CN102439447A

CN102439447A - 对生物学样品中的物质进行检测的方法

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Publication number: CN102439447A
Application number: CN2010800195813A
Authority: CN
Inventors: 高仓由光; 冈直美; 近藤一博
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2012-05-02
Also published as: CA2753873A1; BRPI1005173A2; JP5647599B2; JPWO2010101157A1; AU2010219698A1; EP2405268A1; EP2405268A4; IL214895A0; US20120064543A1; KR20120001741A; SG174217A1; RU2011140006A; WO2010101157A1

Abstract

本发明涉及对生物学样品中的物质进行检测的方法、该方法中使用的担载体以及试剂盒。本发明的方法，在其一个实施方式中，包括：1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)向工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体混合添加：将(a)生物学样品、以及(b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，该细胞破碎提取液是由与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞；混合后添加至工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体中；然后，4)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。

Description

对生物学样品中的物质进行检测的方法

技术领域

本发明涉及对生物学样品中的物质定性和/或定量地进行检测的方法。通过本发明的方法，针对尤其是在生物学样品中微量存在、通常难以检测的物质也能够进行检测。

背景技术

利用通过疏水结合、共价结合等而结合有与被检测物质特异性结合的蛋白质的担载体的物质检测方法

为了对生物学样品中的物质进行检测，以往广泛使用利用针对该物质(被检测物质)特异性结合的物质的方法。作为与被检测物质特异地结合的物质，多数情况下使用抗体、其它蛋白质等。上述这些物质可以固定化在微孔板、微珠、或传感器芯片等担载体上。作为固定化的通常的方法，已知有疏水结合、共价结合等。

“疏水结合”是利用担载体的疏水性表面，和与待检测物质特异性结合的蛋白质(以下，有时也称为“特异的蛋白质”)的疏水性部分之间的相互作用，使担载体与特异的蛋白质结合，不需要特别的试剂、简便。但是，通常结合力较弱，在用于ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)等时，通过结合后的清洗操作等，蛋白质从担载体上脱离的情况较多。此外，通过疏水结合使特异的蛋白质与担载体结合时，有时多数蛋白质会完全丧失其功能或部分地丧失其功能。

“共价结合”是利用特异的蛋白质中的官能团(例如氨基)与设置在担载体表面的官能团(例如羧基)之间的相互作用，结合力较强。但是，通过共价结合使特异的蛋白质与担载体结合时，与疏水结合的情况同样，在多数的蛋白质中，其功能完全或部分丧失。

除了疏水结合和共价结合之外，还已知有如下方法：使多个组氨酸融合在蛋白质的末端，具有该组氨酸标签的融合蛋白与表面设置有镍的例如蛋白质芯片等基板等进行结合的方法。但是，组氨酸标签与镍离子之间的相互作用不太强，此外，还已知镍离子与各种各样的生物体分子之间存在非特异性结合。

通常来说，在特异性结合分析体系中，降低作为背景信号的原因的非特异性结合是重要的课题，上述分析体系使用如上这样通过疏水结合或共价结合而结合有与被检测物质特异性结合的蛋白质的固相。作为解决该课题的方法，提出了如下方法：例如，使细菌成分提取液包含在检测用试剂中的方法(日本特开昭59-99257)；将下述宿主细胞的培养成分添加到样品中的方法，其中，该宿主细胞是导入有与用于生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的载体(vector)同种的、且不含编码该蛋白质的基因的载体的宿主细胞(日本特开平8-43392)；对来自和生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的细胞相同种、且不含该蛋白质的细胞的水提取液进行加热处理后，将其水溶性级分添加到样品中的方法(日本特开2004-301646)等。通过这些方法，可以观察到对抑制非特异性结合具有的一定效果。

利用抗生物素蛋白-生物素结合的物质检测方法

抗生物素蛋白是来源于蛋清的糖蛋白，与生物素(维生素H)的结合非常强。抗生物素蛋白与生物素的相互作用是最强的非共价结合中的一种(Green(1975)Adv Protein Chem 29：85-133)。另一方面，链霉抗生物素是来源于放线菌的类抗生物素蛋白的蛋白质，与生物素的结合也较强。到目前为止，就(链霉)抗生物素蛋白-生物素的相互作用而言，由于其作用力的强度，因此被广泛用于例如抗原和抗体的检测等分子生物学、生物化学领域(Green(1990)Methods Enzymol 184：51-67)。

有人提出了利用该抗生物素蛋白、链霉抗生物素的生物素结合性，使蛋白质与担载体结合的方法。即通过共价结合、疏水结合，将(链霉)抗生物素蛋白与微孔板等这样的基板结合，并进一步与经生物素化的蛋白质结合从而固定化的方法。

此外，日本特开平4-236353中还报告了如下技术：首先通过抗生物素蛋白-生物素结合，在结合有生物素的基板上结合抗生物素蛋白蛋白质，然后在此结合经生物素化的期望的蛋白质，其通过与抗生物素蛋白的另外的生物素口袋(biotin pocket)结合，从而得到按照基板-生物素-抗生物素蛋白-生物素-期望的蛋白质这样的顺序进行固定。使用通过这样的方法固定化的板，可以对被检测物质进行检测。

但是，即使是利用了抗生物素蛋白-生物素结合的分析，与使用通过疏水结合、共价结合等结合有被检测物质特异的蛋白质的固相的方法相同，也存在需要处理背景信号这样较重要的问题。针对上述问题，除了上述的非特异抑制方法之外，提出了如下方法：使结合有去活化的(链霉)抗生物素蛋白的固相与样品接触，然后，与结合有活性(链霉)抗生物素蛋白的固相接触的方法(日本特开平8-114590)；使抗生物素蛋白结合固相与生物素化物质结合后，与聚乙二醇与生物素之间的结合体接触的方法(日本特开平11-211727)；与含生物素的溶液接触的方法(日本特开2002-48794)等。但是，还不能说获得了充分的实用上的效果。

到目前为止，以作为蛋白质的标记、诊断标记物、细胞特异的标靶化因子使用为目的，制作了使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素的融合蛋白(Airenne等人(1999)Biomol Eng 16：87-92)。在这些融合蛋白中，尤其是抗生物素蛋白或链霉抗生物素与scFv、Fab片段、IgG这样的抗体之间的融合蛋白，应用于针对癌细胞等的药剂的特异标靶的研究日益发展。此外，记载了使用链霉抗生物素与scFv的融合蛋白，通过抗生物素蛋白-生物素结合固定化scFv的色谱柱的设想(Kiprivanov等人(1995)Hum Antib Hybrid 6：93-101、Dubel等人(1995)J Immunol Methods 178：201-209)。但是，还尚未了解有利用通过生物素结合性蛋白质的固定化，对生体样品中的被检测物质进行检测的实例。虽然有报道将链霉抗生物素融合蛋白固定在已生物素化的板上，使用以已融合的蛋白质作为抗原的抗体，进行ELISA的实例(WO2002/046395)，但是该报道仅仅是展现了具有可以在不丧失活性的条件下将链霉抗生物素融合蛋白在担载体上进行固定化的可能性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭59-99257

专利文献2：日本特开平8-43392

专利文献3：日本特开2004-301646

专利文献4：日本特开平8-114590

专利文献5：日本特开平11-211727

专利文献6：日本特开2002-48794

专利文献7：WO2002/046395

专利文献8：WO02/072817

非专利文献

非专利文献1：Green(1975)Adv Protein Chem 29：85-133

非专利文献2：Green(1990)Methods Enzymol 184：51-67

非专利文献3：Airenne等人(1999)Biomol Eng 16：87-92

非专利文献4：Kiprivanov等人(1995)Hum Antib Hybrid 6：93-101

非专利文献5：Dubel等人(1995)J Immunol Methods 178：201-209

非专利文献6：Takakura等人(2009)FEBS J 276：1383-1397

发明内容

发明要解决的问题

本发明以提供一种定性和/或定量地对生物学样品中的物质进行检测的方法为目的。

本发明尤其是以提供一种在抑制背景信号的同时定性和/或定量地对生物学样品中微量存在的物质进行检测/测定的方法为目的。

解决问题的方法

本发明人等经过努力地深入研究的结果，开发了如下体系：该体系利用生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，并将与被检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白固定于担载体。这样一来，在该体系中，尤其是为了对在生物学样品中微量存在的物质进行检测，发现处理背景信号成为较大的问题，由此为了降低该背景信号进行钻研，从而想出了本发明。具体来说，在向生物学样品中添加细胞破碎提取液及生物素结合性蛋白质的情况下，减少非特异性结合的效果显著。或者，添加由通过基因工程技术结合有生物素结合性蛋白质的细胞制备的细胞破碎提取液，来代替添加生物素结合性蛋白质，也可以获得同样的效果。

此外，本发明人等发现：在将与检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白固定于担载体的体系中，在添加生物学样品之前，通过使生物素结合性蛋白质与该担载体接触(封闭(blocking))，可以在抑制背景信号的同时稳定地对更低浓度的物质进行测定。

本发明是基于以上的认识，提供如下的检测方法：在将通过抗生物素蛋白-生物素结合而对被检测物质进行特异检测的物质固定于担载体的体系中，减少非特异性结合、灵敏度更高的检测方法。

本发明包括以下的实施方式，但不局限于此。

[实施方式1]

一种对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括：

1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；

2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；

3)将(a)生物学样品、以及

(b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，该细胞破碎提取液是由与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者

(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞；

混合后添加至工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体中；然后，

4)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。

[实施方式2]

一种对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括：

3)使工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体与生物素结合性蛋白质接触，从而进行担载体的封闭；

4)在工序3)的封闭工序后，向结合有融合蛋白的担载体添加生物学样品，然后，

5)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。

[实施方式3]

一种对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括：

4)在工序3)的封闭工序后，将(a)生物学样品，以及

混合后添加至结合有融合蛋白的担载体中；然后，

[实施方式4]

根据实施方式1或3所述的方法，其中，在实施方式1的工序3(b-i)或实施方式3的工序4(b-i)中，添加由含任意载体的细胞提取的细胞破碎提取液作为细胞破碎提取液。

[实施方式5]

根据实施方式1～4中的任一项所述的方法，其中，生物素结合性蛋白质是tamavidin或其突变体。

[实施方式6]

根据实施方式1～5中任一项所述的方法，其中，生物学样品选自血液、血清、脑脊髓液、唾液、汗、尿、泪、淋巴液以及母乳。

[实施方式7]

一种用于检测生物学样品中的物质的担载体，其通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合与融合蛋白结合，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白，所述用于检测生物学样品中的物质的担载体通过下述方法制备：

3)使工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体与生物素结合性蛋白质接触，从而进行担载体的封闭。

[实施方式8]

一种用于对生物学样品中的物质进行检测的试剂盒，其包含：

A)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间结合而与融合蛋白结合的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白，以及

用于稀释生物学样品的包含下述B-i)或者B-ii)的试剂；

B-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，所述细胞破碎提取液是由与用于表达A)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者

B-ii)由在与用于表达A)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞制备的细胞破碎提取液；和/或

C)含生物素结合性蛋白质的封闭剂。

发明的效果

通过本发明的方法，在生物学样品中的被检测物质的检测中，可以抑制背景信号，稳定地进行灵敏度更高的检测。通过本发明的方法，尤其是对于在生物学样品中微量存在，通常难以检测的物质也而可以进行检测。

附图说明

[图1]图1是通过生物素结合性蛋白质进行封闭的模式图。白色圆圈表示生物素，黑色椭圆表示生物素结合性蛋白质，白色椭圆表示与被检测物质特异性结合的蛋白质。图1A：未通过生物素结合性蛋白质进行封闭、有融合蛋白的固定化；图1B：未通过生物素结合性蛋白质进行封闭、无融合蛋白的固定化；图1C：通过生物素结合性蛋白质进行封闭、有融合蛋白的固定化；图1D：通过生物素结合性蛋白质进行封闭、无融合蛋白的固定化。

[图2]图2是通过免疫印迹法(Western blotting)，对利用大肠杆菌表达的SITH-1和TM2的融合蛋白进行检测的结果。作为对照，使用了仅导入了载体的大肠杆菌。

[图3]图3是示出向血清中添加大肠杆菌破碎提取液对非特异的结合带来的效果，以及通过tamavidin 2进行封闭的效果。图3-1示出(仅)通过BSA进行封闭时的结果。即，示出SITH-1-TM2融合蛋白固定化板(0.5％BSA封闭)的测定值减去未进行任何固定化的生物素化板(0.5％BSA封闭)的测定值得到的结果。图3-2示出了利用BSA和TM2进行封闭时的结果。即，示出SITH-1-TM2融合蛋白固定化板(50μg/ml TM2/0.5％BSA封闭)的测定值减去未进行任何固定化的生物素化板(50μg/ml TM2/0.5％BSA封闭)的测定值所得到的结果。

[图4]图4的列2是通过免疫印迹法对利用大肠杆菌表达的Harpin和TM2的融合蛋白进行检测得到的结果。作为对照，使用了仅导入有载体的大肠杆菌(列1)。

具体实施方式

I.本发明的检测方法(实施方式1)

本发明的检测方法(实施方式1)是对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括：

3)将(a)生物学样品、以及

生物学样品中的检测物质

本发明涉及对生物学样品中的物质进行检测的方法。

作为本发明中的生物学样品，只要是可能含有作为检测对象的物质即可，没有特别的限定。可以是含有由生物采集的细胞、组织或其破片等的样品，例如体液，更优选血液、血清、脑脊髓液、唾液、汗、尿、泪、淋巴液以及母乳等。

这样的体液，根据需要稀释使用。稀释率通常为2倍～10000倍左右，优选100倍～1000倍左右，但并不限定于此。用于稀释的溶液可以使用任意的缓冲液，也可以含有适当的封闭剂。作为封闭剂，抑制非特异的结合效果高的物质较好，可以使用本领域技术人员公知的封闭剂如BSA或酪蛋白等。需要说明的是，本发明的实施方式2使用生物素结合性蛋白质作为封闭剂。针对这种情况将在下文中描述。

作为本发明的被检测物质，只要是期望进行生物学样品中的检测或测定的物质即可，没有特别地限制，但可以优选使用抗体、抗原等蛋白质及其片段、肽、核酸、糖类、糖脂等。

本发明也使得对生物学样品中、浓度低的通过以往的方法难以检测或正确定量的物质的测定成为可能。例如，当被检测物质是例如血清中的抗体，且进一步当抗体效价较低时(例如，将血清稀释1000倍时难以检测，但将血清稀释100倍时方才能够检测的低抗体效价的情况)，需要抑制血清的稀释率，其结果还会导致来源于血清中成分的非特异性结合增加，利用现有的方法，对于该抗体的检测和定量较为困难，通过本发明的方法，可以容易地检测，或可以更正确地进行定量。

作为本发明的被检测物质，虽不局限于此，例如有：由HHV-6的潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质(Small protein encoded by theIntermediate Transcript of HHV-6)(SITH-1)的抗体。作为其它，还可以举出：疱疹病毒的上述之外的抗原的抗体、来源于巨细胞病毒、肝炎病毒、HIV病毒、HTLV病毒、麻疹病毒、流感病毒等的病毒关联抗原的抗体；或来源于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)等的细菌关联的抗原的抗体；或真菌关联的抗原的抗体等。

基于PCT/JP2008/67300及美国临时申请No.61/102441所记载的内容的 SITH-1

(1)SITH-1蛋白质、核酸

SITH-1蛋白质、核酸的结构及功能如PCT/JP2008/67300所公开的，将其全部内容引入本说明书中。

SITH-1是与疱疹病毒的潜伏感染相关的因子，更详细来说，是在疱疹病毒的潜伏感染时进行特异表达的蛋白质。在此，“在疱疹病毒的潜伏感染时进行特异性表达”是指在感染了疱疹病毒的宿主中，疱疹病毒潜伏感染(未增殖感染)时，特异性地对疱疹病毒来源的基因或基因产物进行表达。

作为SITH-1的蛋白质及核酸，可以列举例如(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质、以及编码该蛋白质的核酸。

由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的SITH-1蛋白质，如下述参考例所示，是作为人疱疹病毒-6(HHV-6)的潜伏感染时特异表达的蛋白质，而被分离/鉴定的蛋白质。SITH-1蛋白质是具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、由159个氨基酸构成、分子量约17.5kDa的蛋白质。

SITH-1蛋白质由SITH-1基因的核酸编码。该SITH-1基因的cDNA如SEQ ID NO：3所示，具有1795个碱基对(约1.79kbp)的大小，第954～第956位的碱基序列为起始密码子(Kozak ATG)，第1431～第1433位的碱基序列为终止密码子(TAA)。因此，在如SEQ ID NO：3所示的碱基序列中，上述SITH-1核酸具有从第954～1430位的碱基序列作为开放阅读框(ORF)，该ORF具有477个碱基对(约0.48kbp)的大小。在SITH-1的cDNA中，表示ORF区域的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。需要说明的是，所记载的SEQ ID NO：2所示的碱基序列含有终止密码子的3个碱基。

SITH-1核酸通常均在HHV-6潜伏感染的细胞的细胞质中表达，另一方面，在增殖感染细胞中未发现有表达。编码SITH-1蛋白质的核酸，由下述DNA编码，该DNA与到目前为止报告的HHV-6潜伏感染特异的基因(H6LT)成互补链的关系，其表达在HHV-6的潜伏感染的中间阶段增强。从这些事实可以认为：SITH-1蛋白质是在HHV-6的潜伏感染时进行特异表达的蛋白质。

SITH-1蛋白质与宿主蛋白质即CAML(钙离子调节亲环素配体(calcium-modulating cyclophilin ligand)，Accesion#；U18242)结合，使神经胶质细胞内的钙浓度升高。已知CAML在宿主生物体内多存在于脑和淋巴细胞中，是使细胞内的钙浓度升高的蛋白质。此外，可以认为由SITH-1蛋白质的表达导致的细胞内钙浓度升高，使得潜伏感染细胞内的全部信号传导活化，有助于对HHV-6的高效再活化。

已知HHV-6在脑内的神经胶质细胞中潜伏感染，可以认为：在潜伏感染时、或在作为活性高的潜伏感染状态的中间阶段，HHV-6使SITH-1表达时，神经胶质细胞内的钙浓度升高。认为脑细胞中的细胞内钙浓度的升高与情绪障碍等精神障碍有较大关系(日本理研年报2003)。

SITH-1蛋白质具有：与宿主的蛋白质即CAML结合并保持活性、使细胞内钙浓度升高的功能。此外，通过在脑内的神经胶质细胞表达该蛋白质，该神经胶质细胞被认为是表达SITH-1蛋白质最强的细胞，可以诱导精神障碍。由此认为：SITH-1蛋白质在疱疹病毒的潜伏感染时或再活化初期表达，具有使宿主产生精神障碍的功能。

(2)抗SITH-1的抗体

以SITH-1蛋白质或其突变体、或它们的部分肽作为抗原，通过公知的方法，作为多克隆抗体或单克隆抗体得到抗SITH-1的抗体。作为公知的方法，可以举出例如：文献(Harlow等人的“Antibodies：A laboratory manual(ColdSpring Harbor Laboratory，New York(1988))”、岩崎等人的“单克隆抗体杂交瘤和ELISA、讲谈社(1991)”)中所述的方法。这样得到的抗体可以用于SITH-1蛋白质的检测/测定等。

用语的“抗体”表示免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及它们的Fab片段、F(ab’)₂片段、Fc片段)，作为实例，可以列举：多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗独特型抗体及人源化抗体，但不限于这些抗体。

用语“识别SITH-1蛋白质的抗体”是指包括能够与SITH-1蛋白质特异性结合的完整的分子及抗体片段(例如，Fab及F(ab’)₂片段)。可以使用依据本说明书中公开的方法，或公知的方法而获得Fab和F(ab’)₂以及SITH-1抗体的其它片段。这样的片段，代表性的，使用以木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)₂片段)这样的酶，通过蛋白质分解的切断而产生。

认为情绪障碍患者或可能患有情绪障碍的个体，SITH-1蛋白质的表达量增加，其结果SITH-1抗体效价也升高。就本发明而言，在一种实施方式中，通过对生物学样品中的SITH-1抗体进行检测，可以鉴定情绪障碍患者或可能患有情绪障碍的个体。

结合有与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白的担载体(实施方式1的工序1)及2))

本发明的检测方法利用如下担载体，该担载体通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合与如下融合蛋白结合，该融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白。

本发明的担载体，可以通过包括下述工序的方法制备：

2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体。

结合有生物素的担载体

“生物素”是指D-[(+)-顺-六氢-2-氧代-1H-噻吩并-(3，4)-咪唑-4-戊酸]的一般名称。是分类于维生素B族的水溶性维生素的一种，也称为VitaminB₇(维生素B₇)，或者有时也被称为维生素H、辅酶R。生物素与蛋清中所包含的糖蛋白质中的一种，与抗生物素蛋白的结合非常强，从而使其吸收受阻。为此，存在由于大量摄取生蛋清而导致的生物素缺乏症。

本说明书中的“生物素”除上述生物素之外，还包括亚氨基生物素(iminobiotin)(Hofmann等人(1980)Proc Natl Acad Sci USA 77：4666-4668)、脱硫生物素(desthiobiotin)(Hirsch等人(2002)Anal Biochem 308：343-357)、或生物胞素(biocytin)、生物素亚砜(Biotin sufoxide)等生物素类似体。

使用了生物素-抗生物素蛋白(生物素结合性蛋白质)复合体的系统广泛用于组织免疫学、DNA分析、临床检查等领域。将本发明的蛋白质与担载体结合的方法如下所述：利用生物素-抗生物素蛋白结合，使在生物素结合性蛋白质上结合有所期望的蛋白质而形成的融合蛋白与担载体相结合。与以往利用了生物素-抗生物素蛋白结合的结合相比，本发明的方法不会损坏蛋白质的功能，能够非常有效地进行作用。

构成固体担载体的材料包括：纤维素、特氟隆(teflon)(注册商标)、硝酸纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体(ferrite)、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白质(白蛋白等)、碳或它们的组合等，但不限于上述这些。此外，优选具有一定强度，组成稳定，并且非特异性结合少的材料。

固体担载体的形状包括珠子、磁珠、薄膜、微管、滤膜、板、微孔板、碳纳米管、传感器芯片等，但并不限于上述这些。如本技术领域中所知的，可以在薄膜、板等平坦固体担载体上设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。

在发明的一个实施方式中，珠子可以具有约25nm～约1mm范围的球体直径。在优选的实施方式中，珠子具有约50nm～约10μm范围的直径。珠子的大小可以根据特定的用途来选择。由于一些细菌孢子具有约1μm量级的大小，因此优选用于捕捉所涉及的孢子的珠子具有大于1μm的直径。

虽不局限于此，例如，在期望具有高检测灵敏度的情况下，从待检测物质和与其特异性结合的物质之间的接触频繁程度、清洗操作的容易性这样的观点来看，可以优选使用上述这样的珠子作为固体担载体。

作为使生物素与担载体结合的方法，可以列举使用例如生物素化试剂的方法。作为生物素化试剂，可以利用例如：PIERCE公司制造的(括号内按照顺序为接头长度、反应基团)EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-生物素(

伯胺)、EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-LC-生物素(

伯胺)、EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-LCLC-生物素(

伯胺)、EZ-Link(注册商标)PFP-生物素(

胺)、EZ-Link(注册商标)马来酰亚胺-PEO₂-生物素(

巯基)、EZ-Link(注册商标)生物素-PEO₂胺(

羧基)、EZ-Link(注册商标)生物素-PEO₃-LC胺(

羧基)、EZ-Link(注册商标)生物素-酰肼(

醛基)、EZ-Link(注册商标)生物素-LC-酰肼(醛基)、EZ-Link(注册商标)NHS-亚胺基生物素(

伯胺)等，但并不限于上述物质。

利用上述生物素化试剂，使用公知的方法，可以使生物素结合在微孔板、微珠、或传感器芯片等期望的担载体上。例如有使用具有氨基、羧基、巯基、甲苯磺酰基、环氧基、马来酰亚胺基、活性酯等各种官能团的担载体(例如磁珠、Sepharose珠子、琼脂糖珠子(agarose beads)、胶乳珠子、微滴度板等)的方法。此时例如，在使用含NHS酯的生物素化试剂的情况下，可以利用如DMSO(demethlysulfoxide，二亚基亚砜)这样的有机溶剂或pH7至9的磷酸缓冲液溶解含NHS酯的生物素化试剂，并通过添加到具有氨基的固定化担载体中从而使生物素结合。此外例如，在使用含氨基的生物素化试剂的情况下，还可以使用如EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride))这样的碳二亚胺，使固定化担载体的羧基变成活性酯，然后，添加在pH5附近的缓冲液中溶解的生物素化试剂，从而使生物素结合。需要说明的是，就经生物素化的固定化担载体而言，优选对未反应的官能团进行去活化后，利用BSA等进行封闭。

此外，可以利用经生物素化的市售担载体。作为经生物素化的微孔板，可以利用例如：Reacti-Bind^TM生物素包被的聚苯乙烯板(PIERCE公司制造)，但不限定于此。作为经生物素化的微珠，例如，作为磁珠，可以利用BioMag生物素(Polysciences公司制造)，或作为纳米磁珠，可以利用Corefront公司制造的nanomag(注册商标)-D生物素、nanomag(注册商标)-二氧化硅生物素，或作为聚苯乙烯制的微珠，可以使用Beadlyte(注册商标)生物素珠子(Upstate公司制造)，或作为琼脂糖可以使用Sigma公司制造的生物素琼脂糖、2-亚氨基生物素-琼脂糖，或作为高交联琼脂糖，可以使用生物素-Sepharose(Biosearch Technologies公司制造)，但并不限定于上述这些。

就连接担载体与生物素的接头的长度而言，优选至少长于

更优选为

以上，进一步优选为以上，更进一步优选为

以上。

与待检测物质特异性结合的蛋白质

对于与被检测物质特异性结合的蛋白质(以下，有时也称为“特异的蛋白质”)没有特别限定。作为该发明的一个实施方式，例如在抗原与抗体、激素等配体与受体、凝集素与糖、核酸的互补结合等中，可以利用其中的一方，与另一方的特异复合体的形成能力，从被检测样品中选择性地进行分析，但并不局限于上述这些物质。

更为详细来说，作为例如蛋白质，可以举出：抗体、抗原蛋白质、凝集素、肽、或蛋白A、蛋白G、蛋白L、受体、酶蛋白质等。作为抗体，可以列举IgG，除此之外还有scFv、Fab等包含抗原结合部位的抗体片段，作为抗原蛋白质，可以列举甲型/丙型肝炎病毒、HIV、流感、疱疹病毒等病毒来源的蛋白质、幽门螺杆菌等细菌来源的蛋白质、或CEA、PSA等肿瘤标记物、性激素等。凝集素是糖结合性蛋白质，可以列举：甘露糖特异性凝集素、GalNAc特异性凝集素、GlcNAc特异性凝集素、岩藻糖特异性凝集素、唾液酸特异性凝集素等单糖特异性凝集素、寡糖特异性凝集素等。此外，还可以列举DNA/RNA结合蛋白质等。另外作为肽，作为实例可以列举由2～100个氨基酸构成的肽，优选由4～50个氨基酸构成的肽，更优选由6～30个氨基酸构成的肽，但并不限定于上述这些。

此外，虽不局限于此，本发明中作为与被检测物质特异性结合的蛋白质的实例，可以列举SITH-1蛋白质。

生物素结合性蛋白质

本发明包括利用生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使与被检测物质特异性结合的蛋白质固定于担载体。在本发明中，“生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合”有时也称为“抗生物素蛋白-生物素结合”。

作为生物素结合性蛋白质，只要是能够与抗生物素蛋白、链霉抗生物素、中性链亲和素(neutravidin)、AVR蛋白质(Biochem.J.，(2002)，363：609-617)、Bradavidin(J.Biol.Chem.，(2005)，280：13250-13255)、Rhizavidin(Biochem.J.，(2007)，405：397-405)、tamavidin(WO02/072817)、它们的突变体等与生物素强结合的蛋白质，其中的任何均可以优选使用。优选至少与生物素的解离常数(KD)为10^-6以下、更优选为10^-8以下，进而更优选为10^-10以下。需要注意的是，就添加到被检测样品中的生物素结合性蛋白质、以及用于封闭担载体的生物素结合性蛋白质而言，如下文所述。

作为生物素结合性蛋白质，尤其是可以优选使用在大肠杆菌中高表达的tamavidin和其突变体。Tamavidin是从作为食用蘑菇的担子菌白黄侧耳(Pleurotus conucopiae)中发现的生物素结合性蛋白质(WO02/072817、Takakura等人(2009)FEBS J 276：1383-1397)。作为tamavidin的突变体，可以列举例如高结合能力/低非特异性结合tamavidin(PCT/JP2009/64302)等。

本发明的“tamavidin”是指tamavidin 1、tamavidin 2、或它们的突变体。具体来说，典型地，本发明的tamavidin可以是包含SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7的氨基酸序列的蛋白质，或也可以是由包含SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6的碱基序列的核酸编码的蛋白质。或者，本发明的tamavidin可以是包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的氨基酸序列的蛋白质的突变体，或也可以是作为由包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体，与tamavidin 1或2具有同样的生物素结合活性的蛋白质、或具有高结合能力/低非特异性结合活性的蛋白质。在本说明书中，有时将tamavidin 1、tamavidin 2以及它们的突变体统称，简称为“tamavidin”。

Tamavidin 1或2的突变体可以是包含如下氨基酸序列，与tamavidin 1或2具有同样生物素结合活性的蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO：5或7的氨基酸序列中，有1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列。取代可以是保守性取代，保守性取代是指特定的氨基酸残基被具有类似物理化学特征的残基所取代。保守性取代的非限定实例包括：Ile、Val、Leu或Ala的相互取代这样的含脂肪族基团的氨基酸残基之间的取代、Lys与Arg、Glu与Asp、Gln与Asn的相互取代这样的极性残基之间的取代等。

通过氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而得到的突变体，可以通过如下方法来制作：在编码野生型蛋白质的DNA中，通过例如作为公知技术的定点诱变(例如，参考Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982，通过引用将其全部内容引入本说明书)来实现。在本说明书中，“1个或多个氨基酸”优选是能够通过定点诱变法而缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。此外，在本说明书中“1个或多个氨基酸”，根据情况可以为1个或几个氨基酸。虽不局限于此，“1个或多个氨基酸”是指50个以内，优选40个以内、30个以内、20个以内、10个以内、8个以内、5个以内、3个以内的氨基酸。tamavidin 1或2的突变体还可以是包含与SEQ IDNO：5或7的氨基酸序列具有至少60％以上、优选65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上、更优选99.3％以上氨基酸同一性的氨基酸序列，且与tamavidin 1或2具有相同生物素结合活性的蛋白质，或具有高结合能力/低非特异性结合活性的蛋白质。

两个氨基酸序列的同一性％可通过目测检查和数学计算来确定。或者，两个蛋白质序列的同一性百分比可以通过使用以Needleman，S.B.及Wunsch，C.D.(J.Mol.Bol.，48：443-453，1970)的算法为基础、从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序进行序列信息比较来确定。GAP程序优选的默认参数包括：(1)Henikoff，S.以及Henikoff，J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)中所记载的计分矩阵(scoring matrix)、blosum62；(2)12分的空位罚分；(3)4分的空位长度罚分；以及(4)末端空位不罚分。

也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同一性百分比，例如：可以使用Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)中记载的BLAST程序来对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在Nantional Center for Biotechnology Information(NCBI)或DNA Data Bankof Japan(DDBJ)网站使用。该网站对利用BLAST程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但检索通常使用默认值来进行。此外，两个氨基酸序列的同一性％也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值检索。

两个核酸序列的同一性％可通过目测检查和数学计算来确定，此外，该比较更优选使用计算机程序对序列信息进行比较。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组(GCG；威斯康星州Madison)的威斯康星软件包、10.0版“GAP”程序(Devereux等，1984，Nucl.Acids Res.，12：387)。使用该“GAP”程序，不仅可对两个核酸序列进行比较，还可比较两个氨基酸序列，并可进行对核酸序列和氨基酸序列的比较。

需要说明的是，构成与担载体结合的融合蛋白的“生物素结合性蛋白质”用于通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使融合蛋白与担载体结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体。由此，虽不局限于此，上述利用tamavidin 1或tamavidin 2的突变体形成的融合蛋白，与利用它们的野生型形成的融合蛋白的情况相比，优选生物素结合活性无明显减少。

由此，非限定地，tamavidin 1的突变体优选如下序列：SEQ ID NO：5的氨基酸序列中N14、S18、Y34、S36、S78、W82、W98、W110、D118未被修饰。需要说明的是，该表述例如Y34是表示SEQ ID NO：5的氨基酸序列34位的酪氨酸残基。或者，在对这些氨基酸进行修饰的情况下，优选被修饰为性质或结构类似的氨基酸，优选分别进行如下修饰，例如当为天冬酰胺(N14)时，可以修饰为谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)，优选修饰为天冬氨酸；当为丝氨酸(S18、S36、S78)时，可以修饰为苏氨酸(T)或酪氨酸(Y)，优选修饰为苏氨酸；当为酪氨酸(Y34)时，可以修饰为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或苯丙氨酸(F)，优选修饰为苯丙氨酸；当为色氨酸(W82、W98、W110)时，可以修饰为苯丙氨酸(F)；当为天冬氨酸(D118)时，可以修饰为谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)，优选修饰为天冬酰胺。

此外，tamavidin 2的突变体优选如下序列：SEQ ID NO：7的氨基酸序列中的四个色氨酸残基(W69、W80、W96、W108)未被修饰。或者，在对这些氨基酸进行修饰的情况下，优选被修饰为性质或结构类似的氨基酸，例如苯丙氨酸(F)。此外，期望被认为与生物素直接进行相互作用的氨基酸残基(N14、S18、Y34、S36、S76、T78、D116)也未被修饰。或者，在对这些氨基酸进行修饰的情况下，优选修饰为性质或结构类似的氨基酸从而可以保持与生物素的结合，优选分别进行如下修饰，例如为天冬酰胺(N14)时，可以修饰为谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)，优选修饰为天冬氨酸；当为天冬氨酸(D40)时，可以修饰为天冬酰胺(N)；当为丝氨酸(S18、S36、S76)时，可以修饰为苏氨酸(T)或酪氨酸(Y)，优选修饰为苏氨酸；当为酪氨酸(Y34)时，可以修饰为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或苯丙氨酸(F)，优选修饰为苯丙氨酸；当为苏氨酸(T78)时，可以修饰为丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)，优选修饰为丝氨酸；当为天冬氨酸(D116)时，可以修饰为谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)，优选修饰为天冬酰胺。

在本发明中，优选的tamavidin修饰体包含以下物质(PCT/JP2009/64302)。

在包含SEQ ID NO：7所述的氨基酸序列、或者在该序列中具有1个～多个氨基酸突变的氨基酸序列、或者与该序列具有80％以上同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，选自下组中的1个或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质：

1)SEQ ID NO：7的104位的精氨酸残基；

2)SEQ ID NO：7的141位的赖氨酸残基；

3)SEQ ID NO：7的26位的赖氨酸残基；以及

4)SEQ ID NO：7的73位的赖氨酸残基。

更优选选自下组中的修饰型生物素结合蛋白质：

在SEQ ID NO：7中，104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(R104E-K141E)；

在SEQ ID NO：7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-R104E)；

在SEQ ID NO：7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-K141E)；以及

在SEQ ID NO：7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-R104E-K141E)。

与被检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白

本发明将与被检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白(以下，有时也称为“生物素结合性蛋白质融合蛋白”、或“融合蛋白”)固定在担载体上。

对于生物素结合性蛋白质融合蛋白的准备方法没有特别限定，例如可以使用公知的基因工程的手法使其表达。例如、通过使用大肠杆菌等表达体系，表达编码生物素结合性蛋白质和所期望的蛋白质的融合蛋白基因，从而可以获得融合蛋白。需要说明的是，为了在大肠杆菌中高表达，优选利用tamavidin、其突变体。

在生物素结合性蛋白质融合蛋白中，生物素结合性蛋白质可以直接与所期望的蛋白质结合，或者也可以通过接头结合，优选通过氨基酸接头结合。该接头的长度可以至少为1个氨基酸以上，优选为5个氨基酸以上，更优选为6个氨基酸以上。此外，为了进一步提高与担载体结合的生物素和tamavidin之间的结合力，优选10个氨基酸以上、更优选12个氨基酸以上、15个氨基酸以上、18个氨基酸以上，进一步优选25个氨基酸以上。此外，推测这样的接头还可以提高tamavidin融合蛋白的活性。对于构成该接头的氨基酸没有特别限定，优选，由甘氨酸、丝氨酸、或丙氨酸这样中性的氨基酸重复构成。例如，可以举出但不限于下述：GGGGS、GGSGG、GASAG、GSGAA、GSGSA、GGGGSG、GGGSGGS、GGSGGGGS、AAAAGSGAA、GGGGSGGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGS(SEQ IDNO：8-18)等。

此外，生物素结合性蛋白质可以与所期望的蛋白质的N末端侧、或C末端侧中的任何一端结合。此外，表达所期望的蛋白质时，在例如与大肠杆菌的细胞质相比，更适合在周质空间进行表达的情况下，可以使用用于靶向周质空间的前导序列。作为这样的前导序列，有但不限于下述PelB(Lei等人(1987)J Bacteriol 169：4379-4383)、OmpA(Gentry-Weeks等人(1992)J Bacteriol174：7729-7742)等。

当生物素结合性蛋白质融合蛋白从可溶级分得到时，可以不纯化粗蛋白质提取液，与生物素化担载体接触，由此使融合蛋白与生物素化担载体结合而结合后，对其进行充分地清洗，可以一次实现融合蛋白的纯化和在担载体上的固定化。或者，也使用结合有亚氨基生物素等(Hofmann等人(1980)ProcNatl Acad Sci USA 77：4666-4668)生物素类似体的柱，进行纯化，然后与生物素化担载体结合。

或者此外，可以在生物素结合性蛋白质融合蛋白的N末端或C末端进一步添加纯化用标签。作为这样的标签，认为有但不限于下述例如：c-myc表位标签(Munro和Pelham(1986)Cell 46：291-300)、组氨酸标签(Hochuli等人(1988)Bio/Technol 6：1321-1325、Smith等人(1988)J Biol Chem 263：7211-7215)、Halo标签(Los和Wood(2007)Methods Mol Biol 356：195-208)、Flag标签(Einhauer和Jungbauer(2001)J Biochem Biophys Methods 49：455-465)等，或它们的组合。

当融合蛋白从不溶级分得到时，可以使用公知的方法：使用例如尿素、盐酸胍这样的离液盐(chaotropic salt)，使蛋白质溶解，在溶解后使用透析等，边缓慢除去离液盐，边促进蛋白质的折叠(refolding)(Sano和Cantor(1991)Bio/Technology 9：1378-1381、Sano等人(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：1534-1538)。

或者此外，所期望的蛋白质在大肠杆菌内表达为不溶级分时，可以采用例如与麦芽糖结合蛋白(Bach等人(2001)J Mol Biol 312：79-93)、硫氧还蛋白(Jurado等人(2006)J Mol Biol 357：49-61)、谷胱甘肽S转移酶(Tudyka和Skerra(1997)Protein Sci 6：2180-2187)、或Ideno等人(2004)Appl MicrobiolBiotechnol 64：99-105所述的伴侣(chaperon)类共表达，或者在融合蛋白上进一步融合伴侣制作3重融合蛋白。需要说明的是，麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白、谷胱甘肽S转移酶可以作为纯化用标签来使用。

作为融合蛋白的表达体系，利用昆虫细胞、植物细胞、哺乳类细胞、酵母细胞、枯草菌细胞、无细胞表达体系等其它公知的表达体系表达也可以。尤其是利用植物细胞表达融合对象蛋白质(例如植物凝集素等)时，还优选使用植物细胞的表达体系来表达该融合蛋白。本领域技术人员可以考虑融合对象蛋白质的性质来选择适当的表达体系。

融合蛋白与担载体的结合

在本发明中，可以准备结合有生物素的担载体、生物素结合性蛋白质融合蛋白，并通过使两者接触，通过抗生物素蛋白-生物素结合使该蛋白质与担载体结合。

虽不局限于此，按照总蛋白质浓度为0.1mg/ml～5mg/ml、优选为0.2mg/ml～2mg/ml，准备包含生物素结合性蛋白质融合蛋白的细胞破碎粗提取液。使该提取液在10℃～40℃、优选在20℃～30℃，与结合有生物素的担载体接触5分钟～2小时，优选接触30分钟～1小时。或者此外，使纯化为0.1μg/ml～5μg/ml浓度的生物素结合性蛋白质融合蛋白与结合有生物素的担载体接触。

向担载体添加生物学样品(实施方式1的工序3)

本发明的实施方式1的方法，在准备结合有融合蛋白的担载体之后，作为工序3)，包括：

将(a)生物学样品、以及

(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞。

混合后添加至工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体中。

通常地，在利用了担载体的检测方法中，已知有如下方法用于降低作为背景信号的原因的非特异性结合：使细菌成分提取液包含在检测用试剂中的方法(日本特开昭59-99257)；将下述宿主细胞的培养成分添加到样品中的方法，其中，该宿主细胞是导入有与用于生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的载体同种的、且不含编码该蛋白质的基因的载体的宿主细胞(日本特开平8-43392)；对来自和生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的细胞相同种、且不含该蛋白质的细胞的水提取液进行加热处理后，将其水溶性级分添加到样品中的方法(日本特开2004-301646)等。

本发明人等，尝试将上述的方法用于融合蛋白体系，但未能获得充分的效果。然而，通过深入的研究，结果想出了可获得更显著效果的方法。具体来说，发现在使被检测样品与担载体接触时，优选使细胞破碎提取液、以及生物素结合性蛋白质这两者同时存在。

在一个实施方式中，向生物学样品中混合添加：由与用于表达融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液、以及生物素结合性蛋白质。向被检测样品中添加生物素结合性蛋白质和细胞的破碎提取液时，可以先添加任何一种，或者可以同时添加。或者，将生物素结合性蛋白质和细胞的破碎提取液混合，然后添加到被检测样品中。

在另一实施方式中，可以向被检测样品中添加细胞破碎提取液，该细胞破碎提取液是由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞。具体来说可以使用：将生物素结合性蛋白质重组到表达载体中，并在细胞中表达重组蛋白质的该细胞的破碎提取液。

在被检测样品为血清等的情况下，通常利用细胞破碎提取液将血清稀释10倍～10000倍，优选稀释100倍～1000倍，更优选稀释100倍～500倍。

细胞破碎提取液来源的细胞，可以是大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳类细胞、昆虫细胞、植物细胞等，没有特别地限制，优选与用于表达融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞。例如，在融合细胞是利用大肠杆菌制备的情况下，优选细胞破碎提取液也通过大肠杆菌来制备。此外，在通过无细胞系表达融合蛋白时，使用的细胞破碎提取液可以直接使用，或者可以将细胞破碎提取液悬浮在所期望的缓冲液中来使用。

更优选，细胞是优选与生物学样品来源的生物不同种的生物来源的细胞。例如，生物学样品是来源于人的样品时，优选，细胞破碎提取液通过人以外的生物来源的细胞来制备。但是，例如利用哺乳动物细胞来表达融合蛋白时，通常使用由特定的癌细胞等制备的培养细胞株。此时，由于人培养细胞株与生物学样品来源的(例如)生物体中的人细胞的内含物质在实质上有很大的不同，因此即使在使用人来源的培养细胞株的细胞破碎提取液的情况下，也能够获得本发明的效果。

此外，用于制备细胞破碎提取液的细胞可以含有任意载体，优选含有空载体。空载体可以是，与用于表达被检测物质特异性结合的蛋白质或其融合蛋白时使用的载体相同种类、并且不含编码上述这些蛋白质的基因的载体，或者，例如可以是使这些空载体进一步含有任意核酸的任意的载体。此外，用于表达被检测物质特异性结合的蛋白质或其融合蛋白时使用的载体可以是无关联的公知的任意载体。

作为细胞的破碎提取液，只要是细胞来源的成分即可，没有特别地限制，例如，可以使用其蛋白质成分、糖类成分、脂质成分或它们的混合成分。优选，可以使用细胞的可溶性提取物。

对于作为细胞的破碎提取液的制备方法，没有特别地限制，可以使用各种方法。通常，可以如下制备：利用适当的培养基培养的细胞，通过使用超声波等物理方法，或者利用了表面活性剂等的化学方法，或者酶处理等进行破碎或可溶化，以及离心分离或过滤等操作，从而得到可溶性成分。此外，为了延长保存寿命，优选向通过离心分离或过滤等澄清的液体中添加例如蛋白酶抑制剂，或实施高压灭菌处理等加热处理，对来源于细胞的各种酶等进行抑制或使其失活。细胞的破碎提取液的添加浓度，可以根据产生的非特异反应的强度来改变，可以适当地设定吸收该非特异反应的充分的浓度。

作为制备细胞破碎提取液的具体方法的实例，虽不局限于此，例如在大肠杆菌细胞的情况下，可以将大肠杆菌(可以含有载体，而且载体可以含有编码生物素结合性蛋白质的基因)，接种到含抗生素的LB培养基中，在25℃～37℃振荡培养使OD600的吸光度达到0.25～1，优选达到0.4～0.6，然后，添加0.1mM～5mM、优选0.5mM～1mM的IPTG，进一步，在25℃～37℃，进行2小时～24小时、优选进行4小时～16小时的振荡培养。对培养液进行离心回收菌体，将菌体悬浮到所期望的缓冲液中，然后破碎，离心破碎液，回收其上清作为大肠杆菌粗提取液。

可以利用任意方法向担载体中添加生物学样品、以及细胞破碎提取液。但是，生物学样品与担载体接触之前，生物学样品必须与细胞破碎提取液接触。即，只要使生物学样品和细胞破碎提取液充分接触即可，不是必须最终将细胞破碎提取液来源的成分和生物学样品一起添加到担载体中。例如，可以制作结合有细胞破碎提取液成分的担载体，并在其中使用经处理的生物学样品。具体来说，可以举出使生物学样品通过细胞破碎提取液成分柱等的实施方式。

在向生物学样品中混合细胞破碎粗提取液的情况下，虽不局限于此，使样品与通过所期望的缓冲液(可以含有BSA或酪蛋白、市售的封闭剂等)制备的总蛋白质浓度为0.05mg/ml～5mg/ml、优选为0.5mg/ml～5mg/ml的细胞破碎粗提取液在10℃～30℃、优选在20℃～30℃反应30分钟～4小时、优选反应1小时～2小时。需要说明的是，当生物学样品为血清时，虽不局限于此，可以利用上述细胞破碎粗提取液稀释100倍～1000倍。

向被检测样品添加生物素结合性蛋白质

作为本发明的特征之一，向生物学样品中混合由与用于表达融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液、以及生物素结合性蛋白质，然后将混合物添加到担载体中(工序b-i)，或者，向被检测样品中混合细胞破碎提取液，然后将混合物添加到担载体中，所述细胞破碎提取液是由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞(工序b-ii)。

在本发明的方法中，通过向被检测样品中添加生物素结合性蛋白质，最终可以抑制背景信号。

这样的生物素结合性蛋白质可以是与构成融合蛋白的生物素结合性蛋白质相同或不同的蛋白质。此外，可以是野生型也可以是突变体，与野生型相比，生物素结合能力可以是相同的，也可以更高，或可以更低。

此外，作为添加的实施方式，可以直接添加生物素结合性蛋白质(可以是天然来源的，也可以是通过基因工程表达的蛋白质)的粉末，也可以溶解在适当的液体中然后添加。此外，也可以为如下实施方式：例如，不将生物素结合性蛋白质直接添加到样品中，通过固定有生物素结合性蛋白质的担载体，来处理样品和细胞破碎提取液的混合物(例如通过柱子)。(工序b-i)。

在将生物素结合性蛋白质添加到细胞破碎粗提取液的情况下，虽不局限于此，添加生物素结合性蛋白质的浓度，以最终浓度计，为1μg/ml～500μg/ml、优选为10μg/ml～100μg/ml。在通过基因工程在该细胞中表达生物素结合性蛋白质的情况下，关于生物素结合性蛋白质的浓度，也可以为同样的浓度，但虽不局限于此。

或者，可以使用将编码生物素结合性蛋白质的基因导入宿主细胞中使其表达，并破碎该宿主细胞得到的包含生物素结合性蛋白质的细胞提取液(工序b-ii)。此时，生物素结合性蛋白质，在所期望的宿主中，可以通过本领域技术人员所公知的方法来表达，但通过基因工程表达与被检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白时，优选与其宿主是相同种的。

宿主为大肠杆菌时，将编码生物素结合性蛋白质的基因重组到表达载体中，并将该表达载体导入大肠杆菌，边诱导蛋白质表达，边进行大肠杆菌的培养。表达载体、宿主大肠杆菌株、培养基成分、IPTG浓度、培养温度等诱导条件可以适当选择。

被检测物质的检测方法(实施方式1的工序4)

本发明的检测方法、对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。

对被检测物质进行检测的方法，基于所期望的蛋白质的性质，本领域技术人员而可以适当地选择。作为优选的方法，可以列举：酶结合免疫吸附测定法(包括ELISA、Sandwich ELISA法)、放射免疫分析法(RIA)等免疫测定法、核酸杂交测定法、表面等离子共振法等这样的分析法。使通过抗生物素蛋白-生物素结合固相化、与被检测物质特异地结合/相互作用的物质，与被检测样品反应，然后对该被检测物质进行检测。

在免疫测定中，例如待测定物质为抗体时，将抗原固相化、使存在于被检测样品中的抗体与抗原反应，利用本领域技术人员公知的方法进行检测。例如被检测样品为来源于人的物质时，使用抗人抗体来对与抗原结合的人抗体进行检测。此时，该抗人抗体，通过预先用荧光、酶、或放射性同位素进行标记，可以通过测定最终的荧光量、酶活性、或放射性量，来间接地对于抗体的量进行测定、定量。此外，待测定的物质为抗原时，将针对于该抗原的某一部分(表位)的抗体固相化，然后使其与存在于被检测样品中的抗原发生反应。然后，进一步使其与针对该抗原的其它表位的抗体发生反应。将该针对于其它表位的二次抗体如上述所示预先进行标记后，可以间接地测定出抗原的量。或者此外，在核酸杂交测定中，使用抗生物素蛋白-生物素结合，将具有与待测定的核酸互补的序列区域的数十～数百、或数千碱基的核酸固相化。在此与含有预先经过荧光、放射性同位素标记的核酸的被检测样品反应，测定荧光量、放射性量。

上述标记只要是通过本领域技术人员所公知的方法进行即可，此外可以使用市售的、由荧光、酶标记的抗人抗体等。作为荧光标记，还可以考虑例如通过荧光素及罗丹明等标记、GFP等荧光蛋白进行标记。作为酶标记，可以利用过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶、葡萄糖氧化酶等，但并不限于上述这些酶。用于通过这些酶测定的基质是市售的，例如为过氧化物酶时，可以使用TBA、化学发光法用的基质。此外，作为放射性同位素，可以举出例如：碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、以及氚(³H)，为核酸时，可以举出磷(³²P)等。

生物学样品(sample)中存在的抗原、抗体的量，可以使用例如直线回归计算机算法，通过与标准的制备物(例如为临床样本时，健康人的标准样品或者典型患者的标准样品)中存在的量进行比较可以简单地算出。用于检测抗原、抗体的这样的测定法，例如，关于ELISA，如Iacobelli等人，BreastCancer Research and Treatment 11：19-30(1988)中所记载。

或者，例如，当生物学样品中的待检测物质，例如抗体较少时(抗体效价较低时)、或者当血清等生物学样品其本身非特异结合较多时，由于非特异性结合导致的背景信号的影响增大。为此，通过从测定值中适当地减去背景信号，可以更为正确地对想要检测的物质进行测定。本领域技术人员能够根据实验体系适当地判断所减去的背景。

例如，作为这样的实施方式的例子，有对抗血清中存在的胶原的抗体进行检测的“人/猴抗I型及II型胶原IgG抗体测定试剂盒”(Chondrex公司制造)。就该试剂盒而言，从样品测定值中减去背景值(不添加血清，仅由二次抗体得到的测定值)来计算。

此外，如血清，生物学样品本身中非特异的结合较多的情况下，为了减去由这样的非特异反应产生的背景，如实施例2所述，从固定化有SITH-1抗原(与待检测物质特异性结合的蛋白质)和tamavidin的融合蛋白的担载体(板)的测定值中，减去未固定化SITH-1抗原的区域(但是与固定化有SITH-1抗原的区域同样，进行利用BSA等的封闭操作，并且添加包含抗SITH-1抗体(生物学样品中想要检测的物质)的血清(生物学样品)的区域)的测定值的实施方式也是有效的。或者，如实施例2或实施例3所述，可以从固定化有SITH-1抗原和tamavidin的融合蛋白的担载体(板或磁珠)的测定值中，减去仅固定化(结合)有tamavidin的担载体的测定值来进行计算。

作为用于从样品中减去固有的非特异反应的实施方式的进一步的实例，如上述的“人/猴抗I型及II型胶原IgG抗体测定试剂盒”一样，有时也有从使用固定化有胶原的微滴定板的孔的血清中胶原抗体的测定值中，减去未固定化胶原的孔的测定值的情况。另外，作为采取类似实施方式的试剂盒，有用于血清或血浆中的抗单纯疱疹病毒IgM型抗体的检测的“病毒抗体EIA‘生研’疱疹IgM”(Denka生研公司制造)。

此外，优选如下实施方式：通过减去固定化有该样品的来源生物(例如、SITH-1的情况下，来源生物为人)不具有的抗体的任意蛋白质(虽不局限于此，上述生物为哺乳类时，可以举出例如GFP等)区域的测定值，可以更正确地求出。对于作为固相化的方法，没有特别地限制，优选制作与生物素结合性蛋白质的融合蛋白，并通过生物素-抗生物素蛋白结合而固相化在生物素化担载体上。

以上这样的计算方法，本领域技术人员可以根据生物学样品的性质、使用的抗体的特征等适当地设计并进行选择。

本发明的检测方法，优选能够特异地对血清中的抗体效价低的抗体进行检测。

本发明的实施方式1的效果，例如可以通过如下实施方式来理解：对实施例2的图3-1的TM2/pTrc99A/BL21细胞破碎提取液(黑色三角)的结果，与PBS(白色方块)或pTrc99A/BL21细胞破碎提取液(黑色圆圈)的结果进行比较。另外，可以通过对实施例3的表3的TM2/pTrc99A导入的BL21粗提取液的S/N比，与PBS或pTrc99A导入的BL21细胞破碎提取液的S/N比进行比较来理解。

II.本发明的检测方法(实施方式2)

本发明的检测方法(实施方式2)是对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括：

在本发明的实施方式2的方法中，工序1及2的，结合有融合蛋白的担载体的制备方法与实施方式1同样。此外，最后的对与和融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质结合的被检测物质进行检测的工序(实施方式1的工序4、实施方式2的工序5)也是同样的。

实施方式2的方法，以在向担载体添加生物学样品之前，进行担载体的封闭工序(实施方式2的工序3)为特征。

在本发明中，就结合有融合蛋白的担载体而言、在向担载体添加生物学样品之前，进一步通过使生物素结合性蛋白质与担载体接触，可以更有效地抑制背景信号。并不受理论的约束，可以认为这是因为，在担载体表面上，未与融合蛋白结合的、游离的状态(free)的生物素部分与生物素结合性蛋白质结合(图1)。

与结合担载体接触的生物素结合性蛋白质可以与构成融合蛋白的生物素结合性蛋白质可以相同或不同。此外，可以为野生型也而可以为突变体。生物素结合能力与野生型相比，可以同等，也可以更高或更低，优选为同等或为野生型以下。虽不局限于此，可以是例如比野生型蛋白质的生物素结合能力低，并且与生物素的解离常数(KD)小于10^-5(M)的蛋白质。为了制作这样的生物素结合蛋白质，有进行化学修饰的方法(US-A-5051356)等，最优选修饰氨基酸序列的方法(Qureshi等人(2002)J.Biol.Chem.、276、46422-46428)。

在本发明中，在生物素结合性蛋白质与结合担载体接触时，对于其方法没有特别限制。即，可以直接添加生物素结合性蛋白质，也可以溶解在适当的液体中并与担载体接触。另外，可以同时使用BSA或酪蛋白等本领域技术人员公知的封闭剂。

虽不局限于此，向所期望的缓冲液(例如含有0.02％～1％、优选0.1～0.5％浓度的Tween-20或Triton的TBS或PBS)中添加最终浓度为1μg/ml～500μg/ml、优选为10μg/ml～100μg/ml的生物素结合性蛋白质。此外，还可以向其中添加最终浓度1μg/ml～50μg/ml、优选为5μg/ml～10μg/ml的BSA或酪蛋白。该封闭溶液，在10℃～40℃，优选在20℃～30℃，与下述担载体接触10分钟～2小时、优选接触30分钟～1小时，所述担载体，通过抗生物素蛋白-生物素结合与生物素结合性蛋白质融合蛋白结合。

本发明实施方式2的效果通过例如如下实施方式来理解：实施例2中，对抗体为0时的图3-1和图3-2的pTrc99A/BL21细胞破碎提取液(黑色圆圈)的值进行比较。抗体为0时，由于不存在抗体，假设不存在非特异的结合，荧光应该为0。在此，对图3-1和图3-2的抗体0时的黑色圆圈之间进行比较，在通过TM2进行担载体的封闭时，荧光值下降将近一半，可以认为非特异的结合大幅降低。此外，在通过TM2进行了担载体的封闭的图3-2中，与图3-1相比，图表整体向下方移动。另外，就实施例2的表2的pTrc99A/BL21细胞破碎提取液的结果而言，也可以通过对“通过BSA的封闭”的值和“通过BSA和TM2封闭”的值进行比较来理解。

III.本发明的检测方法(实施方式3)

本发明的检测方法(实施方式3)是对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括：

一种对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括：

4)在工序3)的封闭工序后，将(a)生物学样品，以及

混合后添加至结合有融合蛋白的担载体中；然后，

实施方式3是组合了实施方式1和实施方式2的实施方式。具体来说，是进行了实施方式1的细胞破碎提取液及生物素结合性蛋白质的添加，和实施方式2的通过生物素结合性蛋白质进行担载体的封闭这两者的实施方式。

本发明实施方式3的效果，可以通过例如以下实施方式来理解：对实施例2中的图3-2的TM2/pTrc99A/BL21细胞破碎提取液(黑色三角)的结果，与图3-1、图3-2中的其它结果，例如PBS(白色方块)的结果进行比较。另外，在实施例4中，通过对表5的TM2/pTrc99A导入的BL21粗提取液的S/N比，与其它结果，即PBS、大肠杆菌(BL21)或pTrc99A导入的BL21细胞破碎提取液的S/N比进行比较来理解。

IV.结合有融合蛋白的担载体

此外，本发明提供用于对生物学样品中的物质进行检测的担载体。即本发明的担载体，其特征在于，其通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合与融合蛋白结合，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白，所述用于对生物学样品中的物质进行检测的担载体通过下述方法制备：

这样一来，本发明的担载体，优选通过抗生物素蛋白-生物素结合，与和待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白结合，另外，担载体上未反应的生物素，通过抗生物素蛋白-生物素结合，与生物素结合性蛋白质结合。

VII.试剂盒

此外，本发明提供用于对生物学样品中的物质进行检测的试剂盒。本发明的试剂盒包含：

A)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合而与融合蛋白结合的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白，以及

用于稀释生物学样品的包含下述B-i)或者B-ii)和/或的试剂；

C)含生物素结合性蛋白质的封闭剂。

用于稀释生物学样品的试剂，可以是细胞破碎提取液(及生物素结合性蛋白质)本身，或将细胞破碎提取液与生物学样品一起进一步稀释的试剂，可以包括适当的缓冲液、市售的细胞稀释液或血清稀释液等溶剂。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行具体地说明，但这些实施例不是用于限定本发明的技术范围。本领域技术人员依据本说明书的记载可以容易地对本发明进行修饰/变更，这些也包含在本发明的技术范围内。

在本实施例1、2中，利用大肠杆菌表达来源于人疱疹病毒6(HHV-6)的SITH-1蛋白质和tamavidin 2的融合蛋白，使通过超声波破碎得到的大肠杆菌粗提取液直接与生物素化微孔板反应，融合蛋白通过tamavidin-生物素结合被固定化。这样得到的SITH-1板，与利用大肠杆菌粗提取液稀释的人血清(包含兔子抗SITH-1抗体。在本试验中，作为模拟临床样本，使用了向市售的人血清中加入逐级稀释的兔子的抗SITH-1抗体(抗血清)而得到的血清)反应，对人血清中包含的抗SITH-1抗体量进行了测定。

实施例1SITH-1基因和tamavidin 2的融合蛋白表达用载体的构建

在本实施例中，设计了编码在SITH-1的C末侧以接头为中介设置有tamavidin 2(以下，称为TM2)的融合蛋白的基因。

1-1.引物的设计

为了构建SITHl-TM2融合基因，首先，设计了用于以接头(5xlinker：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO：18)为中介将SITH-1和TM2两个基因融合的引物。

即，设计了如下引物：由编码在5’侧的SITH-1的C末端部位、在中央的接头、在3’侧的TM2的N末端部位的DNA序列构成的引物(SITH1C-5xlink-TM2N-F)(SEQ ID NO：19)、由逆向编码在5’侧的TM2的N末端部位、接头、在3’侧的SITH-1的C末端部位的DNA序列构成的引物(SITH1C-5xlink-TM2N-R)(SEQ ID NO：20)。

接下来，设计了包括SITH-1的N末端部位的5’部分和在其上游设置有EcoR I限制性内切酶切断位点(CCATGG)的引物(SITH15’EcoRI-F(SEQ IDNO：21))，以及由编码TM2基因的3’部分和在其下流的BamH I限制性内切酶切断位点(GGATCC)序列构成的引物(TM2CtermBam)(SEQ ID NO：22)。将用于构建SITH-1和TM2的融合基因的引物总结于表1中。

[表1]

用于构建SITH-1和TM2的融合基因的引物

限制性内切酶识别位点用下划线表示。接头序列用小写字体表示。

1-2.PCR

为了构建SITH1-TM2融合基因，进行了二阶段PCR。

第一阶段的PCR，分别进行如下扩增：以重组有SITH-1基因(ORF)(SEQID NO：2)的FLAG表达载体(SIGMA)质粒作为模板，使用引物SITH15’EcoRI-F和SITH1C-5xlink-TM2N-R，扩增了SITH-1位点，此外，以重组有TM2基因的载体pTrc99A质粒(WO02/072817)作为模板，使用引物SITH1C-5xlink-TM2N-F和TM2CtermBam，进行了TM2位点的扩增。

PCR反应条件为：向20μl的反应液中，添加500ng模板DNA、2μl的10×ExTaq buffer(TaKaRa公司)、1.6μl的2.5mM dNTP、各20皮摩尔的引物、0.1μl的5U/μl Ex Taq，使用GeneAmp PCR System 9600(PERKINELMER)，进行96℃、3分钟、1次；95℃、1分钟，60℃、1分钟，72℃、2分钟，20次；72℃、6分钟、1次。结果，在SITH-1部分得到579bp的PCR产物，在TM2部分得到528bp的PCR产物。这些PCR产物，在TAE缓冲液中，使用琼脂糖凝胶电泳进行分级。分别切出各PCR产物的凝胶，使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(QIAGEN)，分别回收这些产物。提取方法按照试剂盒所述的说明书进行。

以上述两个PCR产物作为模板，使用引物SITH15’EcoRI-F和TM2CtermBam进行第二阶段的PCR。反应条件为：向20μl的反应液中添加各500ng的模板DNA、2μl的10×Pyrobest buffer(TaKaRa公司)、1.6μl的2.5mM dNTP、各20皮摩尔的引物、0.1μl的5U/μlPyrobest DNA聚合酶，使用GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)，进行96℃、3分钟、1次；95℃、1分钟，60℃、1分钟，72℃、2分钟，20次；72℃、6分钟、1次。结果得到990bp的PCR产物。

1-3.克隆

将通过PCR得到的SITH1-TM2融合基因克隆到载体pCR4BluntTOPO(Invitrogen公司制造)中。

具体来说，首先，按照载体试剂盒所附的说明书，进行连接反应(ligation)。使用电穿孔法将DNA导入到大肠杆菌TB1中，按照通常方法(Sambrook等人1989，Molecular Cloning，A laboratory manual，2^nd edition)提取质粒DNA。对于确认到插入物存在的质粒，使用M13引物(TaKaRa公司)、ABI PRISM荧光测序仪(Model 310 Genetic Analyzer，Perkin Elmer公司)，对碱基序列进行测序，并与设计的基因序列进行比较，从而确认了无突变。重组有融合基因的质粒通过EcoRI和BamHI进行双重消化，按照与上述同样的方法进行琼脂糖凝胶电泳和纯化，并回收了DNA片段。使用连接试剂盒(TaKaRa公司制造)，连接该片段和预先用EcoRI和BamHI消化的大肠杆菌用表达载体pTrc99A(Pharmacia公司制造)。将连接产物转化到大肠杆菌TB1中，提取质粒DNA，并进一步转化到大肠杆菌BL21中。以得到的大肠杆菌菌落作为模板，使用SITH15’EcoRI-F和TM2CtermBam，通过PCR进行插入基因部位的扩增，以确认插入基因的有无。

如上所述，完成了SITH-1和TM2的融合蛋白表达用载体SITH1-TM2/pTrc99A。编码表达用载体SITH1-TM2/pTrc99A中的SITH1-TM2的碱基序列如SEQ ID NO：23所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。

就SITH1-TM2而言，在5′侧，因为使用EcoRI位点重组至pTrc99A中，在翻译起始的蛋氨酸后添加有两个氨基酸残基(SEQ ID NO：23的碱基编号4-9、SEQ ID NO：24的氨基酸残基编号2-3)。接下来，接续有SITH-1的序列(SEQ ID NO：23的碱基编号10-483、SEQ ID NO：24的氨基酸残基编号4-161)、5xlinker(SEQ ID NO：23的碱基编号484-558、SEQ ID NO：24的氨基酸残基编号162-186)、TM2的序列(除去了Met后的序列)(SEQ ID NO：23的碱基编号559-981、SEQ ID NO：24的氨基酸残基编号187-326)。

1-4.大肠杆菌表达

将导入了SITH1-TM2/pTrc99A的大肠杆菌BL21接种到含抗生素氨苄青霉素(最终浓度100μg/ml)的50ml LB培养基中，在30℃振荡培养直到OD600的吸光度达到0.5。然后，添加1mM IPTG，再于30℃进行5小时振荡培养。离心50ml培养液回收菌体。将菌体悬浮在0.1MHEPES/KOH(pH7.4)3ml中，进行超声波破碎。将破碎液进行离心(15000rpm)，将该上清作为大肠杆菌粗提取液。为了确认TM2融合SITH-1蛋白质的表达，利用SDS-PAGE将粗提取液中含有的蛋白质分级，通过免疫印迹法解析。

将兔子抗SITH-1抗体(纯化利用大肠杆菌表达的SITH-1，并用来对兔子进行免疫从而制作的抗SITH-1抗体(抗血清))和碱性磷酸酶标记抗兔子IgG抗体(BIO RAD公司制造)分别稀释1000倍用于检测SITH-1。结果如图2所示。由表达TM2融合SITH-1的大肠杆菌中检测到在35kDa附近的带(band)。该大小与TM2融合SITH-1的分子量34.8kDa基本一致。此外，关于导入有pTrc99A、TM2/pTrc99A的大肠杆菌BL21(Takakura等人(2009)FEBS J.276：1383-1397)，与上述同样，在IPTG的存在下进行培养，然后制备大肠杆菌粗提取液。

实施例2通过ELISA对人血清存在下的抗SITH-1抗体进行检测

利用0.1M HEPES/KOH(pH7.4)稀释实施例1得到的表达了TM2融合SITH-1的大肠杆菌粗提取液，使其成为总可溶性蛋白质2mg/ml，向生物素板(Sumitomo Bakelite公司制造)的每个孔中分别添加100μl。在室温下静置1小时，通过tamavidin-生物素结合将TM2融合SITH-1蛋白质与生物素板固定化。然后，利用含0.1％Tween20的TBS缓冲液(TBST)对板的各孔清洗3次，向各孔中添加250μl的5μg/ml BSA/TBST溶液或50μg/ml纯化TM2/5μg/ml BSA/TBST溶液，在室温下静置1小时，进行封闭。然后，利用TBST清洗各孔3次。

接下来，利用PBS或实施例1-4制备的总可溶性蛋白质5mg/ml的pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液、或总可溶性蛋白质5mg/ml的TM2/pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液将人血清(Human Serum pool，Cosmo-Bio公司制造)稀释100倍得到溶液，向该溶液中添加兔子抗SITH-1抗体(抗血清)，该兔子抗SITH-1抗体(抗血清)是经逐级稀释成体积比为0.002、0.001、0.0005、0.00025的兔子抗SITH-1抗体(抗血清)，向固定化有TM2融合SITH-1的板的每个孔中分别添加100μl，在室温下反应1小时。

兔子抗SITH-1抗体(抗血清)的血清中抗体效价与典型的抑郁症(情绪障碍)患者的血清中的抗SITH-1抗体效价相比，推定高约50倍左右。因此，按照体积比1/50的量，向市售(健康人)的人血清中混合兔子抗SITH-1抗体(抗血清)，可考虑将其作为典型的抑郁症患者血清的模拟样本。由此，上述的抗体稀释率，可以认为与将抑郁症患者血清稀释约10倍～80倍的情况为同等水平。

作为对照，分别设置了如下两个区域：对没有进行任何固定化的生物素板，仅通过上述BSA进行封闭的区域、和通过BSA和TM2进行的封闭这两种封闭操作的区域。需要说明的是，在利用包含tamavidin溶液进行封闭操作的情况下，由于封闭溶液中的tamavidin的一部分与板上的生物素特异地结合，可以认为与利用了tamavidin固定化板的体系处于相同的状态。然后，与上述同样地，分别添加100μl向利用PBS溶液、pTrc99A导入的或TM2/pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液(总可溶性蛋白质5mg/ml)稀释100倍的人血清中添加逐级稀释的兔子抗SITH-1抗体所得到的混合物，在室温下反应1小时。在人血清存在下，使兔子抗SITH-1抗体与TM2融合SITH-1反应，然后利用TBST清洗3次。

然后，为了分别检测通过tamavidin固定化在板上的SITH-1、反应/结合后的兔子抗SITH-1抗体、以及被认为各孔中非特异地结合的血清中的人IgG，各添加100μl分别利用TBST稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体、以及过氧化物酶标记羊抗人IgG抗体的混合溶液，在室温下静置1小时。然后，利用TBST清洗3次，对过氧化物酶活性进行检测。活性通过下述方法测定：向各孔分别加入100μl的SuperSignal ELISA PicoChemiluminescent Substrate(PIERCE)，在室温下静置5分钟，然后通过酶标仪(plate reader)Infinite M200(TECAN公司制造)对发光量进行测定。

需要说明的是，作为数据，同时进行在兔子抗SITH-1抗体的分别的各浓度区域、对照区(未固定有TM2融合SITH-1，进行利用BSA或BSA和TM2的封闭操作，并且经含各浓度的抗SITH-1抗体的人血清处理的区域)的各发光量的测定，从固定化有TM2融合SITH-1的区域的发光量的值中减去该对照区的值。并将其作为血清中所含有的抗SITH-1抗体的检测量。

向血清中添加大肠杆菌破碎提取液对非特异性结合所产生的效果、通过TM2进行封闭对非特异性结合所产生的效果的结果如图3所示。在图3中，利用PBS将血清稀释100倍的区域由白色方块表示，利用仅具有表达载体的大肠杆菌破碎提取液将血清稀释100倍的区域由黑色圆圈表示，利用表达TM2的大肠杆菌破碎提取液将血清稀释100倍的区域由黑色三角表示。各图表的纵轴(荧光量)表示抗SITH-1抗体的检测量，横轴表示逐级稀释的抗SITH-1抗体的稀释比例。

图3-1示出：在未通过生物素结合性蛋白质(TM2)进行封闭的情况下，人血清用PBS(白色方块)、pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液(黑色圆圈)、或TM2/pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液(黑色三角)稀释时，血清中抗SITH-1抗体量的检测结果。

图3-2示出：在通过生物素结合性蛋白质(TM2)进行封闭的情况下，人血清用PBS(白色方块)、pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液(黑色圆圈)、或TM2/pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液(黑色三角)稀释时，血清中抗SITH-1抗体量的检测结果。

另外，为了对封闭的效果、各血清稀释液的效果进行比较，利用下述方法计算出S/N比。

S/N比＝在各浓度条件下添加抗SITH-1抗体的区域的抗SITH-1抗体检测量/未添加抗SITH-1抗体的区域的抗SITH-1抗体检测量

因此，S/N比越大表示检测灵敏度越高。

各区域的S/N比的计算结果如表2所示。

[表2]

在各区域，示出抗SITH-1抗体的稀释比例为0(未添加抗SITH-1抗体时)的值为1时的S/N比

在利用PBS将血清稀释的区域中，血清中所含有的抗SITH-1抗体的非特异性结合多，在未添加抗SITH-1抗体的区域也检测到高发光量。另一方面，就添加了pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液或TM2/pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液的区域而言，未添加SITH-1抗体的区域的荧光量值相当低，非特异性结合急剧下降。特别是，在添加了TM2/pTrc99A导入大肠杆菌粗提取液的区域的非特异性结合低(图3-1、图3-2)。此时发现：与仅通过BSA进行封闭相比，进一步添加TM2进行封闭(BSA+TM2)的情况下，尤其在低浓度(稀释率0.0005以下)的抗体的检测方面具有定量性(图3-2)。

另外，就添加了pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液的区域，以及添加了TM2/pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液区域而言，发现如果利用添加了TM2的BSA进行封闭，则S/N比升高，可以更高灵敏度地对抗SITH-1抗体进行检测(表2)。尤其是在添加了TM2/pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液的区域，S/N比的上升显著。

通过上述内容显示：对于固定化有TM2融合SITH-1的板，利用含TM2的溶液进行封闭，然后，利用表达了TM2的大肠杆菌粗提取液对人血清进行稀释，由此使人血清来源的非特异性结合减少，针对极低浓度的抗SITH-1抗体，也可以灵敏度良好、稳定并定量地进行检测。

实施例3通过使用磁珠的ELISA在人血清存在下对抗SITH-1抗体进行检测

在本实施例中，在对非常低浓度的SITH-1抗体进行检测的情况下，在将TM2融合SITH-1固定化在生物素化磁珠的体系中，对各种血清稀释液的效果进行了检测。

3-1.固定化有TM2融合SITH-1的磁珠的制备

向磁珠Dynabeads M-270 Amine(DynalBiotech公司制造)1mL(30mg珠子/mL)中添加10mM NHS-Lc-Lc-生物素(PIERCE公司制造)1mL。通过在室温下，颠倒混合30分钟，使氨基和NHS活性酯基反应，使生物素和磁珠共价结合。然后，利用0.1％BSA/0.01％Tween20/PBS溶液清洗磁珠2次，最后，将其悬浮在PBS缓冲液中。得到的磁珠(30mg珠子/mL PBS)作为生物素化磁珠。

与上述的实施例1-4同样地，利用大肠杆菌表达TM2融合SITH-1，利用0.1M HEPES/KOH(pH7.4)稀释制备的大肠杆菌粗提取液，使其总可溶性蛋白质浓度为5mg/ml，向其中添加生物素化磁珠。通过在室温下，颠倒混合1小时，通过tamavidin-生物素结合将TM2融合SITH-1与磁珠固定化。然后，利用含0.2％Tween20的TBS缓冲液(TTBS)清洗磁珠3次。

另外，利用0.1M HEPES/KOH(pH7.4)稀释表达了TM2的大肠杆菌(Takakura等人(2009)FEBS J 276：1383-1397)的粗提取液，使得总可溶性蛋白质浓度为5mg/ml，向其中添加生物素化磁珠。通过在室温下，颠倒混合1小时，通过tamavidin-生物素结合，固定化TM2。与上述同样地，进行清洗，然后将制成的TM2固定化磁珠(30mg珠子/mL PBS)用来减去血清样品固有的非特异性结合。

3-2.使用了磁珠的ELISA分析

以1/50的量，向市售的人血清(Human Serum pool、Cosmo-Bio公司制造)中添加实施例2的兔子抗SITH-1抗体，制备了包含SITH-1抗体的人血清。另一方面，以不加入SITH-1抗体的人血清作为对照。

利用PBS、或表达pTrc99A载体产物的大肠杆菌粗提取液，或表达了TM2的大肠杆菌粗提取液，将人血清或包含兔子SITH-1抗体的人血清稀释1000倍得到溶液，并进一步添加BSA使得最终浓度为2％(w/v)，其中，利用0.1M HEPES/KOH(pH7.4)调整表达pTrc99A载体产物的大肠杆菌粗提取液使得总可溶性蛋白质浓度为5mg/ml，利用0.1M HEPES/KOH(pH7.4)调整表达了TM2的大肠杆菌粗提取液使得总可溶性蛋白质浓度为5mg/ml。需要说明的是，在上述实施例2中，将人血清稀释100倍后，向该稀释后的血清中添加兔子抗SITH-1抗体，从而使得体积比为0.00025～0.002。但是，由于在本实施例3-2中，按照1/50量(体积比为0.02)，将兔子抗SITH-1抗体添加到人血清中，然后稀释1000倍，因此兔子SITH-1抗体的稀释率为1/50000。因此，上述的抗体稀释率与将抑郁症患者血清稀释约1000倍使用时的情况处于同等水平。

向这样制备的稀释血清lmL中分别添加固定化有TM2融合SITH-1的磁珠、或固定化有TM2的磁珠各10μl，在室温下通过颠倒混合1小时使其反应。利用TBST清洗3次，然后，为了检测结合在与磁珠固定化后的SITH-1抗原的兔子抗SITH-1抗体，将检测辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体，或为了检测与各磁珠非特异性结合的人IgG，将过氧化物酶标记山羊抗人IgG抗体，分别利用含2％BSA的TBST稀释5000倍，然后混合，向各磁珠中分别添加1000μl的该过氧化物酶标记第二抗体混合溶液，在室温下，颠倒混合1小时。然后，再利用TBST清洗3次，添加100μl检测试剂1步ELISAultraTMB(PIERCE)，在室温下反应1分钟。通过添加100μl的2M硫酸使反应停止，通过酶标仪Infinite M200(TECAN公司制造)测定发色程度(波长450nm处的吸光度、A450)。测定是对每个处理区域实施2次并求出其平均值。

在固定化有TM2融合SITH-1的磁珠中，从使用各血清稀释液(PBS、表达pTrc99A载体产物的大肠杆菌粗提取液、表达TM2的大肠杆菌粗提取液)时的A450值中，从每个血清稀释液中分别减去使用了固定化有TM2的磁珠时的A450的值，并使用该值作为作为数据值。结果如表3所示。

[表3]血清稀释液在人血清中的SITH-1抗体检测中的效果

其结果如表3所示，在使用PBS作为血清稀释液时，人血清中的SITH-1抗体的A450的值(S)显示最高的值，同时，不含SITH-1抗体的血清的A450值(N)也极其高，结果，就PBS而言，S/N比(添加了兔子抗SITH-1抗体的人血清的显色程度/未添加兔子抗SITH-1抗体的血清的显色程度)最低。

另一方面，使用TM2表达大肠杆菌粗提取液作为血清稀释液时，不含SITH-1抗体的血清的A450值最低，可以较大程度地抑制非特异性结合。另外，S/N比，在使用TM2表达大肠杆菌粗提取液作为血清稀释液时最高，其值高于10。上述内容显示：在使用固定化有TM2融合SITH-1的磁珠的情况下，通过将表达TM2的大肠杆菌粗提取液与人血清混合，可以减少非特异性结合，能够以高灵敏度地检测抗SITH-1抗体。

需要说明的是，假设通过SITH-1抗体的定量进行抑郁症(情绪障碍)的诊断的情况，可以将在本说明书中使用的、加入了兔子SITH-1抗体的人血清、未加入兔子SITH-1抗体的人血清，分别视为抑郁症(情绪障碍)患者血清、健康人血清。在此，在表3中，使用PBS作为血清稀释液时，抑郁症患者(S)为0.64、健康人(N)为0.25，另一方面，作为血清稀释液，在使用TM2/pTrc99A导入的BL21粗提取液的情况下，抑郁症患者(S)为0.22、健康人(N)为0.02。在大多的临床样本(血清)中，认为即使是健康人，也存在非特异性结合高的血清，而就抑郁症而言也存在SITH-1抗体效价不明显高的血清。因此，作为用于对它们的差异进行检测的测定方法，期望可以尽量减少非特异性结合(N)、并且能够确实地检测特异性结合(S)的测定方法。从这样的观点来看，本实施例的S/N比在用于对各血清稀释液等的效果进行比较时是有效的指标。

实施例4.通过使用了Harpin和tamavidin的融合蛋白的ELISA，对在人血清存在下的抗HarDin抗体进行检测

在本实施例中，利用大肠杆菌表达作为植物病原细菌来源蛋白质的Harpin(hrpZpss蛋白质、Takakura等人、2004、Physiol.Mol.Plant Pathol.64，83(89)和tamavidin 2(TM2)的融合蛋白，并通过tamavidin-生物素结合将其固定化在生物素化微孔板上。对这样得到的Harpin板，通过tamavidin 2进行封闭，然后，与经各种大肠杆菌粗提取液稀释的血清(混合了兔子抗Harpin抗体和人血清的血清)反应后，通过过氧化物酶标记山羊抗人IgG抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体，对抗Harpin抗体进行了检测。以下，详细地进行说明。

4-1.Harpin和tamavidin 2的融合蛋白表达用载体的构建和大肠杆菌表达

使用PCR构建了编码将TM2的序列连接在Harpin的C末端侧的融合蛋白的基因。为了构建Harpin-TM2融合基因，设计了用于通过接头(5xlinker：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)(SEQ ID NO：18)将Harpin、TM2两个基因结合的引物。设计的引物如表4所示。

[表4]用于构建编码Harpin和Tm2融合蛋白的基因的引物

如表4所示，设计了由5’侧的Harpin C末端部位、中央的接头、3’侧的TM2N末端部位构成的引物(HarpinC-5xlink-TM2N-F，表4，SEQ ID NO：27)；由逆向编码5’侧的TM2N末端部位、中央的接头、3’侧的Harpin C末端部位的DNA序列构成的引物(HarpinC-5xlink-TM2N-R，表4，SEQ ID NO：26)。此外，设计了Harpin的N末端部位的引物HarpinNtermEcoRI-F(在5’末端包含EcoRI切断序列，表4，SEQ ID NO：25)。

为了构建Harpin-TM2融合基因，进行了两个阶段的PCR。第一阶段的PCR，以重组有Harpin基因(ORF)(SEQ ID NO：28)(编码氨基酸序列：SEQ IDNO：29)的pCR2.1载体(Invitrogen)得到的质粒(Takakura等人、2004、Physiol.Mol.Plant Pathol.64，83(89)作为模板，使用引物HarpinNtermEcoRI-F和HarpinC-5xlink-TM2N-R，进行了Harpin位点的扩增。此外，单独以重组有TM2基因的载体pTrc99A得到的质粒(WO02/072817)作为模板，使用引物HarpinC-5xlink-TM2N-F和TM2CtermBam进行了TM2位点的扩增。

PCR反应条件为：向20μl的反应液中添加100ng的模板DNA、2μl的10×ExTaq缓冲液(TaKaRa社)、1.6μl的2.5mM dNTP、各20皮摩尔的引物、0.1μl的5U/μl Ex Taq，使用GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)，进行94℃、60℃、72℃各30秒25次。其结果，在Harpin位点，得到约1kbp的产物，在TM2部分，得到约0.5kbp的PCR产物。这些PCR产物，在TAE缓冲液中，使用琼脂糖凝胶电泳进行分级。分别切出各PCR产物的凝胶，使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(QIAGEN)回收产物。提取方法按照试剂盒所述的说明书。

以上述两个PCR产物作为模板，使用引物HarpinNtermEcoRI-F和TM2CtermBam进行第二阶段的PCR。反应条件为：向20μl的反应液中添加各100ng的模板DNA、2μl的10×Pyrobest缓冲液(TaKaRa社)、1.6μl的2.5mM dNTP、各20皮摩尔的引物、0.1μl的5U/μl Pyrobest DNA聚合酶，使用GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)，进行94℃、30秒，60℃、1分钟，72℃、1.5分钟25次。其结果得到约1.5kbp的PCR产物。

将通过PCR得到的harpin-TM2融合基因克隆到载体pCR4BluntTOPO(Invitrogen公司制造)中。确认了碱基序列，然后，利用EcoRI和BamHI二重消化重组有融合基因的质粒，按照与上述同样的方法，进行琼脂糖凝胶电泳和纯化，回收了DNA片段。使用连接试剂盒(TaKaRa公司制造)，将该片段与预先使用EcoRI和BamHI消化的大肠杆菌用的表达载体pTrc99A(Pharmacia公司制造)连接。将该连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，对碱基序列进行了确认。

如上所示，构建了harpin和TM2融合蛋白表达用的载体harpin-TM2/pTrc99A。编码harpin-TM2的碱基序列如SEQ ID NO：30所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示。

将导入有Harpin-TM2/pTrc99A的大肠杆菌BL21(DE3)接种到含抗生素氨苄青霉素(最终浓度100μg/ml)的50ml LB培养基中，在30℃振荡培养直到OD600的吸光度达到0.5。然后，添加1mM IPTG，另外，在30℃，振荡培养5小时。离心培养液50ml回收菌体。将该菌体重悬到0.1MHEPES/KOH(pH7.4)3ml中，然后通过超声波进行了破碎。将破碎液进行离心(15000rpm)，将其上清作为大肠杆菌粗提取液。为了确认TM2融合harpin蛋白质的表达，利用SDS-PAGE对粗提取液中含有的蛋白质进行分级，通过免疫印迹法进行了解析。

使用分别稀释1000倍的兔子抗harpin抗体(Takakura等人、2004、Physiol.Mol.Plant Pathol.64，83(89)和碱性磷酸酶标记抗兔子IgG抗体(BIO RAD公司制造)进行Harpin的检测。

结果如图4所示。在仅表达不含插入物的表达载体的大肠杆菌提取液中未检测到特异性的带(图4泳道1)，另一方面，在表达TM2融合harpin的大肠杆菌中，检测到在约50kDa附近的带(图4泳道2)。该大小与TM2融合harpin的分子量51.4kDa基本一致。

4-2.通过ELISA对在人血清存在下的抗Harpin抗体进行检测

利用0.1M HEPES/KOH(pH7.4)稀释TM2融合Harpin大肠杆菌粗提取液使得总可溶性蛋白质浓度为1mg/ml，并向生物素板(Sumitomo Bakelite)的每个孔中分别添加100μl。在室温下，通过静置1小时，通过tamavidin-生物素结合对TM2融合Harpin进行固定化。然后，利用含0.1％Tween20的TBS缓冲液(TBST)对板的各孔清洗3次。将50μg/ml纯化TM2(WO02/072817)/0.5％BSA/TBST溶液250μl添加到各孔中，在室温下，通过静置1小时，由TM2和BSA进行封闭。封闭后，利用TBST清洗各孔3次。

接下来，利用PBS、或总可溶性蛋白质5mg/ml(0.1M HEPES/KOH、pH7.4)的大肠杆菌粗提取液、总可溶性蛋白质5mg/ml(0.1M HEPES/KOH pH7.4)的表达pTrc99A载体产物的大肠杆菌粗提取液、或5mg总可溶性蛋白质/ml(0.1M HEPES/KOH、pH7.4)的表达TM2的大肠杆菌粗提取液，稀释人血清(Human Serum pool、Cosmo-Bio公司制造)100倍。再向该溶液中添加1％BSA，然后添加1/500量的兔子抗Harpin抗体，制备含抗Harpin抗体的血清。需要说明的是，以未添加Harpin抗体的血清作为对照。

将100μl这些血清分别添加到固定化有TM2融合Harpin的板中，在室温下，静置1小时使其反应，然后，利用TBST清洗3次。为了检测与Harpin抗原结合的兔子抗Harpin抗体，将辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体，以及，为了检测与孔非特异性结合的人IgG，将过氧化物酶标记羊抗人IgG抗体，分别通过含1％BSA的TBST稀释5000倍并混合，向各孔中加入各100μl的该过氧化物酶标记第二抗体混合溶液，在室温下静置1小时，使其反应。然后，再利用TBST清洗3次，添加100μl的检测试剂1步ELISAultraTMB(PIERCE)，在室温下反应5分钟。通过添加100μl的2M硫酸使反应停止，通过酶标仪Infinite M200(TECAN公司制造)测定了显色程度(波长450nm的吸光度、A450)。测定是对每个处理区域实施3次并求出了平均值。需要说明的是，在本实施例中，由于形成了抗体的浓度比较高，非特异性结合也较少的体系，因此无需减去未固相化抗原的区域的测定值。

结果如表5所示。

[表5]血清稀释液对人血清中的Harpin抗体检测的效果

如表5所示，人血清中的harpin抗体的A450值(S)在各血清稀释液之间无较大差异，作为对照的不含harpin抗体的血清的值(N)，按照TM2/pTrc99A导入的BL21粗提取液、pTrc99A导入的BL21粗提取液、大肠杆菌(BL21)粗提取液、PBS的顺序降低。由此显示：TM2/pTrc99A导入的BL21粗提取液可以最为有效地抑制非特异性结合。此外，就S/N比(添加了兔子抗Harpin抗体的人血清的显色程度/未添加兔子抗Harpin抗体的血清的显色程度)而言，表达了tamavidin 2的大肠杆菌提取液(TM2/pTrc99A导入的BL21粗提取液)作为血清稀释液使用时最高。

由以上内容显示：通过使用表达了tamavidin 2的大肠杆菌提取液对人血清进行稀释，可以抑制非特异性结合，高灵敏度地进行检测。

SEQ ID NO：1：SITH-1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2：SITH-1 ORF的碱基序列。

SEQ ID NO：3：SITH-1 cDNA的碱基序列。

SEQ ID NO：4：tamavidin 1的碱基序列。

SEQ ID NO：5：tamavidin 1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6：tamavidin 2的碱基序列。

SEQ ID NO：7：tamavidin 2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8：接头序列的实例。

SEQ ID NO：9：接头序列的实例。

SEQ ID NO：10：接头序列的实例。

SEQ ID NO：11：接头序列的实例。

SEQ ID NO：12：接头序列的实例。

SEQ ID NO：13：接头序列的实例。

SEQ ID NO：14：接头序列的实例。

SEQ ID NO：15：接头序列的实例。

SEQ ID NO：16：接头序列的实例。

SEQ ID NO：17：接头序列的实例。

SEQ ID NO：18：接头序列的实例(实施例中使用)。

SEQ ID NO：19：引物SITH1C-5xlink-TM2N-F的碱基序列。

SEQ ID NO：20：引物SITH1C-5xlink-TM2N-R的碱基序列。

SEQ ID NO：21：引物SITH15’EcoRI-F的碱基序列。

SEQ ID NO：22：引物TM2CtermBam的碱基序列。

SEQ ID NO：23：SITH-1-TM2的碱基序列。

SEQ ID NO：24：SITH-1-TM2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：25：引物HarpinNtermEcoRI-F的碱基序列。

SEQ ID NO：26：引物HarpinC-5xlink-TM2N-R的碱基序列。

SEQ ID NO：27：引物HarpinC-5xlink-TM2N-F的碱基序列。

SEQ ID NO：28：Harpin基因(ORF)的碱基序列。

SEQ ID NO：29：Harpin基因(ORF)编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：30：harpin-TM2的碱基序列。

SEQ ID NO：31：harpin-TM2的氨基酸序列。