CN116514988B - 一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体及其应用。所述纳米抗体具有如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4、SEQ ID No.9～SEQ ID No.14其中之一所示的氨基酸序列。所述纳米抗体特异性强、耐高温、耐酸碱、易保存，且生产成本低，生产周期短，能够作为谷胱甘肽过氧化物酶4的特异性检测试剂，并且可以通过靶向谷胱甘肽过氧化物酶4成功诱发肿瘤细胞铁死亡，具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

Description

一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体及其应用。
背景技术
铁死亡是近年来发现的一种铁依赖性的，受调控的新型细胞死亡方式，区别于细胞凋亡、坏死等其他形式的细胞死亡。铁死亡是细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化诱导的细胞死亡，受细胞内信号通路的严密调节。谷胱甘肽过氧化物酶4(GlutathionePeroxidase 4,GPX4)是铁死亡的负调节剂，其以谷胱甘肽(GSH)为还原剂催化脂质过氧化物还原成相应的醇，从而阻止脂质过氧化的发生。GPX4处在细胞铁代谢稳态和氧化还原稳态的交叉点上，被证实在铁死亡中起着关键作用。
据报道，相比于正常组织，GPX4在肿瘤组织中的表达量明显升高，且被证实是通过调节ROS分子来影响肿瘤上皮细胞-间充质转化过程。所以抑制GPX4的活性可以使ROS含量增加，从而导致细胞发生铁死亡。研究表明，GPX4的抑制剂可以有效地诱导经药物治疗的癌症耐药株发生铁死亡，而对健康细胞无明显影响，故GPX4现已成为解决肿瘤耐药问题的重要药物靶点。
纳米抗体(nanobody，NB)是一种新型的基因工程抗体。1993年比利时科学家在双峰驼科动物身上发现了天然缺失轻链的重链抗体，后来人们通过基因工程技术表达出这种重链抗体的抗原结合区，这种单个结构域的重链抗体片段是目前人们通过基因工程手段制备出的具有抗原识别与结合能力的最小抗体片段，其分子量大小只有15kD左右，仅为传统抗体的十分之一。纳米抗体长方体的结构特点会暴露出与抗原结合的突出表位，这使它们更易于靶向传统抗体无法接触到的受体间隙或结合口袋。这种新型抗体具有低免疫原性、高稳定性、高亲和力、高特异性等特点。
发明内容
本发明提供了一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体及其应用。本发明利用噬菌体展示技术得到一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)纳米抗体，所述纳米抗体具有较高的检测灵敏度、特异性，也具有作为肿瘤治疗药物的潜力。
为了实现上述目的，本发明通过以下方案予以实现的：
本发明提供了一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体，其具有如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4、SEQ ID No.9～SEQ ID No.14其中之一所示的氨基酸序列。
优选的，所述纳米抗体具体为氨基酸序列分别如SEQ ID No.9～SEQ ID No.14所示的纳米抗体NB-GPX4-12E、NB-GPX4-4C、NB-GPX4-5C、NB-GPX4-5F、NB-GPX4-12E-CPP和NB-GPX4-4C-CPP。
本发明还提供了一种所述的纳米抗体的编码基因，其具有如SEQ ID No.5～SEQID No.8、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16其中之一所示的核苷酸序列，其分别编码的是如SEQID No.1～SEQ ID No.4、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种重组载体，其中含有所述的编码基因。
优选的，所述载体为pComb3xss。
本发明还提供了一种重组细胞，其中含有所述的编码基因。
优选的，所述重组细胞为大肠杆菌细胞。
本发明还提供了所述的纳米抗体、所述的编码基因、所述的重组载体、或者所述的重组细胞在制备谷胱甘肽过氧化物酶4特异性检测试剂中的应用。
进一步的，所述纳米抗体检测谷胱甘肽过氧化物酶4的检测限不小于1.15nM。
本发明还提供了一种用于检测谷胱甘肽过氧化物酶4的试剂盒，其中含有所述的纳米抗体。
进一步的，所述试剂盒中还包括酶标二抗、显色剂和终止剂。
优选的，所述纳米抗体采用的是NB-GPX4-12E、NB-GPX4-4C、NB-GPX4-5C和NB-GPX4-5F。
本发明还提供了所述的纳米抗体在制备抗肿瘤的药物中的应用。
进一步的，所述纳米抗体NB-GPX4-12E-CPP通过靶向谷胱甘肽过氧化物酶4诱发肿瘤细胞的铁死亡，达到抗肿瘤的作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首先免疫双峰驼，而后利用免疫后的双峰驼淋巴细胞建立抗体基因文库，此抗体基因文库纳米抗体基因多样性好，再用噬菌体展示技术，将检测抗原固相包被于酶标板上，投入双峰驼免疫抗体文库进行亲和淘筛，获得靶向GPX4的纳米抗体。所述纳米抗体具有较高的检测灵敏度、特异性与热稳定性，能够在常温条件下长时间运输、储存与使用，且操作简单、所耗时间较短，可通过基因工程重组表达的方式即将编码该纳米抗体的基因克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行所述纳米抗体的大量制备。并且，所述纳米抗体在GPX4的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间，本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他药物蛋白靶点纳米抗体的筛选和制备，具有较高的应用价值。除此之外，本发明提供的纳米抗体可以在细胞内特异性结合GPX4并诱导肿瘤细胞发生铁死亡，显示了其在抗肿瘤药物领域的应用前景。
附图说明
图1为GPX4免疫过程中血清效价和抑制率变化趋势图；
图2为氨基酸序列如SEQ ID No.1-3所示的GPX4纳米抗体的SDS-PAGE图；
图3为GPX4纳米抗体对GPX4进行定量检测的数据图；
图4为GPX4纳米抗体的细胞荧光成像图；
图5为GPX4纳米抗体对RC2细胞增殖的影响图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：双峰驼免疫抗体文库的构建
1、双峰驼免疫方案
用健康的双峰驼进行动物免疫，以谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)作为免疫抗原，在双峰驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mg。
首次免疫用0.5mL完全弗氏佐剂与免疫抗原混合乳化后用于免疫，后续的加强免疫用0.5mL不完全弗氏佐剂与抗原乳化后免疫，每次免疫间隔2周，共进行4次加强免疫。
从第二次免疫起，每次免疫一周后取10mL双峰驼血液分离血清，用于检测免疫应答情况。第三、第四、第五次免疫一周后，分别取50mL双峰驼外周血分离淋巴细胞备用。
2、免疫应答情况的监测
采用ELISA方法对免疫应答情况进行监测，具体操作如下：
(1)检测抗原固定化：将谷胱甘肽过氧化物酶4作为抗原，用包被液(0.375g Na2CO3与0.7325g NaHCO3加水定容至250mL)将其稀释至1μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃静置过夜。次日将酶标板用稀释20倍的洗液PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)洗涤两次，在吸水纸上拍干。每孔加入150μL 1％ BSA-PBS(w/v)进行封闭，37℃静置2小时。倒出孔内液体，在37℃烘箱中倒置30～60分钟。干燥后的酶标板可直接用于ELISA检测，也可以装入密封袋中，于4℃保存。
(2)免疫反应：将双峰驼血清先稀释1000倍，然后进行两倍梯度稀释，一共稀释7个浓度梯度，最后一个梯度为空白对照。把梯度稀释的血清加入到包有谷胱甘肽过氧化物酶4的酶标板中，每孔100μL，37℃孵育40分钟，用稀释20倍的洗液PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)洗板5次，在吸水纸上拍干。
(3)加入酶标二抗：Anti-VHH-HRP(GenScript A01861-200)二抗用PBST稀释5000倍，每孔加100μL，37℃孵育30分钟，用稀释20倍的洗液PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)洗板5次，在吸水纸上拍干。
(4)TMB底物显色反应及终止：将TMB底物液A和B液(Solarbio，PR1210)等体积提前混合，每孔加入100μL，37℃孵育10分钟，每孔加入50μL终止反应。
(5)读数与数据分析：用酶标仪读取450nm下的吸光值(OD450 nm)。根据免疫应答结果，选择效价和抑制率最高的淋巴细胞进行纳米抗体的制备。
本实施例中共进行6次双峰驼免疫，免疫应答情况如图1所示，从三免开始，双峰驼血清效价与免疫前的阴性血清相比已经有了显著提升；免疫应答在四、五次已经达到稳定。因此取第四、第五次免疫的血进行建库。
3、双峰驼淋巴细胞的分离
取双峰驼全血与等体积生理盐水体积比1:1混合成稀释血液，常温放置。在无菌的50mL离心管中加入20mL的淋巴分离液，用无菌巴氏滴管沿着试管壁缓慢加入20mL的稀释血液。500g离心30分钟。取淋巴细胞层到新的50mL离心管，用生理盐水稀释2倍，4℃条件下2000g离心10分钟，弃上清。用5mL生理盐水吹散淋巴细胞，再次2000g离心10分钟，弃上清，以充分洗涤淋巴细胞。每份淋巴细胞中加入裂解液(TRNsol)，1mL一份，分装到2mL离心管中，于-80℃保存备用。
4、总RNA的提取
总RNA的提取依据Invitrogen公司的Trizol试剂方法进行。具体方法如下：
将上述裂解液每1mL加入0.2mL的氯仿。盖上离心管盖子，剧烈震荡15秒，在冰上孵育5分钟。室温下12000rpm离心10分钟。转移不多于80％上层水相至新的离心管，缓慢加入0.7倍体积的无水乙醇，混匀；将得到溶液和沉淀一起转入GBC吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃废液；向GBC吸附柱中加入500μL Wash Buffer I离心1分钟，弃废液；向GBC吸附柱中加入600μL Wash Buffer II，12000rpm，离心30秒，弃废液。12000rpm离心1分钟，弃废液，室温打开盖子晾干吸附柱中残留漂洗液。将GBC吸附柱转入一个新的离心管中，加入30～100μL超纯水，室温放置2分钟，4℃，12000rpm离心1分钟。收集管内液体，于-80℃保存。
5、cDNA的合成
以RNA为模板，参照Takara公司第一链反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。具体方法为：
(1)按照表1所示的cDNA合成的第一步反应体系，将试剂在无核酸酶的离心管中混合，在冰浴下操作；
表1 cDNA合成的第一步反应体系
总RNA 3μg
Oligo(dT)18primer 1μL
RNase free ddH2O 补充至12μL
总计 12μL
(2)上述反应体系65℃孵育5分钟，冰浴冷却2分钟；
(3)按照表2所示的cDNA合成的第二步反应体系，在上一步反应后的体系中加入试剂；
表2 cDNA合成的第二步反应体系
上一步反应后的体系 12μL
5×Reaction Buffer 4μL
RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL) 1μL
10mM dNTP Mix 2μL
RevertAid M-MiLVRT(200U/μL) 1μL
总计 20μL
(4)42℃孵育60分钟，70℃孵育5分钟。反转录产物cDNA于-80℃保存。
6、纳米抗体目的基因VHH的扩增
采用巢式PCR进行两步法扩增得到纳米抗体目的基因VHH，所用到的引物序列如表3所示：
表3双峰驼重链抗体基因引物序列
第一轮PCR用cDNA作为其PCR模板，具体反应参数如表4和表5所示：
表4巢式PCR第一步反应体系
表5巢式PCR第一步反应条件
94℃ 5分钟
94℃ 30 s
55℃ 30 s
72℃ 1分钟,go to step2,30 cycle
72℃ 10分钟
4℃ Forever
第一步PCR产物在核酸电泳后会出现1000 bp以及750 bp两种产物条带，对750 bp条带进行切胶回收，并测定浓度。
第二轮PCR用第一轮PCR回收产物作为模板进行第二轮PCR扩增，具体反应参数如表6和7所示：
表6巢式PCR第二步反应体系
表7巢式PCR第二步反应条件
7、基因文库构建
(1)VHH目标基因及载体的酶切
采用Sfi I酶对VHH目标基因及pComb3xss载体进行酶切反应。酶切条件：50℃恒温反应16小时。
pComb3xss载体酶切产物通过琼脂糖凝胶回收分子量为3500bp的条带；VHH基因酶切产物通过DNA回收试剂盒直接清洁回收。
(2)酶切产物的连接
将载体pComb3xss和VHH片段混匀(摩尔比1：3)，16℃反应16小时后用DNA回收试剂盒清洁回收。
(3)电击转化
取5μL连接产物加入50μL电转感受态E.coil TG1中，轻轻混匀后转移到0.1cm的电转杯中电击转化(电压为1.8kv)，电击后立即向电转杯加入950μL预热到37℃的SOC培养基，37℃250rpm摇菌1小时复苏细胞。
取100μL复苏菌液进行梯度稀释，将各浓度梯度稀释菌液各取100μL涂布于直径90mm的LB-Amp培养皿作为计数板，37℃培养过夜。剩余未稀释的复苏菌液全部涂布于直径120mm的LB-Amp培养皿，每1mL菌液涂布于2～3个培养皿作为扩增板，37℃扩增培养过夜。
统计计数培养皿上的菌落数，计算复苏菌液中的细菌总数，进行多次电击转化，使转化菌落总数累计达到107cfu以上，本次进行了多次电转化，每管感受态TG1所建立的细菌库的库容量为109。
将扩增板中的转基因大肠杆菌菌落用细胞刮刀刮下，混合均匀后加入终浓度为25％的甘油(v/v)，取50μL菌液进行梯度稀释测定细胞数，其余菌液分装后于-80℃冻存，即为谷胱甘肽过氧化物酶4纳米抗体基因库。
8、噬菌体救援
接种超过10倍库容量的细胞于200mL LB(Amp)中37℃，250rpm培养至OD600约0.4～0.6；加入辅助噬菌体M13K07(20:1感染复数)，37℃静置30分钟后，250rpm培养1小时，加入卡那抗生素(1：1000)37℃，250rpm培养过夜。12000rpm 4℃15分钟离心，取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl(100g PEG 8000与73.05g氯化钠加水定容至500mL)，冰浴2～3小时。12000rpm 4℃15分钟离心，弃上清，沉淀用1mL TBS重悬，转移到2mL离心管，12000rpm 4℃5分钟离心，过0.22μm聚醚砜滤膜，取10μL测定库容，其余加入终浓度50％甘油，-80℃保存。
实施例2：纳米抗体的亲和淘选及其鉴定
1、纳米抗体的亲和淘选
用包被液(0.375g Na2CO3与0.7325g NaHCO3加水定容至250mL)将谷胱甘肽过氧化物酶4稀释至100μg/mL，加入酶标板微孔中，每孔100μL，4℃静置过夜。第二天用稀释20倍的洗液PBST(0.01M PBS，0.05％ Tween-20)洗板两次后，每孔加入150μL 1％BSA-PBS(w/v)溶液37℃静置2小时。倒出孔内液体，在吸水纸上拍干并在37℃下烘1小时后存于4℃备用。
将实施例1得到的谷胱甘肽过氧化物酶4纳米抗体噬菌体文库中加入BSA，使BSA终浓度为1％(w/v)，将含有1％ BSA的噬菌体库(w/v)加入固定化抗原的微孔中，每孔加入100μL，37℃孵育1小时。弃去孔中未结合的噬菌体，用PBST洗涤微孔10次，再用PBS洗涤微孔5次后。将10mg/mL的胰蛋白酶加入孔中，每孔100μL，室温孵育1小时，用于洗脱掉结合的噬菌体。随后将微孔中的液体收集到无菌离心管中，第一轮筛选完成。取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染4mL生长至对数期的E.coil TG1菌株进行扩增。第三天用5倍稀释的PEG/NaCl溶液(100g PEG 8000与73.05g氯化钠加水定容至500mL)沉淀扩增后噬菌体，并测定噬菌体的滴度。
以上筛选步骤一共进行4轮，每轮的淘筛情况如下：
2、阳性克隆的鉴定
采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：
(1)抗原固定化
用包被液(0.375g Na2CO3与0.7325g NaHCO3加水定容至250mL)将谷胱甘肽过氧化物酶4人工抗原B-BSA稀释至1μg/mL，4℃静置过夜。第二天用稀释20倍的洗液PBST(0.01MPBS，0.05％ Tween-20)洗涤两次后，用PBS现配2％的脱脂奶粉(w/v)，每孔加入150μL，37℃进行封闭2小时，弃去封闭液，37℃烘干60分钟，存放于4℃待用。
(2)纳米抗体小量表达
第三、四轮淘筛的竞争洗脱的output滴度测定平板上随机挑选30个单菌落，接种到每孔装有0.5mL LB-Amp的96孔板中，同时接种一个未被噬菌体侵染的E.coil TG1单菌落作为阴性对照，37℃培养过夜，作为菌液“母板”。
从母板中每孔取出10μL菌液接种到另一块每孔装有1mL LB-Amp的96孔深孔板中，接种的孔编号要与母版对应，37℃，180rpm培养3小时，每孔加入IPTG使其最终工作浓度为1mM，37℃180rpm培养过夜，母板4℃保存备用。
(3)酶联免疫鉴定阳性克隆
深孔板4000rpm离心20分钟，取一块有固定化抗原的酶标板，每孔加入100μL离心后的96孔板的上清。37℃孵育40分钟，用稀释20倍的洗液PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)洗五次，拍干孔内液体。用PBST将Anti-VHH-HRP(GenScript,A01861-200)二抗稀释5000倍，每孔加入100μL，37℃孵育30分钟。用稀释20倍的洗液PBST(0.01M PBS，0.05％ Tween-20)洗五次，拍干孔内液体，每孔加入100μL预先用等体积显色A液与显色B液(Solarbio，PR1210)混合的TMB显色液，37℃显色10分钟；加入50μL终止液10％ H2SO4(v/v)终止反应；用酶标仪测定450nm处的吸收吸光值。
选取在板中OD值大于阴性对照孔3倍的克隆，记录其对应孔的编号，并将母板中对应孔的菌液转移到无菌离心管中，加入甘油冻存备用。
将经过ELISA鉴定获得的纳米抗体的噬菌体克隆送到测序公司进行基因测序，根据DNA测序结果及密码子表比对分析后，获得了4株GPX4纳米抗体，其氨基酸序列分别如SEQID No.1-SEQ ID No.4所示，其对应的核苷酸序列分别如SEQ ID No.5-SEQ ID No.8所示。
实施例3：纳米抗体的制备
1、纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
将含有纳米抗体核酸的原始菌株按照1:1000的比例接种于5mL新鲜的LB培养基，37℃，220rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit(Kang Ning)说明书提取质粒。经验证后，取质粒1μL转化于100μL感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上静止30分钟，42℃水浴热激90s，冰浴冷却3分钟。向离心管内加入500μL LB培养基，37℃振荡生长60分钟。取菌液100μL，用三角涂布器涂布在LB平板上，37℃倒置培养过夜。
2、纳米抗体的诱导表达与纯化
从上述转化平板上挑一单菌落接种于10mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养过夜。次日，将过夜培养物按1：100的比例(v/v)接种于150mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养至OD600约为0.4～0.6时，加入IPTG至工作浓度为1mM，20℃，220rpm诱导过夜。第三天，菌体4℃，12000rpm离心15分钟，收集菌体沉淀。加入Tris缓冲液重悬菌体，使用超声破碎仪将菌体破碎，12000rpm离心10分钟，取上清，将上清进行蛋白质电泳分析。
3、纳米抗体的纯化与鉴定
将HisSep Ni-NTAAgarose Resin(翌圣)重悬，取10mL纯化树脂加入到重力柱内，静止3小时，树脂自然沉降于重力柱底部。使用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤纯化树脂，将样品加入重力柱中，使其自然流下并回收流出液。采用不同浓度的咪唑依次洗脱目的蛋白，分别收集流出液，柱子使用20％乙醇保存。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测，即得到纯化后的纳米抗体。
获得了纯度大于90％的四种纳米抗体，分别命名为NB-GPX4-12E，4C，5C和5F。蛋白质电泳结果如图2所示，由左至右样品分别为12E，4C，5C和5F，其氨基酸序列如SEQ IDNo.9-SEQ ID No.12所示。
实施例4：纳米抗体对GPX4的特异性结合及GPX4的定量检测
1、纳米抗体的Cy5荧光标记
将Cy5-NHS溶解在无水DMF中至浓度为10mM，并与纳米抗体混合于100mM碳酸盐缓冲液(pH 9.0)中，Cy5-NHS与实施例3得到的纳米抗体的反应比为5:1。在4℃以25rpm的转速孵育12小时。NB-Cy5偶联物的纯化使用7kDa MWCO Zeba Columns脱盐柱。该脱盐柱使用20mM TRIS-HCI(pH 7.4)缓冲液洗涤4～6次后进行样品纯化。纳米抗体消光系数分别为28830M-1cm-1(NB-GPX4-12E/4C)，30110M-1cm-1(NB-GPX4-5C)以及27550M-1cm-1(NB-GPX4-5F)，通过测量其在280nm的吸光度对纳米体进行定量。Cy5则通过测量其在645nm的吸光度进行定量。四种纳米抗体的标记比均为1:1。
2、NB-Cy5与QD605偶联
购买QD605(武汉珈源量子点有限公司)初浓度为8μM，储存溶液为四硼酸钠。NB-Cy5与QD605以15:1的比例进行标记，混合物室温反应60分钟，纳米抗体末端的多聚组氨酸标签通过金属配位键结合在QD605的表面。
3、纳米抗体对GPX4的检测
由Cy5-NBs-QD605到Cy5-NBs-GPX4的置换反应总体积为120μL，其中包括60μL恒定检测溶液(3nM QD605和45nM NB1-4)与60μL不同浓度的GPX4溶液。反应置于摇床37℃，220rpm震荡2小时。使用荧光分光光度计(上海天美科学仪器有限公司，FL970)测量实验结果。
N端携带多聚组氨酸标签的、被荧光染料Cy5标记的纳米抗体首先通过多聚组氨酸标签与富锌的QD605表面相结合，由于作为供体的量子点与作为受体的Cy5结合后，供受体之间的距离小于10纳米，所以它们之间会发生FRET，表现为量子点的荧光被淬灭，Cy5的荧光增强。随后向体系中加入待检测的GPX4蛋白，由于纳米抗体对GPX4具有结合特异性，其结合会导致纳米抗体从量子点表面脱落，FRET效率降低。FRET效率降低会导致供体量子点的荧光恢复，受体Cy5荧光强度降低。本发明通过采集供体的荧光强度随GPX4浓度的变化实现对GPX4的检测。根据三倍于空白样品的标准偏差计算分析方法的检测限，得到NB-GPX4-12E，4C，5C和5F的检测限分别为1.15nM,1.74nM,5.83nM和1.45nM(图3)。
实施例5：纳米抗体NB-GPX4-12E-CPP作为抗体药物的功能探究
1、纳米抗体NB-GPX4-12E-CPP与NB-GPX4-4C-CPP的设计和表达
2、在纳米抗体NB-GPX4-12E与NB-GPX4-4C-CPP的C端均融合表达可以辅助其进入细胞的穿膜肽“R10”，C端与穿膜肽之间使用SGSGSG作为linker连接，用于保持穿膜肽的柔韧性。将纳米抗体融合蛋白基因克隆在原核表达质粒pET28a(+)中，蛋白使用大肠杆菌进行表达，命名为NB-GPX4-12E-CPP和NB-GPX4-4C-CPP，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.15与SEQ ID No.16所示。
3、纳米抗体NB-GPX4-12E-CPP细胞成像
对纯化得到的纳米抗体NB-GPX4-12E-CPP进行Cy5荧光标记。标记方法同实施例4。之后进行细胞孵育实验，该实验在RC2细胞中进行。在含有血清的细胞培养液中培养RC2细胞，细胞密度为3×104个/mL，加入Cy5标记的纳米抗体和细胞穿透肽孵育1小时，在激光共聚焦显微镜下观测细胞荧光成像。NB-GPX4-12E-CPP与Cy5标记比为1:1。
激光共聚焦拍摄得到的数据图4所示：在与细胞穿膜肽共孵育的条件下，NB-GPX4-12E-CPP-Cy5能够进入RC2细胞，且其主要分布在细胞质中。
4、纳米抗体NB-GPX4-12E-CPP的药理活性
取对数生长期的RC2细胞，消化收集并稀释，以每孔约为5000个细胞种于96孔板，实验设3个复孔，每孔100μL，设置无Ferrostatin-1(Fer-1)组和Ferrostatin-1(Fer-1)给药组，并于种板时加入Fer-1。置于37℃、5％ CO2培养箱中培养过夜后加入不同浓度的纳米抗体NB-GPX4-12E-CPP/NB-GPX4-4C-CPP和细胞穿膜肽。无Ferrostatin-1(Fer-1)组和Ferrostatin-1(Fer-1)给药组均加入100μL浓度为20、15、10、5、2.5、1.25、1、0μM的纳米抗体和10μM的细胞穿膜肽的混合物。置5％ CO2、37℃的培养箱中继续孵育12、24、48小时，随后用CCK8试剂盒进行细胞毒性实验。
CCK8细胞毒实验结果(图5)显示，NB-GPX4-4C-CPP不能使RC2细胞死亡，而NB-GPX4-12E-CPP具有细胞毒性，IC50为0.56μM，并且Fer-1的加入可以逆转其细胞毒性，说明NB-GPX4-12E-CPP通过靶向GPX4诱发细胞铁死亡。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如SEQID No.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.13其中之一所示的氨基酸序列。
2.一种靶向谷胱甘肽过氧化物酶4的纳米抗体的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有如SEQ ID No.5、SEQ ID No.15其中之一所示的核苷酸序列。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中含有权利要求2所述的编码基因。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中含有权利要求2所述的编码基因。
5.权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组载体、或者权利要求4所述的重组细胞在制备谷胱甘肽过氧化物酶4特异性检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述纳米抗体检测谷胱甘肽过氧化物酶4的检测限不小于1.15 nM。
7.一种用于检测谷胱甘肽过氧化物酶4的试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求1所述的纳米抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括酶标二抗、显色剂和终止剂。
9.权利要求1所述的纳米抗体在制备抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为RC2细胞。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述纳米抗体通过靶向谷胱甘肽过氧化物酶4诱发肿瘤细胞的铁死亡，达到抗肿瘤的作用。
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