JPH04236353A - 抗体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、不均質イムノアッセイ
（免疫測定法）の原理により免疫学的に検出することが
可能な物質の検出により、抗体を測定する方法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】抗原が生体に侵入した場合、この抗原に
対する抗体が生体によって産生される。抗原は一般に蛋
白質及びペプチドであり、また抗体はこれらの分子の存
在に応答して生体によって生合成される。これは免疫応
答と呼ばれる特異的な抗原抗体反応であり、多種の抗原
に対してそれに対応する多様な抗体が作り出されること
で特徴づけられる。

【０００３】抗原には抗体と特異的に結合するエピトー
プ（抗原決定基）と呼ばれる小さな部位があり、これが
特異的な抗原抗体反応に関与している。各々の抗体は、
対応する抗原上のエピトープを他の部分と見分けること
ができる。エピトープは蛋白質の立体構造を含む極めて
狭い領域であり、アミノ酸５〜７個ほどから成る。これ
は多様性が高いアミノ酸配列のみではなく糖鎖、糖脂質
などにも基づいて成っている。

【０００４】抗原及び抗体の測定方法はイムノアッセイ
と呼ばれ、抗原抗体反応の高い特異性を利用したもので
ある。イムノアッセイとしては、例えば免疫比濁法、ラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ、放射線免疫測定法）、エ
ンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、酵素免疫測定法）が
ある。これらのイムノアッセイでは、担体を用いる方法
がよく行われている。

【０００５】不均質なイムノアッセイは、生体を維持機
能するために重要な物質であるペプチドホルモンを測定
する内分泌系疾患の診断、ウイルス感染の診断及びワク
チン製造のためのエピトープの探索、蛋白質及びペプチ
ドに対する抗体を得るためのエピトープの決定方法（及
びそのキット）に利用できる。

【０００６】前記エンザイムイムノアッセイのうち、Ｅ
ＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　　Ａｓｓａｙ）は従来より広く行
われている。ＥＬＩＳＡ法による特異抗体測定では担体
を用いて固相とし、この担体上に抗原を不溶化（固定）
して被検液中の抗原特異イムノグロブリン（抗体）をト
ラップし、これを二次抗体トレーサーである標識抗イム
ノグロブリン抗体を用いて測定する。この方法は、被検
液中に通常多量の非特異イムノグロブリンが含まれてお
り、反応後、固相と液相を分離し十分に洗浄しないと、
非特異イムノグロブリンが固相に非特異的に残存吸着し
、測定のバックグランドを高め、測定感度が悪くなると
いう欠点がある。

【０００７】特異抗体測定方法として、試料中の抗原を
担体上に不溶化して標識抗体で検出する方法もあるが、
バックグランドが高く、希釈度に影響されるため、狭い
範囲でしか測定することができない。また、クラス捕獲
法に汎用されている測定方法がある。これは抗イムノグ
ロブリン抗体を不溶化した担体上に被検液中の抗体をト
ラップし、これを標識抗原を用いて測定する方法である
。この方法も抗イムノグロブリン抗体不溶化固相のイム
ノグロブリンをトラップする能力に限界があり、担体の
吸着能力を大きくすればバックグラウンドが大きくなる
ので高感度化が困難である。

【０００８】免疫反応体である抗原、抗体を担体上に不
溶化する方法としては、物理吸着法、化学結合法、スペ
ーサーを介する結合方法がよく使用されている。

【０００９】物理吸着法は、免疫反応体を物理吸着によ
って担体に吸着させる方法である。物理吸着法で不溶化
するためには多量の抗原、抗体が必要であり、担体とし
てプラスチックを用いたときには単位面積あたりの吸着
量が少ない。その他、物理吸着法では以下に記すような
問題がある。

【００１０】測定する免疫反応体は、抗原抗体反応を生
じる際にまず固相へ拡散しなければならないので反応速
度が遅く、固相に不溶化した免疫反応体は不溶化されて
いない溶液中での反応性に比べて低下することが知られ
ている（Ｐａｒｓｏｎｓ，　Ｇ．Ｈ．，Ｊｒ．（１９８
１）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　７３，２２
４）　。

【００１１】物理吸着により不溶化した蛋白質抗原の６
０％までもが分析操作中に脱離ロスするケースがあると
いう報告（Ｌｅｈｔｏｎｅｎ，　Ｏ．−Ｐ．　ａｎｄ　
Ｖｉｌｊａｎｅｎ，　Ｍ．Ｋ．（１９８０）　Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３４，６１．）もあり
、これは抗原がより小さいペプチドであればそれ以上に
生じる可能性がある。しかしこの問題は抗原不溶化後、
または分析操作中での徹底洗浄によりその欠点を最小限
にすることも可能であるという報告（Ｌｅｈｔｏｎｅｎ
，　Ｏ．−Ｐ．　ａｎｄ　Ｖｉｌｊａｎｅｎ，　Ｍ．Ｋ
．（１９８０）　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　３４，６１．）もあるが、物理吸着しにくい疎水
性の低い抗原については固定されずに分析され、正確な
測定が達成されない可能性が高い。

【００１２】化学結合法は、架橋剤と免疫反応体を共有
結合させ、架橋剤を介して担体に免疫反応体を固定する
方法である。この方法では、担体への免疫反応体の結合
量は増加するが、免疫反応体への架橋剤の結合が反応体
分子上のエピトープを破壊することがあるので、測定感
度がよくなるとは限らない。また、固相に固定された免
疫反応体のエピトープが固相から離れて、溶液中の結合
成分（抗体）に配向するように配慮する必要がある。

【００１３】スペーサーを介する結合方法では、免疫反
応体をスペーサーを介して担体に吸着させる方法である
。スペーサーと免疫反応体を化学的に結合させる場合は
、前記と同様に反応体分子上のエピトープを破壊するこ
とがある。スペーサーと免疫反応体を物理吸着させる場
合も前記の物理吸着法と同様な問題を生じる。

【００１４】前記の化学結合法とスペーサーを介する結
合方法では、多種類の免疫反応体を担体に固定する際に
、それぞれの特異的結合性を保持できる担体が必要であ
る。従って、種々の免疫反応体を測定するために各々違
った担体を製造しなければならないので大変な時間と費
用がかかる。これらの理由から免疫反応体を担体に固定
する方法は、前記のような問題はあるが物理吸着法が汎
用されてきた。

【００１５】特開平２−２４５５９号公報には、アビジ
ンを物理吸着によって担体に固定し、アビジンを介して
ビオチン免疫反応体を固定する方法が開示されている。 この方法は、多くの異なる免疫反応体の測定に好適であ
るが、物理吸着により固定されたアビジンは洗浄で脱離
しやすく、単位面積あたりの吸着量もプレートにより問
題がある。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は前記の課題を
解決するためなされたもので、多種類の免疫反応体に利
用できる高感度な抗体の測定方法を提供することを目的
とする。

【００１７】前記ＥＬＩＳＡ法による抗体測定で、抗原
としてエピトープの部分構造を含んだ低分子のペプチド
をマイクロプレート（担体）に物理吸着法で固定する際
には、従来の蛋白質抗原固定方法がそのまま代用されて
いる。しかし、低分子のペプチドは多種類のアミノ酸配
列をもつ蛋白質抗原と異なり、固定の際ペプチド分子そ
のものの性質に大きく影響されるので、同じ固定方法を
用いることは好ましくない。従って本発明では、ペプチ
ド分子の性質に影響されることなく、少量のペプチドで
確実にプレートへ固定することができる感度の高い測定
方法を提供することを目的としている。

【００１８】

【課題を解決するための手段】前記の目的を達成するた
めの本発明の抗体の測定方法は、免疫学的に検出するこ
とが可能な抗原決定基の部分構造を含む抗原を、不均質
なイムノアッセイにより測定するにあたり、表面にビオ
チンを結合させた担体を使用する。本発明の方法を実施
例に相当する図１に従って説明する。担体１（図１では
プレート）の表面にビオチン２（図１ではビオチン−Ｎ
ＨＳ）を結合させた後、ビオチン２にアビジン３を結合
して固相とする。別なビオチンを結合させた抗原４（図
１ではビオチン−ｈＧＲＰである）を固相のアビジン３
にビオチンを介して結合する。次に被検液を加え、固相
に固定した抗原４と特異的に結合する抗体５（図１では
ウサギｈＧＲＰ抗血清）を検出することにより、抗体を
測定する方法である。この方法は、固相がビオチン−ア
ビジン−ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉ
ｏｔｉｎ）の結合を特徴としているので、ＢＡＢ法と記
す。

【００１９】ＢＡＢ法において、担体１のビオチン２に
結合するアビジン３は、ストレプトアビジンを使用して
も同様に結合した複合体を形成させることができる。

【００２０】担体の表面は、ビオチンを共有結合させる
ための官能基を有する必要がある。図２は、表面に官能
基（イミノ基）を有する担体に、市販されているビオチ
ン−Ｎ−ヒドロキシサクシミドエステル（以下、ビオチ
ン−ＮＨＳと記す）を使用し、縮合してビオチンを結合
させた場合を示している。官能基は、イミノ基の他にア
ミノ基、ヒドラジド基が挙げられ、これらのうちから選
ばれる少なくとも一つの基である。表面に官能基を有し
ていない担体は、官能基で担体を修飾して使用すればよ
い。

【００２１】担体は容器形状のものとビーズ形状のもの
があり、容器形状のものとしては例えば試験管、マイク
ロタイタープレート、キュベットがあり、ビーズ形状の
ものも使用できる。これらは光透過性のものが好ましい
。

【００２２】担体にビオチンを結合させておくのは、ビ
オチンを結合させた抗原と結合するアビジンのビオチン
結合部位が破壊されないようにするためである。担体上
のビオチンにアビジン（またはストレプトアビジン）が
結合して固定されるが、この固定は界面活性剤を含んだ
洗浄剤の添加によっても殆ど脱離することがなく良好で
ある。

【００２３】ビオチンを結合させる抗原がペプチドであ
る場合は、そのＮ末端にビオチンを結合させて（以下、
ビオチン化ペプチドと記す）固相上のアビジンに結合さ
せることができる。

【００２４】ビオチン化ペプチドは、図３に示す方法で
作成される（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．ａｎｄ　Ｋｉｓｏ，
Ｙ．（１９７６）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ
．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７３，３５１６．）　。樹脂に
結合した保護ペプチドのＮ末端にビオチン−ＮＨＳを縮
合し、さらに１モルＴＭＳＢｒ−チオアニソウル（Ｔｒ
ｉｍｅｔｈｙｌ　　ｂｒｏｍｏｓｉｌａｎｅ−ｔｈｉｏ
ａｎｉｓｏｌｅ）／ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅ
ｔｉｃ　　ａｃｉｄ）処理により樹脂から分離し、精製
することにより作成される。

【００２５】固相上のビオチン化ペプチドと抗体の特異
的結合は、通常の抗原抗体反応の条件下で行われ、形成
された複合体は固相上に固定される。

【００２６】本発明の方法でアビジンまたはストレプト
アビジンに被覆された固相は、一般的なイムノアッセイ
で使用可能であり、多くのパラメーターの測定を実施す
ることができる。

【００２７】本発明の方法で使用できる被検液は、例え
ば血清、血漿、髄液、唾液、尿などの体液、緩衝液が挙
げられる。測定可能な特異抗体としては、実質上、従来
の免疫学的測定法で測定できるすべての抗体が挙げられ
る。例えば抗甲状腺抗体（抗ミクロゾーム抗体、抗サイ
クログロブリン抗体、抗ＴＳＨレセプター抗体）、抗核
抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗インスリン抗体、抗インスリン
レセプター抗体、抗アセチルコリンレセプター抗体など
ウイルスや微生物に対する抗体及びホルモンなどの蛋白
製剤に対する抗体、アレルゲン抗体である。

【００２８】抗原については、そのエピトープの検索及
び決定のために本発明の方法が好適である。抗原のエピ
トープの検索及び決定には、多種のペプチドを同条件で
測定し比較しなければならないが、本発明の方法では個
々のペプチドにそれぞれ固相を用意しなくてもよい。検
出できる抗原は、前記抗体と抗原抗体反応を生じさせる
ものであり、測定すべき抗体とエピトープの異なる抗体
や、ホルモン、ウイルス蛋白などのペプチド類が挙げら
れる。

【００２９】

【作用】本発明の方法では、担体上に［ビオチン−アビ
ジン−ビオチンを結合させた抗原］の複合体が形成され
ることにより、抗原抗体反応に携わる抗原のエピトープ
が担体との結合でマスクされるのを防ぐことができ、エ
ピトープが担体から離れて抗体に配向することを促す。 また、抗原がビオチンと結合したものであればアビジン
と結合して複合体が形成され、測定が可能である。

【００３０】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。

【００３１】実施例１ 本発明のＢＡＢ法である図１に従って、ペプチドとして
ｈＧＲＰ（ＨｕｍａｎＧａｓｔｒｉｎ　　Ｒｅｌｅｓｉ
ｎｇ　　Ｐｅｐｔｉｄｅ）を担体に固定する。ｈＧＰＲ
はＢＩＯＬＹＮＸ４１７０（ファルマシアＬＫＢ社製）
の自動ペプチド合成機で標準ペプチド固相合成により作
成し、担体は表面にイミノ基を有する９６ウェルプレー
ト（Ｎｕｎｃ社製、Ｃｏｖａｌｉｎｋ）を使用する。ま
ず２５０μｇ／ｍｌのビオチン−ＮＨＳを１００μｌ／
ウェル分注し、３７℃で２時間反応させた。次に１０ミ
リモルのＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅ
ｄ　　ｓａｌｉｎｅ）　で３回洗浄し、５０μｇ／ｍｌ
（１０ミリモル　　ＰＢＳ）のアビジンを１００μｌ／
ウェル分注、３７℃で１時間反応した。１０ミリモル　
　ＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング剤（大日本製薬社
製のブロックエースをＰＢＳで１／４に希釈したもの）
を３００μｌ／ウェル加え２２℃で１時間インキュベー
トし非特定蛋白結合部位をブロックし、ＰＢＳＴ（Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ−ｔｗ
ｅｅｎ＃２０）で３回洗浄した。次にビオチン化ｈＧＲ
Ｐ（ビオチンをｈＧＲＰのＮ末端に結合したもの）を１
００μｌ　　１０ミリモルＰＢＳ（ｐＨ７．２）／ウェ
ル加え、３７℃で１時間反応させてウェル上に被覆した
。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、前記のブロッキング
剤を加え２２℃で１時間インキュベートし、非特定蛋白
結合部位をブロックした後、ＰＢＳＴで３回以上洗浄し
た。これでｈＧＲＰは担体に固定された。

【００３２】次にｈＧＲＰ抗血清（ウサギ）を希釈液（
大日本製薬社製のブロックエースをＰＢＳで１／１０に
希釈したもの）で容積比１：２００００に希釈して、１
００μｌ／ウェル加え、３７℃で２時間反応させた。 ついでウェルをＰＢＳＴで６回洗浄し、非結合抗体を十
分除去した。１００μｌのセイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体は、前記の希釈液で容積比
１：５０００に希釈し、二次抗体トレーサーとして１０
０μｌ／ウェル加え、３７℃で１時間インキュベートし
た。ついでウェルをＰＢＳＴで６回洗浄し、非結合抗体
を十分除去した。０．０６重量％のＴＭＢＺ（３，３’
，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎ
ｅ）　塩酸水溶液（ｐＨ２．０）と、０．００５モル　
　Ｈ２　Ｏ２　／０．１モル　　リン酸−クエン酸バッ
ファ（ｐＨ４．０）の溶液とを容量比３：７に混合した
基質混合溶液を１００μｌ／ウェル加え、３７℃で１０
〜３０分間反応させた。この基質を用いて、着色生成物
の形成によるペルオキシダーゼラベル体の検出を行った
。反応停止は２００μｌ／ウェルの１規定　　硫酸を加
えることによって行い、着色生成物はプレートリーダー
を用いて４５０ｎｍで測定した。結果は図４の容量反応
曲線に示す。

【００３３】実施例２ 実施例１において二次抗体トレーサーとしてβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を使用し、０．
１ミリモル　　４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−
ガラクトシド蛍光基質溶液を２００μｌ／ウェル加え、
３７℃で３０〜６０分間反応させて蛍光性生成物の形成
によるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼラベル体の検出を行っ
た他は、実施例１と同様である。反応停止は１００μｌ
／ウェルの１モル　　グリシン−ＮＡＯＨ（ｐＨ１０．
３）を加えることによって行い、蛍光性生成物はプレー
トリーダーを用いて励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５
０ｎｍで測定した。結果は図５の容量反応曲線に示す。

【００３４】実施例３ 実施例１でｈＧＲＰ抗血清（ウサギ）を希釈液（大日本
製薬社製のブロックエースをＰＢＳで１／１０に希釈し
たもの）で容積比１：２０００００に希釈し、その他は
実施例２と同じ二次抗体トレーサーとしてβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を使用した。結果
は図６の容量反応曲線に示す。

【００３５】比較例１ 実施例１で使用したｈＧＲＰを従来の物理吸着法により
担体に固定する。担体は、表面にイミノ基を有する９６
ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製のＣｏｖａｌｉｎｋ）と
、表面に官能基をもたない９６ウェルプレート（Ｎｕｎ
ｃ社製のＭａｘｉｓｏｒｐ）の２種類を使用した。ｈＧ
ＲＰを１００μｌ　　１０ミリモルＰＢＳ（ｐＨ７．２
）／ウェル分注し、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ブ
ロッキング剤（大日本製薬社製のブロックエースをＰＢ
Ｓで１／４に希釈したもの）を加え２２℃で１時間イン
キュベートし、非特定蛋白結合部位をブロックし、ＰＢ
ＳＴで３回以上洗浄した。これでｈＧＲＰを担体に固定
した後は、実施例１と同様にした。結果は図４に示す。

【００３６】比較例２ 比較例１と同様にｈＧＲＰを従来の物理吸着法により担
体に固定し、その他の操作は実施例２と同様である。結
果は図５に示す。

【００３７】比較例３ 比較例１と同様にｈＧＲＰを従来の物理吸着法により担
体に固定し、その他の操作は実施例３と同様である。結
果は図６に示す。

【００３８】

【発明の効果】以上、詳細に説明したように本発明の抗
体の測定法は、ビオチンと結合したペプチドであれば抗
体の測定ができるのでペプチド自身の性質に依存せず、
少量のペプチドで急勾配の容量反応曲線を提供できる。 抗原のエピトープ検索及び決定では、個々の抗原のため
に特別な固相を準備する必要がないので簡単に行える。 本発明の抗体の測定法は、多種類の免疫反応体を検出す
るために各々の固相を製造することなく高感度の測定が
できるのである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定法の実施例を工程順に示した図で
ある。

【図２】本発明で使用する担体にビオチンが結合する状
態を説明する図である。

【図３】本発明で使用するペプチドにビオチンが結合す
る状態を説明する図である。

【図４】抗体を検出した容量反応曲線を示す図である。

【図５】抗体を検出した容量反応曲線を示す図である。

【図６】抗体を検出した容量反応曲線を示す図である。

【符号の説明】

１はプレート、２はビオチン−ＮＨＳ、３はアビジン、
４はビオチン−ｈＧＲＰ、５はウサギｈＧＲＰ抗血清、
６は標識抗ウサギＩｇＧ抗体である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　表面にビオチンを結合させた担体にア
   ビジンを結合して固相とし、免疫学的に検出することが
   可能な抗原決定基の部分構造を含む抗原を前記ビオチン
   とは別なビオチンと結合しておき、前記別なビオチンと
   結合した抗原を該固相のアビジンに結合させた後、被検
   液を加えて前記抗原と特異的に結合する抗体を検出する
   ことを特徴とする抗体の測定方法。
2. 【請求項２】　　前記アビジンがストレプトアビジンで
   あることを特徴とする請求項１に記載の抗体の測定方法
   。
3. 【請求項３】　　前記担体はビオチンを共有結合させる
   ための官能基を表面に有することを特徴とする請求項１
   に記載の抗体の測定方法。
4. 【請求項４】　　前記共有結合させるための官能基はア
   ミノ基、イミノ基およびヒドラジド基から選ばれる少な
   くとも一の基であることを特徴とする請求項３に記載の
   抗体の測定方法。
5. 【請求項５】　　前記担体は容器形状またはビーズ形状
   であることを特徴とする請求項１に記載の抗体の測定方
   法。
6. 【請求項６】　　前記免疫学的に検出することが可能な
   抗原決定基の部分構造を含む抗原がペプチドであり、該
   ペプチドのＮ末端にビオチンを結合させることを特徴と
   する請求項１に記載の抗体の測定方法。