CN109996891A - 用于进行结肠癌和/或结肠癌前体细胞的早期检测和用于监测结肠癌复发的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测与结直肠癌相关的靶基因的所选区域中是否存在突变的试剂盒，该试剂盒包括XNA夹和引物；其中XNA夹能够与在靶基因中具有野生型序列的所选区域杂交，且引物能够扩增包含靶基因中的各个突变的所选区域。本发明还公开了检测与结直肠癌相关的突变基因的方法，其包括：提供包含DNA和能够杂交至野生型基因的异核酸夹的样品；以及用能够杂交至突变体基因的异核酸探针检测样品中基因突变体。
Description
本申请根据《美国法典》第35编第119节要求2017年1月5日提交的题为“MethodFor Conducting Early Detection Of Colon Cancer And/Or Of Colon CancerPrecursor Cells And For Monitoring Colon Cancer Recurrence”的美国临时专利申请第62/442,898号的优先权权益，将其全部并入本申请以作参考。
技术领域
本发明申请的技术领域是医药界，具体是分子生物学领域。更特别地，本发明阐明了一种用于结直肠癌的早期诊断的方法以及用于执行该方法的试剂盒。本发明进一步涉及用于疾病诊断的方法，该方法包括了对患者结肠癌的早期检测。更特别地，本发明还涉及下述方法：制备源自组织、粪便、循环DNA以及循环肿瘤细胞的样品用于疾病诊断(包括检测结肠癌)，由此确保和增加如果患者患有疾病(例如癌或癌前病变)则样品将包含诊断学相关信息的可能性，并且涉及不论样品来源的用于样品分析的方法。
本发明进一步涉及结肠癌和/或结肠癌前体细胞的非侵入式早期检测。本发明还涉及XNA夹和引物，其允许了以组合方式在响应于结肠癌的基因的所选区域中进行突变分析，涉及包括所述XNA夹和引物的试剂盒，并且还涉及所述引物和所述试剂盒在突变分析中的用途，特别是用于结肠癌和/或结肠癌前体细胞的早期检测。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是在检测病原体方面广泛使用的技术。该技术使用DNA聚合酶，其用于以体外酶法复制的方式扩增一段DNA。PCR法生产DNA(其被用作复制模板)。这导致指数型扩增该DNA模板的链式反应。
在基因组检测方面的技术最常使用：用DNA探针来与靶序列杂交。为实现所需的灵敏度，使用PCR来扩增靶序列在很多实验室中已经成为了标准实操。虽然PCR已经是识别与疾病状态相关的基因的主要方法，该方法仍保持局限于在实验室条件下使用。可用于实验室之外的最新诊断应用基于蛋白质靶抗体识别以及使用基于ELISA的技术来显示出疾病存在。这些方法是快速且相当稳健的，但是它们可能缺乏与核酸检测相关的特异性。
随着分子诊断学的出现和用于病状和疾病的诊断和治疗的众多核酸生物标记物的发现，核酸序列和序列变体、突变和基因多态性检测已经变得越来越重要。在很多情况中，有望在高的野生型序列背景下检测出以低拷贝数存在的序列变体或突变(它们在很多情况下区别在于单个核苷酸)。例如，由于越来越多的体细胞突变表现为针对癌症预后和治疗有效性预测的生物标记物，从样品中检测出罕见突变的、有效率且有效果的方法正变得越来越关键。在相比于野生型序列以低拷贝数存在一种或多种等位基因变体情况下，存在过量的野生型靶序列对检测相对不充足的变体靶序列提出了挑战。核酸扩增/检测反应几乎总是使用有限量的试剂进行。大大过量的野生型序列因此争夺和消耗有限的试剂。因此，在这些条件下对罕见突变或变体等位基因的扩增和/或检测被显著抑制，这些方法可能并不足够灵敏以检测出罕见变体或突变。已经尝试过克服此问题的各种方法。但是，这些方法并不理想，因为它们或需要使用针对各等位基因的独特引物，或需要进行繁琐的熔解曲线分析。这两个缺点都限制了下述能力和可行性：多重检测来自单个样品的多个变体等位基因。
另外还已知：结直肠癌是西方社会中的重要死亡原因。但是，如果得到早期诊断，该疾病可以通过手术移除癌组织得到有效治疗。结直肠癌产生于结直肠的上皮组织且在发展的早期阶段通常不是广泛血管化的(因此不是侵入性的)。人们认为，结直肠癌源自结肠或直肠的上皮层中的单个突变细胞的克隆性扩增。转变成高度血管化的、侵入性的并且最终遍及身体的转移性癌症通常耗时10年或更长时间。如果在在侵入发生之前就检测到癌症，癌组织的手术移除是有效治愈手段。但是，结直肠癌通常仅可在临床症状(诸如疼痛和黑柏油样便)显现之后才被检测到。一般仅当该疾病得到充分发展时(通常在已经发生转移之后)才存在这些症状，且患者预后差，甚至在对癌组织手术切除之后也是如此。结直肠癌的早期检测因此是重要的，因为检测可以显著降低它的病死率。
侵入性诊断方法(诸如内镜检查)允许潜在癌性生长(诸如息肉)的直接视觉识别、移除和活检。内镜检查是昂贵、不舒适、存在固有风险的，并且因此不是筛查人群以识别出患有结直肠癌人员的实操手段。指示出存在结直肠癌或癌初期的特征的粪便样品的非侵入式分析是早期诊断的优选替代方案，但是并没有可靠实现此目的的已知诊断方法可供使用。
基因突变与结直肠癌(CRC)
结直肠癌发病机理涉及复杂的信号通路(诸如WNT和RAS/RAF/MAPK通路)。在通路中成分的基因学和表观遗传学变化方面，已经就其在CRC的起始和发展中的作用进行了广泛研究。在下述几种癌症中发现了KRAS突变：包括结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、胰腺癌和胆管细胞癌。超过90％的KRAS突变位于外显子2的密码子12和13之中，其可导致经由p21-ras蛋白的、异常的生长信号传导。由于信号传导冗余，这些在细胞生长和分裂方面的变化可触发癌症发展。在很多结直肠癌患者中，也已检测出KRAS突变。
B型Raf激酶(BRAF)蛋白是丝氨酸/苏氨酸激酶，它们在调节MAP激酶/ERK信号传导通路方面具有重要作用，影响到细胞的增殖、分化以及细胞的程序性死亡。在很多人类癌症中常会发现BRAF突变：包括黑素瘤、结直肠癌、肺癌和乳头状甲状腺癌。BRAF中最常见的突变发生在密码子600中，在该处激酶结构域的活化区段中的氨基酸置换会造成蛋白质处于持续活化形式。在人类癌症中高频率发现V600E和V600K突变：对于V600E中是70-90％，对于V600K是10-15％。BRAF突变一般发现于KRAS为野生型的肿瘤中。
腺瘤性结肠息肉病(APC)基因是关键的肿瘤抑制基因，而且在大多数结肠癌中已经发现APC突变。该基因编码出多结构域蛋白，其结合于多种蛋白质：包括-连环蛋白，axin，CtBP，Asefs，IQGAP1，EB1和微管蛋白。大多数(～60％)与癌症关联的APC突变发生在称为突变簇生区域(MCR)的区域中并且导致蛋白质的C-端截止。肿瘤抑制基因APC中的突变导致连环蛋白的积累(该蛋白活化Wnt信号传导通路)，这会导致肿瘤发生。APC也在其它基础细胞过程中起作用：包括细胞的粘附和迁移，肌动蛋白和微管蛋白的组织，纺锤体形成和染色体分离。APC的突变引起这些细胞过程的去调节，这会导致结肠癌的起始和扩散。APC已被用作结肠癌早期检测的生物标记物。
β-连环蛋白基因(CTNNB1)也是Wnt通路中的重要成分。基因的调节性结构域(外显子3、密码子29-48)中丝氨酸或苏氨酸磷酸化位点中的突变导致基因产物(β-连环蛋白)的积累，这会活化Wnt通路。
附图说明
图1说明了本发明的突变检测试验的原理。
图2显示了在FFPE组织上经由本发明的化验生成的qPCR扩增曲线。
图3-6说明了：用理想的引物、探针、XNA浓度和ΔCt在野生型(Wt)和突变体之间进行化验的性能实施例。
图7显示了用β-肌动蛋白针对不同的DNA输入值的定量PCR，而且展示了本发明的化验中的PCR效率。
图8说明了DNA与同类XNA的沃森-克里克碱基配对。
图9显示了XNA夹如何检测出突变小于0.1％的DNA。
发明内容
本发明提供了一种检测包含在生物样品中的已知突变基因是否存在的方法，所述方法包括以下步骤：(1)使夹引物(其由与野生型基因的序列或与野生型基因互补的序列的靶位点的全部或部分杂交的XNA组成)、能够扩增包括具有所述突变基因的序列的靶位点的区域的引物、以及生物样品的混合物共存在于用于基因扩增的反应溶液中，并且经由基因扩增方法选择性地扩增包括所述突变基因的靶位点的区域，以及(2)通过基因检测方法使用在步骤(1)中获得的扩增产物或它的部分作为模板，选择性地检测包括所述突变基因的靶位点的区域，以检测所述经突变的基因是否存在。
本发明也涉及筛查患者的结直肠癌存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得来自所述患者的生物样品；和(b)使用异核酸夹(Xenonucleic acid clamp)进行筛查所述样品中的DNA突变的化验，以检测指示出结直肠癌存在突变。
本发明进一步涉及检测与结直肠癌相关的突变基因的方法，其包括：提供包含DNA和能够杂交至野生型基因的异核酸夹的样品；以及，用能够杂交至所述突变基因的异核酸探针检测所述样品中基因的突变体。
本发明另外提供筛查和/或监测患者的与结直肠癌相关的突变的方法，所述方法包括：从得自怀疑患有与结直肠癌突变相关的病状的患者的粪便样品、新鲜外周血(PB)、血浆以及福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)组织样品中分离出DNA；对提取出的DNA进行PCR以制备经扩增的DNA，同时使用异核酸夹来阻止野生型DNA的扩增；在自动测序仪中测序经扩增的DNA；分析自动测序仪的输出信号以识别出在所述序列中的突变。
本发明还提供了一种试剂盒，其用于检测与结直肠癌相关的靶基因在所选区域中是否存在突变，该试剂盒包括了XNA夹和引物；其中所述XNA夹能够与在靶基因中具有野生型序列的所选区域杂交，且所述引物能够扩增在所述靶基因中包含各个突变的所选区域。
本发明进一步提供了：包括新型异核酸夹的试剂盒。
具体实施方式
本发明是基于实时PCR的体外诊断化验，用于定性检测与结直肠癌相关的生物标记物，这些生物标记物包括APC(密码子877，1309，1367，1450，1465，1556)，KRAS(密码子12和13)，BRAF(密码子600)，CTNNB1(密码子41和45)和TGFBR2(密码子449)。该检测试剂盒识别在所述靶标区域中是否存在突变，但是不会指出该突变的确切内容。该检测试剂盒被设计用以：在不指出确切核苷酸变化的情况下检测在指定密码子位点处或者其附近的任何突变。
根据本发明的突变检测化验是基于异核酸(XNA)介导的PCR夹技术。异核酸(XNA)是人工合成的基因聚合物，其包含诸如以不同化学结构替换的核酸碱基、糖、或连接骨架的非天然成分。这种引入在更宽范围内选择有功能构建作用的区块的做法可实现：与XNA序列的DNA或RNA等同物相比，使它们能够参与在更宽范围选择的化学反应。XNA是人工合成的DNA类似物，其中磷酸二酯骨架已经由通过(2-氨基乙基)-甘氨酸单元形成的重复体代替。仅当互补DNA靶完全匹配时XNA才紧密杂交至互补DNA靶序列。使XNA结合于其靶序列的做法阻止了经由DNA聚合酶的链延伸。当在靶位点中存在突变、由此存在错配时，XNA:DNA双螺旋是不稳定的，这允许经由DNA聚合酶的链延伸。在把XNA(其序列具有与野生型DNA的完全匹配)添加到PCR反应中时阻止了野生型DNA的扩增，这允许了突变体DNA的选择性扩增。XNA低聚物不会被DNA聚合酶识别且不会被用作后续的实时PCR反应中的引物。
本发明涉及一种对结肠癌的复发进行早期检测和/或监测的方法以及针对结肠癌前体细胞的检测方法，本方法利用聚合酶链式反应(PCR)使用引物和异核酸(XNA)夹低聚物，用其可以在下述基因：APC、K-ras、β-连环蛋白B-raf和转化生长因子β受体II的所选区域中施行突变分析。本发明还涉及：一种包含所述引物和异核酸(XNA)夹低聚物的试剂盒；以及这些引物和异核酸(XNA)夹低聚物和用于分析突变的试剂盒的用途，它们特别用于实行结肠癌的复发的早期检测和/或监测以及对结肠癌前体细胞的检测。
本发明进一步公开了为了分析源自结直肠癌肿瘤组织活检的肿瘤DNA中的突变而循环游离肿瘤DNA的手段和方法，所述DNA源自患者血浆样品或者源自粪便样品。
本发明使用下述核酸分子低聚物，其通过沃森-克里克碱基配对杂交至靶DNA序列，然而具有经修饰的化学骨架。异核酸低聚物(图8)在杂交至靶序列方面非常有效，并且可以在定量实时聚合酶链式反应(PCR)中用作分子夹或当作高特异性的分子探针用于检测核酸靶序列。
本发明允许了筛查体细胞突变的新途径，该途径利用了抑制野生型模板DNA的PCR扩增的、序列特异性的XNA夹。该夹允许了选择性的(仅突变体模板的)PCR扩增，其允许了在大为过量的野生型模板(来自多种样品：包括FFPE、液体活检以及习惯上具有挑战性的细胞学样品)存在下检测出突变体DNA。
用于qPCR的分子夹是包含天然A、T、C、G或经修饰核苷(15至25nt长)的人工合成低聚物，并且具有亲水性的和中性的骨架(没有像PNA那样的磷酸基团)，并且通过沃森-克里克配对经历杂交。XNA的益处包括对任何已知核酸酶的抗性、高得多的结合亲和力，这是因为DNA结合对于盐浓度的独立性以及单核苷酸(SNP)的大的熔解温差(ΔTm＝15-20℃，其对于天然DNA为5-7℃)和插入/缺失(indels)。
根据本发明的化验利用了序列特异性夹(异核酸XNA探针)，该夹抑制了野生型DNA模板的PCR扩增，并且选择性地仅扩增突变体模板。根据本发明的化验和试剂盒展示了一种快速、可重复的解决方案，该方案使用简单的工作流程以及在研究的和临床的实验室中常用的PCR机器。
可用于本发明的异核酸包括选自以下的官能团：叠氮基，氧杂氮杂和氮杂。很多XNA被公开于申请日：2017年10月17日提交的待审美国申请第15/786,591号；将其全部内容并入本申请以作参考。
用于实行根据本发明的化验的生物样品包括但不限于：全血、淋巴液、血清、血浆、口腔细胞、汗液、泪液、唾液、痰液、头发、皮肤、活检物、脑脊液(CSF)、羊水、精液、阴道分泌物、浆液、滑膜液、心包液、腹膜液、胸膜液、渗出液、分泌液、胆囊液、胆汁、尿液、胃液、肠液、排泄物样品以及棉签标本、抽出物(例如骨髓、细针等)、清洗物(例如口腔的、鼻咽的、支气管的、支气管肺泡的、眼睛的、直肠的、小肠的、阴道的、表皮的等)和/或其它样本。
任何组织或体液样本都可以作为用于该技术的核酸来源来使用，所述样本包括法医样本，存档样本，保藏样本和/或长期储存的样本，例如新鲜冷冻的、甲醇/乙酸固定的、或经福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)样本和样品。核酸模板分子也可以从经培养的细胞(诸如原代细胞培养物或细胞系)中分离出。可以获取模板核酸的细胞或组织可以用病毒或其它的胞内病原体感染。样品也可以是从生物样本、cDNA文库、病毒DNA或基因组DNA提取出的总RNA。样品也可以是来自非细胞来源的经分离的DNA，例如已经储存在冰箱中的经扩增的/经分离的DNA。
核酸分子可以如下获得：例如通过从生物样品中提取，例如通过多种技术(诸如描述于以下的那些)：Maniatis等人的(1982)分子克隆:实验室手册，冷泉港，纽约(参见例如第280-281页)。
XNA-PCR化学也是极为可靠的工具，而且它是提供0.1％或更低的检测灵敏性(该水平无法通过微滴式数字PCR和Sanger测序实现)的唯一技术。该化验对于多数样本都可以在2小时内完成，所述样本包括实体瘤(例如FFPE组织)和液体活检物(例如循环肿瘤DNA)。
被引物和XNA访问的突变：
KRAS密码子12的任何同义突变(除了野生型)GGT--->GXT，XGT等；Gly--->Asp，Ser，Vol，Arg，Ala，Cys
KRAS密码子13-GGC-->GAC Gly>Asp
BRAF密码子600 GTG-->GAG，V600E(V600K，D，R或M)
CTNNB1
密码子33 TCT--->TAT，Ser-->Tyr,
密码子41 ACC>GCC Thr>Ala,,ACC>ATC Thr>Ile
密码子45 TCT>CCT Ser>Pro，TCT>TTT Ser>Phe
APC密码子1309 delAAAAG
密码子1367 CAG>TAG Glu>Stop
密码子1450 CGA>TGA Arg>Stop，7bp del
密码子1465 delAG
密码子1556 insA，delA
密码子877
TGFBR2 c449_458delp.E150fs
被设计用以扩增包含靶基因中每个靶突变的区域的引物与以下野生型序列特异性PCR夹低聚物一起使用：肽核酸(PNA)锁核酸(LNA)，桥接核酸(BNA)或更优选为之前公开的异核酸夹低聚物(参见DiaCarta的XNA专利申请)。进行PCR反应，作为结果生成的扩增子通过基于实时荧光的PCR使用SYBR绿色插入染料或荧光5'-核酸外切酶水解探针(taqman)来检测。或者，所述扩增子可以使用序列特异性杂交捕获及检测以及固相分离技术来检测。
用被设计用以扩增管家基因(诸如β-肌动蛋白(ACTB))的引物与基因突变特异性引物一起进行PCR夹反应。管家基因提供了监测输入DNA的质量和数量的手段，所述输入DNA得自结肠癌组织活检样品、患者血浆中的循环游离肿瘤DNA或者从患者粪便样品中提取的肿瘤DNA。
实施例
实施例I
用于粪便样品制备的试剂。
QIAamp DNA粪便微型试剂盒。Ca#51504。有效用于50×200mg的粪便样品。
用于大规模(总粪便)制备的Qiagen试剂：
缓冲液ASL.Ca#1014755。缓冲液AL，Ca#1014600，缓冲液AW1Ca#1014792，缓冲液AW2Ca#1014592，InhibitEx片剂，Ca#19590，RNAseA Ca#1007885，蛋白酶K Ca#19131。我们的储存缓冲液：10mM NaCl，500mM TrisHCl pH9.5，100mM EDTA。中和缓冲液：1M MES pH5.76(Teknova)。硅土maxi离心柱。Epoch Biosciences(Ca#2040-050)。涂有链霉亲和素的磁珠MyOne(Thermo Fisher Scientific，Ca#00351575)对于DNA捕获是最好的。20XSSC缓冲液。Beckman Coulter Sorvall离心机，其带有JA25.50转子以及带有螺旋帽的50ml离心管(Ca#357003)。BeckmanCoulter AllegraX-15台式离心机，具有SX4750转子用于maxi柱。
以下描述的过程是针对由患者添加的储存缓冲液覆盖的总粪便。如果粪便处于冻结状态，我们推荐切取10×2g的片并添加10体积(20ml)的ASL缓冲液到每个片。使粪便解冻并如下所述继续处理。
添加最小体积的储存缓冲液到新鲜粪便-仅盖住粪便表面即可(无需更多！)。用玻璃棒混合悬浮液几分钟，使其更均匀。封闭容器并在室温下温育16-24h。
确定粪便浓度。
混合粪便并转移2-3勺的粪便悬浮液到带刻度的50ml锥形管中，以确定等分液的体积。
以～20000g离心分离等分液5min。丢弃上清液并确定小丸的重量。
实施例
丢弃含有小丸的试管。
为从2g粪便开始DNA纯化，获取2g/0.55g/ml＝3.6ml的液体粪便。这是为了以200mg(使用360μl粪便)开始。
从在储存缓冲液中的200mg粪便分离人DNA。
本流程是Qiagen的QIAamp规程的修改版。此版是针对训练的目的而推荐的。它是快速的且可以使用DNA粪便微型试剂盒(Ca#51504)进行。混合液体粪便并转移360μl(200mg)到15ml带刻度的锥形管中。添加3.6ml(10倍体积)的ASL缓冲液。涡旋震动。在室温下温育5min。添加360μl 1M MES pH5.76缓冲液。涡旋震动。体积＝4.32ml。
将2ml×2分配到两个2ml离心管中。在台式离心机中以10000-13000g离心分离5min。在15ml锥形管中合并上清液。添加lμl的RNAseA(100mg/ml，Qiagen)。混合并温育5min。添加1个InhibitEx片剂(Qiagen)。涡旋震动约1min，直到片剂完全分散。将全部混合物转移到两个2ml试管中。以13000g离心分离5min。在15ml锥形管中合并上清液。添加25μl蛋白酶K。混合。添加等体积的AL缓冲液。混合。在70℃在水浴中温育20min。将混合物冷却至室温。添加体积等于AL缓冲液的乙醇。
混合。重复装载0.7ml混合物到硅土柱上。(这里可能进行多于10次的装载。参见试剂盒的说明书中的详细描述)。
简单来说：
a)以6000g进行样品的各个装载，进行1min。
b)洗涤。500μl的AW1缓冲液，以6000g进行1min。
500μl的AW2缓冲液，以10000g进行1min，两次。
c)以13000g离心分离干燥柱，进行2min。
d)洗脱。装载50-100μl的AE缓冲液到硅土柱上，温育1min。以13000g离心分离，进行2min。
从储存缓冲液中的2g粪便中分离出人DNA。
混合液体粪便并转移3.6ml(2g)到50ml带刻度的锥形管中。添加36ml(10倍体积)的ASL缓冲液。涡旋震动。在室温下温育5min。添加3.6ml的1M MES pH5.76缓冲液。涡旋震动。体积＝43.2ml。将混合物转移到50ml离心管(Beckman Coulter，Ca#357003)中。以20000g离心分离10min。将上清液收集在50ml锥形管中。添加4μl RNAseA(100mg/ml，Qiagen)。混合并温育5min。添加4个InhibitEx片剂(Qiagen)。涡旋震动约1min，直到片剂被完全分散。将全部混合物转移到50ml离心管中。以20000g离心分离10min。将上清液收集在50ml锥形管中。添加250μl蛋白酶K。混合。添加等体积的AL缓冲液。混合。在70℃在水浴中温育20min。将混合物冷却至室温。添加体积等于AL缓冲液的乙醇。
选项1：
1.使用来自PromegaRSC全血DNA试剂盒的珠瓶的珠
1.1.使珠混合物重新悬浮在试剂盒筒的第2个孔，和
1.2.将珠混合物的全部内容物转移至来自步骤3.7的溶液中
1.3.在定轨摇床上以中等速度在室温下温育0.5小时，以使NA(核酸)结合于NA结合珠。
1.4.用磁体将珠拖下(可选：离心沉降并丢弃上清液)。用珠储存了约500μl的上清液。
1.5.将珠悬浮液转移到试剂盒筒的珠隔室中并进行针对特定试剂盒的程序。
1.6.使用150μl洗脱体积。
DNA准备好用于qPCR。
选项2：
混合。重复装载～20ml混合物到一个插入了50ml锥形管的Maxi硅土柱上。(这里可能进行多于5次装载)。
a)在"Allegra X-15R离心机(筒转子SX4750，Beckman Coulter)中以1850g进行各个样品的装载，进行3min。
b)洗涤。5ml的AW1缓冲液，以4500g进行1min。
5ml的AW2缓冲液，以4500g进行15min。
d)洗脱。装载1ml的AE缓冲液到硅土柱上。温育5min。以4500g离心分离2min。
在序列依赖性捕获之前，对从2g粪便分离的DNA进行浓缩
从maxi柱洗脱的DNA的体积为约700μl。通过在95℃加热5min使DNA变性。
DNA的沉淀
将DNA转移到2ml离心管中。添加70μl的5M NaCl+70μl的5N NH4Ac+700μl异丙醇。在室温下温育1h。通过在台式离心机中以13000g离心15min使DNA沉淀。用70％EtOH洗涤小丸。在55℃下干燥小丸5min。将DNA溶解在35μl的10mM Tris pH8.0中。
用靶特异性捕获5'-BIO探针富集从磁珠上洗脱的DNA。
将35μl洗脱的DNA放入0.2ml管中并在带有预加热盖的热循环器中在95℃下温育2分钟。将管在冰上冷却2分钟。将经变性的DNA转移到新的0.2ml管中。按下表所示组装杂交混合物。
| 组分 | 体积μl | 最终浓度 |
| DNA | 30 | |
| 1μl捕获探针 | 1.5 | 33nM |
| 20ⅹSSC | 15 | ～7X(1M NaCl) |
在热循环机中进行杂交：在95℃下进行4min—在58℃下进行1h。
在杂交过程中制备磁珠。
洗涤磁珠。
在瓶中涡旋震动珠20秒。将10μl(109珠)转移到0.5ml试管的底部。将管在磁体上放置1min。去除覆盖在经浓缩的珠上的液体。从磁体上移走试管。添加100μl的1ⅹB&W缓冲液并通过温和抽吸使珠悬浮。将管放在磁体上。用50μl的lⅹB&W重复洗涤步骤。用50μl的lⅹB&W覆盖珠以防止珠干燥。
捕获磁珠上的杂交产物。
将含有覆盖有lⅹB&W的经洗涤的珠的试管放在磁体上并在不对珠造成干扰的情况下移除上清液。从磁体上移走试管并立即使珠悬浮在10μl的B&W缓冲液中。从热循环机中移走杂交后混合物。添加7μl经洗涤的珠。通过温和抽吸使珠悬浮。把试管放进振动器中在1100rpm下进行2个小时。振荡速度应该足够高，从而不会使珠沉淀。
洗涤带有捕获住的DNA的珠。
在磁体上收集珠。抽吸上清液。使珠悬浮在100μl B&W中。
用50μl的B&W重复该洗涤步骤。用悬浮在50μl的10mM NaCl+20mM TrisHCl pH7.5(高严格度洗涤缓冲液)中的珠重复该步骤。
从所述珠上洗脱DNA。
从珠上抽吸低严格度洗涤缓冲液。使珠悬浮在20μl的20ng/μl polyA或其它均聚物载体中。将试管放进热循环机中并在70℃下加热5min以洗脱DNA。将试管放在磁体上并收集～20μl经捕获的人DNA。
生物素化的捕获探针的序列
实施例II
把从具有已知的临床和突变状态的患者的血浆和FFPE中提取的DNA的55个盲样以15μl等分液分配至微离心管中。一些样品来自结肠癌患者的肿瘤组织。在试管的侧面将样品标记为ID#从1至55。
试验的目的是检测结肠癌患者的血浆中的突变。根据登记入册和样品可追溯性的SOP(标准操作规程)登记样品。
通过使用来自化验内部对照的参比扩增子用qPCR检查DNA的数量和qPCR就绪状态。然后相应地稀释样品并使用所述化验进行试验。任何靶突变的所有阳性召寻(positivecalls)通过扩增子的Sanger测序来确认。
1.方法
用于检测突变的技术
根据本发明的结直肠癌突变检测试剂盒基于异核酸(XNA)介导的PCR夹技术。XNA是人工合成的DNA类似物，其中磷酸二酯骨架已经由通过(2-氨基乙基)-甘氨酸形成的重复单元代替。仅当互补DNA靶是完全匹配的时XNA才紧密杂交至互补DNA靶序列。使XNA结合于其靶序列的做法阻止了经由DNA聚合酶的链延伸。当在靶位点中存在突变、由此存在错配时，XNA:DNA双螺旋是不稳定的，这允许了经由DNA聚合酶的链延伸。将XNA(其序列具有与野生型DNA的完全匹配)添加到PCR反应中阻止野生型DNA的扩增，这允许了对突变体DNA的选择性扩增。XNA低聚物不会被DNA聚合酶识别且无法用作后续的实时PCR反应中的引物。该qPCR检测是基于Taqman的。
qPCR化验
根据本发明的化验是基于实时PCR的体外诊断化验，其用于定性检测结直肠癌相关的生物标记物，包括APC(密码子1309，1367，1450)，KRAS(密码子12和13)，BRAF(密码子600)和CTNNB1(密码子41和45)。检测试剂盒识别靶标区域中是否存在突变，但是不会指出突变的确切内容。该检测试剂盒被设计用以在不指出确切核苷酸变化的情况下检测出在指定密码子位点处或者其附近的任何突变。
表1.在本发明的靶基因中发现的突变及其Cosmic识别号的列表
KRAS
APC
CTNNB1
BRAF
以上表1显示了通常可以在通过试剂盒检测到的靶基因中找到的突变的列表。化验和试剂盒由训练有素的实验室专业人员在实验室环境内使用。
表2.所使用的试剂和仪器
所需材料
用于DNA分离的试剂
QIAamp DSP DNA FFPE组织试剂盒(QIAGEN，Cat.No.60404)或等同物
QIAamp循环核酸试剂盒(QIAGEN，Cat.No.55114)或等同物
耗材
0.2ml无DNase的PCR试管或板、不含核酸酶的低结合的微离心管和带有气溶胶屏障的不含核酸酶的移液吸头。
设备
永久标记物，实时PCR仪器，用于样品制备的专用移液管*(可调节)，用于PCR主混合物制备的专用移液管*(可调节)，用于分配模板DNA的专用移液管*(可调节)，微离心管，配有用于1.5ml试管的转子的台式离心机*，涡旋震动器，PCR架，试剂储器，蒸馏水。
*在使用之前确保仪器已经根据制造商的推荐得到维护和校准。
仪器
化验已经在下表所示的仪器上开发和验证。表中未列的仪器平台应该由实验室各自验证。验证指导可以应要求自DiaCarta获得。
表3.用本试剂盒的验证的仪器列表。
| 公司 | 型号 |
| Roche | Light cycler 96 |
| Roche | Light cycler 480 |
| Bio-rad | CFX384 |
| ABI | QuantStudio 5 |
本发明的试剂盒应该在收到之后立即在-20℃储存在恒温冰箱中并做避光保护。当在指定的储存条件下储存时，直至规定的有效期限试剂盒都是稳定的。推荐将PCR试剂(Box 1和2)储存在扩增前区域，将对照品(Box 3)储存在扩增后(DNA模板处理)区域中。该试剂盒可以经历直至6个冻融循环而不会影响性能。
DNA分离
在使用前必须从固定的石蜡包埋的组织、冷冻的组织或血浆中提取出人基因组DNA。对于DNA分离存在几种方法。为了一致，我们推荐使用商业试剂盒，诸如Qiagen DNA提取试剂盒(QIAamp DNA FFPE组织试剂盒，cat No.56404，用于石蜡包埋的样本；DNeasy血液和组织试剂盒，cat.No.69504或69506，用于组织和血液样本，QIAamp循环核酸试剂盒，cat.No.55114，用于血浆)。根据制造商规程进行基因组DNA的分离流程。可以从FFPE块或新鲜冷冻切片以及血浆(约2-10μg)中分离出足量的DNA。
该化验需要总共22.5-35ng DNA/样品(2.5-5ng/反应)。在DNA分离之后，使用荧光分析(即，Qubit)测量浓度并稀释至1.25-2.5ng/μl。如果使用分光光度分析，则要确保A260/A230值大于2.0且A260/A280值在1.8至2.0之间。
试剂的制备
24-试验试剂盒具有对于3次运行而言足够的对照材料。融解所提供的所有引物和探针混合物、XNAs、阳性对照、WT阴性对照、不含核酸酶的水和2×PCR主混合物。在室温融解所有反应混合物，最少要30分钟。涡旋震动所有组分(除了PCR主混合物以及引物和探针混合物)5秒，并进行快速离心分离。应该通过将试管颠倒几次来温和混合PCR主混合物以及引物/探针混合物。在使用之前确保：PCR主混合物中的所有沉淀物通过吸上/吹下数次而得到再悬浮。不要使试剂盒组分在室温下置留超过2小时。以10μl/反应的总体积建立PCR反应。
表4显示每个10μl反应的组分体积。
| 组分 | 体积/反应 |
| 2×PCR主混合物 | 5μl |
| 引物和探针混合物 | 2μl |
| XNA | 1μl |
| DNA样品或对照 | 2μl |
| 总体积 | 10μl |
为了精确，应该将2×PCR主混合物、引物和XNA预混合为化验混合物，如下在表5所示。
制备化验混合物
化验混合物应该在即将使用之前制备。为每个反应混合物标记微离心管(未提供)，如表5中所示。对于每个对照和突变检测反应，根据表5中的体积，制备如下足够的化验工作混合物用于所述DNA样品：一个阳性对照、用于非模板对照品(NTC)的不含核酸酶的水以及一个WT阴性对照。包括用于1个额外样品的试剂以允许PCR建立的足够超额。化验混合物包含除样品外PCR所需的所有组分。
表5.制备化验混合物。
注意：n＝反应的数目(DNA样品+3个对照)。制备足够用于1个额外样品(n+1)以允许用于PCR建立的足够超额。当处理较大数目的样品时，人们会希望将混合物的体积增加到(n+2)。
每次运行化验时，必须为每个反应混合物运行阴性对照、阳性对照以及非模板对照。
阴性对照：
·使用以2.5ng/μl浓度商业化提供的野生型人基因组DNA作为模板。
·不含靶突变，用XNA夹来有效结合，该夹抑制了靶扩增。
阳性对照：
·用于在2.5ng/μl WT人基因组DNA(hgDNA)中以5％等位基因频率化验的每个靶的人工合成参比突变体模板的混合物。
·XNA夹不会结合，允许突变体模板的扩增。
·阳性对照必须显示在HEX和FAM通道两者中的适当的值，用于使运行有效。
非模板对照品(NTC)：
·使用不含核酸酶的水代替模板
·在HEX和FAM通道两者中荧光都不会观察到扩增，确保在化验建立过程中不存在污染物。
内部对照化验使用ACT-B管家基因作为参比基因以评价可扩增的DNA的质量并显示所述试剂是否正确工作。当使用HEX通道进行评价时，该对照应该对所有样品和对照(除了NTC)都高效地制备扩增子，这提供了另一种途径来监测引物、探针、聚合酶的性能以及样品DNA的质量/数量。
请总是使用白色的板、条或试管。在扩增前区域中添加8μl适宜的化验混合物到板或试管。在指定的模板区域中添加2μl模板到每个孔。
表6.建议的板布局。
PC：阳性对照，NTC：非模板对照品(水)，CC：阴性对照品(野生型DNA)，S1-3：样品1-3
表6是对于分析3种未知样品的单个实验所建议的板设置。对于以下列出的所有化验混合物中并非你的试剂盒的部分，请忽略。在任何试剂已被添加到板时，紧密地密封好该板以防止蒸发。以1000rpm离心分离1分钟以收集所有试剂。立即放进实时PCR仪器中。
仪器设置
Roche Light cycler 96和Light cycler 480，Bio-Rad CFX 384和ABIQuantStudio 5
1)检测器的选择：
i.使用'FAM/HEX'作为Roche light cycler上的检测器
ii.选择'所有通道'作为Bio-Rad CFX384上的检测格式
iii.对于ABI QuantStudio 5，指派个体突变靶作为'FAM'，选择所有靶并指派给VIC
2)设置表7a或表7b中所示的循环参数
3)启动运行
表7a.Roche Light Cycler和Bio-Rad CFX 384平台循环参数
*在Bio-Rad CFX 384上采用默认斜率速率
表7b.ABI QuantStudio 5循环参数
实时PCR结果的评价
实时PCR仪器为每个样品生成循环阈值(Cq，也称为Ct)。Cq是当检测到信号高于荧光的设定阈值时的循环数。信号升至背景以上时的循环数越低，则代表PCR反应越强，以及初始模板浓度越高(**对于更多信息请参见MIQE指南)。
·Light Cycler 480的数据分析
对于Light Cycler 480，打开LightCycler480 SW 1.5.1.61并选择Abs Quant/2nd导数最大算法以分析运行文件数据。
·Bio-Rad CFX384的数据分析
对于BioRad CFX384，使用BioRad CFX manager打开qPCR运行文件。在对数标尺视图中，对于HEX将阈值调整至100±20，对于FAM将阈值调整至300±60。将Cq输出至excel。对于各个仪器精确阈值的设置可以不同。
·ABI QuantStudio 5的数据分析
对于ABI Quant Studio 5仪器，根据表8调整阈值。对于各个仪器精确阈值的设置可以不同。
将Cq输出至excel。为每个对照或样品如下计算突变化验和内部对照化验之间的Cq值的差值：Cq差值(ΔCq)＝突变化验Cq-内部对照化验Cq。
表8.ABI QuantStudio 5推荐的阈值
| 靶 | 推荐的阈值 |
| ACT-B(内部对照) | 5900±600 |
| APC c1309/1367 | 100000±10000 |
| APC c1450 | 20000±2000 |
| CTNNB1 c41 | 20000±2000 |
| CTNNB1 c45 | 8000±800 |
| KRAS c12 | 20000±2000 |
| KARS c13 | 20000±2000 |
| BRAF c600 | 20000±2000 |
对照品的求值
核实：在每个反应混合物的非模板对照品(NTC)中都没有观察到扩增。Cq应该是未确定的。为每个对照品或样品如下计算突变化验和内部对照化验之间的Cq值的差值：Cq差值(ΔCq)＝突变化验Cq-内部对照化验Cq
阴性和阳性对照：对于有效的化验，阴性对照合阳性对照必须满足表9a和表9b中的标准。
表9a.在Roche Light Cycler 480和Bio-Rad CFX384上的阳性对照和阴性对照的可接受的值
| 化验 | 阳性对照 | 阴性对照 |
| 内部对照 | 25<Cq<31 | 25<Cq<31 |
| APC 1309/1367 | ΔCq≤4.7 | ΔCq>20.7 |
| APC 1450 | ΔCq≤2.6 | ΔCq>9.8 |
| CTNNB1 41 | ΔCq≤0 | ΔCq>7.1 |
| CTNNB1 45 | ΔCq≤3.4 | ΔCq>7.3 |
| KRAS12 | ΔCq≤6 | ΔCq>10.6 |
| KRAS 13 | ΔCq≤3.3 | ΔCq>7.3 |
| BRAF V600 | ΔCq≤2.4 | ΔCq>7.5 |
表9b.在ABI QuantStudio 5上的阳性对照和阴性对照的可接受的值
| 化验 | 阳性对照 | 阴性对照 |
| 内部对照 | 25<Cq<30 | 25<Cq<30 |
| APC 1309/1367 | ΔCq≤4.6 | ΔCq>20.3 |
| APC 1450 | ΔCq≤3.4 | ΔCq>9.4 |
| CTNNB1 41 | ΔCq≤0.5 | ΔCq>7.2 |
| CTNNB1 45 | ΔCq≤3.1 | ΔCq>7.5 |
| KRAS12 | ΔCq≤4.2 | ΔCq>13.2 |
| KRAS 13 | ΔCq≤5.7 | ΔCq>10.0 |
| BRAF V600 | ΔCq≤3.7 | ΔCq>7.6 |
基于内部对照结果对样品数据的有效性进行评估
将每个孔中内部对照混合物的Cq值用作DNA的纯度和浓度的指示。因此，试验的有效性可以通过内部对照混合物的Cq值确定。任何样品与内部对照混合物的Cq值应该在25<Cq<31(Roche Light cycler 480和Bio-Rad CFX 384)或25<Cq<30(ABI QuantStudio 5)的范围内。如果Cq值落入该范围外，应该认为试验结果无效。应该按照表10中的推荐重复该实验。
表10.可接受的样品内部对照Cq的范围
对突变状态进行评分
如果Cq值是未确定的，则Cq指派为50并进行分析。下表应该用于基于ΔCq值确定突变状态。
注意：如果FAM的Cq值为50，突变状态将被评分为"阴性"，而不管ΔCq值。
表11.对于Roche Light Cycler 480对突变状态进行评分
表12.对于Bio-Rad CFX384对突变状态进行评分
表13.对于ABI QuantStudio 5对突变状态进行评分
区分KRAS c12 KRAS c13突变状态
KRAS c12反应混合物检测KRAS c12和KRAS c13突变两者，而KRAS c13反应混合物仅检测KRAS c13突变。因此，为了区分KRAS c12和KRAS c13突变，应该按照以下表14所述使用得自两种混合物的结果的组合。
表14.G12/G13突变状态的解释
化验的性能特征
在Roche LightCycler 96、Roche LightCycler 480、Bio-Rad CFX 384和ABIQuantStudio 5实时PCR仪器上确立所述化验的性能特征。该研究使用来自得自HorizonDiscovery(Cambridge，England)的具有确定突变的细胞系的在基因上限定的参比标准品(基因组DNA和FFPE)和得自SeraCare(Massachusetts，US)的cfDNA参比标准品进行。这些样品已经在基因上表征为在相应的靶区域的编码序列中包含杂合的或纯合的突变。靶区域中的这些单核苷酸多态性已经通过基因组DNA测序和/或ddPCR确认。另外的样品由癌症患者组织、血浆样品和来自组织和血浆的正常健康供体DNA组成。
再现性
用具有已知突变状态和等位基因频率的基因组DNA的、经限定的分析水平来确定所述化验的再现性。
·为确立批次间差异，使用三个不同批次的试剂盒进行再现性研究。在RocheLC480和Bio-Rad CFX 384仪器上，基于一个野生型对照和分别包含5％和1％的等位基因频率的突变的两个参比样品以9次重复测试每个批次。
·对于由相同使用者在相同仪器上测试的相同批次的试剂确立化验间％CV。
·通过在参比样品上的试剂盒性能重复9次确立化验内％CV。
·用一个批次的试剂、两位操作员来对操作员差异性进行评价。
对于在两个批次上的所有化验和对于Roche和Bio-Rad仪器的操作员，基于Cq值的％CV和％正确突变召寻(call)的速率证明再现性。
表15.再现性结果的总结
| 差异性 | ％CV |
| 化验内 | ≤3％ |
| 化验间 | ≤4％ |
| 批次间 | ≤4％ |
| 操作员 | ≤3％ |
表16.在Roche LC480上的化验内再现性结果。
化验间数据展示了良好的再现性(带有低的％CV)(表16)。
分析灵敏度和检出限(LOD)
为确定该试剂盒的检出限(LOD)和分析灵敏度，在野生型背景中使用系列稀释的突变体DNA(参比FFPE和cfDNA)进行该研究。用于稀释的野生型DNA分别得自不含突变体的FFPE和正常人类血浆。所测试的突变体等位基因频率在2.5、5和100ng/反应的DNA输入水平时为1％、0.5％和0.1％。处于不同DNA输入水平的以1％、0.5％和0.1％等位基因频率存在于基因组DNA中的突变体拷贝数在表17a中示出。
表17a.处于不同等位基因频率的突变体DNA拷贝数
表17b.使用基因组DNA参比标准品确定的LOD的总结
表17c.使用cfDNA参比标准品确定的LOD的总结
结论：
·所有靶都可以按1％等位基因频率在5ng DNA输入值/PCR反应进行检测；
·对于FFPE DNA样品，APC 1309、APC 1307、APC 1450、CTNNB1(c41、c45)和KRAS(c12)中的0.5％突变频率可以在5ng DNA输入值进行检测；
·对于血浆cfDNA样品，在APC 1309、APC 1450和CTNNB1 41中的0.5％突变频率可以在5ng DNA输入值进行检测；
·所推荐的DNA输入值是最小5ng/孔。
所推荐的FFPE输应为不高于20ng/孔，这是由于可能的PCR抑制。理想的FFPE样品输入值为25至31的内部对照Cq值。
分析的特异性
当在不同WT模板浓度下正确召寻不带突变的样品时确定该试剂盒的分析特异性。对于至多320ng的gDNA/孔和至多20ng FFPE DNA不存在假阳性召寻。用混合阳性对照品(在50％等位基因频率下)中存在的一个或多个突变测试使用该试剂盒的化验的交叉反应性。
表18.分析的特异性：交叉反应性
上述数据展示了，本发明的试剂盒可以正确识别一个模板之中的几个突变。在KRAS12和KRAS13之间存在交叉反应性，这是由于所述突变的近似性，所述突变是可以区分的(参见表13)
该化验的临床性能
基于从患有不同期的CRC(从正常到晚期腺瘤(AA)到结直肠癌1期到4期)的患者的FFPE和血浆中提取的样品对临床灵敏度和特异性进行测试。
只要有至少一个靶突变基于表10-12所展示的截止点被测试为阳性，就认为样品是阳性。
表19.临床样品测试
1.用于本研究的产品
-根据本发明的qPCR结直肠癌检测化验和试剂盒
-BRAF基因分型突变试验(60个样品)，CatJ DC-10-0066
2.用于本研究的仪器
-Roche LC480 qPCR仪
3.用于本研究的标准操作规程(SOP)
-CL-OPS.0005样品登记和管理
-CL-OPS 0006临床实验室患者试验管理
-CL-TF.0007 DiaCarta临床实验室样本登记和跟踪日志
-用于QClamp化验的Qubit HS dsDNA化验的CL-OPS.0013-NA测量
4.报告的结果
qPCR试验结果的总结示于以下表20：
在全部化验召寻(从右边数第二个)的列中，以绿色高亮列出的为阳性样品，而淡绿色为弱阳性。阴性召寻-橙色。由于样品是盲选的，且预期它们的大多数从血浆提取，我们使用阳性、阴性和弱阳性召寻，这是由于血浆样品类型的截止点未经验证。该列还显示了所有发现对于靶突变均为阳性/弱阳性的基因。全部地，存在29个阳性召寻，16个阴性召寻和10个弱阳性召寻。
样品s22、s24、s34、s36、s39、s44、s52和s55具有不充足的DNA，这一点通过IC的Cq超过30所证明。这些样品通过根据本发明的化验进行处理，但是这些试验的结果应当谨慎地进行解释，尤其是样品s24、s34和s55上的阴性召寻。
所有阳性和弱阳性样品的qPCR结果进一步通过qPCR扩增子的Sanger测序得到确认。一些BRAF样品也通过作为替选的BRAF qPCR DiaCarta试剂盒进行测试。
结果显示在右边最后一列。在针对所有相关靶进行了测试的49个样品之中，Sanger测序对于6个样品未产生令人满意的数据。发现：有2个BRAF弱阳性样品是阴性的(或者通过Sanger测序的WT，或者通过对于BRAF c600的作为替选的qPCR DiaCarta化验是阴性的)。这显示了：在V600E之外的几个BRAF突变存在于其它弱阳性案例中，这些案例不改变载有这些突变的样品的总召寻。100％的根据本发明的阳性召寻通过Sanger测序(带有可用数据)来确认。3个召寻无法得到确认，这是由于差的Sanger数据。10个弱阳性召寻中的3个通过Sanger确认为阴性的，5个未产生测序或qPCR数据，2个BRAF WP召寻测试为：对于除V600E之外的突变是阳性的。
1.结论：
上述试验结果明确地展示出，该化验可以用于检测从患者血浆提取的CRC DNA样品中的突变。少至30ng的DNA足以提供试验结果，这一点通过对于阳性召寻的100％的和合率以及可用的Sanger数据来证明。大多数带有低的数量/质量的DNA的样品难以进行测试，但是它们可以通过使用内部对照数据识别出来。
| N | 特异性 | 灵敏度 | |
| 癌症(I-IV期) | 35 | N/A | 100％ |
| 非恶性的 | 22 | 95％ | N/A |
| 全部的(不包括癌前期) | 57 | 95％ | 100％ |
| 全部的(包括癌前期) | 67 | 95％ | 91％ |
上表显示来自FFPE样品的化验的性能。癌前检测的灵敏度为60％(10个样品中的6个)。
下表比较了根据本发明的化验与根据现有技术的化验的技术细节和性能特征。
实施例III
本实施例描述了用于定性检测与结直肠癌引发事件相关的APC(密码子1309，1367，1450)、KRAS(密码子12和13)、BRAF(密码子600)和CTNNB1(密码子41和45)基因的靶基因中的突变的化验的可行性研究。
该化验是基于实时qPCR的体外诊断试验，其意在用于检测从FFPE切片和人类粪便样品提取的DNA中的APC(密码子1309，1367，1450)、KRAS(密码子12和13)、BRAF(密码子600)和CTNNB1(密码子41和45)基因中的突变。
由于来自癌症患者的临床样品常常包含处于大大过量的野生型DNA中的痕量突变体等位基因，DiaCarta在享有专利权的XNA-PCR技术被用于本发明的Taqman化验中以抑制WT等位基因的扩增，从而改善突变检测的灵敏度。
靶基因和突变的选择
基于早期结直肠癌患者(从波茨坦大学许可的UP专利第0,172,823A1号)中的靶基因的突变频率、由Sholttka博士(出版文献)进行的初步临床试验选择出一组靶基因。这些早期结直肠癌相关的生物标记物包括：APC(密码子1309，1367，1450)、KRAS(密码子12和13)、BRAF(密码子600)、CTNNBl(密码子41和45)基因和TGFβ(待包括在内)。基于来自B.Sholttka的初步数据且由于竞品化验(来自Exact Sciences的ColoGuard)也为内部对照使用与下述相同的基因，将管家基因、β-肌动蛋白(ACTβ)选作内部对照。ACTP化验被用于监测样品DNA提取效率和PCR抑制剂的存在，以及用于提供对每个反应孔中的可扩增模板进行定量的途径，以避免假阳性/阴性的结果。
3.2.引物、探针和XNA的设计
3.2.1.引物和探针使用PrimerQuest Tool按照qPCR引物和探针设计规则设计。引物经设计具有62-64℃的Tm，而探针经设计具有66-68℃的Tm。
3.2.2.如果可行，扩增子大小被设计低于150bp。
3.2.3.引物和探针用电脑检查其特异性(BLAST)、引物二聚物/二级结构(autoDimer)和扩增子二级结构(M-折叠)。
3.2.4.XNA设计为在正向引物和反向引物之间，或者与正向引物重叠几个碱基。
3.2.5.该探针经设计以与XNA平行(在与XNA相同的链上)而且：或与XNA(突变体特异性探针)重叠或位于XNA(基因座特异性探针)的远端。
3.3.设计的选择策略
3.3.1.进行引物、探针和XNA组合以及浓度最优化试验以找到用于区分每个靶标体细胞突变的突变体和WT等位基因的理想条件。
3.3.2.测试几种qPCR主混合物以找到最好的一种，其给出最低的Ct和最高的ΔCt用于性能最佳地区分开突变体和WT。
3.3.3.为了通过XNA进行高效的夹动作，在qPCR循环程序中包括了：在引物与探针结合之前在70℃下进行XNA退火步骤。引物和探针的最佳退火温度将通过梯度分析进行测试。
4.材料和方法
4.1.PCR反应混合物的组成
表21.PCR反应混合物
1.1.参比模板：
CTNNB1 CD 41：IDT gBlock，惯常
CTNNB1 CD 45：ATCC CCL-247_D1
BRAF C600：BRAF C600参比标准品(Horizon Cat#：HD238)
KRAS c13：KRAS G13D参比标准品(Horizon Cat#：HD290)
KRAS c12：KRAS G12D参比标准品(Horizon Cat#：HD272)
APC 1309：ATCC CRL-2158_D1
APC 1367：ATCC CRL-2101_D1
APC 1450：ATCC CCL-235_D1
1.2.仪器
Roche LC96 DC2034，Cat.No.05 815 916 001
Roche LC480II DC2035，Cat.No.05015243001
BioRad CFX384 DC2044，Cat.No.4329001
1.1.试剂/试剂盒
Takara Bio Premix Ex Taq(Probe qPCR)2X主混合物，Clontech/TAKARA，Cat.#RR390A
SensiFAST Probe No-ROX混合物(2x)，Bioline，Cat.#BIO-86002
STAT-NAT-DNA-混合物(冻干的)，SENTINEL，Cat.#1N001)
KAPA探针快速qPCR主混合物(2x)Universal(Cat.#：KK4703)
SensiFAST Probe No-ROX混合物(2x)，Bioline，CatJ BIO-86002
1.2.软件
PrimerQuestTool/IDT
Autodimer
M-fold
CLC sequence viewer 7
1.3.基于浏览器的工具
UCSC Genome Browser
NCBI
dbSNP
dbVar
COSMIC
1.1.所参考的DiaCarta文件
DDC.0007_present invention qPCR Project Plan
DDC.0006_Product Requirements for present invention multiplex qPCRTest CO.0001 Product development and Commercialization
2.设计的评价结果
2.1.主混合物选择
根据在用于基于Taqman的qPCR化验的主混合物上的前置试验，KAPA探针快速qPCR主混合物(2×)Universal被选作：用于突变检测化验的开发的基于Taqman探针的qPCR反应的首要主混合物。将以下另外的主混合物与KAPA主混合物进行比较：
1)Takara Bio Premix Ex Taq(Probe qPCR)2X主混合物，Clontech/TAKARA，Cat.#RR390A
2)SensiFAST Probe No-ROX混合物(2×)，Bioline，CatJ BIO-86002
3)STAT-NAT-DNA-混合物(冻干)，SENTINEL，Cat.#1N001)
表22.用于通过QClamp Taqman实时PCR检测CTNNB1密码子45突变的主混合物的比较
3.1.1.冻干的主混合物可以便利地在室温下储存和运输，因此也对冻干的Bioline主混合物进行评估并将其与KAPA探针快速qPCR主混合物(2×)Universal进行比较(表23)
表23.使用Bioline SensiFAST探针混合物(冻干)进行的根据本发明突变检测化验
Bioline主混合物和KAPA探针快速qPCR主混合物(2×)进一步使用带有不同突变频率的样品并且在不同的qPCR机(Roche LC 480相比于Biorad CFX 384)上进行比较。对照品在FLEX通道中，而所有的靶标突变在Fam中。为每个样品如下计算ΔCt：Ct差值(ΔCt)＝突变化验Ct-对照化验Ct。数据总结于表24。
3.1.1.表24.在带有不同突变频率的根据本发明靶上和在不同的qPCR机(RocheLC 480相比于Biorad CFX 384)上对KAPA探针快速qPCR主混合物和Bioline主混合物进行比较。
5.1.主混合物选择的结论
当突变频率为5％或更高时同时当突变频率较低(0.5％或0.1％或更低)时，Bioline主混合物和KAPA探针快速qPCR主混合物(2×)Universal是相当的，KAPA探针快速qPCR主混合物(2×)Universal在区分突变体和WT等位基因这方面性能更好。因此，KAPA探针快速qPCR主混合物(2×)Universal将被用于本发明的化验。
5.2.化验试剂组成以及热循环条件的优化。
5.2.1.预先地用现有QClamp SYBR商业化产品(DC-10-1066，DC-10-0036，DC-10-0039，DC-10-1039，DC-10-0197，DC-10-0169)设计和优化BRAF c600和KRAS c12、c13的引物。
5.2.2.APC、CTNNB1、β-ACT引物被设计为，具有与BRAF和KRAS引物对相同的退火温度(对于Roche和BioRad仪器为64℃)。
5.2.3.退火温度梯度(60-70℃)使用Roche LC96于KAPA探针快速qPCR主混合物(2×)Universal进行，以找到每个靶引物和探针的最佳退火温度。梯度分析的结果总结于表25和表26。
表25.化验引物和探针(无XNA)的退火温度的梯度分析
表26.化验引物和探针(有XNA)的退火温度的梯度分析
5.2.1.PCR退火温度条件。展示了：63-64℃退火温度对于针对所有本发明化验靶区分突变和WT等位基因是最佳的。
5.2.2.PCR循环条件的优化
XNA用于本发明Taqman突变检测化验以抑制wt(野生型)扩增，这是为了便于改善突变检测的灵敏度。为通过XNA进行高效的夹动作，在结合引物和探针之前qPCR循环程序包括了在70℃下的XNA退火步骤。基于引物和探针退火温度的梯度分析，根据本发明Taqman突变检测化验的热循环条件如下进行优化：
5.2.3.95℃下进行5min，然后进行50个下述的循环：在95℃下进行20秒，在70℃下进行40秒，在64℃下进行30秒以及在72℃下进行30秒(数据采集)。
5.3.引物和探针浓度的优化
5.3.1.实行引物和探针基质稀释实验以找到用于区分靶标基因的突变和WT等位基因的最佳浓度。
表27.经测试的引物浓度以及引物/探针比率：
5.3.1.与有限的引物/探针浓度组合使用XNA的做法，对于所选的基因座特异性探针得到了WT背景较小或无的扩增。引物、探针和XNA浓度的优化结果总结于表28。
表28.用于在Bio-Rad CFX 384上的CTNNB l c41化验的引物、探针和XNA滴度
表29.在LC 96上用在200nM/100nM的引物/探针进行的CTNNB 1 c41化验的XNA滴度
表30.在LC 96上进行的CTNNB1 c45化验的引物、探针和XNA滴度
表31.在LC 96上用在100nM/50nM的引物/探针进行的BRAF c600化验的XNA滴度
表32.在LC 480上进行的BRAF密码子600化验的引物、探针和XNA滴度
表33.在LC96上用引物/探针400nM/200nM进行的KRAS密码子12化验的XNA滴度
表34.在LC480上进行的KRAS c12化验的引物和探针滴度
3.1.2.表35.在LC96上用引物/探针400nM/200nM进行的KRAS c13化验的XNA滴度
表36.在LC480上用引物/探针200-100nM/100-50Nm进行的KRAS c13 XNA滴度
5.3.经优化的引物和探针浓度
5.3.1.最佳浓度是0.1μM引物和0.05μM探针，用于在Roche LightCycler 96、Roche LightCycler480和BioRadCFX384上区分CTNNB1c45、BRAF c600的突变体和WT。
5.3.2.对于CTNNBl c41、对于在Roche Light cycler 96、Roche Light Cycler480上区分突变体和WT等位基因，0.2μm引物和0.1μm探针最佳。
5.3.1.对于KRAS12和13、对于在LC 96上区分突变体和WT，0.4/0.2μm引物和探针是最佳的，对于在LC 480和BioRadCFX384上区分突变体和WT，0.2μm引物和0.1μm探针是最佳的。
5.3.2.通常，使用有限的引物和基因座特异性探针的浓度(100Nm到200Nm/50到100nM)导致WT(野生型)背景较少或无的带有XNA的扩增。高于0.4/0.2μm的引物/探针锥(cone)通常导致带有XNA的WT背景扩增。将有限的引物/探针锥与XNA组合使用将导致对于所选的基因座特异性探针得到WT背景较少或无的扩增。
5.4.对带有引物-探针的XNA浓度进行优化
5.4.1.筛选引物和探针用于在XNA存在下区分突变体和WT等位基因。对于优化，使用XNA滴度和有限的引物和探针浓度(100Nm到200nM/50到100nM)。
5.4.2.通过SYBR化验筛选以下引物以找到引物对(其在突变体和WT等位基因之间得到最好ΔCt)(表37-39)。
表37.针对APC 1309、APC 1367和APC 1450经筛选的引物
表38.对于APC 1309、1367和1450进行XNA和引物浓度的优化。
表39.针对BCT 41和BCT 45筛选的引物。
| 引物名称 | 引物序列 |
| PBBCT-F-SEQ ID NO:18 | ACTCTGGAATCCATTCTGGTGC |
| PBBCT-R-SEQ ID NO:19 | AGAAAATCCCTGTTCCCACTCATA |
| LPBCT-F2-SEQ ID NO:20 | ATCCATTCTGGTGCCACTAC |
| LPBCT-R2-SEQ ID NO:21 | ACTTGGGAGGTATCCACATC |
运行引物/XNA基质以找到最佳引物/XNA浓度，其给出BCT c41的WT和5％MT之间的最佳区分。引物/XNA基质分析总结于表40。
表40.BCT41的XNA和引物浓度的基质分析。
5.3.1.对于包括BRAF V600和KRAS c12和c13的其它靶标突变，用于BRAF和KRASc12和KRAS c13化验的DiaCarta Qclamp SYBR试剂盒的引物对也用于基于Taqman探针的BRAF和KRAS c12和KRAS c13突变检测化验的开发。
5.3.2.针对每个靶标突变检测化验选择出引物、探针和XNA的组合和浓度，该组合和浓度导致最高的ΔCt(测量为WT和5％突变样品的突变检测化验的Ct之间的区别值)的。
5.3.3.以下引物和探针和XNA显示了在区分突变体和WT等位基因方面的最好性能。对于通过SYBR化验筛选引物的更多细节，请参见本文件的附件。
表41.针对化验的最终配置选择出的引物、探针和XNA的名称：
表42.本发明的化验的最终组成
5.3.本发明化验的最终配置的扩增曲线的实施例
5.3.1.以下附图说明了带有最佳的引物、探针、XNA浓度和Wt和突变体之间ΔCt的本发明的化验的性能实施例。
5.3.本发明的初步分析验证
基于本发明的靶引物、探针和XNA组合和滴度分别进行的实验，为每个靶标突变检测化验获得最佳条件，这一点列于表22中并在以上附图中进行了说明。对根据本发明定案的化验的试验特异性、灵敏度和再现性进行了评价。
5.3.1.准确度
测试带有已知突变状态的一组细胞系以评估根据本发明的化验准确度。根据本发明的化验在Roche LC 96仪器上运行。在所有测试的细胞系中仅检测到预期的突变。
表43.在带有已知突变状态的细胞系上的CTNNB1 c41、CTNNB1 c45、KRAS c12、KRAS c13和BRAF c600试验。
5.3.1.分析灵敏度
分析灵敏度通过下述确定：测试将DNA系列稀释为野生型DNA的DNA样品。在wt(野生型)背景中分别在带有5％、1％、0.5％、0.1％突变体DNA的DNA样品上进行突变检测化验。确定可以在野生型背景中检测到突变的DNA的最低百分比。在野生型背景中至少0.5％的经突变DNA可以通过本发明Taqman化验(参见表18)和表19检测到。
表44.稀释成wt DNA的突变DNA(5％，1％，0.5％和0.10％)的根据本发明的突变检测化验，其中PCR循环为40个，且使用Abs Quant/Fit Points算法来运行文件数据分析。对照在HEX通道中，而所有靶标突变均在Fam中。如下计算每个样品的ΔCt：Ct差值(ΔCt)＝突变化验Ct-对照化验Ct。
表45.本发明突变检测化验的灵敏度。
突变体DNA以5％、1％和0.10％稀释成WT DNA。进行50个循环的PCR并且使用AbsQuant/2nd导数最大算法来运行文件数据分析。对照在HEX通道中，而所有靶标突变均在Fam中。如下计算每个样品的ΔCt：Ct差值(ΔCt)＝突变化验Ct-对照化验Ct。
5.3.1.化验的精确度
根据本发明的化验的再现性(精确度)展示如下：比较来源于在整个可行性研究期间多重运行的5％的AF样品上的突变检测化验的试验结果(参见表46和47)。计算运行内的和运行之间的％CV值以测试化验间和化验内精确度(表47和48)。
在表47和48示出的数据指明了，所有根据本发明的化验均具有良好的化验间和化验内精确度(％CV<10)。
表46.化验精确度和仪器比较：化验间再现性：本发明Taqman化验在不同日期在LC96上运行
表47.化验精确度和仪器比较：化验间再现性：本发明Taqman化验在不同日期在LC480上运行
表48.化验精确度(化验内再现性)
表49.表格：化验精确度(化验间再现性)
5.3.1.分析特异性
通过在带有已知突变阴性状态的参比样品上进行化验来测试分析特异性。所有试验结果均如预期的那样(参见表43)。
5.7.1.通过在NTC样品上进行化验来测试空白的限值。
所有经测试的NTC样品均被召寻阴性。
1.结论
1.1.最终设计在表41和42中示出。
1.2.最终的化验PCR循环参数示于第5.2.3节：
95℃下进行5min，然后照以下进行50个循环：95℃下进行20秒，70℃下进行40秒，64℃下进行30秒以及72℃下进行30秒(数据采集)。
1.3.根据本发明的设计展示了，经测试的设计的性能参数满足或超过产品要求文件(DDC.0006)中列出的规格，且该化验已准备好用于开发阶段。
1.3.1.经测试的样品类型的产品要求1将在验证研究的基质干扰试验中进行测试。要求11-15也将在开发阶段的验证研究和稳定性研究中测试。
1.3.2.产品要求2得到满足：经60min建立反应，并且经2.5h在三个qPCR仪器上运行PCR反应进行测试。
1.3.3.产品要求3将在单独的粪便DNA制备研究中处理
1.3.4.产品要求4通过具有7种反应的混合物满足，其中每个基因在单独的反应混合物中测试，KRAS 12和KRAS 13在两个单独的反应中测试；CTNNB 41和45也在2个单独的反应中测试。APC在2个试管中测试。
1.3.5.产品要求5如下得到满足：在全部三种列出的qPCR仪器-Roce LC96和LC480和BioRad CFX上测试化验
1.3.6.产品要求6通过在每个反应试管中包括内部对照品化验来满足，这种做法提供了在每个反应孔中具有足够数量的可扩增DNA的证据。
1.3.7.产品要求7如下得到满足，即试剂盒包含了NTC、WT对照品和混合了的阳性对照品。
1.3.8.通过根据本发明的Taqman化验(高灵敏度)以2.5ng/孔的总DNA输入值可以检测到在野生型背景中至少0.5％的突变体DNA。这超过了产品要求8(该要求设想为用于检测出1％突变体DNA)。
1.3.9.在报告中所示出的数据展示了：根据本发明的设计的可行性，该设计用以检测目标突变(在其中观察不到交叉反应性)。此为产品要求9。
1.3.10.该设计还显示了良好的化验内和化验间再现性(CV<10％)。这满足了产品要求10。
1.4.最终设计在表41和42示出。
1.5.最终化验PCR循环参数在第5.2.3节示出：
95℃下进行5min，然后如以下进行50个循环：95℃下进行20秒，70℃下进行40秒，64℃下进行30秒以及72℃下进行30秒(数据采集)
实施例IV
本实施例进一步描述了把根据本发明的化验用于对与引发结直肠癌事件相关的APC(密码子1309，1367，1450)、KRAS(密码子12和13)、BRAF(密码子600)和CTNNB1(密码子41和45)基因的靶基因突变进行定性检测的验证研究和确认研究。该化验和试剂盒已经在精确度、检出限(LOD)、稳定性、特异性/交叉反应性以及基质干扰的方面进行了确认。
验证研究和确认研究在两个开发批次的化验和试剂盒上进行。除了对APC 1309和APC 1367的阳性对照品单独制备用以LOD研究，都使用经混合的阳性对照品作为测试样品。该突变检测规程与根据本发明对于试验样品所做的是一样的。确认试验在LC 480上运行(为了进行仪器比较，该试验也在BioRad384上运行)。
根据本发明的化验是基于实时qPCR的体外诊断试验，其用意为：对从FFPE切片和人类粪便样品中提取的DNA中的APC(密码子1309，1367，1450)、KRAS(密码子12和13)、BRAF(密码子600)和CTNNB1(密码子41和45)基因中的突变进行检测。
确认计划的概述
测试化验的分析灵敏度(LOD)和等位基因频率
测试化验的空白的限值
测试基质干扰(例如FFPE提取，添加乙醇)，用于得到真实患者样品最可能遇到的几种物质的潜在抑制性作用
测试交叉反应性(检测根据本发明的靶DNA的每一种)。
测试化验的再现性：
化验内：重复：代表LOD附近的所有突变的样品
化验间：在每个仪器中3次运行：3×3个样品
如下测试批次间差异：在相同运行的第二批次上重复1.5.1和1.5.2
仪器比较：在Roche LC480、BioRad CFX384上
操作员差异(2名操作员在同一天在相同仪器上测试相同批次)
在两个批次上都测试分析特异性
在高浓度的WT参比样品上的分析特异性试验
本发明的稳定性研究
加速稳定性研究
冻融稳定性研究
实时稳定性研究
与本发明化验分析性能的计划V&V的偏差值
使Sensifast冻干的Bioline主基质恢复为通用型KAPA 2×液体制剂，原因有两个：在Bioline侧进行制造的时间线过长，且在1％突变的化验灵敏度并不像KAPA那样好
制造·：用于一些引物-探针混合物的试剂分别购得用于批次2，其它的同样如此
用于等分试剂盒的试管得自USA scientific，计划变为：得自用于所有现有产品制造的Fisher Scientific的得到检验的试管的库存。BioRad CFX 384仪器的运行时间超过针对产品要求#5号规定的2h限值。该要求并非必需，并且人们认为2.5h的运行时间是可接受的。
1.材料和方法
PCR反应混合物的组成
表50.PCR反应混合物
参比模板：
CTNNB1 CD 41：IDT gBlock，惯常
CTNNB1 CD 45：ATCC CCL-247_D1
BRAF C600：BRAF C600参比标准品(Horizon Cat#：HD238)
KRAS c13：KRAS G13D参比标准品(Horizon Cat#：HD290)
KRAS c12：KRAS G12D参比标准品(Horizon Cat#：HD272)
APC 1309：ATCC CRL-2158_D1
APC 1367：ATCC CRL-2102_D1
APC 1450：ATCC CCL-235_D1
仪器
Roche LC480II DC2035，S/N 5536
BioRad CFX384 DC2044，S/N 786BR02318
试剂/试剂盒
复用结直肠癌检测试剂盒的2个开发批次(DL-1和DL-2)，其包括：
-2×PCR主混合物，
-5×本发明引物和探针混合物，
-10×本发明XNA混合物和
-混合的阳性对照品，如参比模板中所述，以及
-非模板对照品(NTC，不含核酸酶的水)。对于该开发批次的报告在DDC.0041中
化验的性能参数的验证
化验的分析灵敏度(LOD)
对于全部本发明靶，该化验的分析灵敏度通过在2.5ng、5ng和10ng输入值测试1％、0.5％和0.1％突变体DNA模板进行评估。对于每个靶，针对在三个DNA输入水平的每一个的1％、0.5％和0.1％突变进行三复本测试，且在LC 480上进行3个单独运行。在每个运行中都包括：非模板对照品(NTC)、野生型DNA(夹对照品)以及经混合的阳性对照品(APC 1309和APC 1367的阳性对照品单独制备)。为FAM(靶)和HEX(内部对照品)两者的平均Ct值、标准差(SD)和差异系数(％CV)。ΔCt值(ΔCt＝Ct Fam-Ct Hex)由平均的Ct值计算出(表51至表)。对于全部三个运行，计算在全部3个DNA输入值的平均ΔCt值。截止值ΔCt设置平均的ΔCt值-1.5ΔCt SD(表)。在2.5ng、5ng和10ng DNA输入值，计算全部靶的1％、0.5％和0.1％突变检测的正确召寻(Call)百分比(表53和表54)。在V&V期间的所有运行，在5ng DNA输入值也计算所有靶的1％突变检测的正确召寻百分比，结果包含在表53和54中。
表51.在2.5ng、5ng和10ng DNA输入值的WT、1％、0.5％和0.1％突变体DNA模板的平均FAM CT值。
表52.在2.5ng、5ng和10ng DNA输入值的WT、1％、0.5％和0.1％突变体DNA模板的平均ΔCT值。
表53.Roche LC480的ΔCt截止值
| 化验 | ΔCt | 通过/未通过 | 全部％正确 |
| APC 1309 | 17.04 | 通过 | 96％ |
| APC 1367 | 16.37 | 通过 | 96％ |
| APC 1450 | 7.62 | 通过 | 100％ |
| BCT 41 | 8.4 | 通过 | 96％ |
| BCT 45 | 9.5 | 通过 | 100％ |
| KRAS 12 | 10.83 | 通过 | 96％ |
| KRAS 13 | 10.89 | 通过 | 100％ |
| BRAF V600 | 8.5 | 通过 | 96％ |
| 全部％正确 | 98％ |
表54.基于来自表3的截止值的本发明化验的分析灵敏度
注意：表54中的数据基于来自对于5ng输入值包含1％、5％和0.1％突变体数据的所有实验的值计算出。
表55.LC480的检出限总结
| 化验 | DNA的限值(ng/PCR) |
| APC1309 | 5 |
| APC1367 | 2.5 |
| APC1450 | 2.5 |
| BTC CD41 | 2.5 |
| BTC CD45 | 2.5 |
| KRAS CD12 | 2.5 |
| KRAS CD13 | 2.5 |
| BRAF V600 | 5 |
结论：
-可以在低至2.5ng DNA输入值/PCR反应条件下可靠地检测到APC(c1367，c1450)、BCT(c41，c45)、KRAS(c12，c13)中的0.5％突变频率(100％正确召寻)。
-在5ng DNA输入值，APC 1309和BRAF V600中的1％突变可以分别用94％和100％正确召寻检测到。对于APC(c1367，c1450)、BCT(c41，c45)和KRAS(c12，c13)，在上述输入值的100％正确召寻下，分析灵敏度为0.5％。
该化验的空白的限值
非模板对照品(不含核酸酶的水)以每个确认试验运行，以监测PCR中的污染物。将来自多个运行的50次重复的NTC的数据进行编译(表56)和分析以评估本发明化验的背景噪声的水平。
表56.空白试验结果的限值
结论：对于包括APC 1450、BCT 41、BCT 45、KRAS 12和BRAF V600的根据本发明的靶，不存在背景扩增噪声，当测试NTC时对于这些靶不存在检测得到的扩增。对于APC 1309/1367和KRAS13，存在极小背景噪声，平均Ct分别超过48和49。
基质干扰
为确定从FFPE分离的DNA中的残留常见物质是否对发明化验的性能具有干扰性的抑制作用，将乙醇(ETOH)以2％、5％和10％浓度掺在DNA样品中，并在Roche LC 480上重复5次进行测试。计算每个样品的平均Ct值。计算每个掺有酒精的样品和未掺杂的样品之间的平均Ct差值并将其总结于表57。
表57.基质干扰
结论：
未掺杂试验和掺杂试验之间的Ct差值被用于确定：经测试的ETOH量是否引起对本发明qPCR反应的抑制。表中的数据显示在本发明化验上没有EHOH干扰，大多数本发明的靶(包括APC 1309/1367，APC 1450，BCT 41，BCT 45和BRAF V600)的样品被掺入至多10％的ETOH。KRAS 13的扩增被低至2％的ETOH(dCT超过2)所抑制。
交叉反应性。
在本发明化验中存在8个靶突变检测反应。测试所有阳性参比材料的每个靶试验化验以评估交叉反应性。各化验混合物用8个各自1％突变标准品进行三复本测试。一些参比材料带有多于一个靶突变(例如来自Horizon的BRAF参比标准品以50％频率带有BRAFV600E、BCT 45和KRAS 13突变，来自ATCC的BCT 45标准品也以50％频率带有KRAS 13突变)。为带有所有突变反应的每个标准品计算ΔCt(Ct Fam-CtHex)并将其总结于表58。每个测试样品的突变状态(阳性或阴性)基于截止值dCT值确定(参见表53)。
表58.本发明的化验的交叉反应性
结论：
所有靶突变(包括APC 1309、APC 1367、APC 1450、BCT 41、BCT 45、BRAF V600)确如预期地由本发明的化验检测到，这指明了：不存在不同靶检测的交叉反应性。KRAS 12在KRAS13阳性样品中产生信号，但是在真实KRAS 13信号和来自KRAS 12的串扰信号之间存在6Ct的差值。该特征可以用于区分真实KRAS 12和KRAS 13阳性样品。由于试剂盒意在检测KRAS 12和KRAS 13突变而非区分它们，串扰(cross-talk)将不会对试剂盒的性能产生影响。因此，只有目标靶突变可以由本发明的试剂盒检测到。
DNA输入限值
基于分析灵敏度研究(第5.1节)，发现2.5ng或5ng是最小值。
本发明的试剂盒的DNA输入值是为了检测1％突变。为确定本发明qPCR化验的最大可允许的DNA样品输入值，测试大量的野生型人基因组DNA。对于所有靶，(所有靶三复本地)使用不同WT DNA输入值进行本发明的qPCR化验(Fam和Hex)。预期：上LOD确定为产生假阳性试验结果的最低DNA输入水平。使用β-肌动蛋白(Hex)的qPCR用于估计DNA量以及展示PCR效率(图1)。计算每个DNA输入样品的ΔCt(ΔCt＝Ct Fam-Ct Hex)并与ΔCt截止值相比较以确定每个DNA输入样品的突变状态(表53)。
表59.上LOD试验结果的总结(ΔCt＝Ct Fam-Ct Hex)。
| 化验 | 2.5ng | 5ng | 10ng | 20ng | 40ng | 80ng | 160ng | 320ng |
| APC 1309/1367 | 20.30 | 21.01 | 18.14 | 23.61 | 24.77 | 25.58 | 26.47 | 27.33 |
| APC1450 | 16.75 | 17.76 | 13.92 | 9.83 | 10.62 | 10.07 | 10.74 | 10.52 |
| BCT41 | 14.07 | 11.25 | 9.81 | 10.29 | 9.63 | 9.63 | 9.41 | 9.47 |
| BCT45 | 12.80 | 10.20 | 10.08 | 11.52 | 9.86 | 10.20 | 10.00 | 10.10 |
| KRAS12 | 14.78 | 17.34 | 14.70 | 15.80 | 14.50 | 13.05 | 13.90 | 14.34 |
| KRAS13 | 16.33 | 13.35 | 13.53 | 13.99 | 13.64 | 12.82 | 12.33 | 13.50 |
| BRAFV600 | 10.62 | 10.71 | 12.93 | 10.15 | 9.68 | 10.30 | 9.82 | 9.73 |
结论：
当DNA输入量(对照品Ct值)在31≤Ct≤24之间，显示其对于本发明化验是可接受的，这相当于2.5ng/gDNA/孔至320ng/gDNA/孔。不同DNA输入量的ΔCt分析显示了100％的正确召寻。使用多至320ng DNA的输入值未观察到假阳性结果。由于本发明突变检测化验的推荐的DNA输入仅为5ng/反应，将不太可能存在假阳性结果，这由于在该输入水平样品会过载。
化验的精确度的研究结果
两个开发批次的本发明的试剂盒试剂被用于再现性实验-DL1和DL2。两名操作员(Qing Sun和Larry Pastor)是在两种不同的仪器上测试该试剂盒。主仪器是来自Roche的LC480，第二试验仪器是BioRad CFX384。进行这些试验是为了评价：该产品满足了DDC.0006中所列的要求。
进行若干实验以评估本发明的化验的再现性，包括化验内、化验间、批次间、仪器比较和操作员再现性。对于化验间再现性和仪器比较，每个样品(包括NTC，WT和PC)的9个复本在每批次的一个运行中在一块板上进行测试。为了评价化验间、批次间和操作员再现性，每个样品(包括NTC，WT和PC)的3个复本在所有本发明靶的每批次的一个运行中在一块板上进行测试。在DL2中重复化验内和化验间再现性实验。计算每个标记物或每个批次和试验样品的平均值、SD、％CV值。数据总结于下表50至66。
所有靶Ct值均为FAM信号，来自内部对照的对照品在HEX通道上测量。对每个运行的所有复本，以平均值计算其对照值。
表60.化验内再现性试验结果(LC 480)，(DLl)
表61.化验内再现性试验结果(BioRad 384)，DLl。
表62.化验间再现性测试结果。显示了各个运行的平均Ct值。平均值(Ave)是三个运行的总平均值。
表63.批次间差异(Roche LC 480)，DL1和DL2。
表64.批次间差异(BioRad CFX384)，DL1和DL2。
表65.操作员差异试验(DL2，QS和LP)。显示了各个操作员的平均Ct值。
表66.基于Roche LC 480和BioRad 384的仪器比较
注意：在LC480和BioRad384上的正确召寻是基于在LC 480和BioRad384上设置的不同截止点制得。
化验的精确度的总结
表10至16中总结的关于本发明试剂盒试剂的精确度测试的数据展示了：所有本发明的化验均具有良好的化验内、化验间、批次间和操作员再现性，其中％CV<10(满足了产品要求PR10)。
测试了可以影响本发明化验的再现性的变化来源的所有计划的试验，结果显示：该化验是稳健的且满足DDC.0007所列出的产品要求。
7.7.使用FFPE样品的化验灵敏度和特异性(基质干扰)
来自阳性参比FFPE(KRAS G12D，Horizon Diagnostics)和阴性(WT)FFPE的DNA使用QIAamp DSP DNA FFPE组织试剂盒(Catalog，Qiagen，REF 60604.QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)按照制造商说明书提取。为确定本发明的化验的FFPE DNA输入上限(可以在不产生假阳性结果的情况下测试的WT DNA的最大量)，不同量的WT FFPE DNA(10和20ng/孔，基于Qubit数据)用于本发明反应且在LC 480仪器上测试。数据总结于表67。
表67.上限FFPE DNA输入试验结果的总结(ΔCt＝Ct Fam-Ct Hex)
为使用来自FFPE的DNA估计出化验灵敏度，通过Qubit数据将DNA输入值设置为5ng/孔。测试以2％和4％等位基因频率包含KRAS G12D突变的DNA样品，数据总结于表68。
表68.FFPE DNA(2％和4％KRAS G12D)试验结果的总结，5ng/孔((ΔCt Fam-CtHex)。阳性召寻加了下划线，阴性召寻未加下划线
| 靶 | 4％G12D | 4％G12D | 4％G12D | AVE4％ | 2％G12D | 2％G12D | 2％G12D | AVE2％ |
| APC 1309 | 23.27 | 10.83 | 23.27 | 19.12 | 23.38 | 11.66 | 11.58 | 15.54 |
| APC 1367 | 23.31 | 23.44 | 23.6 | 23.45 | 23.31 | 10.51 | 23.48 | 19.1 |
| APC 1450 | 10.3 | 11.52 | 10.39 | 10.74 | 23.31 | 10.16 | 23.2 | 18.89 |
| BTC CD41 | 8.9 | 9.3 | 9.2 | 9.13 | 9.25 | 8.69 | 9.98 | 9.31 |
| BTC CD45 | 13.21 | 11.44 | 10.36 | 11.67 | 11.7 | 10.42 | 9.42 | 10.51 |
| KRAS CD12 | 8.46 | 8.34 | 8.38 | 8.39 | 9.87 | 9.89 | 10.11 | 9.96 |
| KRAS CD13 | 11.18 | 13.51 | 11.86 | 12.18 | 18.2 | 11.65 | 14.79 | 14.88 |
| BRAF V600 | 10.74 | 9.94 | 10.31 | 10.33 | 8.65 | 8.63 | 9.3 | 8.86 |
| BACT的Ct | 26.77 | 26.74 | 26.64 | 26.72 | 26.78 | 26.77 | 26.73 | 26.76 |
结论：
FFPE样品的特异性评价：不同FFPE DNA输入值的试验结果指明，多至20ng/孔的FFPE DNA输入值不会产生假阳性结果。
FFPE样品的灵敏度评价：
在带有2％和4％的KRAS G12D突变的FFPE DNA的初步测试表明，2％的KRAS G12D可以用100％准确度在5ng输入FFPE DNA水平检测到。
本申请引用的所有专利、专利申请和公开包括那些专利、申请和公开中所有引用的参考文献，其针对所有目的全部并入本申请以作参考，并入程度与各单独的专利、专利申请或公开也被单独指出一样。
虽然前述说明书(Angres)包含很多细节，但是不应该认为这些限制本发明的范围，而仅是提供对本发明优选实施方式中的一些的说明。类似地，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以设想其它实施方式。来自不同实施方式的特征可以组合使用。因此，本发明的范围仅由所附权利要求及其法律等同物指明和限制，而不由前述说明书指明和限制。落入权利要求的含义和范围内的本申请公开的对本发明的所有增加、删除和修改也由此包括在内。
序列表
<110> 蒂雅卡特公司
<120> 用于进行结肠癌和/或结肠癌前体细胞的早期检测
和用于监测结肠癌复发的方法
<130> DIA 025
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(95)
<223> 生物素化的捕获探针（Biotinylated capture probe）
<400> 1
gatacagcta attcagaatc attttgtgga cgaatatgat ccaacaatag aggtaaatct 60
tgttttaata tgcatattac tggtgcagga ccatt 95
<210> 2
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(90)
<223> 生物素化的捕获探针（Biotinylated capture probe）
<400> 2
aagtcaatca tccacagaga cctcaagagt aataatatat ttcttcatga agacctcaca 60
gtaaaaatag gtgattttgg tctagctaca 90
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(63)
<223> 生物素化的捕获序列（Biotinylated capture probe）
<400> 3
aggaaggaag gctggaagag tgcctcaggg cagcggaacc gctcattgcc aatggtgatg 60
acc 63
<210> 4
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(80)
<223> 生物素化的捕获探针（Biotinylated capture probe）
<400> 4
ttgtcatcag ctgaagatga aataggatgt aatcagacga cacaggaagc agattctgct 60
aataccctgc aaatagcaga 80
<210> 5
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(75)
<223> 生物素化的捕获探针（Biotinylated capture probe）
<400> 5
gtaaaggcaa tcctgaggaa gaggatgtgg atacctccca agtcctgtat gagtgggaac 60
agggattttc tcagt 75
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 6
gaatcagctc catccaagt 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 7
ctgtgacact gctggaactt cgc 23
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 8
agcaccctag aaccaaatcc agcag 25
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 9
tggcatggtt tgtccagggc 20
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 10
acaaaccatg ccaccaagca ga 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 11
gagcactcag gctggatgaa caag 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 12
ggatgtaatc agacgacaca gga 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 13
cacaggatct tcatctgacc tagtt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
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tctccctcca aaagtggtg 19
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 15
aaactatcaa gtgaactgac agaag 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 16
ccagatagcc ctggacaaac c 21
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成物
<400> 17
cttttcagca gtaggtgctt tattttta 28
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 18
actctggaat ccattctggt gc 22
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 19
agaaaatccc tgttcccact cata 24
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 20
atccattctg gtgccactac 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 21
acttgggagg tatccacatc 20
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 22
acgacacagg aagcagattc t 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 23
tcacaggatc ttcagctgac ct 22
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 24
ttccaatctt ttatttctgc tatt 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(24)
<223> Lys 修饰碱基（Lys modified base）
<400> 25
ctgacctagt tccaatcttt tctt 24
<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 26
ttcaggagcg aaatctccc 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 27
tgaacatagt gttcaggtg 19
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(28)
<223> 荧光修饰探针（Fluorescent modified probe）
<400> 28
caaaagtggt gcttagacac ccaaaagt 28
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(15)
<223> Lys 修饰碱基（Lys modified base）
<400> 29
agtggtgctc agaca 15
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 30
ccagatagcc ctggacaaac c 21
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 31
cttttcagca gtaggtgctt tattttta 28
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 32
aggtacttct cacttggttt 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 33
taggtacttc tcgcttggtt t 21
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 34
actctggaat ccattctggt gc 22
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 35
agaaaatccc tgttcccact cata 24
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 36
aggaagagga tgtggatacc tcccaag 27
<210> 37
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(17)
<223> Lys 修饰碱基（Lys modified base）
<400> 37
tgccactacc acagctc 17
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 38
actctggaat ccattctggt gc 22
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 39
agaaaatccc tgttcccact cata 24
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 40
aggaagagga tgtggatacc tcccaag 27
<210> 41
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(15)
<223> 乙酰修饰碱基（Acetyl modified base）
<400> 41
ctccttctct gagtg 15
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 42
aaggcctgct gaaaatgact g 21
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 43
gttggatcat attcgtccac 20
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 44
tctgaattag ctgtatcgtc aaggcactc 29
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(24)
<223> D-Lys 修饰碱基（D-Lys modified base）
<400> 45
ctacgccacc agctccaact acca 24
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 46
acttgtggta gttggagctg gt 22
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 47
gttggatcat attcgtccac 20
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 48
tctgaattag ctgtatcgtc aaggcactc 29
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(23)
<223> D-Lys PEG 修饰碱基（D-Lys PEG modified base）
<400> 49
tcttgcctac gccaccagct cca 23
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 50
acagtaaaaa taggtgattt tggtctagct a 31
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 51
catccacaaa atggatccag acaa 24
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 52
caaactgatg ggacccactc catcg 25
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 53
atcgagattt cactgtagct agac 24
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 54
cctggacttc gagcaagaga 20
<210> 55
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 55
ccgtcaggca gctcgta 17
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 56
cttccagctc ctccctggag aa 22
Claims (7)
1.一种检测包含在生物样品中的已知与结直肠癌相关的突变基因是否存在的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)使夹引物、能够扩增包括具有经突变基因的序列的靶位点的区域的引物、以及生物样品的混合物共存于用于基因扩增的反应溶液中，并且通过基因扩增方法选择性地扩增包括经突变基因的靶位点的区域，所述夹引物由与野生型基因的序列或与野生型基因互补的序列的靶位点的全部或部分杂交的XNA组成，以及
(2)通过基因检测方法使用在步骤(1)中获得的扩增产物或其部分作为模板选择性地检测包括所述突变基因的靶位点的区域，以检测经突变基因是否存在。
2.一种筛查出患者的结直肠癌存在的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)获得来自所述患者的生物样品；和
(b)进行：用异核酸夹来筛查所述样品中的DNA突变的化验，以检测指示出结直肠癌存在的突变。
3.一种检测与结直肠癌相关的突变体基因的方法，其包括：提供包含DNA和能够杂交至野生型基因的异核酸夹的样品；以及用能够杂交至所述突变体基因的异核酸探针检测所述样品中基因的突变体。
4.一种筛查和/或监测患者的与结直肠癌相关的突变的方法，所述方法包括：从得自怀疑患有与结直肠癌突变相关的病状的患者的粪便样品、新鲜外周血(PB)、和福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)组织样品中分离出DNA；在提取出的DNA上进行PCR以制备经扩增的DNA同时使用异核酸夹来阻止野生型DNA的扩增；在自动测序仪中测序经扩增的DNA；分析自动测序仪的输出信号以识别在所述序列中的突变。
5.一种用于检测与结直肠癌相关的靶基因的所选区域中是否存在突变的试剂盒，其包括XNA夹和引物；
其中所述XNA夹能够与在靶基因中具有野生型序列的所选区域杂交，且所述引物能够扩增包含所述靶基因中的各个突变的所选区域。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其中所述突变选自：APC 1309，APC1367，APC 1450，BCT41，BCT 45，KRAS 12，KRAS 13和BRAF V600。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述XNA夹和引物具有表22所示的序列。
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