CN107271239A - 一种溶解石蜡组织切片的方法及应用 - Google Patents

一种溶解石蜡组织切片的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种溶解石蜡组织切片的方法，是在完成常规的第一次蛋白酶K孵育后，将孵育溶解体系升至高温后维持3‑5分钟后取出，待其冷却至室温，再向溶解反应体系中加入蛋白酶K，再孵育10‑30分钟即可使组织完全溶解消失。本发明专门针对较厚或较大量石蜡组织切片无法在短时间内彻底溶解消化的问题。采用本发明所述方法可将石蜡组织多量厚切片在3小时内完全消化溶解，使组织溶液澄清，不破坏核酸物质，无明显颗粒物。本发明方法显著缩短多量厚切片石蜡组织消化溶解所需时间，不破坏核酸物质，减少长时间孵育引起的核酸物质降解，使所提取核酸物质对整个切片组织具有更完整的代表性，可在溶解石蜡组织切片中应用。

Description

一种溶解石蜡组织切片的方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。涉及生物组织石蜡样本处理，尤其涉及一种溶解石蜡组织切片的方法，是一种溶解消化石蜡包埋组织切片的方法，特别适用于生物组织石蜡样本提取核酸物质时使用。
背景技术
肿瘤基因检测是当前热门的临床检验领域，通过对肿瘤组织DNA、RNA、miRNA等核酸物质检测可获得肿瘤的分子特征，从而预判肿瘤患者复发生存、治疗反应等临床特征。石蜡包埋肿瘤组织切片是最常用的肿瘤基因检测样本，如检测肺癌石蜡包埋组织DNA的EGFR突变可判断酪氨酸激酶抑制剂的疗效，检测乳腺癌21个基因的RNA表达量可判断是否需要术后化疗。在这些肿瘤基因检测中，一般需要从石蜡包埋组织切片中提取DNA或RNA进行检测。
石蜡包埋是常温长期保存组织蛋白和核酸分子的经典方法，几乎所有医疗机构均会采用石蜡包埋方法保存肿瘤组织。在石蜡包埋过程中，新鲜组织经过有机溶剂固定和逐步脱水，组织中水的成份被石蜡油替代，从而使生物分子得到完整保存。而在石蜡包埋组织提取DNA或RNA的过程中，则必须将组织中的石蜡成份溶解出，由水来替代，称为“脱蜡”。脱蜡的组织一般采用蛋白酶进行溶解消化，以释放出DNA和RNA等核酸物质。脱蜡和溶解的过程，一般由有机溶剂二甲苯和蛋白酶K来完成。
一般的石蜡切片组织要求厚度在5-6微米之间，薄的切片有利于二甲苯溶剂的渗透和蛋白酶K的消化，从而使提取更加彻底。但是在实际操作中，石蜡切片的厚度在不同医疗机构及不同切片操作员切取时会有较大差异。特别在进行一些核酸用量较大的基因检测如乳腺癌21基因表达定量时，检测者会要求切取较大量的石蜡组织，此时石蜡切片数量和切片厚度可能会显著增加。此时检测操作者会采用延长蛋白酶K孵育时间的方法消化溶解较大量的石蜡组织。一般石蜡组织核酸提取时蛋白酶K消化孵育的时间为15分钟到3小时，但对于切片较厚且数量较多的石蜡切片，即使延长蛋白酶K孵育时间至24小时也无法将其彻底溶解，容器底部仍然会残留固体组织。孵育时间的过度延长会使部分核酸物质出现降解，组织残余的存在不仅会使DNA和RNA提取量减少，而且会使已溶解消化部分组织所提取DNA和RNA对整个组织的代表性出现偏差，从而影响测定结果。
发明内容
本发明的目的是提供一种溶解石蜡组织切片的方法，是在完成常规的第一次蛋白酶K孵育后(一般孵育时间为60-120分钟)，将孵育溶解体系升至高温(80-90摄氏度之间)后维持3-5分钟后取出，待其冷却至室温，再向溶解反应体系中加入蛋白酶K，再孵育10-30分钟即可使组织完全溶解消失，无明显颗粒物，溶液清亮。
本发明方法的具体步骤如下：
(1)第一次酶解：在已脱蜡干燥的组织中注入适于蛋白酶酶解的溶液及蛋白酶组成酶解体系，在56摄氏度孵育60-120分钟；
(2)短时升温：完成第一次孵育后将其取出，立即置于高温下短时孵育；
(3)第二次酶解：再次向酶解体系中注入蛋白酶，混匀后在56摄氏度孵育10-30分钟，组织完全溶解；
(4)在第一次或第二次酶解孵育期间，用物理方法震荡松动正在酶解的组织1-2次。
其中步骤(2)所述短时升温中的高温是指80-90摄氏度。其短时升温中的短时是指3-5分钟。
其中步骤(4)所述物理方法震荡松动酶解组织，是指弹击酶解体系的容器壁或者上下快速震荡容器。
本发明的技术方案是采用短时升温二次酶解法。
本发明的另一个目的是提供所述方法在溶解石蜡组织切片中的应用。
本发明提供的一种消化溶解石蜡组织切片的方法，专门针对较厚或较大量石蜡组织切片无法在短时间内彻底溶解消化的问题。采用本发明所述方法可将石蜡组织多量厚切片在3小时内完全消化溶解，使组织溶液澄清，不破坏核酸物质，无明显颗粒物。本发明方法显著缩短多量厚切片石蜡组织消化溶解所需时间，不破坏核酸物质，减少长时间孵育引起的核酸物质降解，使所提取核酸物质对整个切片组织具有更完整的代表性。
附图说明
图1是短时升温二次酶解步骤示意图。
具体实施方法
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
参见图1，取两支同一蜡块切取的乳腺癌石蜡组织，标为A和B，两管组织量基本相同。A管和B管石蜡组织切片在经过相同的二甲苯脱蜡、酒精清洗和组织干燥后，其组织体积均约为5毫米×4毫米×6毫米(0.12毫升)。向含有待溶解干燥组织的A和B离心管内各加入200微升组织溶解液，溶解液配方为常规含SDS溶液。再向离心管A加入20毫克/毫升浓度的蛋白酶K溶液15微升，向离心管B加入相同的蛋白酶K溶液25微升，各自组成溶解反应体系。将含有溶解反应体系的离心管盖紧后在金属浴恒温仪上于56摄氏度进行第一次孵育。60分钟后观察组织溶解情况，可见两管均出现组织聚缩成团，组织溶解度无显著区别。将含溶解反应体系的离心管取出上下剧烈摇晃混匀，用手指弹击离心管底部使之混匀。混匀后A管和B管继续第一次孵育，孵育60分钟后再观察，此时观察到两管组织均呈松解状浑浊液，晃动离心管可见溶液中有棉絮样沉淀。此时，B管继续在56摄氏度恒温金属浴内孵育16个小时，A管则取出进行短时升温二次酶解操作。
另取一个金属恒温仪，调节温度至80摄氏度，待恒温仪到达设定温度后，将离心管A置入80摄氏度高温孵育5分钟，5分钟后立即取出置于室温，待其降温至30摄氏度以下后，打开离心管A盖子，向离心管A溶解反应体系内再加入20毫克/毫升浓度蛋白酶K溶液8微升，盖紧管盖。将离心管A置入56摄氏度恒温金属浴内进行第二次孵育，时间为30分钟。30分钟后取出离心管A，此时可观察到A管内溶解反应体系已无棉絮样沉淀或其他颗粒物，溶液清亮(图1)。后续进行常规80摄氏度高温孵育15分钟后，溶解反应体系更加清亮并透明，无需15分钟高速离心去除沉淀，直接可加入乙醇进行后续提取。最后得到880纳克/微升的RNA溶液共30微升，共获得26.4微克RNA。
B管在孵育16小时后，溶液反应体系内棉絮状沉淀物有少许减少，但整个反应体系仍呈浑浊状，对光透视可见溶液中仍然有明显颗粒物。后续80摄氏度高温孵育15分钟后，颗粒物有所减少，但溶液仍然浑浊。将B管在13000转/分下高速离心15分钟，离心后可见B管底部粘稠沉淀物，沉淀物上层有约120微升清亮液体，清亮液体与管壁接触部分亦有粘稠物质。小心将B管内上层清亮液转移至另一干净离心管内，加入乙醇进行后续提取，最后得到350纳克/微升的RNA溶液共30微升，共获得10.5微克RNA。
实施例2
参见图1，取一支含较多结直肠癌石蜡切片组织的离心管，在经过二甲苯脱蜡、酒精清洗和组织干燥后，其组织体积均约为8毫米×5毫米×10毫米(0.4毫升)。向含有待溶解干燥组织离心管内加入600微升组织溶解液，溶解液配方为常规含SDS溶液。再向离心管内加入20毫克/毫升浓度的蛋白酶K溶液25微升，组成溶解反应体系。将含有溶解反应体系的离心管盖紧后在金属浴恒温仪上于56摄氏度进行第一次孵育。60分钟后观察组织溶解情况，可见离心管内组织聚缩沉于底部。将含溶解反应体系的离心管取出上下剧烈摇晃混匀，用手指弹击离心管底部使之混匀，为第一次混匀，混匀后继续第一次孵育。孵育30分钟后再将离心管取出上下剧烈摇晃混匀，用手指弹击离心管底部使之混匀，为第二次混匀，混匀后继续第一次孵育。孵育30分钟后取出离心管，此时可见组织均呈松解状浑浊液，溶液中有棉絮样沉淀。
将金属恒温仪调节温度至90摄氏度，待恒温仪到达设定温度后，将离心管置入90摄氏度高温孵育5分钟，5分钟后立即取出置于室温，待其降温至30摄氏度以下后，打开离心管盖子，向离心管溶解反应体系内再加入20毫克/毫升浓度蛋白酶K溶液15微升，盖紧管盖置入56摄氏度恒温金属浴内进行第二次孵育，时间为30分钟。30分钟后取出离心管，此时可观察到管内溶解反应体系已无棉絮样沉淀或其他颗粒物，溶液清亮。
实施例3
参见图1，取一支含胃癌石蜡切片组织的离心管，在经过二甲苯脱蜡、酒精清洗和组织干燥后，其组织体积均约为5毫米×3毫米×4毫米(0.06毫升)。向含有待溶解干燥组织离心管内各加入200微升组织溶解液，溶解液配方为常规含SDS溶液。再向离心管内加入20毫克/毫升浓度的蛋白酶K溶液15微升，组成溶解反应体系。将含有溶解反应体系的离心管盖紧后在金属浴恒温仪上于56摄氏度进行第一次孵育。30分钟后观察组织溶解情况，可见离心管内组织聚缩。将含溶解反应体系的离心管取出上下剧烈摇晃混匀，用手指弹击离心管底部使之混匀。混匀后继续第一次孵育，孵育30分钟后取出离心管，此时可见组织均呈松解状浑浊液，溶液中有棉絮样沉淀。
将金属恒温仪调节温度至85摄氏度，待恒温仪到达设定温度后，将离心管置入85摄氏度高温孵育3分钟，3分钟后立即取出置于室温，待其降温至30摄氏度以下后，打开离心管盖子，向离心管溶解反应体系内再加入20毫克/毫升浓度蛋白酶K溶液10微升，盖紧管盖置入56摄氏度恒温金属浴内进行第二次孵育，时间为10分钟。10分钟后取出离心管，此时可观察到管内溶解反应体系已无棉絮样沉淀或其他颗粒物，溶液清亮。

Claims (5)

1.一种溶解石蜡组织切片的方法，其特征在于，在孵育时间为60-120分钟完成常规的第一次蛋白酶K孵育后，将孵育溶解体系升至80-90摄氏度，然后维持3-5分钟后取出，待其冷却至室温，再向溶解反应体系中加入蛋白酶K，再孵育10-30分钟使组织完全溶解消失，无明显颗粒物，溶液清亮。
2.根据权利要求1所述的一种溶解石蜡组织切片的方法，其特征在于，具体通过以下步骤实现：
(1)第一次酶解：在已脱蜡干燥的组织中注入适于蛋白酶酶解的溶液及蛋白酶组成酶解体系，在56摄氏度孵育60-120分钟；
(2)短时升温：完成第一次孵育后将其取出，立即置于高温下短时孵育；
(3)第二次酶解：再次向酶解体系中注入蛋白酶，混匀后在56摄氏度孵育10-30分钟，组织完全溶解；
(4)在第一次或第二次酶解孵育期间，用物理方法震荡松动正在酶解的组织1-2次。
3.根据权利要求2所述的一种溶解石蜡组织切片的方法，其特征在于，其中步骤(2)所述短时升温中的高温是指80-90摄氏度。其短时升温中的短时是指3-5分钟。
4.根据权利要求2所述的一种溶解石蜡组织切片的方法，其特征在于，其中步骤(4)所述物理方法震荡松动酶解组织，是指弹击酶解体系的容器壁或者上下快速震荡容器。
5.根据权利要求1或2所述的方法在溶解石蜡组织切片中的应用。
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