６；３（１２）：９９５−１０００）に従って実施することができる。より具体的には、検出対象ポリペプチドのＯＣＬＮ遺伝子由来部分を認識する抗体と、検出対象ポリペプチドのＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来部分を認識する抗体を用いて、当該二つの抗体が同一分子を認識していることを上記技術によって検出することにより、検出対象ポリペプチドの存在を検出することができる。さらに具体的には、検出は、ｉ）被験者から得た試料に検出対象ポリペプチドのＯＣＬＮ遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び検出対象ポリペプチドのＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を接触させる工程、ｉｉ）該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体を添加する工程、ｉｉｉ）該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲースを含有するライゲーション溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、ｉｖ）形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、ｖ）伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、ｖｉ）該標識シグナルを検出する工程により、実施することができる。このような検出は、ＰＬＡプローブと、Ｄｕｏｌｉｎｋ ＩＩ試薬キット又はＤｕｏｌｉｎｋ ＩＩ Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ試薬キット（Ｏｌｉｎｋ社）に含まれる試薬を用いて実施することができる。
１つの実施形態において、本発明の検出方法は、被験者から試料を得る工程を包含する。
１つの実施形態において、本発明の検出方法における被験者はがん患者であり、より具体的な実施形態において、当該がんが胃癌である。当該胃癌は、特に限定されないが、例えばＬａｕｒｅｎ分類でのｄｉｆｆｕｓｅ ｔｙｐｅであってもｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｙｐｅであってもｍｉｘ ｔｙｐｅであってもよい。また、特に限定されないが、例えば乳頭腺癌、管状腺癌、低分化腺癌、印環細胞癌、粘液癌等のいずれの癌種であってもよい。
本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチド又は検出対象ポリペプチドが被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者ががん（特には胃癌）に罹患している可能性が高いと判定できる。
また、本発明の検出方法における検出工程は、被験者におけるがん（特には胃癌）の存在の検出方法、又は被験者におけるがん（特には胃癌）の診断方法に使用することができる。本発明の診断方法は、当該検出工程に加えて、検出対象ポリヌクレオチド又は検出対象ポリペプチドが被験者から得た試料から検出された場合に該被験者ががん（特には胃癌）に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでもよい。また、当該検出工程は、ＡＲＨＧＡＰ２６機能阻害剤、及び／又はＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる被験者（胃癌などのがん患者）を同定する方法にも使用することができる。本発明の同定方法は、当該検出工程に加えて、当該ポリヌクレオチドが被験者から得た試料から検出された場合に被験者がＡＲＨＧＡＰ２６機能阻害剤、及び／又はＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定する工程を含んでもよい。
《本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット及び検出用キット》
本発明は、本発明の検出方法で使用されるプライマーセット、プローブ、プローブセット及び検出用キットを包含する。
本発明のプライマーセットは、ＯＣＬＮをコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは検出対象ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる。
本発明のプライマーセットにおいて、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方を、検出対象ポリヌクレオチドの融合点を含む領域に対応するように設計してもよい。
本発明のプライマーセットの具体的な態様としては、以下のプライマーセットが挙げられる：
配列番号１の塩基番号１から８９１からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号８９２から２０６４からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
本発明のプライマーセットのより具体的な態様としては、以下のプライマーセットが挙げられる：
配列番号１の塩基番号１から８９１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号８９２から２０６４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
プライマーセットにおいては、センスプライマーとアンチセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスプライマーにより増幅される核酸断片の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。また、本発明のプライマーは、通常、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１６塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、さらに好ましくは少なくとも２０塩基の鎖長を有する。１つの実施形態において、当該プライマーは、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、より好ましくは１８〜２４塩基、さらに好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
本発明のプローブ及び本発明のプローブセットに含まれる各プローブは、検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、高度にストリンジェントな条件下）でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。本発明のプローブ及び本発明のプローブセットに含まれる各プローブの鎖長は、使用するハイブリダイゼーション方法に応じて当業者に適宜選択され得るが、プローブは、好ましくは少なくとも１６塩基の鎖長を有する。
１つの実施形態において、本発明のプローブは、検出対象ポリヌクレオチドにおける融合点を中心にその上流及び下流のそれぞれ少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチド（具体的な例として、配列番号１の塩基番号８７６〜９０７の配列）又はそれに相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
１つの実施形態において、本発明のプローブセットは、ＯＣＬＮをコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチドのＯＣＬＮ遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブ、及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチドのＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子領域内の任意の部分）から設計されるプローブを含む、プローブセットである。
１つの実施形態において、本発明のプローブセットは、ＯＣＬＮをコードする部分から設計される複数種のプローブ、及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計される複数種のプローブを含む。
１つの実施形態において、本発明のプローブセットは、以下を含む：
配列番号１の塩基番号１〜８９１の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）、及び配列番号１の塩基番号８９２〜２０６４の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種（好ましくは１０〜２５種、より好ましくは１８〜２２種、さらに好ましくは２０種のプローブペア）。
前記プローブペアの各プローブは、検出対象ポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドの長さは、通常、少なくとも１６塩基、好ましくは少なくとも１８塩基である。１つの実施形態において、該オリゴヌクレオチドの長さは、１６〜３０塩基、好ましくは１８〜２５塩基である。
本発明のプローブ及び本発明のプローブセットに含まれる各プローブは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
本発明は、本発明のプライマーセット、本発明のプローブ又は本発明のプローブセットを含む、検出用キットを包含する。本発明の検出用キットには、本発明のプライマーセット、本発明のプローブ又は本発明のプローブセットに加え、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する試薬等、検出対象ポリヌクレオチドを検出するために該プライマーセット、プローブ又はプローブセットと共に用いる構成要素を含んでもよい。
本発明はまた、検出対象ポリペプチドを検出するための検出用キットを包含する。好ましくは、当該検出用キットは、検出対象ポリペプチドのＯＣＬＮ遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）及び検出対象ポリペプチドのＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子由来部分を認識する抗体（一次抗体）を含む。より好ましくは、該一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体、該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド、それらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲース、及び標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含んでもよい。
本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット、及び検出用キットは、本発明の検出方法、診断方法、患者の同定方法、及び被験者の同定方法に使用することができる。１つの実施形態において、本発明のプライマーセット、プローブ、プローブセット、及び検出用キットに関して、被験者はがん患者であり、より具体的な実施形態において、当該がんが胃癌である。当該胃癌は、特に限定されないが、例えばＬａｕｒｅｎ分類でのｄｉｆｆｕｓｅ ｔｙｐｅであってもｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｙｐｅであってもｍｉｘ ｔｙｐｅであってもよい。また、特に限定されないが、例えば乳頭腺癌、管状腺癌、低分化腺癌、印環細胞癌、粘液癌等のいずれの癌種であってもよい。
特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
［実施例１］ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子の単離
胃癌細胞株ＯＫＡＪＩＭＡ（広島大学医学部病理学第一講座（現広島大学大学院・医歯薬保健学研究院・分子病理学研究室）から譲受）から調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ；ライフテクノロジーズ社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ（ｄＴ）２０プライマー；ライフテクノロジーズ社）を用いて、試薬の標準プロトコールに従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、配列番号３に示されるＯＣＬＮ＿ｆｕｌｌ ｆｗｄ２１及び配列番号４に示されるＡＲＨＧＡＰ２６＿ｆｕｌｌ ｒｅｖ０１のプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ；タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃３分を３０サイクル、続いて６８℃５分）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号５に示されるＯＣＬＮ＿ｆｕｌｌ ｆｗｄ２２及び配列番号６に示されるＡＲＨＧＡＰ２６＿ｆｕｌｌ ｒｅｖ０２のプライマーを用い、同じＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃３分を３０サイクル、続いて６８℃５分）を行った。ＰＣＲ反応後、電気泳動したところ、２ｋｂｐ強のＰＣＲ産物を得たことがわかった。Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ産物の３’末端にＡを付加後、クローニングベクター（ＴＯＰＯ ＸＬ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングした。インサートをダイデオキシシーケンス法（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）により配列決定した。この結果、胃癌細胞株ＯＫＡＪＩＭＡ由来の２ｋｂｐ強のＰＣＲ産物には、ＮＣＢＩに登録されているＯＣＬＮ（ＮＭ＿００１２０５２５４．１）の塩基番号２０７（ＣＤＳの５’末端に対応）から１０９７に、ＡＲＨＧＡＰ２６（ＮＭ＿００１１３５６０８．１）の塩基番号１１４３から２３１５（ＣＤＳの３’末端に対応）までの塩基配列のうち、塩基番号１２８０のチミンがグアニンに、塩基番号２２２５のシトシンがチミンに置換された配列、が融合した転写産物（配列番号１）が存在していることが明らかになった。配列番号１によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
［実施例２］ＡＲＨＧＡＰ２６ ｓｉＲＮＡを用いたＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子発現胃癌細胞株でのＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質発現抑制能評価と、同条件下での当該細胞株の生存能評価
実施例１に示したＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を発現する胃癌細胞株ＯＫＡＪＩＭＡを１０％ウシ血清（ギブコ社）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（和光純薬）で培養後、遺伝子導入試薬ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（ＧＥヘルスケア社）の標準プロトコールに従って目的のｓｉＲＮＡの導入を行った。具体的には、上記癌細胞を６ウェルプレート（１４０６７５、ヌンク社）に１ウェルあたり２×１０5細胞播種した後、ＡＲＨＧＡＰ２６を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓ２３０１３、ライフテクノロジーズ社）及びコントロールｓｉＲＮＡ（ＡＭ４６１１、ライフテクノロジーズ社）を７５ｐｍｏｌ（終濃度７５ｎＭ）となるようそれぞれ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ2環境下で１２０時間培養した（以下、コントロールｓｉＲＮＡを遺伝子導入した群をＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ群、ＡＲＨＧＡＰ２６を標的とするｓｉＲＮＡを遺伝子導入した群をＡＲＨＧＡＰ２６ ｓｉＲＮＡ群と称する）。
ｓｉＲＮＡの導入によるＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質の発現抑制は、ウェスタンブロッティング法により評価した。具体的には、培養後の細胞を３５０ｍＭ ジチオトレイトール（フェルメンタス社）含有Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（バイオラッド社）に溶解し、蛋白質を抽出した。蛋白質濃度をＰｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（マッハライ・ナーゲル社）により測定した。目的の蛋白質抽出液を１レーンあたり５μｇ又は２０μｇとなるよう８％又は１２％のＳＤＳ（和光純薬）含有ポリアクリルアミドゲル（セルバ社）にローディングし、１時間、４０ｍＡの条件でゲル電気泳動した。ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ ＳＤ ＳＥＭＩ−ＤＲＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＣＥＬＬ（バイオラッド社）を用いて８０分、６０ｍＡの条件でＰＶＤＦ膜（ミリポア社）へと転写した後、５％Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社）含有ＰＢＳ（以下、ブロッキングバッファーと称する）により室温で２時間ブロッキングを行った。抗ＡＲＨＧＡＰ２６抗体（ＨＰＡ０３５１０７、シグマアルドリッチ社）及び抗β−Ａｃｔｉｎ抗体（４９６７、セルシグナリングテクノロジー社）をブロッキングバッファーによりそれぞれ１：５００及び１：３０００の倍率で希釈した一次抗体溶液にメンブレンを振とうさせ、４℃にて一晩反応した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（和光純薬）含有ＰＢＳ（以下、洗浄バッファーと称する）による洗浄後、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体（Ｐ０３９９、ダコ社）をブロッキングバッファーにより１：３０００の倍率で希釈した二次抗体溶液にメンブレンを振とうさせ、室温で１時間反応させた。洗浄バッファーによる洗浄後、Ｐｉｅｒｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｌｕｓ（サーモサイエンティフィック社）をメンブレンに添加し、ＬＡＳ‐４０００Ｒ（富士フイルム社）を用いてメンブレン上の化学発光を検出した。ウェスタンブロットの結果、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質の発現がＡＲＨＧＡＰ２６を標的とするｓｉＲＮＡ処理により抑制されることを確認した（図１）。
次にＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子の癌細胞の生存能への影響を評価するため、上記と同様の条件で胃癌細胞株ＯＫＡＪＩＭＡにＡＲＨＧＡＰ２６を標的とするｓｉＲＮＡ及びコントロールｓｉＲＮＡの遺伝子導入を行った。２４時間後に０．５％ウシ血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地へと培地交換し、１ウェルあたり１×１０3細胞となるように９６ウェルプレート（１６７００８、ヌンク社）に１００μＬずつ、各群それぞれ６ウェル播種して、３７℃、５％ＣＯ2環境下で更に４８時間培養した。コントロールとして、細胞を播種せずに１０％ウシ血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地のみを添加したウェルを用意した（以下、培地群と称する）。生細胞数はＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）の標準プロトコールに従って測定した。具体的には、１ウェルあたり１０μＬの試薬を添加して３７℃、５％ＣＯ2環境下で４時間培養した後、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ社）により４５０ｎｍの吸光度を測定することで生細胞数を測定した。解析データとしては、各条件共に吸光度の最高値と最低値を除去した４ウェルのデータを採用した。Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ群及びＡＲＨＧＡＰ２６ ｓｉＲＮＡ群の生存率は、各群の吸光度から培地群の吸光度を引いた値（以下、補正値と称する）を元に、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ群の補正値を１００％として算出した。Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ群とＡＲＨＧＡＰ２６ ｓｉＲＮＡ群との間の有意差検定にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いた。ｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。
その結果、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を内在的に発現する細胞株である胃癌細胞株ＯＫＡＪＩＭＡにおいて、ＡＲＨＧＡＰ２６を標的とするｓｉＲＮＡを遺伝子導入し、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質の発現を抑制することで、細胞の生存能が有意に減少した（図２）。従って、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を内在的に発現する癌細胞における当該融合遺伝子の発現抑制は、癌細胞の増殖を抑制させる、及び／又は生存を減弱させることが明らかになった。
以上より、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６は癌細胞の腫瘍進展能に関与していることが明らかとなった。
［実施例３］ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子の検出
実施例１に示したＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を発現する胃癌細胞株ＯＫＡＪＩＭＡに加えて、胃癌細胞株ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（ＪＣＲＢ０６１１、ＪＣＲＢ細胞バンク）及びＨＳＣ−３９（国立がん研究センター研究所動物実験部門から譲受）、並びに国立がん研究センター研究所バイオマーカー探索部門にて樹立済みの胃癌細胞株ＮＳＣ−９Ｃ、ＮＳＣ−６Ｃ及びＮＳＣ−１６Ｃから調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ；ライフテクノロジーズ社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ（ｄＴ）２０プライマー；ライフテクノロジーズ社）を用いて、試薬の標準プロトコールに従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、配列番号７に示されるＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６＿Ｏ５Ａ１２＿ｐａｒｔｉａｌ ｆｗｄ０２及び配列番号８に示されるＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６＿Ｏ５Ａ１２＿ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｖ０２のプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ換算で２００ｎｇ）として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ライフテクノロジーズ社）を使用してＰＣＲ（９４℃２分に続いて９４℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃１分を３０サイクル）を行った。同様に、鋳型ｃＤＮＡの量が一定であることを確認するため、配列番号９に示されるＡＣＴＢ＿Ｆ２及び配列番号１０に示されるＡＣＴＢ＿Ｒ２のプライマーを用いて、上記と同じＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲ（９４℃２分に続いて９４℃１５秒、５５℃１５秒、６８℃１分を２５サイクル）を行った。ＰＣＲ反応後、２％アガロースゲル（ロンザ社）で電気泳動したところ、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子の発現が確認されている胃癌細胞株ＯＫＡＪＩＭＡでのみ５００ｂｐ強のＰＣＲ産物が増幅された（図３）。実施例１で明らかになった当該融合遺伝子の塩基配列によると、上記プライマーセットで増幅されるＰＣＲ産物は５１１ｂｐであることから、ＰＣＲ法により癌細胞が発現する当該融合遺伝子を検出することが可能であることが明らかになった。
［実施例４］ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質発現抑制条件下でのＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子発現胃癌細胞株の生存能評価
実施例１に示したＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を発現する胃癌細胞株ＯＫＡＪＩＭＡを１０％ウシ血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養後、遺伝子導入試薬ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｔ２００１−０３、ＧＥヘルスケア社）の標準プロトコールに従って目的のｓｉＲＮＡの導入を行った。具体的には、上記癌細胞を１２ウェルプレート（３８１５−０１２、旭テクノグラス社）に１ウェルあたり２×１０5の細胞を播種した後、ＯＣＬＮを標的とした２種のｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ ｓ９８１４及びｓ４５８０１５（共にライフテクノロジーズ社））、ＡＲＨＧＡＰ２６を標的とした３種のｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ ｓ２３０１３、ｓ２３０１５（共にライフテクノロジーズ社）、及びＳＩ０３０７７６９０（キアゲン社））を７５ｐｍｏｌ（終濃度７５ｎＭ）となるようそれぞれ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ2環境下で７２時間培養した。同時にネガティブコントロールｓｉＲＮＡとしてＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（１０２７２８０、キアゲン社）を、細胞死のポジティブコントロールｓｉＲＮＡとしてＫＩＦ１１を標的とするｓｉＲＮＡ（ＳＩ０２６５３７７０、キアゲン社）を、同様にそれぞれ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ2環境下で７２時間培養した。ＡＲＨＧＡＰ２６を標的とするｓｉＲＮＡのうちｓ２３０１５については、その配列から野生型ＡＲＨＧＡＰ２６のみを標的とし、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６を標的とはしないことが予想された。
ｓｉＲＮＡの導入によるＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質の発現抑制は、ウェスタンブロッティング法により評価した。具体的には、培養後の細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（２５９５５−１１、ナカライ社）とＨａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（７８４４１、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をそれぞれ１／１００量加えた１倍濃度のＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（９８０３、セルシグナリングテクノロジー社）に溶解し、タンパクを抽出した。蛋白質濃度をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（２３２２７、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）により測定した。目的の蛋白質抽出液を１レーンあたり４μｇとなるようＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（ＮＰ０３２２ＢＯＸ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）にローディングし、４０分、１８０Ｖの条件でゲル電気泳動後、ツインミニバッファートランスファー装置（ＢＥ−３５１Ｗ、株式会社バイオクラフト）を用いて１２０分、１９０ｍＡの条件でＰＶＤＦ膜（１６２−０１７６、バイオラッド社）へと転写した後、ＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（ＮＹＰＢＲ０１、ＴＯＹＯＢＯ）により室温で１時間ブロッキングを行った。抗ＡＲＨＧＡＰ２６抗体（ＨＰＡ０３５１０７、Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）及び抗β−Ａｃｔｉｎ抗体（４９６７Ｓ、セルシグナリングテクノロジー社）をＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１（ＮＫＢ−２０１、ＴＯＹＯＢＯ）によりそれぞれ１：１，０００の倍率で希釈した一次抗体溶液にメンブレンを振とうさせ、４℃にて一晩反応した。０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有Ｔｒｉｓバッファー（以下、洗浄バッファーと称する）による洗浄の後、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体（ＮＡ９３４０、ＧＥヘルスケア社）をＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２（ＮＫＢ−３０１、ＴＯＹＯＢＯ）により１：１０，０００の倍率で希釈した二次抗体溶液にメンブレンを振とうさせ、室温で１時間反応させた。洗浄バッファーによる洗浄後、ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＲＰＮ２２３２、ＧＥヘルスケア社）をメンブレンに添加し、ＬＡＳ‐４０１０（ＧＥヘルスケア社）を用いてメンブレン上の化学発光を検出した。ウェスタンブロットの結果、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質の発現は、ＯＣＬＮを標的とした２種のｓｉＲＮＡ処理により、またＡＲＨＧＡＰ２６を標的とした３種のｓｉＲＮＡのうちｓ２３０１５を除いた２種のｓｉＲＮＡにより、それぞれ抑制されることを確認した。
次にＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子の癌細胞の生存能への影響を評価するため、上記と同様の条件で胃癌細胞株ＯＫＡＪＩＭＡにＯＣＬＮ、ＡＲＨＧＡＰ２６を標的とするｓｉＲＮＡ及びコントロールｓｉＲＮＡの遺伝子導入を行った。２４時間後に１０％ウシ血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地へと培地交換し、１ウェルあたり１×１０3細胞となるように９６ウェルプレート（３８６０−０９６、旭テクノグラス社）に１００μＬずつ、各群それぞれ３ウェルとなるよう播種すると共に、細胞を播種せずに１０％ウシ血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地のみを添加したウェルを用意した（以下、培地群と称する）上で、３７℃、５％ＣＯ2環境下で更に４８時間（以下ｄａｙ３とする）と１２０時間（以下ｄａｙ６とする）培養した。この他、正規化のためのコントロールとして、細胞を播種するのみで培養しないプレートも用意した（以下ｄａｙ１とする）。生細胞数は上記それぞれのタイミングで、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｇ７５７１、プロメガ社）の標準プロトコールに従って測定した。具体的には、１ウェルあたり１００μＬの試薬を添加して室温で１０分間処理した後、マイクロプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００（テカン社）により発光強度を測定することで生細胞数を測定した。各培養時間でのｓｉＲＮＡ処理細胞群の生存率は、各群の発光強度から培地群の発光強度を引いた値（以下、補正値と称する）を元に、ｄａｙ１でのそれぞれのｓｉＲＮＡ処理群の補正値を１００％として算出した。
その結果、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を内在的に発現する細胞株である胃癌細胞株ＯＫＡＪＩＭＡにおいて、融合遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを遺伝子導入しＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合蛋白質の発現を抑制することで、細胞の生存能が有意に減少することが確認された（図４）。従って、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６融合遺伝子を内在的に発現する癌細胞における当該融合遺伝子の発現抑制は、癌細胞の増殖を抑制させる、及び／又は生存を減弱させることが明らかになった。
以上より、ＯＣＬＮ−ＡＲＨＧＡＰ２６は癌細胞の腫瘍進展能に関与していることが明らかとなった。
本発明の検出方法は、ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出する方法であり、被験者におけるがんを検出及び診断する方法として有用である。また、本発明のプライマーセット及び検出用キットは、本発明の方法に用いることができる。

Claims (12)

  1. 被験者から得た試料中の、下記（１）又は（２）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、オクルディン（ＯＣＬＮ）遺伝子とロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン２６（ＡＲＨＧＡＰ２６）遺伝子との融合遺伝子の検出方法：
    （１）配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （２）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチド、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍進展能を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ポリヌクレオチドを検出するために、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程、又は、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程をさらに包含する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 以下のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、請求項５に記載の方法：
    ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、ＯＣＬＮをコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、検出対象ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、検出対象ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
  7. 以下のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、請求項５に記載の方法：
    ＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、センスプライマーが、配列番号１の塩基番号１から８９１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号１の塩基番号８９２から２０６４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
  8. 被験者ががん患者である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. がんが胃癌である、請求項８に記載の方法。
  10. 被験者から得た試料中のＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、ＯＣＬＮをコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
  11. 被験者から得た試料中のＯＣＬＮ遺伝子とＡＲＨＧＡＰ２６遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドのＯＣＬＮをコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＲＨＧＡＰ２６をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
  12. センスプライマーが、配列番号１の塩基番号１から８９１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号１の塩基番号８９２から２０６４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる、請求項１１に記載のプライマーセット。
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