JP2003525033A

JP2003525033A - ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料からのｒｎａの単離方法

Info

Publication number: JP2003525033A
Application number: JP2001546900A
Authority: JP
Inventors: ダネンバーグ，キャスリーン; ダネンバーグ，ピーター; スウェンソン，スティーブン
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 1999-12-20
Filing date: 2000-10-31
Publication date: 2003-08-26
Also published as: US20020009795A1; US7919280B2; AU1578501A; KR20030027878A; IL150116A; EP1242594B1; IL150116A0; US20010029018A1; AU2006202986B2; EA008832B1; NO20022945L; DK1743939T3; AU784565C; EP1743939A2; EA200501772A1; AU784565B2; EP1743939B1; CN1420927A; EP1242594A1; EA006827B1

Abstract

(57)【要約】ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料からのＲＮＡの迅速で、信頼できる且つ簡単な単離のための方法が開示される。この方法で精製されるＲＮＡは、遺伝子発現レベルをモニタリングするために用いられ得る。組織試料は、腫瘍またはその他の病理学的組織であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（政府の支援）国立予防衛生研究所（ＮＩＨ）の国立癌協会からの認可番号R01 CA 71716によ
り、政府は本発明に一定の権利を有する。

【０００２】（産業上の利用分野）本発明は、生物学的組織試料からのＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の精製の
分野に関する。

【０００３】（発明の背景）組織中の遺伝子発現レベルの確定はヒト疾患を正確に診断するために非常に重
要であり、患者の治療経過を確定するために益々用いられている。薬理ゲノム学
的方法は、特定の薬剤に応答すると思われる患者を同定し得るし、新規の治療ア
プローチへの方法を導き出し得る。

【０００４】例えばチミジレートシンターゼ（ＴＳ）は、それがデオキシチミジンモノホス
フェート（ｄＴＭＰ）へのデオキシウリジンモノホスフェート（ｄＵＭＰ）の還
元的メチル化を触媒するＤＮＡ生合成において欠くことのできない酵素であり、
細胞内のピリミジンヌクレオチドのde novo合成のための経路のみを提供する（J
ohnston et al., 1995）。チミジレートシンターゼは、化学療法薬、もっとも一
般的には抗葉酸剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に関する標的である。結腸
癌、頭および頚部癌ならびに乳癌の治療のための最も有益な単一剤として、５−
ＦＵの主な作用は、ＴＳ活性を抑制し、細胞内チミンレベルの枯渇を生じ、そし
てその後に細胞死をもたらす。

【０００５】ＴＳ発現におけるかなりの変動が、原発性腫瘍（Johnston et al., 1995; Len
z et al., 1995）および転移（Farrugia et al., 1997; Leichmann et al., 199
7）の両方からの臨床的腫瘍検体間で報告されている。例えば結腸直腸癌では、
腫瘍組織中のＴＳ発現の正常胃腸粘膜組織と比較した比率は、2:10の範囲であっ
た（Ardalan and Zang, 1996）。

【０００６】チミジレートシンターゼは、５−ＦＵに曝露後の腫瘍性細胞中のＴＳタンパク
質の急性誘導およびＴＳ酵素の増大を示した試験により実証されているように、
腫瘍耐性の発生において臨床的重要性を有することも知られている（Spears et
al., 1982; Swain et al., 1989）。５−ＦＵのような細胞傷害性剤に対する応
答においてＴＳを短時間に過剰発現する腫瘍の能力は、フルオロウラシル耐性の
発生において一役を演じ得る。従来の研究は、ＴＳタンパク質のレベルが５−Ｆ
Ｕ療法の有効性と直接相関しており、タンパク質とＲＮＡ発現との間の直接相関
が存在し（Jackman et al., 1985）、そしてＴＳ発現が結腸直腸および乳癌にお
ける強力な予後マーカーであるということが示されている（Jackman et al., 19
85; Horikoshi et al., 1992）。

【０００７】進行性転移性疾患においては、ＲＴ−ＰＣＲにより定量される高ＴＳｍＲＮＡ
、ならびに高ＴＳタンパク質発現はともに、結腸直腸（Johnston et al., 1995;
Farrugia et al., 1997; Leichman et al., 1997）、胃（Lenz et al., 1995;
Alexander et al., 1995）ならびに頭および頚（Johnston et al., 1997）癌に
対するフルオロピリミジンベースの療法に対する不十分な応答を予測することが
示されている。応答者および非応答者間のかなりの重複はしばしば低ＴＳ範疇に
存在するが、しかし中央値以上のＴＳレベルを有する患者は主に非応答者であっ
た。ＴＳ過剰発現の予測値は、その他の分子特徴、例えばジヒドロピリミジンデ
ヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）およびチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）発現、複製エ
ラー陽性（ＲＥＲ＋）状態（Kitchens and Berger 1997）およびｐ５３状態（Le
nz et al., 1997）と併用された場合には、さらに強化され得る。ヒト腫瘍にお
けるＴＳの発現を評価した今日までの研究は、ヒト腫瘍におけるＴＳ発現をベー
スにした応答および結果を予測する能力が、ＴＳ特異的療法から利益を受けると
思われる患者を選定するための将来における機会を提供することを示唆する。

【０００８】今まで、ＴＳ発現の研究を含めた定量的組織遺伝子発現研究は、凍結組織から
のＲＮＡの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅に限定されて
きた。しかしながらほとんどの病理学的試料は凍結組織として調製されず、ルー
チンにホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されて、組織学的分析をそ
して記録保存を可能にする。遺伝子発現レベルは、タンパク質発現レベルをモニ
タリングするための免疫組織化学的染色を用いることにより、このような固定お
よび包埋試料において半定量的におよび間接的にモニタリングされ得る。パラフ
ィン包埋試料は広範に利用可能であるため、このような試料からの核酸、特にＲ
ＮＡの単離のためには迅速且つ信頼できる方法が必要とされる。

【０００９】生物学的試料からのＲＮＡの精製のための多数の技法が存在するが、しかしＦ
ＦＰＥ試料からのＲＮＡの単離に関して信頼できるものはない。例えばChomczyn
ski（米国特許第5,346,994号）は、フェノールおよびグアニジンイソチオシアネ
ートを用いた液相分離を基礎にした組織からのＲＮＡ精製方法を記載する。生物
学的試料は、フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートの水性溶液中で均
質化され、ホモジネートはその後クロロホルムと混合される。遠心分離後、ホモ
ジネートは有機相、間相および水性相に分離する。タンパク質は有機相中に封鎖
され、ＤＮＡは間相中にそしてＲＮＡは水性相中に隔絶される。ＲＮＡは、水性
相から沈殿される。この方法は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料からの
ＲＮＡの信頼できる単離を提供しない。

【００１０】ＲＮＡを単離するためのその他の既知の技法は、例えばSambrook, J. et al.(
1989) pp. 7.3-7.24およびAusubel, F.M. et al.,(1994) pp. 4.0.3-4.4.7に記
載されているように、典型的にはグアニジン塩またはフェノール抽出を利用する
。しかしながら既知の方法で、パラフィン包埋組織試料からのＲＮＡの単離にお
いて再現可能な定量的結果を提供するものはない。

【００１１】パラフィン包埋組織からのＲＮＡの単離のための技法は、腫瘍組織中での遺伝
子発現の研究のために特に必要とされる。ある種の受容体または酵素の発現レベ
ルは、特定の治療の成功の見込みを示し得る。

【００１２】全く定量的なＴＳ遺伝子発現研究は凍結組織からのＲＴ−ＰＣＲに限定されて
おり、一方、ガラススライド上に固定された記録保管病理学的物質におけるＴＳ
タンパク質発現の半定量的モニタリングは、免疫組織化学的染色を介して利用可
能であった。記録保管病理学的物質からＲＮＡを単離する場合の制限のために、
このような試料から遺伝子発現レベルを測定するための定量的技法は従来は利用
可能でなかった。

【００１３】発明の要約本発明の一局面は、生物学的組織の試料からのＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク
質の単離のための信頼できる方法を提供することである。本発明は、パラフィン
に包埋された組織からのＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の単離のための簡単で
、効率的且つ再現可能な方法も提供する。本発明は、有効濃度のカオトロピック
剤の溶液中で約50〜約100℃の温度で約5〜約120分間試料を加熱することによる
生物学的組織試料からのＲＮＡの精製方法を提供する。一実施態様では、カオト
ロピック剤はグアニジニウム化合物である。次にＲＮＡは前記の溶液から回収さ
れる。例えばＲＮＡ回収は、クロロホルム抽出により成し遂げられ得る。本発明
の一方法において、ＲＮＡは記録保管病理学的試料から単離される。一実施態様
では、パラフィン包埋試料が先ず脱パラフィン化される。脱パラフィン化法の一
例としては、有機溶媒、好ましくはキシレンでパラフィン処理試料を洗浄するこ
とが包含される。脱パラフィン化試料は、低級アルコールの水性溶液で再水和さ
れ得る。適切な低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノー
ルおよびブタノールが上げられる。一実施態様では、脱パラフィン化試料は、漸
減濃度の低級アルコール溶液の連続洗浄で再水和される。別の実施態様では、試
料は同時に脱パラフィン化および再水和される。

【００１４】脱パラフィン化試料は、均質化の機械的音波またはその他の手段を用いて均質
化され得る。一実施態様では、再水和試料は、カオトロピック剤、例えばグアニ
ジニウムチオシアネート（グアニジニウムイソチオシアネート（イソチオシアン
酸グアニジニウム）としても販売されている）を含む溶液中で均質化される。

【００１５】均質化試料は、有効量のカオトロピック剤を含むカオトロピック溶液中で約50
〜約100℃の範囲の温度に加熱される。一実施態様では、カオトロピック剤はグ
アニジニウム化合物である。好ましいカオトロピック剤は、グアニジニウムチオ
シアネートである。

【００１６】次に、例えばフェノールクロロホルム抽出、イオン交換クロマトグラフィーま
たはサイズ排除クロマトグラフィーにより、ＲＮＡが溶液から回収される。

【００１７】ＲＮＡは次に、抽出、電気泳動、クロマトグラフィー、沈降またはその他の適
切な技法を用いて、さらに精製され得る。本発明の方法により単離されたＲＮＡ
は、ｃＤＮＡライブラリーを提供するための無作為プライマーによる逆転写を含
めた分子生物学における多数の用途に適している。

【００１８】精製ＲＮＡは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅によりホル
マリン固定パラフィン包埋組織試料における遺伝子発現のレベルを確定するため
に用いられ得る。適切なＰＣＲプライマーを用いて、任意のメッセンジャーＲＮ
Ａの発現レベルが本発明の方法により確定され得る。定量的ＲＴ−ＰＣＲ技法は
、パラフィン包埋試料中のタンパク質発現レベル（免疫組織化学による）と同一
試料中の遺伝子発現レベル（ＲＴ−ＰＣＲ使用）との比較を可能にする。

【００１９】本発明の方法は、広範囲の組織および腫瘍型ならびに標的遺伝子に適用可能で
あり、そこで一連の癌、例えば乳癌、頭部および頚部癌、食道癌、結腸直腸癌等
における治療の査定のためにそして診断道具として用いられ得る。本発明の方法
のために特に好ましい遺伝子は、チミジレートシンターゼ遺伝子である。本発明
の方法は、凍結組織由来のものに匹敵する、ＦＦＰＥ組織におけるＴＳ遺伝子発
現の再現可能な定量を達成した。

【００２０】本発明の詳細な説明本発明の方法は、生物学的試料からのＲＮＡの精製を包含する。一実施態様で
は、試料はパラフィン包埋組織試料であり、方法は包埋試料の脱パラフィン化、
脱パラフィン化組織の均質化、ならびに有効量のグアニジニウム化合物を含有す
るカオトロピック溶液中での約50〜約100℃の範囲の温度で約5〜約120分の時間
の均質化組織の加熱を包含する。これらの加熱過程は、検体から増大されるｃＤ
ＮＡの量を、加熱されない試料の1000倍まで増大する。

【００２１】凍結腫瘍組織は広範に利用されないが、一方、パラフィンブロックは手術後の
あらゆる種類の腫瘍からルーチンに調製されて、ＴＳ発現および化学療法応答の
大規模な遡及的調査が実施されるようにする。

【００２２】さらに、本技法は、広範な腫瘍型のいずれかに、そして非限定範囲の標的遺伝
子に適用され得る。これは個々の腫瘍「遺伝子発現プロフィール」の将来的調製
のための意味を有し、それにより発現レベルは、臨床結果および種々の化学療法
剤に対する応答に影響を及ぼすことが知られている一連の遺伝子に関して個々の
患者試料で確定され得る。ＦＦＰＥ試料からの自動実時間ＰＣＲは、個々の腫瘍
に対する治療のターゲッティングを可能にする。

【００２３】組織試料ＲＮＡは、本発明の方法を用いてあらゆる生物学的試料から単離され得る。生
物学的試料はしばしば、固定液により固定される。アルデヒド固定液、例えばホ
ルマリン（ホルムアルデヒド）およびグルタルアルデヒドが典型的には用いられ
る。その他の固定技法、例えばアルコール浸漬（Battifora and Kopinski, J. H
istochem. Cytochem. (1986) 34:1095）を用いて固定される組織試料も適してい
る。用いられる使用はさらに、パラフィンに包埋される。ＲＮＡは、本発明の方
法により任意のパラフィン包埋生物学的試料から単離される。一実施態様では、
試料はホルマリン固定され且つパラフィン包埋される。

【００２４】試料の脱パラフィン化脱パラフィン化は、パラフィン包埋試料から大部分のパラフィンを除去する。
脱パラフィン化のための多数の技法が既知であり、任意の適切な技法が本発明と
ともに用いられ得る。本発明の好ましい方法は、有機溶媒を用いた洗浄を利用し
てパラフィンを溶解する。このような溶媒は、ＲＮＡ単離に悪影響を及ぼすこと
なく組織試料から効率的にパラフィンを除去し得る。適切な溶媒は、例えばベン
ゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレンおよびそれらの混合物といった溶媒
から選択され得る。キシレンは、本発明の方法に用いるための好ましい溶媒であ
る。単独のまたは本発明の方法において組合せた溶媒は、好ましくは高純度を、
通常は99％より高い純度を有する。

【００２５】パラフィンは、典型的には有機溶媒を用いて激しく混合しながら洗浄し、その
後遠心分離することにより除去される。試料は、試験管中で組織をペレットにさ
せるに十分な速度で、通常は約10,000〜約20,000 xgで遠心分離される。遠心分
離後、有機溶媒上清は廃棄される。用いられる有機溶媒の容量および必要な洗浄
の回数は、試料のサイズおよび除去されるパラフィンの量によっている、と当業
者は認識する。除去されるパラフィンが多いほど、必要とされる洗浄回数は多い
。典型的には、試料は1〜約10回、好ましくは約2〜約4回洗浄される。有機溶媒
の典型的容量は、組織検体10μmに対して約500μLである。

【００２６】当業者に既知のその他の脱パラフィン化方法も、本発明の方法に用いられ得る
。このような方法としては、直接融解（Banerjee et al., 1995）が挙げられる
。

【００２７】試料は、好ましくは脱パラフィン化後に再水和される。再水和の好ましい方法
は、漸減濃度の水性低級アルコール溶液を用いた段階洗浄である。エタノールは
再水和のための好ましい低級アルコールである。その他のアルコール、例えばメ
タノール、イソプロパノールおよびＣ1〜Ｃ5の範囲のその他の同様のアルコール
も、本発明とともに用いるのに適している。あるいは試料は、アルコール溶液と
激しく混合されて、遠心分離される。好ましい実施態様では、アルコールの濃度
範囲は、約3〜5漸増段階に亘って、水中で約100％から約70％に段階的に低減さ
れ、この場合、各段階での溶液濃度の変化は普通は、約10％未満である（即ち濃
度列：100％、95％、90％、80％、70％）。別の実施態様では、脱パラフィン化
および再水和は、ＥＺ−ＤＥＷＡＸ（BioGenex, San Ramon, CA）のような試薬
を用いて同時に実行される。

【００２８】均質化脱パラフィン化再水和試料は、任意の標準機械的、音波またはその他の適切な
技法により均質化され得る。組織均質化は、好ましくは標準手法により機械的組
織ホモジナイザーを用いて実行される。多数の市販ホモジナイザー、例えば、Ul
tra-Turraxホモジナイザー（IKA-Works, Inc., Wilmington, NC）、ティッシュ
マイザーTissumizer（Tekmar-Dohrmann, Cincinnati, OH）およびポリトロンPol
ytron（Brinkmann, Westbury, NY）が本発明とともに用いるのに適している。

【００２９】一実施態様では、試料はカオトロピック剤の存在下で均質化される。カオトロ
ピック剤の非存在下で単離される場合の約10倍より多い量でパラフィン包埋試料
からＲＮＡが有効濃度で精製されるよう、カオトロピック剤は選択される。カオ
トロピック剤としては、グアニジニウム化合物、尿素、ホルムアミド、ヨウ化カ
リウム、チオシアン酸カリウムおよび同様の化合物が挙げられる。本発明の方法
のために好ましいカオトロピック剤は、グアニジニウム化合物、例えばイソチオ
シアン酸グアニジニウム（チオシアン酸グアニジニウムとしても販売されている
）および塩酸グアニジニウムである。多数の陰イオン性対イオンが有用であり、
当業者はこのような適切な陰イオンを用いて多数のグアニジニウム塩を調製し得
る。本発明に用いられるグアニジニウム溶液は一般に、約1〜約5 Mの範囲の濃度
を有し、好ましい値は約4 Mである。ＲＮＡがすでに溶液中に存在する場合、試
料において達成される最終濃度が約1〜約5 Mの範囲であるよう、グアニジニウム
溶液はより高い濃度を有し得る。グアニジニウム溶液は、適切な生化学的緩衝剤
例えばトリス−Ｃｌを用いて、好ましくは約3〜約6、さらに好ましくは約4のｐ
Ｈに緩衝される。カオトロピック溶液は、還元剤、例えばジチオトレイトール(
ＤＴＴ)およびβ−メルカプトエタノール(ＢＭＥ)も含有し得る。カオトロピッ
ク溶液は、ＲＮアーゼ阻害剤も含有し得る。

【００３０】加熱試料は、約60℃〜約100℃の温度で約5分〜約2時間、カオトロピック溶液中で
加熱される。あるいは試料は、約50℃〜約100℃の温度で約5分〜約2時間、カオ
トロピック溶液中で加熱される。加熱時間は、典型的には、精製されるＲＮＡの
量が非加熱試料の少なくとも約100倍より高く、さらに好ましくは約1000倍より
高い。好ましい実施態様では、試料は約75〜約100℃の温度で約20分間加熱され
る。さらに好ましくは、試料は約95℃で30〜60分間加熱される。

【００３１】ＲＮＡ回収ＲＮＡは、カオトロピック溶液の少なくとも１つの構成成分からのＲＮＡの単
離を生じる任意の適切な技法により、加熱後にカオトロピック溶液から回収され
得る。ＲＮＡは、当業者に明らかなように、有機溶媒による抽出、クロロホルム
抽出、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール、イソプロパノールまたは任
意のその他の低級アルコールによる沈降により、クロマトグラフィー、例えばイ
オン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、シリカゲルクロ
マトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーにより、あるいは電気泳動法、例
えばポリアクリルアミドゲル電気泳動およびアガロースゲル電気泳動により、カ
オトロピック溶液から回収され得る。ＲＮＡは、好ましくはフェノールクロロホ
ルム抽出を用いてカオトロピック溶液から回収される。

【００３２】ＲＮＡ回収後、ＲＮＡは任意にさらに精製され得る。さらなる精製は、夾雑Ｄ
ＮＡまたはタンパク質を実質的に含有しないＲＮＡを生じる。さらなる精製は、
ＲＮＡ回収のための前記の技法のいずれかにより成し遂げられ得る。ＲＮＡは、
好ましくは低級アルコールを用いて、特にエタノールまたはイソプロパノールを
用いて沈降により精製される。沈降は、好ましくは担体、例えば沈降を促すグリ
コーゲンの存在下で実行される。

【００３３】ＤＮＡおよびタンパク質回収本発明の方法は、組織試料からＤＮＡまたはタンパク質を精製するためにも用
いられ得る。試料を有機溶媒、例えばクロロホルムと混合後、そして遠心分離後
に、溶液は３相、即ち下部有機相、中間相および上部水性相を有する。適切なカ
オトロピック剤を用いて、特にグアニジニウム化合物を用いて、試料の生物学的
構成成分は３相に分離する。上部水性相はＲＮＡを含有し、一方中間相はＤＮＡ
を含有し、そして有機相はタンパク質を含有する。本発明の方法はＤＮＡおよび
タンパク質相の両方ならびにＲＮＡを含有する相を回収するのに適している、と
当業者は認識する。

【００３４】精製ＲＮＡ本発明の方法により精製されるＲＮＡは、種々の目的および分子生物学手法に
適しており、その例としては、ｃＤＮＡへの逆転写；遺伝子チップ、オリゴヌク
レオチドマイクロアレイ等に関する分析のための放射能、蛍光またはその他の方
法で標識されるｃＤＮＡの産生；アクリルアミドによる電気泳動またはアガロー
スゲル電気泳動；クロマトグラフィー(例えばイオン交換、シリカゲル、逆相ま
たはサイズ排除クロマトグラフィー)による精製；核酸プローブを用いたハイブ
リダイゼーション；ならびに機械的、音波またはその他の手段による断片化が挙
げられるが、これらに限定されない。

【００３５】実施例材料および方法これらの材料および方法は、以下の実施例に共通である。

【００３６】試料調製。ヒト細胞株ＳＫ１、Ｈ１５７、Ａ４３１、ＨＴ２９、ＨＣＣ２９
８およびＨＨ３０の特徴は、以前に記載されている。トリプシン処理により細胞
をそれらの単一層から取り出し、3000 rpmで5分間の遠心分離によりペレットか
した。細胞ペレットは、−70℃で凍結するか、あるいはホルマリン中で24時間固
定した後、パラフィン中に包埋した。

【００３７】腫瘍組織の代表的切片を手術時に採取し、ほとんどの臨床病理学実験室に共通
の手法により、ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。組織の横断切
片（5μm）をミクロトームを用いて切断した。

【００３８】ＲＮＡ単離。以下のようにパラフィン包埋組織からＲＮＡを単離した。パラ
フィン処理組織の単一5 μm切片をエッペンドルフ管中に入れ、キシレンで15分
間2回の洗浄により脱パラフィン化した。段階的アルコール（100％、95％、80％
および70％）を用いた連続15分洗浄により、組織を再水和した。その結果生じた
ペレットを、0.5％サルコシンおよび20 mMジチオトレイトール(ＤＴＴ)とともに
4 Mグアニジンイソチオシアネート中に懸濁した。懸濁液を均質化し、次に約50
℃から約95℃に0〜60分間加熱した。各試料に関する対照として、ゼロ加熱時点
を包含した。酢酸ナトリウム(ｐＨ4.0)を付加して0.2 Mとし、その溶液をフェノ
ール／クロロホルムで抽出して、イソプロパノールおよび10 mgグリコーゲンを
用いて沈降させた。遠心分離（13000 rpm、4℃、15分）後、ＲＮＡペレットを75
％エタノール1 mLで2回洗浄し、次にＲＮアーゼ無含有水中に再懸濁した。

【００３９】逆転写(ＲＴ)。加熱後、ランダムヘキサマーを用いて全ＲＮＡをｃＤＮＡに
転換した。ＲＴ条件は、凍結組織に関して前に記載されたのと同様であった（Ho
rikoshi et al., 1992）。逆転写酵素を省いた対照(無ＲＴ)を、各試料に関して
調製した。

【００４０】 Perkin Elmer Cetus 7700ＰＣＲ機（Taqman）を用いたＴＳおよびβ−アクチ
ン発現の実時間ＰＣＲ定量。前に記載された（Heid et al., 1996; Eads et a
l., 1999）ような蛍光検出法に基づいた実時間ＰＣＲを用いて、ｍＲＮＡレベル
の定量を実行した。前記と同様にｃＤＮＡを調製した。５‘−蛍光レポーター染
料(６ＦＡＭ)および３’−消光剤染料（ＴＡＭＲＡ）とともにプローブを用いて
、当該ｃＤＮＡおよび参照ｃＤＮＡを別々に増幅した。ＴＡＱポリメラーゼの５
‘−エキソヌクレアーゼ活性はプローブを切断し、レポーター分子を放出して、
その蛍光をＡＢＩプリズム配列検出系（Taqman）により検出する。蛍光検出閾値
を越えた後、ＰＣＲ増幅は、精製されたＰＣＲ産物の量に比例して蛍光シグナル
を生じる。蛍光シグナルがＰＣＲ反応の指数期において閾値を越えた回数から、
初期鋳型濃度を確定した。相対遺伝子発現は、当該遺伝子および参照遺伝子の閾
値サイクルを基礎にして確定した。参照遺伝子の使用は、誤差の主な原因であり
得るＲＮＡを直接定量する必要を回避する。

【００４１】プライマーおよびプローブ配列は以下の通りであった：ＴＳ：配列番号１：GG
C CTC GGT GTG CCT TT；配列番号２：AAC ATC GCC AGC TAC GCC CTG C；配列番
号３：GAT GTG CGC AAT CAT GTA CGT。β−アクチン：配列番号４：TGA GCG CGG
CTA CAG CTT；配列番号５：ACC ACC ACG GCC GAG CGG；配列番号６：TCC TTA A
TG TCA CGC ACG ATT T。実時間ＰＣＲ実験に関しては、前記のように、レポータ
ーオリゴヌクレオチド(配列番号２および５)を６ＦＡＭで５‘標識し、そしてＴ
ＡＭＲＡで３’標識した。

【００４２】各ＰＣＲに関しては、「無逆転写酵素」(ＮＲＴまたは無ＲＴ)対照を包含した
。この反応の目的は、残留ゲノムＤＮＡ夾雑に由来する任意のバックグラウンド
増幅に関して補正することであった。それゆえ、ＴＳおよびβ−アクチンに関す
る全体的値は各々、ＲＴ値マイナスＮＲＴ値(ＲＴ−ＮＲＴ)として算定される。

【００４３】統計学的分析。期待値検定の非パラメーター比較を実施して、同一腫瘍の凍
結組織およびＦＦＰＥ試料間のＴＳレベルの差が有意であるかまたは非有意であ
るかを確定した。

【００４４】実施例１一般ＲＮＡ単離手法以下の一般手法により、パラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出した。

【００４５】Ａ．切片の脱パラフィン化および水和：（１）約10 Μm切片の一部分を1.5 mLプラスチック遠心管中に入れる。

【００４６】（２）600 μLのキシレンを付加し、混合物を室温（およそ20〜25℃）で約10
分間、激しく振盪する。

【００４７】（３）卓上遠心分離機の最大速度(約10〜20,000 xg)で、室温で約7分間、試料
を遠心分離する。

【００４８】（４）パラフィンの大部分が溶解されるまで、過程２および３を反復する。オ
リジナル試料部分に包含されるパラフィンの量によって、２回またはそれ以上を
通常は要する。

【００４９】（５）低級アルコールを用いて、好ましくは100％エタノール（約600 μL）を
用いて約3分間激しく振盪することにより、キシレン溶液を除去する。

【００５０】（６）過程（３）におけると同様に約７分間、試験管を遠心分離する。上清を
デカントし、廃棄する。ペレットは白色になる。

【００５１】（７）連続希釈エタノール溶液を用いて、先ず約95％エタノールを用いて、次
に約80％エタノールを用いて、そして最後に約70％エタノールを用いて、過程５
および６を反復する。

【００５２】（８）過程（３）におけると同様に室温で7分間、試料を遠心分離する。上清
を廃棄し、ペレットを室温で約5分間乾燥させる。

【００５３】Ｂ．フェノール−クロロホルムによるＲＮＡ単離（１）0.5％サルコシンおよび8 μLの1 Mジチオトレイトールを含む400μLの
グアニジンイソチオシアネート溶液を付加する。

【００５４】（２）次に組織ホモジナイザー（Ultra-Turrax, IKA-Works, Inc., Wilmingto
n, NC）を用いて約2〜3分間、低速（速度１）から高速（速度５）に速度を次第
に増大しながら、試料を均質化する。

【００５５】（３）次に約95℃で約5〜20分間、試料を加熱する。加熱前に試料を含有する
試験管の蓋をファインゲージ針で貫くのが好ましい。あるいは蓋にプラスチック
製クランプまたは実験室フィルムを付し得る。

【００５６】（４）次に試料をｐＨ4.0の2 M酢酸ナトリウム50 μLおよびフェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコール（10:1.93:0.036）600Μlで抽出し、フェノー
ル18 mLを1:49イソアミルアルコール：クロロホルム溶液3.6 mLと混合すること
により新たに調製する。溶液を約10秒間激しく振盪し、次に氷上で約15分間冷却
する。

【００５７】（５）溶液を最大速度で約7分間遠心分離する。上部（水性）相を新しい試験
管に移す。

【００５８】（６）ＲＮＡを約10 μLのグリコーゲンをおよび400 μLのイソプロパノール
を用いて−20℃で30分間沈降させる。

【００５９】（７）卓上遠心分離機中で最大速度で約7分間の遠心分離によりＲＮＡをペレ
ット化し、上清をデカントして、廃棄し、ペレットを約70〜75％のエタノール約
500 μLで洗浄する。

【００６０】（８）試料を再び最大速度で7分間遠心分離する。上清をデカントし、ペレッ
トを風乾する。次にペレットをさらなる実験のために適切な緩衝液（例えば50
μL の5 mMトリス塩化物、ｐＨ8.0）中に溶解する。

【００６１】実施例２加熱時間本実施例は、ＲＮＡの収量に及ぼす加熱の時間の作用を説明する。

【００６２】図１で説明したように、沈降および逆転写前の95℃でのカオトロピック溶液の
加熱は、ＴＳおよびβ−アクチン標的の検出の効率を有意に増大した。加熱過程
を包含しない場合、ＴＳもβ−アクチンも検出されなかった（0分時点）。95℃
で20分後、両転写体が検出可能であった。加熱時間を60分にさらに増大すると、
ＴＳに関する検出感度は3倍に、そしてβ−アクチンに関しては4.5倍に増大した
（ＮＲＴ＝無逆転写酵素対照、ＲＴ−ＮＲＴ＝全体的相対的遺伝子発現レベル、
即ち逆転写酵素−無転写酵素）。

【００６３】図２は、正常（Ｎ）または腫瘍性（Ｔ）組織におけるβ−アクチン遺伝子のＲ
ＮＡ発現の量を示す。試料を95℃で0〜40分間の範囲の間、加熱した。ほとんど
の試料に関して、約30分という好ましい加熱時間が観察される。

【００６４】図３は、約60分より長い加熱時間で、抽出されるＲＮＡの量が減少し始めるこ
とを示すが、これはＲＮＡの熱分解を示唆する。一方、抽出されるＤＮＡの量は
増大し始める。これは、ＤＮＡの存在がいくつかの場合において擬似ＰＣＲシグ
ナルを示し得るため、望ましくない。

【００６５】実施例３加熱溶液本実施例は、カオトロピック剤の存在下でのＲＮＡ溶液の加熱がＲＮＡの高収
量を得るために重要であることを説明する。これは、種々の溶液中で単離される
ＲＮＡの相対量の測定値としてβ−アクチン遺伝子発現の検出を用いるＲＴ−Ｐ
ＣＲ実験であった。

【００６６】食道癌ＦＦＰＥ組織試料の臨床検体を前記の方法により処理したが、但し、脱
パラフィン化後に得た初期ペレットは、4 Mグアニジニウムイソチオシアネート
（ＧＩＴＣ）、4 Mグアニジニウムイソチオシアネート＋100 μMβ−メルカプト
エタノール（ＧＩＴＣ＋ＢＭＥ）、4 Mグアニジニウムイソチオシアネート＋20
μMジチオトレイトール（ＧＩＴＣ＋ＤＴＴ）中に、あるいはトリス−Ｃｌ緩衝
液（10 mM、ｐＨ7.5）またはトリス−Ｃｌ緩衝液＋20 μMＤＴＴ（トリス／Ｃｌ
＋ＤＴＴ）中に溶解または懸濁した。次に試料を30分間95℃に加熱するか、また
は加熱しなかった（0分、95℃）。次にトリス／Ｃｌ試料を4 Mグアニジニウムイ
ソチオシアネートで処理した。ＲＴ−ＰＣＲおよびβ−アクチンの実時間ＰＣＲ
検出によりＲＮＡレベルを確定した。図４に示したように、カオトロピック剤グ
アニジニウムイソチオシアネートの存在は、加熱する場合、ＲＮＡの高収量回収
のために重要であった。還元剤、例えばＤＴＴまたはＢＭＥの存在は、ＲＮＡの
高収量回収のために不可欠であるというわけではない。4 Mグアニジニウムイソ
チオシアネート溶液が、50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5）、25 mMＥＤＴＡおよ
び0.5％サルコシンを含有する。

【００６７】実施例４同一供給源からのＦＦＰＥおよび凍結組織で確定された遺伝子発現値の比較本実施例は、本発明の方法が、凍結組織から得られるものと等価のホルマリン
固定パラフィン包埋試料からの遺伝子発現に関する値を提供することを示す。本
発明の方法を用いて、6つの細胞株からの試料をＦＦＰＥ処理し、ＴＳ定量を実
施した（95℃で30分間の加熱を含む）。その結果生じた相対ＴＳ値（図５）を、
既知の方法を用いて凍結細胞ペレットから得たものと比較した。相対ＴＳ発現レ
ベルは、凍結細胞で3.0〜19.5（平均＝8.5）に対してＦＦＰＥ試料では3.0〜25.
0（平均＝9.0）であった。2つの平均間の差の統計学的分析は0.726のｐ値を明示
したが、これはオリジナルＲＴ−ＰＣＲ法を用いて凍結細胞ペレットから得られ
たＴＳ値と本発明の方法を用いてＦＦＰＥ細胞ペレットから得られたものとに有
意差が認められないことを示す。

【００６８】腫瘍性組織のならびに正常（非腫瘍性）組織の試料中のＲＮＡ発現レベルも、
試料をホルマリン固定およびパラフィン包埋したかまたは凍結したかに関係なく
等価であった。5つの正常組織ならびに6つの腫瘍結腸組織および4つの食道腫瘍
組織を、前記のようにパラフィンおよび凍結組織（ＦＴ）を適合させる場合の相
対ＴＳ遺伝子発現に関して比較した。結果を図６に示す。凍結組織試料で見出さ
れたＴＳのレベルと同一組織のＦＦＰＥ試料で見出されたＴＳ値との間に有意差
は認められなかった。これは、結腸および食道組織の両方に関して言えた（平均
ＦＴ試料結腸＝3.46、平均ＦＦＰＥ試料結腸＝3.06、ｐ＝0.395；平均ＦＴ試料
食道＝13.9、平均ＦＦＰＥ試料食道＝15.93、ｐ＝0.21）。

【００６９】実施例５応答性および非応答性腫瘍組織におけるＴＳレベルの比較ＩＶ期結腸癌における凍結組織および適合性ＦＦＰＥ試料におけるＴＳレベル
の５−ＦＵ／ロイコボリン（ＬＶ）との相関。凍結組織から得られたＲＴ−Ｐ
ＣＲを基礎にした従来の報告は、腫瘍中の高レベルのＴＳ（相対的遺伝子発現≧
4.0）がＴＳ処置に対する乏しい応答を示すことを見出した。応答性腫瘍は、低
レベルのＴＳを発現するとして特性化され得た。凍結組織試料の分析により５−
ＦＵ／ＬＶに対する応答が従来ＴＳ遺伝子発現と結び付けられてきた患者17名か
らのパラフィン切片で、ＴＳ／β−アクチン比を確定した（図７）。17例のうち
、6例がＴＳに応答性であることが判り、11例がＴＳ処置に対する不十分応答者
であったことがわかった。適合するパラフィン組織を用いたＴＳ結果も、この療
法に対する応答を予測していることが判明した（平均応答者ＦＴ＝2.87、平均応
答者ＦＦＰＥ＝2.37、ｐ＝0.641；平均非応答者ＦＴ＝7.66；平均非応答者ＦＦ
ＰＥ＝7.84、ｐ＝0.537）。凍結組織から得られたＴＳレベルと適合するＦＦＰ
Ｅ組織から得られたものとの間に有意差は認められなかった。

【００７０】実施例６原発性結腸癌および肝臓転移におけるＴＳ遺伝子発現レベルこの実施例は、原発性結腸癌における、ならびに同一患者からの再発性肝臓転
移におけるＴＳおよびその他の遺伝子発現の分析を示す。

【００７１】図８は、原発性結腸癌および1年後に再発した同一患者からの肝臓転移（ｍｅ
ｔ）のＦＦＰＥ試料中の4つの遺伝子：ＴＳ；ＴＰ；シクロオキシゲナーゼ−２
（ＣＯＸ−２）；および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現レベルを示す。知
見は、原発性腫瘍は５−ＦＵ療法に感受性であった（ＴＳ＝2.32）が、一方、転
移は難治性である（ＴＳｍｅｔ11.58）ということを示唆する。ＣＯＸ−２およ
びＶＥＧＦ発現レベルは、それらが攻撃的疾患における発現において増大され、
同時調製されるという発表済みの表示と相関する（Ｃｏｘ−２原発性＝1.35；Ｃ
ＯＸ−２ｍｅｔ＝5.4；ＶＥＧＦ原発性＝5.02；ＶＥＧＦｍｅｔ＝14.4）。原発
性結腸癌の5 ΜmＦＦＰＥ切片から、ならびに肝臓転移のＦＦＰＥ切片から、前
記のようにＲＮＡを単離した。応答性原発性腫瘍における相対ＴＳ遺伝子発現は
2.32であったが、これに比して転移性疾患では11.58であった（図８）。本明細
書で報告したＲＴ−ＰＣＲ法により確定した場合のＴＳ発現におけるこの5倍増
は、二次疾患が５−ＦＵに応答しないことを示し、そしてＣＰＴ−１１のような
代替療法が適切であり得ることを示唆する。

【００７２】本明細書中に引用された参考文献は全て、それらの記載内容が参照により本明
細書中に含まれる。

【００７３】参考文献

【００７４】

【表１】

【００７５】

【表２】

【００７６】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、種々の加熱時間でのβ−アクチンおよびＴＳ発現のレベルを示す。こ
れらのデータは、加熱過程を用いない場合、パラフィンから抽出されるＲＮＡの
収量が最小であることを示す。

【図２】図２は、95℃で0〜40分間抽出されたＲＮＡからの定量的ＰＣＲにより確定し
た場合の結腸直腸癌患者からの正常（Ｎ）または腫瘍性（Ｔ）組織におけるβ−
アクチン発現のレベルを示す。これらのデータは、最適加熱時間として30分を示
唆する。

【図３】図３は、β−アクチンＲＮＡの収量に、ならびにＤＮＡの単離に及ぼす温度お
よび時間の影響を示す。これらのデータは、加熱時間が長いほど（60〜120分）
ＲＮＡは分解を蒙るが、一方、ＤＮＡＰＣＲシグナルを生じ得る夾雑ＤＮＡの増
大が認められる、ということを示す。棒は、指示された種々の時間および温度で
実行した三重反復実験の値を表す。

【図４】図４は、単離ＲＮＡの収量に及ぼす種々の加熱溶液の影響を示す。これらのデ
ータは、溶液中のカオトロープ（この場合はグアニジニウムイソチオシアネート
（ＧＩＴＣ））が、ＲＮＡ抽出溶液の必須構成成分であることを示し、これを用
いない場合、抽出ＲＮＡの収量は少なくとも10分の1である。

【図５】図５は、６つの細胞株からのパラフィン包埋（白棒）および凍結細胞ペレット
（黒棒）からの相対的ＴＳ遺伝子発現の比較を示す。これらのデータは、パラフ
ィン抽出ＲＮＡが、新鮮な凍結組織中での遺伝子発現値を確実に反映することを
示す。

【図６】図６は、ホルマリン固定およびパラフィン包埋された、あるいは凍結された正
常または腫瘍性結腸および腫瘍性食道組織におけるＴＳ遺伝子発現レベルの比較
を示す。

【図７】図７は、５−ＦＵ／ＬＶに対するその応答が予めＴＳ遺伝子発現に連結された
患者からのパラフィン切片中で確定されたＴＳ／β−アクチン比を示す。

【図８】図８は、原発性結腸癌および同一患者において１年後に再発した肝臓転移のＦ
ＦＰＥ試料中の４つの悪性マーカー遺伝子（ＴＳ；チミジンホスホリラーゼ（Ｔ
Ｐ）；シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）；および血管内皮増殖因子（Ｖ
ＥＧＦ））の発現レベルを示す。これらのデータは、予測され得るように,４つ
の悪性疾患マーカーのうちの３つが転移腫瘍組織中で上昇されることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ダネンバーグ，ピーターアメリカ合衆国，カリフォルニア 91001，アルタデナ，ルビオクレストドライブ 3367 (72)発明者スウェンソン，スティーブンアメリカ合衆国，カリフォルニア 91007，アルカディア，ウエストラシエラドライブ 116 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA04 CA11 HA12 HA20 4B063 QA01 QQ02 QQ42 QQ52 QR08 QR31 QR41 QR56 QR62 QR66 QS12 QS13 QS25 QX02 4H045 AA20 CA40 GA01 GA15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】体液からの水性試料ではない生物学的組織サンプルからのＤ
ＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の回収方法であって、以下の：有効濃度のグアニジニウム化合物を含むカオトロピック溶液中の上記サンプル
を約5〜約120分間、約75〜約100℃の範囲の温度に加熱し、そして上記カオトロピック溶液から上記ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質を回収する
ことを含む方法。
【請求項２】加熱前に前記サンプルを再水和することをさらに含む、請求
項１に記載の方法。
【請求項３】加熱前に前記サンプルを均質化することをさらに含む、請求
項２に記載の方法。
【請求項４】水不溶性有機溶媒を用いた前記カオトロピック溶液からの抽
出により前記ＲＮＡが回収される、生物学的組織サンプルからＲＮＡを回収する
ための請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記水不溶性有機溶媒が本質的にクロロホルムからなる、請
求項４に記載の方法。
【請求項６】前記ＲＮＡを精製することをさらに含む、請求項５に記載の
方法。
【請求項７】前記ＲＮＡがエタノール沈降により精製される、請求項６に
記載の方法。
【請求項８】前記時間が約10〜約60分である、ＲＮＡを回収するための請
求項１に記載の方法。
【請求項９】前記時間が約30〜60分である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記温度が約85〜約100℃の範囲である、請求項１に記載
の方法。
【請求項１１】前記時間が約30〜約60分である、請求項１０に記載の方法
。
【請求項１２】前記グアニジニウム化合物が塩酸グアニジニウムである、
ＲＮＡを回収するための請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記グアニジニウム化合物がイソチオシアン酸グアニジニ
ウムである、ＲＮＡを回収するための請求項１に記載の方法。
【請求項１４】前記イソチオシアン酸グアニジニウムが約2〜約5 Mの濃度
で存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記イソチオシアン酸グアニジニウムが約4 Mの濃度で存
在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記カオトロピック溶液が約３〜６のｐＨをもつ、請求項
１３に記載の方法。
【請求項１７】前記カオトロピック溶液が約４のｐＨをもつ、請求項１６
に記載の方法。
【請求項１８】前記カオトロピック溶液が還元剤をさらに含む、ＲＮＡ回
収のための請求項１に記載の方法。
【請求項１９】前記還元剤がβ−メルカプトエタノールである、請求項１
８に記載の方法。
【請求項２０】前記還元剤がジチオトレイトールである、請求項１８に記
載の方法。
【請求項２１】前記ＲＮＡが、遺伝子の発現レベルを測定するために使用
される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】ホルマリン固定パラフィン包埋生物学的組織サンプルから
ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を回収する方法であって：上記サンプルを脱パラフィン化し；有効濃度のグアニジニウム化合物を含有するカオトロピック溶液中で上記サン
プルを、約５〜約１２０分間の時間期間にわたり約５０〜約１００℃の範囲内の
温度まで加熱し；そして上記カオトロピック溶液から上記ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質を回収する、ことを含む前記方法。
【請求項２３】加熱前に前記脱パラフィン化サンプルを再水和することを
さらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】加熱前に前記サンプルを均質化することをさらに含む、請
求項２３に記載の方法。
【請求項２５】前記ＲＮＡが、水不溶性有機溶媒による上記カオトロピッ
ク溶液からの抽出により回収される、生物学的組織サンプルからＲＮＡを回収す
るための、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】前記水不溶性有機溶媒がクロロホルムを含有する、請求項
２５に記載の方法。
【請求項２７】前記ＲＮＡを精製することをさらに含む、請求項２６に記
載の方法。
【請求項２８】前記ＲＮＡが、エタノール沈降により精製される、請求項
２７に記載の方法。
【請求項２９】前記時間期間が、約１０〜約６０分間である、ＲＮＡを回
収するための請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】前記時間期間が、約３０〜約６０分間である、請求項２９
に記載の方法。
【請求項３１】前記グアニジニウム化合物が、塩酸グアニジニウムである
、ＲＮＡを回収するための請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】前記グアニジニウム化合物が、イソチオシアン酸グアニジ
ニウムである、ＲＮＡを回収するための請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】前記カオトロピック溶液中の前記イソチオシアン酸グアニ
ジニウムの濃度が、約２〜約５Ｍである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】前記カオトロピック溶液が、約３〜６のｐＨをもつ、請求
項３２に記載の方法。
【請求項３５】前記カオトロピック溶液が、還元剤をさらに含有する、Ｒ
ＮＡを回収するための請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】前記還元剤がβ−メルカプトエタノールである、請求項３
５に記載の方法。
【請求項３７】前記還元剤がジチオトレイトールである、請求項３５に記
載の方法。
【請求項３８】前記ＲＮＡが、遺伝子の発現レベルを測定するために使用
される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３９】ホルマリン固定パラフィン包埋生物学的組織サンプルから
ＲＮＡを回収する方法であって：上記サンプルを脱パラフィン化し；有効濃度のグアニジニウム化合物を含有するカオトロピック溶液中で上記サン
プルを、約３０〜約６０分間の時間期間にわたり約７５〜約１００℃の範囲内の
温度まで加熱し；そして上記カオトロピック溶液から上記ＲＮＡを回収する、ことを含む前記方法。
【請求項４０】加熱前に前記脱パラフィン化サンプルを再水和することを
さらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】加熱前に前記サンプルを均質化することをさらに含む、請
求項４０に記載の方法。
【請求項４２】前記ＲＮＡが、水不溶性有機溶媒による上記カオトロピッ
ク溶液からの抽出により回収される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】前記水不溶性有機溶媒がクロロホルムを含有する、請求項
４２に記載の方法。
【請求項４４】前記ＲＮＡを精製することをさらに含む、請求項４３に記
載の方法。
【請求項４５】前記ＲＮＡが、エタノール沈降により精製される、請求項
４４に記載の方法。
【請求項４６】前記グアニジニウム化合物が、塩酸グアニジニウムである
、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】前記グアニジニウム化合物が、イソチオシアン酸グアニジ
ニウムである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】前記カオトロピック溶液中の前記イソチオシアン酸グアニ
ジニウムの濃度が、約２〜約５Ｍである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】前記カオトロピック溶液が、約３〜６のｐＨをもつ、請求
項４７に記載の方法。
【請求項５０】前記カオトロピック溶液が、還元剤をさらに含有する、請
求項３９に記載の方法。
【請求項５１】前記還元剤がβ−メルカプトエタノールである、請求項５
０に記載の方法。
【請求項５２】前記還元剤がジチオトレイトールである、請求項５０に記
載の方法。
【請求項５３】前記ＲＮＡが、遺伝子の発現レベルを測定するために使用
される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に計測する方法であって
：ホルマリン固定パラフィン包埋生物学的組織サンプルを脱パラフィン化し；上記脱パラフィン化されたサンプルを再水和し；約５のｐＨをもち、かつ、イソチオシアン酸グアニジニウムと還元剤を含有す
るカオトロピック溶液と前記再水和されたサンプルを併合し；約３０分間約９５℃の温度で上記サンプルと上記カオトロピック溶液の混合物
を均質化及び加熱し；水不溶性有機溶媒を用いた上記カオトロピック溶液からの抽出により上記サン
プルのＲＮＡを回収し；上記の回収されたＲＮＡを精製し；逆転写反応により上記の精製されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換し；少なくとも特定の配列を増幅するために好適なオリゴヌクレオチド・プローブ
、ポリメラーゼ、及び蛍光団を含有するポリメラーゼ連鎖反応溶液中で上記ｃＤ
ＮＡをＰＣＲ反応に供し；上記ＰＣＲ反応の結果としての蛍光の強度において生じる変化を計測し；そし
て上記蛍光の強度における変化に基づき、上記サンプル中に存在する特定の配列
をもつ核酸の量を測定する、を含む前記方法。
【請求項５５】前記カオトロピック溶液中のイソチオシアン酸グアニジニ
ウムの濃度が約３Ｍである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】前記還元剤が、ジチオトレイトールを含む、請求項５５に
記載の方法。
【請求項５７】前記水不溶性有機溶媒がクロロホルムである、請求項５６
に記載の方法。
【請求項５８】前記の回収されたＤＮＡが、エタノール沈降を用いて精製
される、請求項５７に記載の方法。