KR20220139813A

KR20220139813A - 암 환자의 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220139813A
Application number: KR1020220043035A
Authority: KR
Inventors: 권성훈; 이충원; 이용주; 최아현; 이현호; 신경섭
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2022-04-06
Publication date: 2022-10-17
Also published as: WO2022216066A1

Abstract

일 양상은 암 환자의 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 일 양상에 따르면, GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인함으로써, 암 환자, 특히 삼중음성유방암 환자의 예후를 예측할 수 있음을 확인하였는 바, GPX4 유전자를 바이오마커로서 활용할 수 있다. 나아가, 상기 바이오마커를 이용하여, 암 환자의 예후를 개선하거나 암의 예방 또는 치료가 가능한 바, 상기 바이오마커는 다양한 용도로 활용될 수 있다.

Description

암 환자의 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도{A biomarker for predicting prognosis in patients with cancer and use thereof}

암 환자의 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

인간의 몸을 구성하고 있는 가장 작은 단위인 세포는 정상적일 때 세포 내 조절기능에 의해 분열하며 성장하고 죽어 없어지기도 하면서 세포 수 균형을 유지한다. 그러나 여러 가지 이유로 인해 이러한 증식과 억제가 조절되지 않는 비정상적인 세포들이 과다하게 증식할 뿐만 아니라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴 형성 및 정상 조직의 파괴를 초래하는 상태를 암(cancer)이라 정의한다. 암은 정상적인 세포와 장기의 구조와 기능을 파괴하기에 그 진단과 치료의 중요성은 매우 크다.

또한, 환자에게 가장 적절하고 효율적인 항암치료를 제공하고 부작용을 감소시키기 위하여 환자의 예후(prognosis)를 정확하게 예측하는 것 역시 매우 중요하다. 환자의 예후는 나이, 병리학적 단계 등 일반적인 임상 변수에 기초하여 판단될 뿐만 아니라, 유전학적 변이, 증폭과 같은 분자적 변수들을 통해서도 예측될 수 있다.

한편, GPX4(glutathione peroxidase 4)는 glutathione peroxidase 계열에 속하는 항산화 효소로서, 과산화수소, 유기 과산화수소 및 지질 과산화물의 감소를 촉매하여 산화 스트레스로부터 세포를 보호하는 기능을 한다. 또한, GPX4는 활성 산화 지질을 환원시켜 이들의 축적을 막아 세포가 과산화 되는 과정을 막음으로써 지질 과산화물과 관련된 세포 사멸과정인 페롭토시스(ferroptosis)를 억제한다고 알려져 있다. 최근, GPX4가 세포 내에서 페롭토시스 과정을 조절하여 암의 발달 및 치료 예후에 영향을 미친다는 보고가 제시되고 있으며, 대장암, 유방암, 폐암 환자에서 SEPP1, GPX4, SELS15 등과 같은 selenoprotein에서의 변이가 일어날 경우 암에 대한 위험도가 증가된다는 보고 또한 제시된 바 있다.

유전자 변이의 한 종류인 RNA 편집(editing)은 DNA가 아닌 RNA 특이적인 유전자 변이로, 이 중 가장 대표적인 변이는 ADAR(adenosine deaminase) 효소에 의한 A-to-I 편집이다. 최근 전사체(transcriptome) 연구는 A-to-I 편집이 단백질 코딩 서열에서 비동의적(non-synonymous) 변이를 초래하는 많은 recoding 위치들을 발견하였으며, 대부분의 A-to-I 편집 위치가 유전자의 non-coding 부분에 위치한다는 사실을 밝혀냈다. 이러한 recoding 및 non-recoding 변이는 모두 진화에 영향을 미치며, 이러한 부위의 조절에 이상이 생길 경우 질병으로 이어질 수 있다.

따라서, 암 환자의 예후 예측용 바이오마커로서 GPX 유전자를 활용하여 암 환자의 예후를 정확하게 예측함으로써, 적절한 치료방향 및 방법을 결정하여 암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.

한국공개특허 제10-2021-0146649호

일 양상은 암 환자의 예후 예측용 바이오마커로서 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자를 제공하는 것이다.

다른 양상은 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인하는 제제를 포함하는 암 환자의 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인하는 제제를 포함하는 암 환자의 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 암 환자로부터 분리된 시료 내 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인하는 단계를 포함하는 암 환자의 예후를 예측하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 억제제를 암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암 환자의 예후 개선 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 억제제를 암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 억제제의 용도를 제공하는 것이다.

일 양상은 암 환자의 예후 예측용 바이오마커로서 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자를 제공한다.

상기 용어 "암(cancer)"이란, 사멸해야 할 비정상 세포들이 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침입하여 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미하며, 종양(tumor), 신생물(neoplasma), 양성종양(benign tumor), 악성종양(malignant tumor), 암종(carcinoma), 육종(sarcoma) 등을 모두 포함한다. 또한 "암"은 "종양"과 호환성 있게 사용될 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암, 직장암, 유방암, 자궁암, 식도암, 기관지암, 신장암, 뇌암, 폐암, 피부암, 난소암, 자궁경부암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 요도암, 고환암, 후두암, 구강암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암일 수 있고, 구체적으로 유방암일 수 있고, 보다 구체적으로, 삼중음성유방암(Triple negative breast cancer, TNBC)일 수 있다. 상기 용어 "삼중음성유방암"은 유방암의 한 종류로서, 다른 종류의 유방암과는 달리 에스트로겐(ER), 프로게스테론 수용체(PR), HER-2 유전자에 대해 음성을 나타내는(ER-/PR-/HER2-) 특징을 가진 난치성 유방암이다. 이로 인해, 삼중음성유방암은 기존의 호르몬 요법 및 항-HER2 치료에 대해 내성을 나타내며, 다른 종류의 유방암에 비해 전이 및 재발 빈도가 높게 나타난다는 특징이 있다.

상기 용어 "예후"는 병세의 의학적 결과에 대한 전망 내지 예비적 평가를 의미하는 것으로, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함한다. 상기 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행, 장기 생존 가능성 또는 무병생존율 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 생존율 감소, 재발, 종양 성장, 전이, 약물 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함한다.

상기 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 구체적으로 암 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 재발, 종양 성장, 약물 저항성 치료 후 사망 가능성 또는 생존율 등)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.

상기 용어 "바이오마커"란 단백질, DNA, RNA 또는 대사 물질 등을 이용해 생체 내 변화를 측정할 수 있는 지표로, 이를 활용해 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다.

상기 "유전자"는 생물체의 개개의 유전 형질을 발현시키는 원인이 되는 인자를 의미하며, DNA 및 RNA를 포함할 수 있고, "유전자"는 “DNA”와 호환성 있게 사용될 수 있다.

일 양상에 따르면, GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자가 상기 바이오마커로 이용될 수 있다. GPX4 유전자가 코딩하는 GPX4 단백질은 glutathione peroxidase 계열에 속하는 항산화 효소로서, 과산화수소, 유기 과산화수소 및 지질 과산화물의 감소를 촉매하여 산화 스트레스로부터 세포를 보호한다. 구체적으로, GPX4 단백질의 활성 부위 내 셀레놀(selenol)이 과산화물에 의해서 셀레네익 산(selenenic acid)으로 산화되며, 이것이 글루타치온(glutathione)을 환원시켜 글루타치온 디설파이드(glutathione disulfide)를 형성하여 지질 과산화물의 감소를 유도하게 된다. 또한, GPX4 단백질은 세포 내 페롭토시스(ferroptosis) 과정을 조절하여 암의 발달에 영향을 미칠 수 있다. 일 양상에 따르면, 상기 GPX4 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 GPX4 유전자가 코딩하는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다.

일 양상에 따르면, 상기 바이오마커를 이용하여 암 환자의 예후를 정확하고 신속하게 예측할 수 있으며, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향 및 방법을 결정할 수 있어 암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 암 줄기세포(cancer stem cells, CSC) 유사 미세구역(microniches)을 찾기 위해 서로 다른 임상적 단계에 있는 5명의 삼중음성유방암 환자의 종양 조직 내 전사체 및 후성전사체를 분석하고, 미세구역을 항-CD44 및 항-ALDH1 항체로 면역화학 염색 처리한 결과, 목표 미세구역이 CD44⁺/ALDH1⁺, CD44^low/-/ALDH1^high, CD44^high/ALDH1^low/- 및 CD44^-/ALDH1^- 그룹으로 구분되었다(실시예 2 참조).

다른 실시예에 따르면, 면역화학 염색을 통해 구분한 4가지 그룹에서 종양유발성을 가진 CSC 유사 미세구역을 찾기 위하여 유전자 분석을 진행한 결과, CD44^low/-/ALDH1^high 그룹에서 CSC에 고유한 유전자 발현 패턴 및 특징들을 확인하였다(실시예 3 참조).

또 다른 실시예에 따르면, CD44^low/-/ALDH1^high 그룹에서 CSC에 고유한 유전자 발현 패턴이 많이 발견되는 원인을 분석하기 위하여, 단일 염기 해상도로 해당 미세구역의 후성전사체를 분석한 결과, 특이적인 A-to-I 편집을 발견하였고, 이는 GPX4 유전자의 1106616 위치에 존재하는 것임을 확인하였다(실시예 4 참조).

또 다른 실시예에 따르면, CD44^low/-/ALDH1^high 그룹과 페롭토시스 간 연관성을 확인하기 위하여, 해당 그룹의 후성전사체를 유전자 세트 농축 분석(gene set enrichment analysis)을 통해 분석한 결과, 해당 미세구역에서 타 미세구역 대비 예외적으로 높은 페롭토시스 유전자의 농축 값(enrichment value)이 확인되었다(실시예 5 참조).

또 다른 실시예에 따르면, GPX4 유전자 내 A-to-I 편집 여부와 페롭토시스 관련 유전자 간 연관성을 확인하기 위하여 GPX4 내 A-to-I 편집이 있는 미세구역 그룹과 없는 그룹으로 구분하여 volcano plot으로 분석한 결과, GPX4의 A-to-I 편집 여부에 따라 미세구역 내 페롭토시스 관련 유전자의 발현량이 달라짐을 확인하였고, 이는 GPX4의 A-to-I 편집이 CSC 유사 미세구역에서 이루어지는 페롭토시스에 영향을 미침을 의미한다(실시예 6 참조).

또 다른 실시예에 따르면, GPX4 유전자 내 A-to-I 편집 여부와 삼중음성유방암 환자의 임상 결과 간 연관성을 확인하기 위하여 삼중음성유방암 환자의 전사체 데이터 분석을 수행한 결과, GPX4 1106616 위치에 A-to-I 편집이 존재하는 환자들의 경우, 상기 편집이 존재하지 않는 환자들에 비해 생존율을 더 낮음을 확인함으로써, GPX4 1106616 위치의 A-to-I 편집이 암 환자의 예후를 예측 용도로 활용될 수 있음을 확인하였다(실시예 7 참조).

다른 양상은, GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인하는 제제를 포함하는 암 환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.

상기 "GPX4", "유전자", "암", "예후", "예측" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 유전자의 발현물은 상기 GPX4 유전자가 코딩하는 mRNA, 단백질 또는 이들의 단편일 수 있다. 상기 mRNA는 DNA로부터 만들어지는 RNA로, 단백질 합성과정에서 아미노산 배열을 지령할 수 있다. 상기 아미노산은 단백질을 구성하는 기본 단위로, 염기성 아미노기와 산성 카복실기를 모두 포함하는 유기산을 의미한다. 상기 단백질은 아미노산이 펩티드 결합을 하여 생긴 여러 개의 아미노산으로 이루어진 고분자 화합물로 세포를 구성하고 생체 내 물질대사의 촉매 작용을 하여 생명 현상을 유지하는 물질을 의미한다.

또한, 일 양상에 있어서, 상기 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 센스 또는 안티센스 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체, 펩티드 및 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 용어 "프라이머"란 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 5 내지 50nt의 핵산 서열을 의미한다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소(polymerase) 또는 역전사 효소(reverse transcriptase)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산 (nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

구체적으로, GPX4 유전자의 뉴클레오티드 서열 부위의 센스 (sense) 및 안티센스 (antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시한 뒤 증폭된 유전자를 Sanger 시퀀싱, 차세대 시퀀싱(next generation sequencing) 등과 같은 시퀀싱 방법으로 분석하여 특정 위치에 변이가 존재하는지 여부를 확인함으로써, 암 환자의 예후를 예측할 수 있다.

상기 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있다. 구체적으로, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 단백질은 항체, 항원, 효소, 펩티드 등을 포함할 수 있다.

상기 용어 "항체"란 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 상기 항체는 일 양상에 따른 바이오마커에 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있고, 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다. 일 양상에 따른 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 또한, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 변이 여부의 확인은 상기 GPX4 유전자가 코딩하는 mRNA의 1106616 위치의 염기, 상기 mRNA의 1106616 위치의 염기를 코딩하는 유전자의 염기 또는 상기 mRNA의 1106616 위치의 염기가 코딩하는 아미노산의 변이 여부를 확인하는 것일 수 있다.

상기 mRNA의 1106616 위치는 GPX4 유전자가 코딩하는 mRNA의 1106616 위치를 의미하며, 변이된 mRNA에는 선택적 스플라이싱 처리된 GPX4 mRNA 변이체(Genbank accession No. NM_001039848.4)가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 변이는 GPX4 유전자가 코딩하는 mRNA의 1106616 위치에서 A-to-I 편집(editing), 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism) 또는 체세포 돌연변이(somatic mutation)로 인하여 발생된 것일 수 있고, 예를 들어, 상기 변이는 rs713041의 단일염기다형성일 수 있다. 일 양상에 있어서, 상기 GPX4 유전자가 변이된 경우, 변이된 GPX4 유전자는 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 일 양상에 있어서, 상기 아미노산의 변이는 라이신(lysine)에서 세린(serine)으로 치환되는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 GPX4 유전자가 코딩하는 mRNA의 1106616 위치의 염기에 변이가 발생할 경우, 상기 mRNA의 1106616 위치의 염기가 코딩하는 아미노산이 라이신에서 세린으로 치환될 수 있으며, 이로 인해 GPX4 단백질 구조가 기존 구조와 다르게 변형됨을 확인하였다(실시예 4 참조).

일 양상에 있어서, 상기 GPX4 유전자가 코딩하는 단백질이 변이된 경우, 상기 변이된 GPX4 유전자가 코딩하는 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다.

또한, 일 양상에 있어서, 상기 변이는 A-to-I 편집(editing), 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism) 및 체세포 돌연변이(somatic mutation)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 의해 유발되는 것일 수 있다.

상기 "변이"는 DNA, RNA 및 아미노산에 발생할 수 있는 모든 구조적, 기능적 변형을 포함할 수 있으며, "변이(variant)"는 "돌연변이(mutation)"와 호환성 있게 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 변이는 A-to-I 편집(editing), 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism) 및 체세포 돌연변이(somatic mutation)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 의해 유발되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 A-to-I 편집에 의해 유발되는 것일 수 있다.

상기 암 환자의 예후 예측용 조성물을 이용해 암 환자의 GPX4 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인할 수 있으며, 이를 통해 암 환자의 예후를 정확하고 신속하게 예측할 수 있고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향 및 방법을 결정할 수 있어 암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.

또 다른 양상은, GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인하는 제제를 포함하는 암 환자의 예후 예측용 키트를 제공한다.

상기 "GPX4", "유전자", "발현물", "변이", "제제", "암", "예후", "예측" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.

상기 암 환자의 예후 예측용 키트를 이용해 암 환자의 GPX4 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인할 수 있으며, 이를 통해 암 환자의 예후를 정확하고 신속하게 예측할 수 있고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향 및 방법을 결정할 수 있어 암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.

상기 키트에는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 센스 또는 안티센스 프라이머, 앱타머, 항체, 펩티드 및 뉴클레오티드가 포함될 수 있고, 이에 추가로 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적으로, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.

상기 RT-PCR 키트는 상기 GPX4 유전자 또는 mRNA의 변이를 특이적으로 검출하기 위하여 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함할 수 있다. RT-PCR 키트는 상기 GPX4 유전자의 특정 부위에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

상기 마이크로어레이 칩은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 마이크로어레이는 기판 표면의 구분된 영역에 상기 프로브가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것을 의미한다. 상기 마이크로어레이는 상기 GPX4 유전자 또는 유전자의 발현물의 특정 부위에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

상기 단백질 칩 키트는 상기 GPX4 mRNA의 1106616 위치에서 변이가 발생한 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다. 단백질 칩 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 발색 효소로는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광 물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질로는 ABTS (2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD (o-페닐렌디아민), TMB (테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.

또 다른 양상은, 암 환자로부터 분리된 시료 내 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인하는 단계를 포함하는 암 환자의 예후를 예측하는 방법을 제공한다.

상기 "GPX4", "유전자", "발현물", "변이", "암", "예후", "예측" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.

상기 변이 여부를 확인하는 단계는 Sanger 시퀀싱, 차세대 시퀀싱(next generation sequencing) 또는 Select-seq(spatial-hisopathological examination linked epitranscriptomics converged to transcriptomics with sequencing) 등의 염기서열 분석방법을 통해 수행될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 Select-seq은 기존 시퀀싱 기술과 대비하여 정확도와 처리량이 뛰어난 기술로서, 전체 길이의 전사체 정보를 공간 정보와 함께 단일 염기 수준으로 정확하게 확인할 수 있는 새로운 염기서열 분석방법으로, 유전체, 전사체, 후성전사체 및 이들의 공간적 정보를 분석하는데 유용하게 활용될 수 있다(실시예 1 참조).

일 양상에 따르면, 상기 암 환자의 예후를 예측하는 방법은, 상기 시료 내 GPX4 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이가 존재하는 경우, 상기 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이가 존재하지 않는 암 환자에 비하여 생존율이 낮으며,

상기 시료 내 GPX4 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이가 존재하지 않는 경우, 상기 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이가 존재하는 암 환자에 비하여 생존율이 높다고 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 일 양상에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 척수액 및 복수액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로 혈액, 조직, 세포 및 림프액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암, 직장암, 유방암, 자궁암, 식도암, 기관지암, 신장암, 뇌암, 폐암, 피부암, 난소암, 자궁경부암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 요도암, 고환암, 후두암, 구강암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암일 수 있고, 구체적으로 유방암일 수 있으며, 보다 구체적으로 삼중음성유방암일 수 있다.

일 양상의 방법에 따르면, 암 환자의 GPX4 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인함으로써 암 환자의 예후를 정확하고 신속하게 예측할 수 있고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향 및 방법을 결정할 수 있어 암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.

또 다른 양상은 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 "GPX4", "유전자", "발현물", "변이", "암" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.

상기 변이 억제제는 GPX4 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이를 억제할 수 있는 모든 물질을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 변이 억제제는 RNAi를 유도할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. RNAi는 단일 가닥으로 존재하는 타겟 mRNA에 상보적으로 결합하여 double strand RNA(dsRNA)를 형성하고 이를 통해 타겟 mRNA가 저해되도록 하여 타겟 단백질의 발현을 저해하는 방식으로, 세포내 인터페론의 이상반응을 유발하지 않는 short-interfering RNA(siRNA)의 형태로 주입되거나 DICER 효소를 통해 siRNA으로 정제되는 siRNA의 전구체인 short-hairpin RNA(shRNA)의 형태로 유전자에 도입되어 활용될 수 있다. 이를 활용하면, GPX4 mRNA에 변이가 발생하더라도, 해당 변이가 존재하는 단백질의 발현을 저해함으로써 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 상기 변이 억제제는 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 유전자 치료에 활용되는 물질(예를 들어, CRISPR 단백질 및 가이드 RNA 등)을 포함할 수 있다. CRISPR는 박테리아와 같은 원핵생물이 외부에서 유입된 핵산 물질을 감지하여 제거하기 위한 목적으로 사용하는 DNA 염기서열의 일종으로 CRISPR 체계는 CRISPR-associated protein(Cas) 및 guide RNA를 함께 활용하여 높은 특이도로 핵산 내 원하는 위치의 염기서열을 편집할 수 있으며, 이러한 특성을 활용하여 CRISPR 편집기술을 유전자 치료에 활용할 수 있다. Cas13과 같은 단백질을 활용할 시, DNA 뿐만 아니라 RNA 수준에서도 원하는 위치에 편집을 유도할 수 있어 이를 RNA 기반의 유전자 치료제로 활용할 수 있다. Cas13은 RNA에 특이적으로 작용하는 CRISPR 효소 단백질로서, RNA 편집을 유도하는 ADAR 효소 및 guide RNA를 함께 활용하여 RNA 분자 상 원하는 위치에 A-to-I 편집을 유도할 수 있다. CRISPR 편집 기술을 활용함으로써, GPX4 유전자 또는 mRNA에 변이가 발생하더라도, 이에 대한 편집을 유도하여 해당 변이가 존재하는 단백질의 발현을 저해할 수 있고, 이에 따라 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

추가적으로, 상기 변이 억제제는 암 백신(cancer vaccine)을 포함할 수 있다. 상기 암 백신은 종양과 연관되어 있는 또는 종양 특이적인 단백질, 항체, 핵산, 세포 또는 이를 포함한 바이러스 또는 박테리아 벡터를 주입하여 환자 내에서 종양 특이적인 면역 반응을 유도하여 치료제로 활용할 수 있는 방법으로 차세대 면역항암제와 함께 새로운 항암 치료제로 제안되고 있다. 환자의 종양 세포 내에서 GPX4 유전자 또는 mRNA에 변이를 유도한 뒤 이를 암 백신으로 이용할 경우, 높은 수준의 면역 반응을 유도함으로써, 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

상기 용어 "예방"이란 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 상기 용어 "치료"란 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 용어 "투여"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 약학적 조성물을 개체에게 물리적으로 도입하는 것을 의미한다.

상기 용어 "개체"란 암의 치료를 필요로 하는 대상을 의미한다. 구체적으로, 인간 또는 영장류, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 말, 돼지, 토끼 및 소 등의 포유류를 의미한다.

상기 "약학적 조성물"은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.

구체적으로, 상기 담체는 예를 들어, 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres) 또는 나노 구형입자일 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.

상기 약학적 조성물이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 동맥내 주사, 골수내 주사, 심장내 주사, 경막내 주사, 경피주사, 비강내 주사, 장관내 주사, 국소주사, 설하 주사, 또는 흉부내 주사 주입방식과 같은 비경구 투여 및 경구 투여가 가능할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있다. 예를 들어, 격일로 투여되는 것일 수도 있으며, 일주일에 하루 투여되는 것일 수도 있다.

상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 새롭게 개발되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 혼합되어 제공될 수 있다. 상기 약학적 조성물이 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 더 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 단독 투여 또는 다른 항암제와 병용 투여되는 것일 수 있다. 즉, 상기 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 항암제와 병행하여 투여될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 "GPX4", "유전자", "발현물", "변이 억제제", "암", "투여", "예후" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.

상기 용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

상기 "GPX4", "유전자", "발현물", "변이 억제제", "암", "투여", "예방", "치료" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.

상기 "GPX4", "유전자", "발현물", "변이 억제제", "암", "예방", "치료" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.

일 양상에 따르면, GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인함으로써, 암 환자, 특히 삼중음성유방암 환자의 예후를 예측할 수 있음을 확인하였는 바, GPX4 유전자를 바이오마커로서 활용할 수 있다. 나아가, 상기 바이오마커를 이용하여, 암 환자의 예후를 개선하거나 암의 예방 또는 치료가 가능한 바, 상기 바이오마커는 다양한 용도로 활용될 수 있다.

도 1은 ROI(regions of interest)를 자동적으로 분리할 수 있는 소프트웨어를 나타낸다.
도 2는 전체 길이의 공간적 전사체 및 후성전사체를 단일 염기 수준으로 분석할 수 있는 Select-seq(Spatial-histopathological examination-linked epitranscriptomics converged to transcriptomics with sequencing)의 과정을 개략적으로 나타낸다.
도 3a는 PFA로 고정된 세포와 메탄올로 고정된 세포의 FPKM(Fragments per kilobase of transcript per million mapped reads) 값을 나타낸다.
도 3b는 벌크 RNA-seq 데이터와 PFA 또는 메탄올로 고정된 세포의 Select-seq 데이터 간 상관관계를 나타낸다.
도 4는 Select-seq을 검증하기 위하여 HEK 293T, HuT-78 및 IM-9 세포주를 이용한 여러 실험 결과를 나타낸다.
도 4a는 관측되는 유전자의 수(FPKM 값) 및 엑손 정렬도를 나타낸다.
도 4b는 전체 길이 전사체에서 보여지는 3' 말단 편향(bias)을 나타낸다.
도 4c는 PCA(Principal component analysis) 분석 결과를 나타낸다.
도 4d는 비지도적 클러스터 히트맵(unsupervised clustering heatmap) 분석 결과를 나타낸다.
도 4e는 HEK 293T 및 HuT-78 세포주의 전사체 아이소폼(isoform) 다양성을 나타낸다.
도 5는 5명의 삼중음성유방암(TNBC) 환자의 서로 다른 임상적 단계를 나타낸다.
도 6은 5명의 삼중음성유방암 환자의 ROI에서 유래한 전사체 데이터의 PCA 분석 결과를 나타낸다.
도 7a는 삼중음성유방암 환자 A의 조직 A 내 ROI를 타겟한 결과를 나타낸다.
도 7b는 조직 A를 Hoechst 염료, 항-CD44 및 항-ALDH1 항체로 면역화학염색한 결과를 나타낸다.
도 7c는 조직 A 내 CD44⁺/ALDH1⁺, CD44^low/-/ALDH1^high, CD44^high/ALDH1^low/- 및 CD44^-/ALDH1^- 그룹에서의 면역화학염색 결과를 확대한 이미지 및 이와 대응되는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 결과를 나타낸다.
도 7d는 조직 A 내 72번 목표 구역에서의 전사체, 후성전사체 및 유전자 발현 프로필 결과를 나타낸다.
도 7e는 조직 A 내 전사체 및 후성전사체 지점을 바코드로 매핑한 결과를 나타낸다.
도 8은 조직 A에서의 전체 길이 전사체 품질의 균일성을 검증하기 위한 실험 결과를 나타낸다.
도 8a는 PCA 분석 결과를 나타낸다.
도 8b는 ROI에서 관측되는 유전자 수 및 아이소폼의 수를 나타낸다.
도 9는 CD44⁺/ALDH1⁺, CD44^low/-/ALDH1^high, CD44^high/ALDH1^low/- 및 CD44^-/ALDH1^- 그룹에서 발현되는 유전자 패턴을 나타낸다.
도 10a는 CD44⁺/ALDH1⁺, CD44^low/-/ALDH1^high, CD44^high/ALDH1^low/- 및 CD44^-/ALDH1^- 그룹에서의 A-to-I 편집 비율 및 ADAR 유전자 발현 정도를 나타낸다.
도 10b는 ADAR과 ADAR 패밀리인 ADARB1 및 ADARB2의 유전자 발현 히트맵(heatmap)을 나타낸다.
도 10c는 ADAR 아이소폼에 대한 공간적 히트맵을 나타낸다.
도 11은 A 조직에서 발견된 A-to-I 편집이 유전체상 위치하는 장소를 나타낸다.
도 12는 CD44⁺/ALDH1⁺, CD44^low/-/ALDH1^high, CD44^high/ALDH1^low/- 및 CD44^-/ALDH1^-의 그룹별로 엑손 구역에서 발생하는 A-to-I 편집에 대한 히트맵을 나타낸다.
도 13a는 A 조직에서의 A-to-I 편집체(editome)를 CD44⁺/ALDH1⁺, CD44^low/-/ALDH1^high, CD44^high/ALDH1^low/- 및 CD44^-/ALDH1^-의 그룹별로 분석한 결과를 나타낸다.
도 13b는 A 조직 내 총 A-to-I 편집을 조직에 공간적으로 매핑한 결과를 나타낸다.
도 14는 조직 B, C, D 및 E에서 A-to-I 편집체를 공간적으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 15a는 CD44⁺/ALDH1⁺, CD44^low/-/ALDH1^high, CD44^high/ALDH1^low/- 및 CD44^-/ALDH1^- 그룹에서 ADAR 유전자의 수, ADAR 유전자 발현 정도 및 A-to-I 편집 수를 나타낸다.
도 15b는 CD44⁺/ALDH1⁺, CD44^low/-/ALDH1^high, CD44^high/ALDH1^low/- 및 CD44^-/ALDH1^- 그룹에서 측정한 A-to-I 편집 수와 ADAR 유전자 발현과의 상관관계를 나타낸다.
도 16은 물리적 거리에 따라 분류된 공간 그룹에서 보존되는 특이적인 A-to-I 편집을 나타낸다.
도 17은 ROI의 공간적 위치 및 유전자 발현을 이용한 응집 클러스터로 그린 계층도 및 해당 클러스터를 조직 A 위에 표시한 이미지를 나타낸다.
도 18은 서로 다른 공간 클러스터 그룹에서의 차등 발현 분석(differential expression analysis) 결과를 나타낸다.
도 19는 CD44⁺/ALDH1⁺, CD44^low/-/ALDH1^high, CD44^high/ALDH1^low/- 및 CD44^-/ALDH1^- 그룹에서 철(iron) 조절과 관련된 유전자에 발생한 단일 염기 RNA 편집 히트맵을 나타낸다.
도 20은 GPX4 1106616 위치에 정렬된 A-to-I 편집을 검증하기 위한 모세관 전기영동 시퀀싱 결과를 나타낸다.
도 21은 비동의적(non-synonymous) A-to-I 편집된 GPX4 구역과 GPX4 유전자 발현 간 상관관계를 나타낸다.
도 22는 A-to-I 편집으로 인한 아미노산 및 단백질 구조 변화를 나타낸다.
도 23은 GPX4 유전자의 1106616 위치를 Sanger 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱(next generation sequencing)으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 24는 CD44⁺/ALDH1⁺, CD44^low/-/ALDH1^high, CD44^high/ALDH1^low/- 및 CD44^-/ALDH1^- 그룹에서의 유전자 세트 농축 분석(gene set enrichment analysis) 결과를 나타낸다.
도 25는 4명의 삼중음성유방암 환자로부터 채취한 조직 B, C, D 및 E를 나타낸다.
도 26은 조직 B, C, D 및 E에서, GPX4 내 A-to-I 편집이 있는 미세구역 그룹과 없는 그룹으로 구분한 volcano plot을 나타낸다.
도 27a는 삼중음성유방암 환자의 벌크 전사체 데이터와 GPX4 1106616 변이를 페롭토시스 유전자 농축 값으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 27b는 페롭토시스 유전자 농축 값이 높은 환자 그룹 및 낮은 환자 그룹의 Kaplan-Meier 방법으로 분석한 생존율을 나타낸다.
도 28은 삼중음성유방암 환자의 생존율과 다양한 변수 간 상관관계를 나타낸다. 각각 환자의 생존율과 ADAR1 발현량(a), ADAR2 발현량(b), ADAR3 발현량(c), 총 ADAR 발현량(d), A-to-I 편집 수(e), GPX4 내 A-to-I 및 SNP 여부(f) 및 GPX4 내 A-to-I 빈도수(g)와의 상관관계를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참조예

참조예 1. 관심영역(Region of interest, ROI) 격리

SLACS(Spatially-resolved Laser Activated Cell Sorter) 기기는 조직에서 샘플을 고처리량으로 회수하기 위한 광학 모듈과 기계 모듈로 구성되며, 회수된 목표물을 처리하기 위한 두 개의 전동 스테이지가 존재한다. X-Y 축 전동 스테이지(ACS Motion Control, Migdal, Israel)는 목표물의 공간적 위치를 제어하기 위해 제작되었으며 컴퓨터와 통신하여 장치를 자동으로 제어할 수 있다. 한 스테이지는 샘플 슬라이드를 로딩하기 위한 것이고, 다른 스테이지는 분리된 세포를 수확하기 위한 튜브를 로딩하기 위한 것이다.

또한, 대물렌즈를 통해 레이저 펄스가 적용될 위치를 관찰하기 위해 전하결합소자(CCD) 카메라(Jenoptik, Jena, Germany)를 설치하였다. 네오디뮴이 도포된 이트륨 알루미늄 가넷(Nd:YAG) 나노초 레이저는 Continuum(Minilite™ Series ML II; Continuum, San Jose, CA)에서 구입하였다. 광원과 대물 렌즈 사이의 광 경로에 슬릿이 위치하여 분리될 영역을 제어하며, 슬릿은 수동 또는 자동으로 제어되어 레이저 펄스의 크기를 조정한다. 다양한 배율의 대물 렌즈는 Mitutoyo에서 구입했으며, 긴 작업 공간은 사용자의 편의를 위해 렌즈와 샘플 사이에 더 많은 공간을 제공한다.

참조예 2. SLACS 통신 시스템

Python 스크립트를 통해 두 가지 소프트웨어를 설계하였다. 첫 번째 소프트웨어는 사용자가 분리할 세포를 선택할 수 있도록 구축되었다. 전체 슬라이드 이미지를 서버를 통해 사용자와 공유하였으며, 사용자는 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 조직 이미지를 탐색하면서 관심 세포를 선택하기 위해 소프트웨어를 실행하였다. 선택 이후, 프로그램은 ROI에 대한 위치 정보가 포함된 텍스트 파일과 선택한 목표물이 원본 이미지에 투명한 파란색으로 오버레이된 이미지 파일을 생성한다.

두 번째 소프트웨어는 SLACS 기기의 자동 제어를 위한 것으로, 이를 이용하여 사용자는 슬릿을 제어하고, 대물 렌즈를 교체하며 전동 스테이지를 조정할 수 있으며, 첫 번째 소프트웨어에서 두 가지 파일이 로드될 때 자동적인 목표물의 분리가 가능하게 한다. 모든 조직 샘플은 자동 기능을 사용하여 분리되었으며, 세포주 실험은 수동으로 수행되었다.

참조예 3. 세포 배양

인간 HEK 293T 세포(cat # 21573), 인간 IM-9 세포(cat # 10159), 인간 HuT 78 세포(cat # 90078), 및 쥐 NIH3T3 세포(cat # 21658)는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 구입했으며 제조업체의 지침에 따라 증식시켰다. HEK 293T 세포를 1% 페니실린-스트렙토마이신(Corning, New York, USA) 및 10% 소태아 혈청(HyClone, Massachusetts, USA)이 포함된 DMEM(Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, USA)에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. IM-9 세포를 1% 페니실린-스트렙토마이신(Corning) 및 10% 소 태아 혈청(HyClone)이 포함된 RPMI 1640(Thermo Fischer Scientific)에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. HuT 세포를 1% 페니실린-스트렙토마이신(Corning) 및 10% 소태아 혈청(HyClone)이 포함된 DMEM(Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, USA)에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. NIH3T3 세포를 1% 페니실린-스트렙토마이신(Corning) 및 10% 소 혈청(HyClone)과 함께 DMEM(Thermo Fischer Scientific)에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

HEK 293T 세포 및 NIH3T3 세포와 같은 부착 세포를 50~80%의 합류점까지 성장시킨 후 5분간 TrypLE(Invitrogen, California, USA)로 처리하고 동일한 부피의 성장 배지로 급랭시켜 3분간 1500 rpm으로 회전시켰다. 또한, IM-9 및 HuT 78 세포와 같은 현탁 세포는 2 x 10⁵ 내지 5 x 10⁵ cells/mL의 농도까지 성장시키고 1500 rpm에서 3분간 회전시켰다. 그 후, 상층액을 제거하고 세포를 10 μl RNase Inhibitor(Invitrogen, California, USA)가 포함된 1 mL의 1x PBS에 재현탁하고 1500 rpm에서 3분 동안 다시 회전시켰다. 상층액을 다시 제거하고 세포를 10 μl로 재현탁하고 ITO(indium tin oxide) 유리(Fine Chemicals Industry, Korea)에 도말하였다. 파라포름알데히드(PFA) 고정을 위해 도말된 세포를 4% PFA 용액(Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, USA)에서 37℃ 하에 15분간 고정하였고, 메탄올(MeOH) 고정을 위해 도말된 세포를 증류수에 70%, 90% 및 99% MeOH로 30초간 연속적으로 고정하고 역순으로 30초간 침지하여 재수화시켰다.

참조예 4. 조직 준비

조직 절편은 서울대학교 암연구소 유방암생물학 연구실 바이오리포지토리에서(Archives of the biorepository of Lab of Breast Cancer Biology at the Cancer Research Institute, Seoul National University) 획득하였다. 조직 준비는 서울대학교병원 기관심사위원회(SNUH, IRB No. 1405-088-580)의 승인을 받아 진행하였다. PFA 고정을 위해 조직 절편을 얼음 위의 PBS에서 4% PFA로 15분 동안 고정한 다음 1% 재조합 RNase 억제제(Takara, 일본)를 포함하는 차가운 PBS로 두 번 세척한 뒤 얼음 위에서 3분간 공기 건조시켰다. 또한, MeOH 고정을 위해 증가하는 메탄올 농도(75, 95 및 99% MeOH, 각각 30초)에서 조직 절편을 고정하고 얼음 위에서 1분 동안 공기 건조하였다.

헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해, 공기 건조 과정을 제외하고 상기 4% PFA 고정 과정을 통해 조직 절편을 고정하였다. 이 후, 조직 절편을 Mayer's haematoxylin(Sigma-Aldrich, Germany)으로 1분 동안 염색하고 bluing buffer (Agilent Dako, US, California)를 30초간 처리한 후 eosin(Sigma-Aldrich, Germany)으로 10초 동안 염색하였다. 염색 중 각 완충액 교환 과정 사이에 증류수를 사용하여 샘플을 30초 동안 세척하였으며, 그 이후 샘플을 70% MeOH에 30초 동안 담그고 얼음 위에서 1분 동안 공기 건조하였다.

면역형광염색을 위해, 공기 건조 과정을 제외하고 상기 4% PFA 고정 과정을 통해 조직 절편을 고정하였다. 이 후, 조직 절편을 얼음 위에서 15분 동안 1% BSA를 포함한 PBS로 처리하였고, 1차 항체(1:200)를 용액에 희석시킨 뒤, 슬라이드를 1차 항체와 함께 15분간 얼음 위에서 배양한 후에 차가운 PBS로 2번 세척하였다. 조직 절편을 얼음 위에서 3분 동안 공기 건조하고 현미경(Nikon Eclipse Ti)을 통해 형광 이미지를 확인하였다. 1차 항체로 CD4(Abcam, UK, ab181724), CD8(Abcam, UK, ab251596), CD14(Abcam, UK, ab230903) 및 CD19(Abcam, UK, ab237772)에 대한 항체를 사용하였으며, 각 항체에 대해 Alexa 488(Abcam, UK, ab236553), TxRed(Abcam, UK, ab195225), Cy3(Abcam, UK, ab188287) 및 Cy5(Abcam, UK, ab188288)와 같은 형광 접합체 키트를 사용하였다.

참조예 5. 수정된 Smart-seq2

세포를 용해하기 위해 분리된 세포를 0.2% Triton X-100(Sigma-Aldrich, Germany) 및 2 U/μl의 재조합 RNase 억제제(40 U/μl, Takara, Japan)로 구성된 약한 저장성 용해 완충액 2 μl, 10 mM oligo-dT 프라이머(Macrogen, Korea, 5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3') 1 μl, 및 10 mM dNTP mix(Takara, Japan) 1 μl와 함께 0.2 ml 박벽 PCR 튜브에 첨가한 뒤 72℃에서 15분 동안 배양한 다음 즉시 얼음 위에 처리하였다.

PFA 고정 샘플의 경우 고정 세포를 2.5 mg/ml Proteinase K(10 mg/ml, Sigma-Aldrich, Germany) 및 nuclease free water(Invitrogen, California, USA)로 구성된 효소 용해 완충액 2 μl, oligo-dT 프라이머 1 μl, 및 dNTP mix(Takara) 1 μl와 함께 0.2 ml 박벽 PCR 튜브에 첨가한 뒤 50℃에서 1시간, 70℃에서 20분 간 배양한 후 즉시 얼음 위에 처리하였다.

추출된 RNA에서 얻은 cDNA는 이전에 보고된 SMART-seq2 프로토콜에 하기 수정사항을 적용하여 준비되었다.

0.5 μl SuperScript II (200 U/μl, Invitrogen, California, USA), 0.25 μl 재조합 RNase 억제제 (40 U/μl, Takara, Japan), 2 μl SuperScript II First-Strand Buffer (5 x, Invitrogen, California, USA), 0.25 μl dichlorodiphenyltrichloroethane (DTT) (100 mM, Invitrogen, California, USA), 2 μl betaine (5 M, Sigma-Aldrich, Germany), 0.06 μl MgCl2 (1 M, Sigma-Aldrich, Germany), 0.1 μl template switching oligo (TSO) (100 μM, Bioneer, Korea, 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+G-3′) 및 0.59 μl nuclease-free water(Qiagen, Germany)가 포함된 6 μl의 첫 번째 가닥 반응 혼합물을 준비하였고, KAPA HotStart HIFI 2x Ready Mix (Kapa Biosystems, Switzerland) 12.5 μl, PCR primers (10 μM, Macrogen, Korea, 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′) 0.25 μl, 및 nuclease-free water (Qiagen, Germany) 2.25 μl로 이루어진 추가적인 PCR 혼합물로 단일 세포의 RNA에 대해 상기 프로그램의 방법대로 20 또는 25회 PCR을 수행하여 cDNA를 증폭하였다. PCR 산물은 CeleMag 비드(Celemics, Korea)를 사용하여 정제되었으며, 정제된 cDNA의 평균 단편 길이는 1.2% agarose gel 내에서 전기영동을 통해 측정하였고, cDNA의 농도는 제조사의 프로토콜에 따라 Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit(Life Technologies, California, USA)를 사용하여 측정하였다.

참조예 6. 차세대 시퀀싱

과활성 E54K 및 L372P 돌연변이를 야생형 Tn5에 도입한 pTXB1 클로닝 벡터를 Addgene에서 획득하였고, 기존의 프로토콜에 따라 pTXB1 Tn5 및 그 돌연변이체를 발현 및 정제하였다. 이 후, Illumina NextSeq 시퀀싱 플랫폼에서 50-bp paired-end 시퀀싱을 수행한 결과, 샘플당 평균 약 600 M의 read depth를 확인하였다.

참조예 7. Read 정렬 및 유전자 정량

Cutadapt를 사용하여 가공되지 않은 시퀀싱 read를 역다중화하고 트리밍하였다. 이 후, 시퀀싱 품질이 15보다 작고 길이가 25bp보다 짧은 read를 필터링하였다. 나머지 read는 STAR aligner의 기본 설정값을 이용하여, 마우스 세포주 샘플의 경우 마우스 게놈(GRCm38)에 대해 정렬하였고, 인간 세포주 샘플 및 유방암 샘플의 경우 인간 게놈(GRCh38)에 대해 정렬하였다.

각 샘플의 고유하게 매핑된 read는 다운스트림 차등 발현 분석을 위한 기본 매개변수가 있는 featureCounts 및 FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)을 위한 기본 매개변수가 있는 RSEM(RNA-seq by expectation-maximization)을 통해 계산하였다. 유전자 발현을 정량화 및 정규화하기 위해 FeatureCounts의 데이터를 DESeq2에서 수행되는 정규화방법으로 처리하였다.

참조예 8. 공간적 유전자 발현 시각화

공간적 유전자 발현은 정규화된 FeatureCounts의 유전자 발현 데이터와 분리 프로세스 전에 얻은 상기 맞춤형 소프트웨어에 의해 선택되고 분리된 샘플의 위치 정보 데이터를 사용하여 Python 및 matplotlib에 표시하였다.

참조예 9. 차등 유전자 발현 분석

샘플과 선택된 공간 영역 간의 차등 유전자 발현을 분석하기 위하여, DESeq2를 사용하여 차등 유전자 발현 분석을 수행하였다. log2-fold 변화값이 1보다 크고 조정된 p-value가 0.05보다 작은 유전자만을 차등적으로 발현된 유전자로 간주하였다.

경로 분석은 DESeq2를 통해 정규화된 발현 count에 대하여 R package gage를 사용하여 수행되었으며 매핑된 경로는 R package pathview를 통해 시각화되었다. 유전자 발현 수준은 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes) 또는 MSigDB(Molecular Signatures Database) 분석에 의해 해당 경로에 매핑되었다. 안정적인 삼중 음성 유방암(TNBC) 하위 유형의 최적 수는 Lehmann TNBC 하위 유형의 유전자 목록을 사용하여 결정하였다.

참조예 10. REDItools를 이용한 RNA editing 분석

STAR로 정렬 read에서 REDItools를 이용하여 RNA 편집 장소를 검출하였으며, 위양성 발생을 줄이기 위해 Harsh 매개변수 설정(-c 10,10 -m 25,25 -v 3 -q 25,25 -e -n 0.1 -u -l -p)을 적용하였다.

이미 알려진 아데노신-이노신(A-to-I) 편집 장소 목록은 REDIportal 데이터베이스에서 다운로드하였으며, 알려진 편집 장소만 선택하였다. 총 20,367개의 편집 장소가 관측되어 추가적인 A-to-I 편집 분석에 적용하였다.

참조예 11. CIBERSORT

다른 샘플의 세포 유형 비율은 주석이 달린 단일 세포 데이터를 사용하여 세포 유형별 특정 signature 유전자를 감지하는 cibersortx를 사용하여 추정하였으며, 입력 값으로 featureCounts에서 각 샘플별 고유하게 매핑된 read 수를 사용하였다. Cibersortx에 필요한 signature matrix로 NSCLC PBMCs Single Cell RNA-Seq signature matrix를 사용했으며, 세포 유형 비율은 기본 매개변수로 계산하였다.

참조예 12. 데이터 처리

Genomic Data Commons Data Portal을 통해 TCGA에서 추가로 115개의 TNBC 정렬 RNA-seq 파일을 얻었고, 생존 여부 분석을 위해 각 샘플에 해당하는 임상 데이터를 얻었다.

각 샘플의 고유하게 매핑된 read 수는 featureCounts를 사용하여 계산하였고, 정상 조직에서 추출한 6개의 샘플을 제외한 나머지 109개의 샘플에 대하여 ferroptosis(hsa04216)와 관련된 경로 분석을 수행하였다.

ferroptosis 관련 유전자가 다른 샘플보다 더 많이 발현되어 통계적으로 양의 값을 가지는 샘플들은 상향 조절(upregulated) 그룹으로 구분하였고, 통계적으로 음의 값을 가지는 샘플들은 하향 조절(downregulated) 그룹으로 구분하였으며, 통계적으로 구분되지 않는 샘플은 negative 그룹으로 구분한 결과, 상향 조절 그룹과 하향 조절 그룹에는 각각 70개와 39개의 샘플이 포함되었다.

각 그룹의 A-to-I 편집 빈도 밀도는 바이올린 플롯으로 표현되었으며, 검은색 사각형은 빈도의 중앙값을 표시한다. Lifelines python package(version 0.25.7)를 사용하여 해당 그룹의 생존 분석을 수행하였고, 추적 관찰 기간이 30일 미만인 환자를 제외하고, HER2, ER, PR 발현이 적은 삼중음성유방암 환자에 대해 상향 조절된 그룹과 하향 조절된 그룹을 비교하는 Kaplan-Meier 분석을 수행하였다. 두 그룹의 생존 곡선은 log-rank 테스트('lifelines.statistics.logrank_test')를 사용하여 비교하였다.

실시예

실시예 1. 공간적 전사체 전체 서열을 단일 염기 수준에서 분석하기 위한 Select-seq 개발

(1) Select-seq의 개발 배경

암 미세환경은 전사체(transcriptome)의 특징 및 후성전사체(epitranscriptome)의 특징이 서로 이질적인 여러 미세구역(microniches)으로 구성되어 있다. 후성전사체의 변형 중 하나로, ADAR(adenosine deaminased acting on RNA) 효소가 매개하는 A-to-I 편집이 존재하는데, 이는 암 미세환경에서 기능적 또는 병리학적으로 영향을 미칠 수 있는 비동의적(non-synonymous) 코돈 변화를 일으킬 수 있다. 기존의 기술로 전사체 및 후성전사체의 공간적 정보를 분석할 경우, 시퀀싱 정확도가 떨어지는 문제가 있어 전체 길이의 전사체 정보를 공간 정보와 함께 단일 염기 수준으로 정확하게 확인할 수 있는 새로운 Select-seq(spatial-hisopathological examination linked epitranscriptomics converged to transcriptomics with sequencing) 기술을 완성하였다(표 1 참조).

(2) Select-seq의 수행 방법

얼려진 10 μm 두께의 조직 샘플을 PFA(paraformaldehyde)로 고정시킨 뒤, 면역형광 염색을 통해 조직 슬라이드의 이미지를 얻어 개발된 소프트웨어를 실행시키면 ROI(regions of interest)가 표시되며(도 1 참조), 조직 샘플에 펄스 레이저를 조사해 ROI를 분리시킨 뒤, 회수 PCR 튜브에 넣어 용해시키고 역전사 및 PCR 증폭을 진행한다. 분리된 각각의 ROI는 별개의 PCR 튜브에 각각 바코드를 표시하여 구분하였으며, Illumnia 시퀀싱 플랫폼을 이용해 전체 길이의 전사체 데이터를 생성할 수 있다(도 2 참조).

(3) Select-seq으로 얻은 데이터 검증

Select-seq을 통해 얻은 전체 길이의 전사체 데이터 품질을 검증하기 위하여, 하기 실험들을 수행하였다.

우선, PFA로 고정된 세포와 메탄올로 고정된 세포의 FPKM(fragments per kilobase of exon model per million reads mapped) 값을 측정하였고(도 3a 참조), 벌크 RNA-seq 데이터와 PFA로 고정된 세포 데이터 및 메탄올로 고정된 세포 데이터의 상관관계를 비교하였다. 그 결과, PFA로 고정된 세포 데이터의 경우 R값이 0.83으로, 메탄올로 고정된 세포의 R값인 0.74보다 높아, 벌크 RNA-seq 데이터와 보다 높은 상관관계를 확인하였다(도 3b 참조).

추가적으로, PFA로 고정된 인간 유래의 세 개의 세포주 HEK 293T, HuT-78 및 IM-9을 이용해 FPKM 값 및 엑손 정렬도 분석, 전체 길이 전사체의 3' 말단 편향(bias) 분석, PCA(principal component analysis) 분석 및 비지도적 클러스터 히트맵(unsupervised clustering heatmap) 분석을 수행하였으며, HEK 293T 및 HuT-78의 전체 길이 전사체 데이터를 통해 전사 아이소폼(isoform) 다양성을 분석하였다.

그 결과, HEK 293T, HuT-78 및 IM-9의 순서대로 관측된 유전자 수는 각각 4928, 2096 및 730.75개였으며, 엑손 정렬도는 각각 52.80%, 57.81% 및 57.65%로 나타났다(도 4a 참조). 전체 전사체 증폭에 5' 말단 편향이 측정되었으며(도 4b 참조), PCA 및 히트맵 분석을 통해 유전자 발현 프로필에 따라 세포주를 구분할 수 있음을 확인하였고(도 4c 및 4d 참조), HEK 293T 및 HuT-78의 전체 길이 전사체 데이터를 통해 선택적 스플라이싱 변이 프로필을 확인하였다(도 4e 참조).

실시예 2. 삼중음성유방암(TNBC) 환자의 조직 내 전사체 및 후성전사체 분석

삼중음성유방암 환자의 공간적 전사체 및 후성전사체를 분석하기 위해 5명의 서로 다른 임상적 단계(도 5 참조)에 있는 환자 A, B, C, D 및 E의 조직 샘플 A, B, C, D 및 E에 Select-seq을 수행하였고, PCA를 통해 5명의 환자의 전사체 데이터를 분석하였다(도 6 참조). 또한, 원발 종양 조직 내에서 암 줄기세포(cancer stem cells, CSC) 유사 미세구역을 찾기 위해, 조직 A(ID: 190603) 내 목표 구역을 설정한 뒤(도 7a 참조), PFA로 고정된 얼린 조직 A를 Hoechst 염료, 항-CD44 및 항-ALDH1 항체로 면역화학 염색 처리하였다(도 7b 참조). 참고로 도 7a 및 도 7b에 삽입된 스케일바의 크기는 500㎛이다.

그 결과, 106개의 목표 ROI 그룹을 각각 CD44⁺/ALDH1⁺, CD44^low/-/ALDH1^high, CD44^high/ALDH1^low/- 및 CD44^-/ALDH1^- 그룹으로 구분했으며(도 7c 및 표 2 참조), 각 구역의 전사체 및 후성전사체를 분석하였고, 이를 조직 그림에 바코드로 매핑하였다(도 7d 및 7e 참조). 참고로 도 7c에 삽입된 스케일바의 크기는 100㎛이다.

각 그룹의 전체 길이 전사체 품질의 균일성은 PCA 분석(도 8a 참조)과 106개의 ROI에서 관측되는 유전자 수 및 아이소폼(isoform)의 수를 비교하여 검증하였다(도 8b 참조).

실시예 3. CD44 ^low/- /ALDH1 ^high 염색 미세구역의 종양유발성 확인

면역화학 염색을 통해 구분한 4가지 그룹에서 종양유발성을 가진 CSC 유사 미세구역을 찾아내기 위하여, 유전자 분석을 진행하였다.

그 결과, CD44^low/-/ALDH1^high 그룹에서 CSC에 고유한 유전자 발현 패턴 및 특징들을 확인하였다(도 9 참조). 이는 CD44^low/-/ALDH1^high 그룹이 종양유발성을 가지고 있음을 의미하므로, 종양유발성의 원인을 규명하기 위하여 CD44^low/-/ALDH1^high 미세구역의 전사체 및 후성전사체를 하기에서 보다 자세하게 분석하였다.

실시예 4. CD44 ^low/- /ALDH1 ^high 염색 미세구역 내 특이적인 A-to-I 편집체(editome) 확인

CD44^low/-/ALDH1^high 그룹에서 CSC에 고유한 유전자 발현 패턴이 많이 발견되는 원인을 분석하기 위하여, 단일 염기 해상도로 해당 미세구역의 후성전사체를 분석한 결과, 특이적인 A-to-I 편집체를 발견하였다.

A-to-I 편집이란, 이중가닥 RNA에서 이루어지는 전사 후 아데노신의 디아민화로 인해 아데노신이 이노신으로 바뀌는 비가역적 반응으로, ADAR 패밀리에 의해 촉매되고, 바뀐 이노신 염기는 구아닌 염기로 시퀀싱된다. ADAR 유전자는 균일하게 발현되어 조직 전체의 A-to-I 편집에 영향을 미친다(도 10a, 10b 및 10c 참조).

REDItools를 이용하여, A 조직에서 총 12,879개의 A-to-I 편집을 확인하였으며, 632개가 반복 구역에서, 546개가 비반복 구역에서 발견되었고, 11,030개가 Alu 구역에서 확인되었다. GENCODE 레퍼런스에 따르면, 편집된 엑손 구역은 약 1% 정도에 해당하며, 그 중 약 80%가 비동의적(non-synonymous) 편집에 해당한다(도 11 참조). 엑손 구역에서의 A-to-I 편집을 히트맵(heatmap)으로 나타냈고(도 12 참조), A 조직에서 공간적 A-to-I 편집체를 분석하고 이를 조직에 매핑하였으며(도 13a 및 13b 참조), 그 외 4개의 조직에서도 공간적 A-to-I 편집체를 분석하였다(도 14 참조).

A-to-I 편집이 기술적 차이에 의함이 아님을 증명하기 위하여, A-to-I 편집의 수와 관측된 유전자의 수 및 ADAR 유전자 발현과의 상관관계를 확인하였다.

그 결과, A-to-I 편집의 수는 ADAR 유전자 발현과 강한 상관관계를 확인하였으나, 관측된 ADAR 유전자의 수와는 유의미한 상관관계를 확인하지 못한 바, 조직 전체에서 발견된 A-to-I 편집이 유의미한 RNA 편집임을 증명하였다(도 15a 및 15b 참조).

또한, A-to-I 편집체는 면역화학 염색과 ROI간 물리적 거리에 따라 분류된 공간 그룹에 대해 특이적인 A-to-I 편집 패턴을 나타낸다. 구체적으로, ROI간 물리적 거리에 따라 분류된 각각의 클러스터에서 A-to-I 편집 패턴이 보존되며(도 16 참조), ROI 각각의 공간적 위치 및 유전자 발현을 이용한 응집 클러스터를 계층도(hierarchy tree)로 나타낸 뒤 해당 클러스터를 조직 A 이미지 위에 표시하였다(도 17 참조).

추가적으로, 각각의 공간 클러스터 그룹에서 고유하게 발현되는 총 798개의 A-to-I 편집을 발견하였는데, 이를 차등 발현 분석(differential expression analysis)를 통해 분석한 결과, 서로 다른 유전자를 발현하고 있음을 확인하였다(도 18 참조).

면역화학 염색에 특이적인 A-to-I 편집체에서, 특징적인 비동의적(non-synonymous) A-to-I 편집이 GPX4의 1106616(rs713041) 위치에 정렬되어 있음을 확인하였다. 구체적으로, CD44^low/-/ALDH1^high ROI에서 유래된 선택적 스플라이싱 변이가 존재하는 GPX4 (Genbank accession No. NM_001039848.4)에서 다른 미세구역과 대비하여 정렬도가 높았으며(도 19 참조), 0.23 내지 0.80의 발현 빈도수 범위를 확인하였고(표 3 참조), 이를 모세관 전기영동 시퀀싱(capillary electrophoresis sequencing, Sanger sequencing)으로 검증하였다(도 20 참조).

추가적으로, GPX4의 1106616 위치를 Illumina 시퀀싱 플랫폼으로 분석한 결과, 아데노신이 구아닌으로 100% 치환됨을 확인하였는데, 이는 Illumina 시퀀싱 플랫폼의 기술적 한계로 이노신이 구아닌으로 분석된 것으로 판단된다(표 4 참조).

또한, 상기 비동의적 A-to-I 편집된 GPX4 구역과 GPX4 유전자 발현 간 분포를 조사한 결과 상관관계가 없음을 확인하였는데(도 21 참조), 이에 대한 원인을 규명하기 위하여 A-to-I 편집이 발생한 단백질을 단백질 구조 시뮬레이션을 통해 분석하였다.

그 결과, A-to-I 편집으로 인해 아미노산이 라이신(lysine)에서 세린(serine)으로 바뀌어 GPX4 단백질 구조가 기존 구조와 다르게 변형됨을 확인하였다(도 22 참조). 또한, GPX4 유전자의 1106616 위치를 Sanger 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱(next generation sequencing)으로 분석한 결과, 아데노신 염기만이 관측됨을 확인하였다(도 23 참조).

실시예 5. CD44 ^low/- /ALDH1 ^high 염색 미세구역과 페롭토시스(ferroptosis) 간 연관성 확인

CD44^low/-/ALDH1^high 미세구역의 후성전사체를 유전자 세트 농축 분석(gene set enrichment analysis)을 통해 분석한 결과, 해당 미세구역에서 타 미세구역 대비 예외적으로 높은 페롭토시스 유전자의 농축 값(enrichment value)이 확인되었다(도 24 참조). 페롭토시스란. 지방 활성산소(lipid ROS)를 통한 세포 사멸 과정으로, GPX4 단백질에 의해 조절되며, 아폽토시스(apoptosis)와는 구별되는 과정이다. CD44^low/-/ALDH1^high 미세구역에서 페롭토시스 유전자의 농축 값이 높다는 사실은 해당 미세구역이 삼중음성유방암에 대한 약물의 새로운 표적이 될 수 있음을 의미한다.

추가적으로, ALDH1^high ROI의 ALU 구역에서 A-to-I 편집을 발견하였는데, 해당 편집이 많을수록 삼중음성유방암 환자의 예후가 악화된 바, 이는 상기 편집이 ALDH1^high 미세구역에서 일종의 고유한 후성전사체적 특징이 될 수 있음을 의미한다.

실시예 6. GPX4 유전자 내 A-to-I 편집(editing)과 페롭토시스(ferroptosis) 관련 유전자 간 연관성 확인

GPX4 유전자 내 A-to-I 편집 여부와 페롭토시스 관련 유전자 간 연관성을 확인하기 위하여, 선행 화학요법(neoadjuvant chemotherapy)을 받은 4명의 환자로부터 각각 조직 B(ID: 180908T), C(ID: 180807T), D(ID: 190422T) 및 E(ID: 200710T)를 채취하여 161개의 목표 구역에 Select-seq를 수행하였고(도 25 참조), 조직 B, C, D 및 E에서 각각 미세구역 내 GPX4 유전자를 확인한 뒤, GPX4 내 A-to-I 편집이 있는 미세구역 그룹과 없는 그룹으로 구분하여 volcano plot으로 표시하였다(도 26 참조).

그 결과, GPX4 내 A-to-I 편집이 있는 미세구역에서 철 흡수 단백질을 코딩하는 유전자인 TFRC는 하향 조절(downregulated)되고, 철 저장 단백질 ferritin을 코딩하는 유전자인 FTH1/FTL 및 지질 ROS 제거 관련 단백질을 코딩하는 유전자인 GPX4는 상향 조절(upregulated)됨을 확인하였다. 또한, GPX4 내 A-to-I 편집이 있는 미세구역에서, 페롭토시스를 일으키는 VDAC3 유전자가 발현되었는데, 이는 VDAC3에 결합하여 페롭토시스를 유도하는 erastin과 같은 약물에 대해 해당 미세구역이 저항성을 가지지 않음을 의미한다.

GPX4 내 A-to-I 편집이 없는 미세구역의 경우, CSC 내에서 하향 조절되는 것으로 알려진 TFAP2C, ITGB6, 및 SPINT2 유전자가 과발현됨을 확인하였다. GPX4의 A-to-I 편집 여부에 따라 페롭토시스 관련 유전자의 발현량이 달라짐을 확인함으로써, GPX4의 A-to-I 편집이 CSC 유사 미세구역에서 이루어지는 페롭토시스에 영향을 미침을 확인하였다.

실시예 7. GPX4 유전자 내 A-to-I 편집(editing)과 삼중음성유방암(TNBC) 환자의 임상 결과 간 연관성 확인

GPX4 유전자 내 A-to-I 편집 여부와 실제 삼중음성유방암 환자의 임상 결과 간 연관성을 확인하기 위하여, 삼중음성유방암 환자의 전사체 데이터 분석을 수행하였다. 총 109명의 환자의 데이터를 분석하였으며, 상기 데이터는 TCGA(The cancer genome atlas)에서 획득하였다.

그 결과, 80명의 환자가 GPX4에 A-to-I 편집, 단일염기다형성(SNP) 또는 체세포 돌연변이를 가지고 있었으며, 전사체 데이터에서 GPX4 변이의 빈도 중간값이 높을수록 페롭토시스 관련 유전자의 농축 값(enrichment value)이 높아짐을 확인하였다(도 27a 참조). 또한, Kaplan-Meier 방법을 이용하여 두 개의 그룹의 생존율을 비교한 결과, 전사체 수준에서 GPX4 1106616 변이의 빈도가 높으며 페롭토시스 관련 유전자의 농축 값이 높은 그룹은 변이의 빈도가 낮은 그룹에 비해서 좋지 않은 임상 결과를 보여주었다(도 27b 참조).

추가적으로, ADAR 유전자의 조합, 총 A-to-I 편집 수 및 GPX4 내의 SNP 여부와 생존율과의 연관관계를 확인하기 위해 ADAR1 발현 여부, ADAR2의 발현 여부, ADAR3의 발현 여부, 조합된 ADAR의 발현 여부, A-to-I 편집 여부, A-to-I 편집 및 SNP의 발현 여부 및 A-to-I 편집 빈도에 따른 생존율과의 연관관계를 분석하였다.

그 결과, GPX4 1106616 변이만이 페롭토시스 관련 유전자의 농축 값에 따라 나뉘어진 그룹의 생존율 차이와 강한 상관관계를 보여주었다(도 28 참조).

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> A biomarker for predicting prognosis in patients with cancer and use thereof <130> SDP-2022-1028 <150> KR 10-2021-0045928 <151> 2021-04-08 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1326 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tacgctgagt gtggtttgcg gatcctggcc ttcccgtgta accagttcgg gaagcaggtg 60 ggctgctgcg tccccggggc ccgcagaggc gggtgggtgg gggtcggggt gggctccagc 120 ctggagaggg cctgggagtg tgcagggggc ccggactgag ggggtgccag cccccgactc 180 actcacacac cttggccgcc acaggagcca gggagtaacg aagagatcaa agagttcgcc 240 gcgggctaca acgtcaaatt cgatatgttc agcaagatct gcgtgaacgg ggacgacgcc 300 cacccgctgt ggaagtggat gaagatccaa cccaagggca agggcatcct gggaaagtgc 360 gtgacctctg gggacagtac ggctgctggg gtgggggtgg gggggctgct gggatgctca 420 cacctccctg gggcagaatg gctcatggct cggggggcgg ttgcggggag gtgctgggac 480 tctcacatcg cgtggcctcc tgggggtaag atggctcagg gggacataga gggctgtgga 540 ggcagccagg gatgcccaca cctttgtggc ctcctgggga caggatggct cgggggcctg 600 tggggggctg ttgggactct cacactgcat ggcctcctgg ggtaagatgg ctctgggggg 660 gcttgggggc actgtggctg tggaggcagc cggggaagct cacacccttg tggcctcctg 720 gagacaggac agcttgggga ctgtgggggg ctgctgggga cgctcacgtc catgtgcttc 780 ttttccagtg ccatcaagtg gaacttcacc aaggtaaggg ggctgtgggg ggtaggggac 840 cagcttcccc tggccacagc cgtggcccag atgggcagcg gacaggaagg gcagcctcag 900 ccccttgcag gggtggcccc acagtttgga caccgtctct ccacagttcc tcatcgacaa 960 gaacggctgc gtggtgaagc gctacggacc catggaggag cccctggtag gtcctctcta 1020 gggagcccgc ttgaggctcg ggggcttggg aggtagctgc cctaacccag ctttcctccc 1080 cgacaggtga tagagaagga cctgccccac tatttctagc tccacaagtg tgtggccccg 1140 cccgagcccc tgcccacgcc cttggagcct tccaccggca ctcatgacgg cctgcctgca 1200 aacctgctgg tggggcagac ccgaaaatcc agcgtgcacc ccgccggagg aaggtcccat 1260 ggcctgctgg gcttggctcg gcgcccccac ccctggctac cttgtgggaa taaacagaca 1320 aattag 1326 <210> 2 <211> 436 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Ala Glu Cys Gly Leu Arg Ile Leu Ala Phe Pro Cys Asn Gln Phe 1 5 10 15 Gly Lys Gln Val Gly Cys Cys Val Pro Gly Ala Arg Arg Gly Gly Trp 20 25 30 Val Gly Val Gly Val Gly Ser Ser Leu Glu Arg Ala Trp Glu Cys Ala 35 40 45 Gly Gly Pro Asp Gly Gly Ala Ser Pro Arg Leu Thr His Thr Pro Trp 50 55 60 Pro Pro Gln Glu Pro Gly Ser Asn Glu Glu Ile Lys Glu Phe Ala Ala 65 70 75 80 Gly Tyr Asn Val Lys Phe Asp Met Phe Ser Lys Ile Cys Val Asn Gly 85 90 95 Asp Asp Ala His Pro Leu Trp Lys Trp Met Lys Ile Gln Pro Lys Gly 100 105 110 Lys Gly Ile Leu Gly Lys Cys Val Thr Ser Gly Asp Ser Thr Ala Ala 115 120 125 Gly Val Gly Val Gly Gly Leu Leu Gly Cys Ser His Leu Pro Gly Ala 130 135 140 Glu Trp Leu Met Ala Arg Gly Ala Val Ala Gly Arg Cys Trp Asp Ser 145 150 155 160 His Ile Ala Trp Pro Pro Gly Gly Lys Met Ala Gln Gly Asp Ile Glu 165 170 175 Gly Cys Gly Gly Ser Gln Gly Cys Pro His Leu Cys Gly Leu Leu Gly 180 185 190 Thr Gly Trp Leu Gly Gly Leu Trp Gly Ala Val Gly Thr Leu Thr Leu 195 200 205 His Gly Leu Leu Gly Asp Gly Ser Gly Gly Ala Trp Gly His Cys Gly 210 215 220 Cys Gly Gly Ser Arg Gly Ser Ser His Pro Cys Gly Leu Leu Glu Thr 225 230 235 240 Gly Gln Leu Gly Asp Cys Gly Gly Leu Leu Gly Thr Leu Thr Ser Met 245 250 255 Cys Phe Phe Ser Ser Ala Ile Lys Trp Asn Phe Thr Lys Val Arg Gly 260 265 270 Leu Trp Gly Val Gly Asp Gln Leu Pro Leu Ala Thr Ala Val Ala Gln 275 280 285 Met Gly Ser Gly Gln Glu Gly Gln Pro Gln Pro Leu Ala Gly Val Ala 290 295 300 Pro Gln Phe Gly His Arg Leu Ser Thr Val Pro His Arg Gln Glu Arg 305 310 315 320 Leu Arg Gly Glu Ala Leu Arg Thr His Gly Gly Ala Pro Gly Arg Ser 325 330 335 Ser Leu Gly Ser Pro Leu Glu Ala Arg Gly Leu Gly Arg Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Phe Pro Pro Arg Gln Val Ile Glu Lys Asp Leu Pro His Tyr Phe 355 360 365 Leu His Lys Cys Val Ala Pro Pro Glu Pro Leu Pro Thr Pro Leu Glu 370 375 380 Pro Ser Thr Gly Thr His Asp Gly Leu Pro Ala Asn Leu Leu Val Gly 385 390 395 400 Gln Thr Arg Lys Ser Ser Val His Pro Ala Gly Gly Arg Ser His Gly 405 410 415 Leu Leu Gly Leu Ala Arg Arg Pro His Pro Trp Leu Pro Cys Gly Asn 420 425 430 Lys Gln Thr Asn 435 <210> 3 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified GPX4 gene <400> 3 tacgctgagt gtggtttgcg gatcctggcc ttcccgtgta accagttcgg gaagcaggtg 60 ggctgctgcg tccccggggc ccgcagaggc gggtgggtgg gggtcggggt gggctccagc 120 ctggagaggg cctgggagtg tgcagggggc ccggactgag ggggtgccag cccccgactc 180 actcacacac cttggccgcc acaggagcca gggagtaacg aagagatcaa agagttcgcc 240 gcgggctaca acgtcaaatt cgatatgttc agcaagatct gcgtgaacgg ggacgacgcc 300 cacccgctgt ggaagtggat gaagatccaa cccaagggca agggcatcct gggaaagtgc 360 gtgacctctg gggacagtac ggctgctggg gtgggggtgg gggggctgct gggatgctca 420 cacctccctg gggcagaatg gctcatggct cggggggcgg ttgcggggag gtgctgggac 480 tctcacatcg cgtggcctcc tgggggtaag atggctcagg gggacataga gggctgtgga 540 ggcagccagg gatgcccaca cctttgtggc ctcctgggga caggatggct cgggggcctg 600 tggggggctg ttgggactct cacactgcat ggcctcctgg ggtaagatgg ctctgggggg 660 gcttgggggc actgtggctg tggaggcagc cggggaagct cacacccttg tggcctcctg 720 gagacaggac agcttgggga ctgtgggggg ctgctgggga cgctcacgtc catgtgcttc 780 ttttccagtg ccatcaagtg gaacttcacc aaggtaaggg ggctgtgggg ggtaggggac 840 cagcttcccc tggccacagc cgtggcccag atgggcagcg gacaggaagg gcagcctcag 900 ccccttgcag gggtggcccc acagtttgga caccgtctct ccacagttcc tcatcgacaa 960 gaacggctgc gtggtgaagc gctacggacc catggaggag cccctggtag gtcctctcta 1020 gggagcccgc ttgaggctcg ggggcttggg aggtagctgc cctaacccag ctttcctccc 1080 cgacaggtga tagagaagga cctgccccac tatttctagc tccacaagtg tgtggccccg 1140 cccgagcccc tgcccacgcc ctcggagcct tccaccggca ctcatgacgg cctgcctgca 1200 aacctgctgg tggggcagac ccgaaaatcc agcgtgcacc ccgccggagg aaggtcccat 1260 ggcctgctgg gcttggctcg gcgcccccac ccctggctac cttgtgggaa taaacagaca 1320 aattag 1326 <210> 4 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified GPX4 protein <400> 4 Tyr Ala Glu Cys Gly Leu Arg Ile Leu Ala Phe Pro Cys Asn Gln Phe 1 5 10 15 Gly Lys Gln Val Gly Cys Cys Val Pro Gly Ala Arg Arg Gly Gly Trp 20 25 30 Val Gly Val Gly Val Gly Ser Ser Leu Glu Arg Ala Trp Glu Cys Ala 35 40 45 Gly Gly Pro Asp Gly Gly Ala Ser Pro Arg Leu Thr His Thr Pro Trp 50 55 60 Pro Pro Gln Glu Pro Gly Ser Asn Glu Glu Ile Lys Glu Phe Ala Ala 65 70 75 80 Gly Tyr Asn Val Lys Phe Asp Met Phe Ser Lys Ile Cys Val Asn Gly 85 90 95 Asp Asp Ala His Pro Leu Trp Lys Trp Met Lys Ile Gln Pro Lys Gly 100 105 110 Lys Gly Ile Leu Gly Lys Cys Val Thr Ser Gly Asp Ser Thr Ala Ala 115 120 125 Gly Val Gly Val Gly Gly Leu Leu Gly Cys Ser His Leu Pro Gly Ala 130 135 140 Glu Trp Leu Met Ala Arg Gly Ala Val Ala Gly Arg Cys Trp Asp Ser 145 150 155 160 His Ile Ala Trp Pro Pro Gly Gly Lys Met Ala Gln Gly Asp Ile Glu 165 170 175 Gly Cys Gly Gly Ser Gln Gly Cys Pro His Leu Cys Gly Leu Leu Gly 180 185 190 Thr Gly Trp Leu Gly Gly Leu Trp Gly Ala Val Gly Thr Leu Thr Leu 195 200 205 His Gly Leu Leu Gly Asp Gly Ser Gly Gly Ala Trp Gly His Cys Gly 210 215 220 Cys Gly Gly Ser Arg Gly Ser Ser His Pro Cys Gly Leu Leu Glu Thr 225 230 235 240 Gly Gln Leu Gly Asp Cys Gly Gly Leu Leu Gly Thr Leu Thr Ser Met 245 250 255 Cys Phe Phe Ser Ser Ala Ile Lys Trp Asn Phe Thr Lys Val Arg Gly 260 265 270 Leu Trp Gly Val Gly Asp Gln Leu Pro Leu Ala Thr Ala Val Ala Gln 275 280 285 Met Gly Ser Gly Gln Glu Gly Gln Pro Gln Pro Leu Ala Gly Val Ala 290 295 300 Pro Gln Phe Gly His Arg Leu Ser Thr Val Pro His Arg Gln Glu Arg 305 310 315 320 Leu Arg Gly Glu Ala Leu Arg Thr His Gly Gly Ala Pro Gly Arg Ser 325 330 335 Ser Leu Gly Ser Pro Leu Glu Ala Arg Gly Leu Gly Arg Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Phe Pro Pro Arg Gln Val Ile Glu Lys Asp Leu Pro His Tyr Phe 355 360 365 Leu His Lys Cys Val Ala Pro Pro Glu Pro Leu Pro Thr Pro Ser Glu 370 375 380 Pro Ser Thr Gly Thr His Asp Gly Leu Pro Ala Asn Leu Leu Val Gly 385 390 395 400 Gln Thr Arg Lys Ser Ser Val His Pro Ala Gly Gly Arg Ser His Gly 405 410 415 Leu Leu Gly Leu Ala Arg Arg Pro His Pro Trp Leu Pro Cys Gly Asn 420 425 430 Lys Gln Thr Asn 435

Claims

암 환자의 예후 예측용 바이오마커로서 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자.
청구항 1에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암, 직장암, 유방암, 자궁암, 식도암, 기관지암, 신장암, 뇌암, 폐암, 피부암, 난소암, 자궁경부암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 요도암, 고환암, 후두암, 구강암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 암인, GPX4 유전자.
청구항 2에 있어서, 상기 유방암은 삼중음성유방암(Triple negative breast cancer, TNBC)인, GPX4 유전자.
GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인하는 제제를 포함하는 암 환자의 예후 예측용 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 유전자의 발현물은 상기 GPX4 유전자가 코딩하는 mRNA, 단백질 또는 이들의 단편인, 암 환자의 예후 예측용 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 제제는 상기 유전자 또는 유전자의 발현물에 특이적으로 결합하는 센스 또는 안티센스 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체, 펩티드 및 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 암 환자의 예후 예측용 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 변이 여부의 확인은 상기 GPX4 유전자가 코딩하는 mRNA의 1106616 위치의 염기, 상기 mRNA의 1106616 위치의 염기를 코딩하는 유전자의 염기 또는 상기 mRNA의 1106616 위치의 염기가 코딩하는 아미노산의 변이 여부를 확인하는 것인, 암 환자의 예후 예측용 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 아미노산의 변이는 라이신(lysine)에서 세린(serine)으로 치환되는 것인, 암 환자의 예후 예측용 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 변이는 A-to-I 편집(editing), 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism) 및 체세포 돌연변이(somatic mutation)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 의해 유발되는 것인, 암 환자의 예후 예측용 조성물.
GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인하는 제제를 포함하는 암 환자의 예후 예측용 키트.
암 환자로부터 분리된 시료 내 GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 여부를 확인하는 단계를 포함하는 암 환자의 예후를 예측하는 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 시료 내 GPX4 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이가 존재하는 경우, 상기 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이가 존재하지 않는 암 환자에 비하여 생존율이 낮으며,
상기 시료 내 GPX4 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이가 존재하지 않는 경우, 상기 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이가 존재하는 암 환자에 비하여 생존율이 높다고 판단하는 단계를 더 포함하는, 암 환자의 예후를 예측하는 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 암 환자의 예후를 예측하는 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 암은 삼중음성유방암인, 암 환자의 예후를 예측하는 방법.
GPX4(glutathione peroxidase 4) 유전자 또는 상기 유전자의 발현물의 변이 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 15에 있어서, 상기 암은 삼중음성유방암인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.